JPS5945302A - 色素又は螢光化合物でマ−キングされた反応性の親水性ラテツクス粒子の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、困難な必要条件をほとんど要せずに簡単に実
施される５色素又は螢光化合物でマーキングされた反応
性の親水性ラテックス粒子の製法に関する。導入された
色素又は螢光化合物を含有する粒子は１例えば免疫学に
おいて極めて重要である、それというのもこれらはヒト
又は獣の組織内の抗原ないしは抗体を検出するだめに適
当であるからである。この検出法は特に組織学において
組織切片を作るために特に有利である。もう１つの用途
は、表面で識別される摂取体を担持する細胞の選択的マ
ーキングである。

ラテックス粒子は公知方法でラジカル性乳化重合によっ
て製造される。この場合には、水に難溶性の単量体を乳
化剤の水溶液と一緒に攪拌する、その際に牛乳状の乳濁
液が生じる。水溶性のラジカル性開始剤を加えることに
」こり、適当な温度で重合を開始させる。生じるラテッ
クスは乳化剤の存在下で極めて安定である、それという
のも各々の粒子はイオン化されたセッケン分子の層で包
囲され、ひいては凝集から保護されるからである。しか
し、包囲せる層により、ラテックス粒子は本来の重合体
とは全く別の特性を呈することになる。

古典的系の欠点は、一部分いわゆる乳化剤不合の乳化重
合によって回避される。この重合は、乳化剤を含有せず
、ひいては著しく純粋である７テソクスをもたらす。こ
のようなラテックスは例えばポリテトラフルオロエチＩ
／ン、ポリスチレン、ポリビニルアセテート、ポリカル
丁キンスチレンから製造される４、安定なラテックスは
・特、にイオノゲンフ１晴体の重合において生成し、こ
の場合イオノゲン基は粒子表面に、乳化剤の役割を演じ
るように配置される４、 しかし、免疫学的目的のだめにｄｌ、前記の中量体は特
に不適当である。それというのも生物学及び／又は免疫
学的活性物質とのカップリングを可能にする活性基の導
入に費用がががりかつ困（※１［であるからである。従
って、欧州時ｗ［磯購！持許公開明卸１ｓ第５４６８５
号に基づく親水性ラテックス粒子が開発された、該粒子
は筒中に生物学及び／又は免疫学的活性蛋白質に結合す
ることができ、しかもその際に結合され／ζ物質の構造
及びラテックスの安定台は分解されなイ、、親水性のラ
テックス粒子は、エポキン基ヲ含有する単量体を場合に
より別の粒子特性に所望の方向で作用する中量体と水溶
性開始剤の存在下に但し乳化剤又は安定剤を添加せずに
重合させることによる乳化重合によって得られる３゜粒
子特性に作用する伺加的な単量体としては、例えば色素
又は螢光化合物の中量体の重合可能な誘導体を使用する
ことができる。この場合、色素又は螢光化合物でマーキ
ングされた親水ＩＩＡニラテックス粒子が得られる。

免疫学において使用するだめの有色ないしは螢光ラテッ
クス粒子を製造するためのもう１つの可能性は、例えば
米国特許第４．１０８．９７２号明細書に記載されてい
るように、既製のラテックス粒子を色素又は螢光化合物
の反応＋′１１誘導体と反応させることから成る３゜ 前記の両者の方法は以下の共通の欠点を有している。色
素又は螢光化合物の反応性誘導体を多々にして煩雑な方
法によって合成することが無条件に必要である。更に、
米国特許第４，１０８、９７２号明細書記載の方法では
、色素又は螢光化合物の反応性誘導体の反応は殆んど専
ら粒子の表面で行なわれる、即ち元来生物学及び／又は
免疫学的活性物質とのカッシリングのためにＪうえられ
た粒子の反応性基との反応が起るごこの場合には、反応
性のかつ酸も容易に接近しゃ−すい基がまず色素ないし
は螢光化合物と反（ＨＨ。

し、従って生物学及び／又は免疫学的活性蛋白７１の所
１υ１のカッシリングの／ζ、めには低反応性のか゛つ
得難い基かのこされるにすぎないということが特に不利
に作用する１−１更に、置換度が高ければカップリング
のだめに供与される表面の自由部分が著しく少なくなる
。従って、乳化剤不含の乳化重合の利点は失わ、１する
。

色素又は螢光化合物でマーキングされる反応性の親水性
ラテックス粒子を製造するだめの公知方法の前記欠点口
１、本発明Ｊｊ法に基づき回避される。

本発明では、色素又は螢光化合・物でマーキングされた
反応性の親水性ラテックス粒子を製造する方法が提供さ
れ、該方法は水に難溶性の１種の単量体又は水に難溶性
の単眼体の混合物を色素又は螢光化合物の存在下に重合
又は共重合させることを特徴とする。重合は水性分散液
中で水素の遮断下に水溶性のラジカル形成開始剤を用い
て、但し乳化剤又は安定剤を添加せｒに乳化法に基づい
て実施する。

水に離溶性の単量体としては、分子内に少なくとも１個
のＣ＝Ｃ二重結合を含有するエポキシ化合物が有利に使
用される。特にエポキンアルキレン化合物、ブリッジル
エステル又はグリシジルエーテル、例えばグリシジルア
クリレート、グリシジルメタクリレート、グリシジルビ
ニルエーテル、グリシジルビニルフタレート、３．４−
エポキシ化合物−１が有利である。本発明方法では、特
定のエポキシ単量体或はまた種々のエポキシ単量体の混
合物を利用することができる。単量体相中のエポキシ化
合物の濃度は１〜１００重量係であることができる。

エポキシ基の含量並びにまだその他の化学的及び物理的
特性は、有利に別の単眼体例えばスチレン、ジエン、ア
クリルアミド、メタクリルアミド、アルキル−、ヒドロ
キシアルギル−及びアミノアルキルアクリレート又は−
メタクリレート、ビニルエーテル、ビニルエステル、Ｎ
−ビニルピロリドン、メタクリル−又はアクリルアルデ
ヒドを添加することによって制御することができる。

大抵の場合、特に強親水性コモノマーが存在する場合に
は、生成するラテックス粒子の水又は有機溶剤中の溶解
度を低下させる必要がある。

このことは重合混合物に通常のジビニル系架橋剤１例え
ばアルキレン−又（ｌよヒドロキシアルキレンアクリレ
−１・又は−メタクリレート、アルキレノビスアクリル
−又は−メタクリルアミド、ジビニルベンゼンを添加す
ることにより達成することができる。

色素及び螢光化合物は、重合混合物に有利には０．０５
〜１重量係の量で加える。本発明では、フルオレセイン
、ローザミン、ローダミン、クマリン、アクリジン及び
同種の化合物が特に有利である。

開始剤としては、乳化重合のだめに通常使用される水溶
性開始剤の全てのものを使用することができる。本発明
では、ベルオキソジスルフエート、啄ルオキソボレート
、過酸化水素又はイオノゲンの２，２′−アゾジイソブ
チロニトリル誘導体を０５〜１．５．９　／　ｌの濃度
で使用するのが有利である。

色素又は螢光化合物でマーキングされた反応・性の親水
性ラテックス粒子を製造するだめの本滲明方法は、９気
酸素に対して極めて敏感である。従って、酸素は極めて
慎重に全型合成物及び容器から十分な煮沸、不活性雰囲
下での蒸留又は窒素、アルゴン又はその他の不活性ガス
の導入により除去することができる。

重合は本発明では有利に水及び単量体相間の容量に対す
るフロート比８：１〜１６：１で実施する。温度は０〜
８０℃、有利には６０〜８０　’Ｇの範囲にかつ反応時
間は５〜４０時間の範囲に選択する、この場合面パラメ
ータは選択された開始剤に左右される。

本発明で製造される反応性の親水性ラテンクス粒子は、
厳密な意味において球状の単分散性の細分された、相互
にほぼ同じ友きさの、直径約０２〜１．５１１ｍを有す
る粒子である。、有色のないしは螢光を発するラテック
ス粒子は１、乳化重合の終了後になお未重合単量体、色
素又は螢光化合物の残留分を含有することがあり、これ
らは水蒸気蒸留、透析又は数回の遠心分離及びデカンテ
ーションによって排除することができる。ラテックス粒
子の純ＩＷは、有利に透析又は廃水のフルオレセン検査
によって追跡することができる。

色素ないし°は螢光化合物の導入は、水相内ではセッケ
ンに似た、螢光を発する分子で終結されたオリゴマーの
放出下に並びに有機ミセル川内で行なうことができる。

両者の工程の比率は水と有機相との間の色素ないしは螢
光化合物の分配係数及び両相間の拡散速度に左右される
。

一方ないしは他方の川内での色素ないしは螢光化合物の
溶解性は、主としてその化学的構造によって規定される
。

本発明で使用する色素ないしは螢光化合物としては、大
体において芳香族物質、例えば一般に高い移動定数を有
するフェノールが該当する。

溶解特性は簡単な化学的変換によって調節することがで
きる。最後に、中間相輸送は相−トランスファー触媒で
高めることもできる。

ラテックスの末端位の遊離エボキン基は高反応性である
。これらは容易に自体公知の反応によって別の反応性基
、即ち生物学及び／又は免疫学的に活性蛋白質とカップ
リングさせるために一層適当である別の反応性基に変換
さ丑ることができる。これらの反応においては、ラテッ
クス粒子の色及び螢光特性は一般に失われない。

次に実施例で本発明方法を詳細に説明する３、例　　１ グリシジルメタクリレ−１・２（ｌにフルオレセイン１
０７１ｇを溶かしかつ窒素を貫通させることにより空気
酸素を除去する。煮沸し、窒素を貫通させ々から冷却し
た蒸留水２００ｍ６中に。

３．３′−アゾビス（３−シアノブタンナトリウムース
ルホナン）０．’４ｇを溶かす。両者の成分をガラス反
応器に入れかつ更に１０分間窒素で処理する。次いで、
反応器を密閉しかつ激しく攪Ｖ１゛シなから（５００ｒ
ｐｍ）　７５℃（７）　昌’ｆ　ｆ　２牛時間反応の実
施する４、この時間後、反応率は９５％である３１反応
生成物は、黄色に着色されておりかつｔ、＋　Ｖ赤白で
発光する１求状のｒ（＋分散べｌ子である。、これらは
直径５００　［＋１１１を有寸−る、。

重合体はポリグリンジルメタクリレ−１，１、ｑ　中に
フルオレセイン０．０５　、！７　を含有ｔＪ、、例　
　２ 例１記載と同様にして、３．δ′−アゾビス（δ−ンア
ノブタンーナトリウｌ、スルポナ篤ン）０．４．９を溶
かした蒸留水２００フ１ｅと、フルオレセイン１１０ｌ
１１及びセチルトリメチルーツ′ンモニウムクロリドを
溶かしたプリンノルメタクリレート１５重［’ｆｔ％及
びメチｌノン８５　屯Ｍ　％から成る混合物２０ｇとか
ら別々に酸素を除去する。、／ＩＬ合後に、反応混合物
を激しく混合しなから７５°Ｃの温度で２４時間反応さ
せる３、重合していない残留単量体を水蒸気蒸留によっ
て除去する。

生成した単分散共重合体粒子は直径２５０ｎｍを有する
。これらはＵ　Ｖ赤白で黄緑色の螢光を発する。クルオ
レセインの濃度は０．０３ｍ！ｌ／／重合体１ｇである
３゜ 例　　３ 例１記載と同様にして、蒸留水２００．７１／！中の３
．３′−アノビス（３−ンアノブタンーナＩＳリウムー
スルホナン）　０．３．９のＭ液、！：、ｙルＡレセン
ｌ　Ｑ　＋７１９を溶かしたグリシジルメタクリレ−１
・１５重州係及びビニルアセデー１−８５ｉｉ飴から成
る混合物２０＆から酸素を除去しかつ相互に反応させる
。、実施例１記載の重合条件下で、反応率は８０％であ
る。このラテックスは直径２００ｎｍを有する単分散性
球状粒子から成る。

フルオレ士イン含量は０．０２　ｍｙ　／重合体］−、
９である１゜ 例　　４ 例１記載と同様にして、蒸留水２　ＯＱ　ｍｅ中の３．
３′−アノビス（３−シアノブタン−ナトすウムースル
ホナン）０．４ｇの溶液と、グリシジルメタクリレ−１
・１５重合係及び１ソプレン８５重量係の混合物２０ｇ
とをフルオレセイン］−ｏ　：ｎ’；ｔ　及びセチルト
リメデルアンモニウム・ゾロミ暑’１０ｍ！？と温度７
５°Ｃで２４時間反応させる１、この反応率は７５％で
ある。引ｊイ５き、残留単量体を水蒸気蒸留によって除
去する。安定なラテックスは黄緑色の螢光を発しかつ直
径２５０　ｎｍを有する栄分散性の細分された球状粒子
を含有する。

例　　５ 例１記載と同様にして、蒸留水２０Ｏｒｄ中の３．３′
−アゾビス（３−シアンブタン−ナトリウムースルホナ
ン）　０．４　ｇト、クマリンＩ　Ｑ　＋７１９を有す
るグリシジルメタクリ−１−２０、！７とから別々に酸
素を除去する。混合した後、反応混合物を激しく攪拌し
ながら温度７５℃で２５時間重合させる。残留乍量体及
びその池の低分子−量物質を透析で除去する。この反応
率は９６％である。得られたラテックスはＵ光赤白青色
の螢光を発しかつ直径５２０ｎｍ　　を有する単分散性
の細分された球状粒子を含有する。クマリンの含量は０
０４ｍｇ／重合体１ｇである。

引続き、この乳濁液１００ｍ１にアンモニア溶液（２５
％）１００ｍ／を加えかつ室温で２４時間放置する。こ
の際に、エポキシ基はアンモノリスによってアミン基に
換変される。ラテックスのその他の全ての特性はそのま
まである。この変性ラテックスはクマリン０．０３　ｍ
９／重合体１ｇを含有する。

例　　６ 例１記載と同様にして、蒸留水２００　舒中の３．３′
−アゾビス（３−シアノブタンーナトリウムースルホナ
ン）０．４ｇと、エチレンジメタクリレート１ｇ、ロー
ダミンＢ１ｏｍｙ及びＦデシルトリメチルアンモニウム
・クロリド２０ｍ９を有するグリシジルメタクリレート
２０ｇとから別々に空気酸素を除去する。混合後、その
反応混合物を激しく攪拌しながら温度７５℃で１２時間
反応させる。未反応単量体及びその他の低分子量物質を
加圧濾過により除去する。この反応率は９６％である。

単分散性のかつＵＶ光赤白螢光を発する粒子は直径５０
０ｎｍを有する。

ローダミンＢ＠量は００３！ｎ９／重合体１ｇである。

この乳濁ＨＩ　ＯＱ　ｍ１３に０．０５モル／ｌの硫酸
１００ｍ１を加えかつ引続き３時間８０℃に加熱する。

この際に、エポキシ基は隣位のヒドロキシ基に変換され
る。粒子の大きさはそのままである。１％のソーダ溶液
に対して透析させた後、粒子はローダミンＢ０．０３ｒ
ｎｇ／重合体１ｇノ１ｌｊ１度に相当する螢光を発する
。

次いで、加水分解されたラテックス１００ｍ１を、０１
モル／ｌの過沃素酸溶液２００　ｍｌで攪拌しながら室
温で２４時間処理する。乾式濾過により、容量を１００
ｉ７１１に減らす。こうして得られだラテ８ツクス粒子
はアルデヒド基４重般係を含有する。この螢光はローダ
ミンＢ０．０１ｍ９フ重、合体１ｇの濃度に相当する。

例　　７ 例１記−載の同様に、蒸留水３００ｍ１　、及びクマリ
ンとホルムアルデヒド及びドデシルアミンとの縮合生成
物１５ｍｇを溶かしたジビニルベンゼン０．５ｇを有す
るグリシジルメタクリレート２０ｇ中の３，３′−アゾ
ビス（３−ンアノブタンスルポン醒）の溶液から空気酸
素を除去する。

混合後、反応混合物を温度７５°Ｃで２４時間重合させ
る。未重合単量体成分及びその他の低分子量物質を加圧
濾過によって除去する。ラテックスは直径５００ｎｍを
有する乍分散性の球状粒子を含有しかつ青色の螢光を発
する。

例　　８ ＨＮＨ２ 例１に基づいて製造したかつフルオレセイン０．０５ｍ
９／重合体ｌ、９を含有するラテックスに同じ容にの１
５％のアンモニア溶液を加えかつ室温で２４時間放４す
る。次いで、透析しかつｐｔ（値をＰＩ＋８に調整する
。フルオレセイン１ｏ；ｒｖ及’ｏ：ホル・ムアルデヒ
ド（３７％）０．５ｍ６を加える。−１一定の攪拌下に
、混合物を室温で更に２４時間保持する３、次いで、１
％のソーダ溶液に対して透析する。得られた変性ラテッ
クスは直径５００Ｉ］１７１を有する乍分散性の細分さ
れた球状粒子から成る。これはフル第１／セイン１０ｍ
ｇ／重合体１ｇを含有する。

第１頁の続き ０発　明　者　イリ・ラブスキー チェツコスロヴアキア国プラー グ６す・ヴイピフ１９５６−２８ ０発　明　者　工ヴア・ヅルコヴア チェツコスロヴアキア国プラー グ４イエレメンコーヴア６２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■８色素又は螢光化合物でマーキングされた反応性の親
   水性ラテックス粒子を製造する方法において、水に難溶
   性の１種の中量体又は水に難溶性の種々の狛黄体を色素
   又は螢光化合物と一緒に水中に分散させかつ酸素の遮断
   下にラジカルを形成する水溶性の開始剤の存在下に、但
   し乳化剤又は安定剤を添加せずに乳化重合によって一成
   分重合又は共重合させることを特徴とする、色素又は螢
   光化合物でマーキングされた反応性の親水性ラテックス
   粒子の製法。 ２、　水に離溶性のｉｌ−ｉ体として、少なくとも１種
   の（４す重合可能なＣ＝＝Ｃ二重結合を含有するエポキ
   シ化合物を特徴する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　エポキシ化合物として、３，４−エボキシゾテン
   −１、グリシジルビニルエーテル、グリシジルビニルフ
   タレート、グリンジルアクリレート又はグリシツルメタ
   クリレートを特徴する特許請求の範囲第２項記載の方法
   ３゜牛、乳化重合をジビニル系架橋剤を添加して実施す
   る、特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記
   載の方法。 ５、　色素又は螢光化合物として、フルオレセイン、ロ
   ーダミン、ローダミン、クマリン又ハアクリジンないし
   は該ｒヒ合物の誘導体を特徴する特許請求の範囲第１項
   〜第牛項の、いずれか１項に記載の方法。 ６、水相と有機相との間の色素又は螢光化合物の分配係
   数及び拡散速度を相−１・ランスファー触媒によって変
   化させる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、色素又は螢光化合物の濃度が０．０５〜１重量％で
   ある、特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に
   記載の方法。 ８　乳化重合の際にフロート比が容量に対して８：１〜
   ｌ　６　：　］、である、！特許請求の範囲第１項〜第
   ７項のいずれか］項に記載の方法。３９　開始剤濃度が
   ０．５〜１．５　ｇ／’　ｌである、特許請求の範囲第
   １項〜第８頃のいずれか１項に記載の方法。 １０　　単量体相中のエポキシ化合物の濃度が１〜１０
   ０重量係である。特許請求の範囲第１項〜第９項のいず
   Ｊｌか１項に記載の方法。 １１　　乳化重合を０〜８０℃の温度範囲で５〜４０時
   間実施する、特許請求の範囲第１項〜第１０項のいずれ
   か１項に記載の方法。