JPS59501047A

JPS59501047A - Ｄｎａ検出に基づく悪性腫瘍の高感度試験

Info

Publication number: JPS59501047A
Application number: JP58502498A
Authority: JP
Inventors: ゴツトリ−ブ・エイ・ア−サ−
Original assignee: イムレツグ，インコ−ポレ−テツド
Priority date: 1982-06-17
Filing date: 1983-06-17
Publication date: 1984-06-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はヒト及び動物のいくつかの悪性腫瘍の有無の改良試験法に関する。さら沈具体的には数種のリンパ性悪性腫瘍（白血病）の診断を可能にする態様全開本発明者は、ある種の悪性腫瘍を持つマウス又はヒトから集めた血清やその他の体液は、ＤＮＡポリメラーゼとして知られている酵素群のいくつかを選択的に阻害する能力を有する、いくつかの特異な２本鎖ＤＮＡ分子を含有することを見出した。これらのＤＮＡ分子は、これらの悪性腫瘍を持たないマウスやヒトには存在しない、本発明者は他の者と共に、この発見事実とこれらのＤＮＡ　’ｉ関連情報と共に、一連の文献に発表してきた。

それらは　Ｐｅｒｉｓｃｏ　ａｎｄ　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、骨髄腫のＤＮＡポリメラーゼＮａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　ＢＩＯＩＯｇｙ　２３９°１７３−７６（１９７２）　；　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｐｌｅｓｃｉａ、　Ｐｅｒｉｓｃｏ。

ａｎｄ　Ｎ１ｃｈｏｌｓｏｎ、　ＤＮＡポリメラーゼのインヒビター。

Ｎａｔｕｒｅ　２４６　：　４８０　８２　（１９７３）　；Ｇｏｔｔｌ、ｉｅｂ。

Ｓｍ１ｔｈ、　Ｐｌｅｓｃｉａ、　Ｎ１ｃｈｏｌｓｏｎ、　Ｂｏｗｅｒｓ、　Ｐａｎｋｕｓｈ、　ａｎｄＢｅｒｋｏｃ＋ｅｎ　、新生物の基礎（Ｆｕｎｄ、ａｍｅｎｔａ−Ｉ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆＮｅｏｐｌ、ａｓｌａ　）＋第２０１章、ｌ１ｌ）、２６９−７７　（１９７５）中のＤＮＡポリメラーゼのインヒビター；　Ｇｏｔｔｌｌｅｂ。

０ｏｔｔ１．ｊ、ｅｂ、　ａｎｄ　Ｎ＋、ｃｈｏｌｓｏｎ、　Ｂ＋、ｂｌｉｏｔｈｅｃａ、　Ｈａｅｍａ−ｔｏｌｏｇｉｃａ。

Ｄ（＋１．Ａポリメラーゼの単離への不溶性へバリンの使用。

Ａｎａｉｙｌｃａｌ　Ｂ１ｏｃｈｅｍ＋、５ｔｒｙ　８７　：　４１１−１７　（１９７８）ニア５８−７０（１９８０）を参照。これらのＤＮＡはここでは捷とめてｒ　ＤＮＡ　Ｌ　Ｊと呼ぶ。

ＤＮＡ−ｒ、ｎ塩ｔ＝対カ１５０−３００　ｏｘ”Ｇ囲（７）　ＤＮＡ分子の混合物である。これらのＤＮＡ分子はどれも、Ｒ−１ＤＮＡポリメラーゼを選択的に阻害することができる。本発明者はこれらのＤＮＡ分子をクロマトグラフィー法で分離できるＤＮＡ−１とＤＮＡ　−２の２つの群に分けた。

類似のＤＮＡ分子は正常の肝臓から抽出できるが、正常血清からは抽出できない。正常血清にはこれらのＤＮＡが存在せず、白血病患者の血清に存在する。前記のＤＮＡ−Ｌ分子は全てクローン１ヒすることが可能で、ここに記載する試験法に使用することができる。

ここでは主に関係のある２群のＤＮＡ、−Ｌ分子があり、各分子はまだ数は決められていないが限定された数の異なる分子を含ひ。ここでは主に関係のあるＤＮＡ　ｉｒ　ＤＮＡ〜１」と［ＤＮＡ　−２Ｊと呼ぶ。これらのＤＮＡは白血病細胞の複製に重要な役割を果たすがもしれないと考えられている。ＤＮＡ　−１とＤＮＡ　２　？″ｉｉ共通要な性質を有する。

ＤＮＡ　−１及びＤＮＡ−２は共に、不ズミ骨髄・隼に見出され他の凍傷や正常組権ＩＣも存在しうるＲ　−Ｉ　ＤＮＡポリメラーゼを選択的に１阻害することが証明されている。

（この酵素や他のポリメラーゼを無差別に阻害する他のＤＮＡが存在する可能性があるという意味で、この阻害１″ｊ：「選択的」である。このＤＮＡはＲ−１ＤＮＡポリメラーゼ全阻害するが、他恍知られているポリメラーゼは阻害しない。）　Ｒ−１ＤＮＡポリメラーゼはＡｎａｌ、ｙｔｉｃＢｘｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　８７　：　４１１−１７　（１９７８）　（前記）に記載された方法により、不ズミのＭＯＰＣ−２１骨髄腫から回収できる。この酵素はヒト及び不ズミより得た目的のＤＮＡと反応するので、この酵素が不ズミより得られるという事実 ″は重要ではない。

骨槌倹腎のような、現在の白血病の試、験は患者にとって不快である。又その感度は大量の癌細胞の存在全検出するのに限られ、白血病の早期発見は難かしい。

不発明の方法はＢｏｇｏｃｈ、悪性腫瘍細胞の検出、米国特許第４，２９８，５９０号（１９８１年１１月６日）の方法とは異なり、抗体産生は含まない。ここではそのような手間のかかる間接的な測定方法は使用しない。

発　明　の　要　約本発明の方法は、体液中に相当量存在することは悪性１挿瘍細胞の増殖に関係のある、従って体内に悪性腫瘍細胞が存在することを示すＤＩ（Ａの有無全測定する。

それには既知量のそのような癌ＤＮＡ　’ｉｚ競合物（時にｒ　１）ＮＡ、プローブ」と呼はれろ）として、癌ＤＮＡ　２含有すると思われる媒体を起こりうるであろう「競合的結合」をさくで試１験をする。以下に記載する媒体は血清であるが、これは取り扱いが便利であり、入手し易いことから本発明者が好んで使用する媒体である。しかし他の媒体、たとえば腹水やリンパ液もここに記載する％　ＤＮ、Ａをきんで変り、また類似の関係を有する他の癌ＤＮＡ　ｉ含んでいるかもしれない。脳を髄液、十二指腸液、胃液、胸水、尿、唾液、他の粘性分泌液、及び他の体液も類似のＤＮＡ　”ｆ：含有しているかもしれない。

本試験方法においては、癌ＤＮＡについて検ｉｔべき血清を既知量の「標識」癌ＤＮＡ　（ＤＮＡプローブ）と混合させる。この混合液を、以下［酵素結合マ）　ＩＪソクス」として記載するものに導入する。このマトリックスは癌ＤＮＡと結合するが、混在する他の種類のＤＮＡや、他の物質には結合しない。次に酵素結合マトリックスに結合した標識ＤＮＡ　（ＤＮＡプローブ）の量、又は試験混合液の残液に残った標識ＤＮＡの量を測定する。

酵素結合マトリックスに結合した標識ＤＮＡが比較的少ない場合、それは被験血清中の標識していない類似のＤＮＡが、酵素結合マトリックスの酵素部位に対し競合し、標識ＤＮＡ　ｉここから排除したためである。酵素結合マ）　ＩＪラックス結合した標識ＤＮＡが比較的多い場合、それは標識ＤＮＡに類イｖの競合すべき非標識ＤＮＡが血清中に存在せず、酵素結合マトリックスの結合部位から標識ＤＮＡ　’ｉ排除しないためである。

本発明の主な有用性は、白血病又は再発が早期発見でき、寛快しているか否かを測定できる感度の高い試験方法が発見されたことにある。この方法は非常に感度が高く、−匹のマウス中のわずか２５０個の悪性腫瘍細胞を検出できる、すなわちこれを延長して血液と体重を基礎にして考えると、−人の人間の約７５０，０００個の悪性腫瘍細胞を検出できると考えられる。後者の数字全代表的なヒトの血流中の約４．５　Ｘ　１０１０個の細胞と比較すると、本試験は約１００万分の１５を検出できる。これに対して現在の白血病の試験は、体内に約ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ個の悪性腫瘍細胞、すなわち約１００万分の２２０が生成した場合にのみ白血病を検出することが可能であると考えられる。

白血病のような悪性腫瘍の早期発見を可能にするより高感度の試験が好ましい理由はいくつかある。第１に治療を早く開始することは患者の体に害を与えることが少なり、捷たおそらく患者の生存率を上昇させるであろうと考えられている。

しかしそのような衰弱させるような療法の前に早期診断が必要である。第２に白血病は非常に危険な病気である。単核細胞増加症はその症状が似ているためにしばしば白血病と混同される。白血病の疑いがあるという診ｉ祈が、若い７を者やその両親に与える重大な精神的悪影響のため、単核細胞増加症の場合はただちに白血病でないという診断を得ることが重要である。

本発明の方法は現存の方法と比較すると、より費用が安く、より便利であり、患者に対しより不快感は少なく、より大規模なスクリーニングに適しており、同一の患者でしばしば検査するのにより実用的である。

この意味において、本発明者の好んで使用する「白血病」の意味はＭＣＤＶ’　１２やＬ１２１１のような°ネズミの白血病だけでなく、ヒト又は動物のリンパ系の多発性骨髄腫やその他の悪性腫瘍を含む。従って以下「白血病」の意味をこのように解して読んでもらいたい。

好適な態様の詳細な説明本発明の方法は、特定のＤ１執に関連した悪性腫瘍（たとえば白血病）の有無の、新しい改良された検査方法である。白血病の場合はこのＤＮＡはＤＮＡ、−Ｌである。

本発明者は、他の悪性腫瘍に同様に関係のある他のＤＮＡもあり得るし、それらも同じような試験方法が適用できるかもしれないと考えている。

■　試料の調製本発明の白血病試１験の最初の段階は、試験材料から血液（又は他の体液）を取り、遠心分離により（血液の場合は）血球を除去して血清を調製し、そこから試料を調製することである。そのために体液試料全７゜多硫酸アンモニウムで処理して、試料中の蛋白を全て沈澱させる。沈澱物は捨て上澄液は取っておく。この上澄液を遠心分離と透析によって十分精製し得られた透き通った液体が「試°料」である。

例１−試料研究室のマウスから血清をＱ、５ｍ１手忙入れる。特級（ＡＣ８Ｒｅｏｇｅｎｔ　Ｇｒｏｄｅ　）　（ＮＨ４）２ＳＯ４飽和水溶液を、最終濃度が７０％（ＮＨ４）２ＳＯ４になるまで試料に滴下して加える。こうして得られる蛋白の沈澱で勿は１，７００ｇで１０分間遠心分離して取り除き捨てる。こうして上清約１ｍｌが得られる。この上清は分子量１２，０００の透析袋に入れて、０．０１　Ｍ　トリスＨＣＪｔ緩衝液（ｐＨ７，８）に対して４°Ｃで一晩透析する。こうして透析袋の中に残っている物質が試料である。

例１の試料を直接試験してもよいが、この試料をさらに下記の例８Ｂに記載する「精製用マトリックス」で精製する方が好ましいと本発明者は考える。

１１　ＤＮＡ−Ｌの調製本発明者はＤＮＡ−Ｌの抽出方法をＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ４０ニア５８（１９８０）（上記）で一般的に記載した。ＤＮＡ−Ｌは、ＤＮＡの混合物である。ＤＮＡ　−１とＤＮＡ　−２のＤＮＡ−Ｌ混合物を用いてここに記載した試験を行なうことも可能でるる。この方法では既知の変わりうる比率のＤＮＡ　 −１とＤＮＡ　−２よりなる混合物を使用する必要がある。従って本発明者はＤＮｐ、　−１とＤＮＡ−２を互いに分離できる光学的方法を開発した。又不発明者は、ＤＮＡ−Ｌ群内の個々のＤＮＡのクローンを得る方法も開発した。

このＤＮＡ＝１とＤＮＡ　−２の分離方法では、白血病又は骨髄腫を持つことがわがっているヒト又は動物から取り例１の方法で調製した、ヒト又はイ・ズミの試料を連続的クロマトグラフィーにかける。このクロマトグラフィーは、酵素の結合した酵素結合マトリックスで行なう。この−例はアガロースが基材〈なったケ８ル状の物質で、ここに酵素か共有結合で安定尾結合しており、そのため再使用することも可能である。もうひとつの例は小球である。両例共恍以下に記載する。

社）に記載されている。樹脂（・ま目的の酵素が結合できるものでなければならない。ファルマンア社の製品であるＣＮＢｒ−セファロースはＲ−ｉ　ＤＮＡポリメラーゼに適していることがわかっており、本発明者はそのようなマトリックスを調製する方法を開発した。Ｒ−１ＤＮＡポリメラーゼがマトリックスに結合しているような酵素結合マトリックスの調製方法については発表された方法又は公知の方法はこれまでは存在しなかった。

下記の方法はいくつかの重要、な点で、前に引用した９一般的な方法とは異なる。下記の方法や試験に有効に使用できる（すなわち再現性のある確天な結果の得られる）セファロ−スケ゛ル酵素結合マトリックスを調製するＫは、酵素結合マトリックスを、ＤＮＡ、たとえばアルカリ変性したサケの精子のＤＮＡ　（ミ’）ボア社）ｋ含有する緩衝液で前処理することが重要、あるいはおそらく必要であること全本発明者は見出した。このように処理したマトリックスを緩衝液で洗う。もしこのＤＮＡによる前処理を実施しない場合は、このセファロ−スケゝル酵素結合マトリックスはＤＮＡ−Ｌと特異的に結合しなくなり、正確な結果は得られないであろう。

ＤＮＡ−Ｌに対し選択的親和性を有する結合部位とは異なり、ＤＮＡに対し一般的又は非選択的親和性を有する酵素結合マトリックス上の結合部位は、この前処理によってふさがれ以下の操作に関与しなくなると考えられる。

このようなマトリックスに関連してこのような前処理を案施することは先行技術には見出されないと考えられる。セファロースに結合した酵素についてのみこの処理の必要性を記載したが、例６Ａの酵素結合ビーズや、その他の醇素結合マ）　ｌ）ノクスについても、この処理が必要か又は好ましいことが証明されると思われる。

例２−　ＤＮＡ　−’ｌとＤＮＡ　−２の精製混合液の調製骨髄腫ＭＯＰＣ−２１ｋ持つ近文系マウスから取ったプール血清から、例１の試料を便利な量だけ（２ｊｎｌ　）１０　特ｌ！Ｉ唱９−５＠１０４７（５）調製し、例１の最後の透析ｖｈとに、ｏ、ｏ　Ｉ　Ｍ　トリス・ＨＣＪ緩衝液（ｐＨ７−８）中３０％のポリエチレングリコールに対して濃縮する。こうして得られる溶液金、０．０１　Ｍ　トリス・Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ７，８）中ＫＣ１の０から１．０　Ｍまでの直偶的濃厳勾配を用いてＤＥＡＥ−セルロース（ワットマフ社）でクロマトグラフイーケしてさらに精製する。ＤＮＡ　ｉ”；ｔ、　０．４５　Ｍ　ＫＣｆで溶出し、溶出画分はポリエチレングリコールに対して透析して濃縮する。

こうして得られるＤＮＡ調製液をリン酸ナトリウム緩衝液（、ｐＨ７，０）中で０．４Ｍに調製し、６８℃で１６分処理して加熱忙よる不活性化を行なう。蒸留水會加えてり／酸塩一度を０．１４ＭＫ調製し、混合液をｉ　ｒｔｒｌのヒドロキシアパタイト（ＤＮＡグレード、Ｂ１６−Ｂａａ　Ｌａｂｓ）忙かけろ。このカラムはあらかじめ０．０１　Ｍのリン酸ナトＩＪウム緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化させ、５分煮沸し、６’８”ＯＫ保っておく。ＤＮＡ混合液をカラムにのせてから、重力により液を流出させ、過剰の液全捨てる。

次に０．１４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　６．０ｍｌ　ｆ注意深くカラムにのせ、液を流出させる。

次に０．４’Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ（７−０）　８．０ｍ、ｌを注意深くカラムにのせて、目的の２本鎖ＤＮＡ　’ｅカラムから溶出させる。こうして得られる２本鎖ＤＮＡの精製混合ｔｊ、全［混合Ｉ）ＮＡ−Ｌ　Ｊ又はｒ　ＤＮＡ−Ｌ混合液」と例２Ａ−同様の調製（ＭＣＤＶ−１２）例２の操作を、白血球ＭｃＤｖ−１，２ｆｒ：持つマウスで繰返す。

例２Ｂ−何様の調製（Ｌ　−１，２１１）例２の操作を白血病Ｌ　−１１２’ｉ　ｉ　ｋ持つマウスで繰（プールしたＭＯＰＣ２１，ＭＣＤＶ−１２，Ｌ−１γ ′ｉ）骨髄腫ＭＯＰＣ−２１、白血病′：ＡＣＤ■−１２、白血病ニー１２１１にそれぞれ持つマウスから取った血清で例２の操作を繰返すことにより、ＤＮＡ −Ｌ　９合１夜が各白血病を代表することになる。

ＤＮＡ−Ｌ混合液を酵素結合マ）　ＩＪンクスで分画することによシＤＮ／ｌ− −１とＤＩ執−２が分離されさら妃精製される。これはＲ−Ｉ　ＤＮＡポリメラーゼが共有結合した不溶性セファロース（ファルマ／ア社）マトリックスである。これは原方法であるＡｘｅｎ、　Ｐｏｒａｔｈ、　ａｎｄＥｒｎｂａｃｋのハロケゞン化／アンを用いるペプチドと蛋白の多糖類への化′合結合、Ｎａもｕｒｅ２１４：１３０２−ｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｃｌ、ｓ　）　（ファル７ンア社）に記載されている一般的な方法を、この場合の特殊条件拠金うように若干変更した方法により調製できる。セファロースのような親和性マトリックスのかわりに下記の様な他の不溶性マトリックスを用いることもできる。たとえばガラスピーズ、セラミックス、ンリカなどを酵素反応の酵素の支持体として使用することは公知である。

酵素結合マトリックスはまた、下記の如（ＤＮＡ−Ｌと特異的に結合できるように前処理をしなければならない。

例ろ一酵素結合マトリックスの調製１．９のＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社）をガラスフィルター上０．００１　Ｍ　ＨＣＪ中で膨潤させ、２００　ｊｎｌの０．０１］　ｊ　Ｍ　ＨＣＪ、で１５分間洗浄する。

こうして得られるケゞルをＱ、１Ｍ　Ｎａ、ＨＣＯ３（ｐ）ｌ　ａ、６）で洗い、次に０　、５　Ｍ　ＮａＣＪ、’ｆ：含有する０、１　Ｍ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８−３）で洗う。次にこのゲルを０．５　Ｍ　Ｎａ−’Ｊ、ｆ含有する０、１　ＭＮａＨＣＯ３（ＰＨｔＥＬ３　）　３．５　ｍ１ＩＣ浮遊させる。次に精製したＲ　−ｉ　’ＤＮＡポリメラーゼ（０，００１ＭのＤＴＴ　（ジチオスレイトール）と２０チの〃゛リセロール含有する加し、混合液をリストアク／ヨ６ン振盪機（ＷｒｉＳｔａＣｔｌＯｎｓｈａ、ｋｅｒ　’）で４°Ｃで１晩振盪する。

次にｔ１５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ　ｆ含有するＯ’、’　ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３（ｐＪ（８−３）でケ９ルを２回洗浄してから、残っている活性基’ｔＩＭトリス・ＨｆＪ緩衝液（ｐＨ８，０）で室温で２時間反応させてブロックする。次に下記の洗浄操作を６回１繰返す。

各洗浄操作は、１　Ｍ　Ｈａｃｋ會含有する０、１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）による洗浄１回と、Ｉ　Ｍ　＋１ａｃｚ’（ｉ＝金含有る０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８゜０）による洗浄１回から成る。

こうして得られたＲ　−１ＤＮＡポリメラーゼを含有するセファロ−スケゝルを、次罠［緩衝液Ａ　ｊ　（０，００５Ｍの２−メルカプトエタノール、０．０［）０１ＭのＭｎｃＪ２　、　Ｑ−０４ＭのＫ（Ｊ　ｉ含有する０、０５４　Ｍのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７，８）　）に浮遊させる。次Ｋ　１　ｒｎｌのミ二カラム沈注ぎ込む。これで酵素結合マトリックスは部用できる。これは４°Ｃで保存すると少なくともろが月は良好な状態にあるので保存してもよい。このマ）　ＩＪックスｉｄ　ｉ　ｍｌ当たり約１０マイクログラムの酵素を含有する。しかし結果は各バッチとと洗炭わシ、正確な酵素含量は定量して確認する必要がある。

例４−ポリビーズ酵素結合マトリックスの調製セファロースケルよりも簡単に使用できてよシ信頼性の高い結果の得られる別の酵素結合マトリックスを、本発明者は開発した。これは表面にカルボキシル基を有するポリビーズ小球（ポリサイエンス社、ＷａｒｒｉｎｇｔｏｎＰａ、）を基材とする。このビーズは「カルボキシル化単分散小球Ｊ　（”　ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ　ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ”）とも呼ばれる。

約０．１グラムのポリビーズ小球（「ビーズ」をリン酸カリウム緩”衝ｅ、（ｐＨ７，２−７，６）中で完全に洗浄する。ビー７ズの濃縮浮遊液約２５マイクロリツトルを、１−エチル−３−６〜ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＣＤＩ　）の５０多溶夜（水溶夜）を１０マイクロリツトルと共に、７５マイクロリツトルの同じリン酸カリウム緩衝液に添加する。混合液を室温（２４°Ｃ）で６０分間反応させる。次に同じリン酸カリウム緩衝液でビーズｆＪ：２回洗浄し、４％グリセロールを含有するこの緩衝液７５マイクロリツトルに再浮遊し、このままの状態で保存しておく。

この保存しておいたビーズの約７５マイクロリツトルを試験管に加える。次に例６に記載Ｉ−たＰＯ４／ＤＴＴ／クリセロール中０．５−１．０マイクログラム／マイクロリツトルの精製Ｐ、　−１ＤＮＡ、ポリメラーゼの２５マイクロリットル全混合液が１００マイクロリツトルになる寸で加える。この混合液は次に４ °Ｃで６０分間反応させる。

次にこの混合液に、１０マイクロリツトルの０．２　Ｍグリシノ（ｐＨ７，６− ８，０）か、又Ｖｉｉｏマイクロリットルの牛血清アルブミン溶液（２０ｍ帥ｌ）ｋゆっくり加え、室温（２４°Ｃ）で６０分間、定期的に攪拌しながら反応させる。次にビーズを［保存緩衝液Ｊ（０，０５ＭトリスｐＨ７，８；　０．００４Ｍベーターメルカゾトエタノール；　０．０４　Ｍ　ＫＣｆ、　０．２　ｍ９７ｍ１牛血清アルフミン；０−０００１　Ｍ　ＭｎＣｊ！２２＋０％グリセロール）で２回洗浄し、保存緩衝液５０マイクロリツトルに再浮遊させる。

これは使用する壕でとっておく。試験に使用する前にビーズは保存緩衝液中０．１チの変性ザケ精子ＤＮＡで洗い、保存緩衝液で軽くすすぐ。これは１は当り約５．０マイクログラムの酵素全含有するが、正確な酵素含量は定量する必要がある。

例５−カラムの前処理とＤＮＡ　−１とＤＮＡ〜２の分離列３のミ二カラムを適当な非ヒト、非イ・ズミＤＮＡ（たとえば４°Ｃでこのカラムに通したアルカリ変性サケ精子ＤＮＡ　（５０”イクログラム／　ｍｌ　）　）　５ｍｌ　テ前処理する。次にこのカラムをｉＱｍｌの緩衝液Ａ、１０ｍ１の緩衝液＋Ｑ、５　Ｍ　Ｋ（Ｊ　、　そして再び１０７ｎｌの緩衝液Ａの順で洗浄する。例２の混合ＤＮＡ、−Ｌ　（ＤＮＡ　−１とｐｂ＋Ａ−２の精製混合液）をカラムに通し、溶出液を２０分間かげてもう一度カラムに通す。

カラムから液を流出させ、５ｍｌの緩衝液Ａでもう一度洗浄し、５ｍｌの直線的ａ度勾配のｘｃｉ　（緩衝液Ａ中０−ＩＭ）でＤＮＡ、−Ｌ混合液を溶出させる。　ＤＮＡ−１はｏ、ｉＭＫｃコ夕で溶出し、ＤＮＡ　−２は０．２２　Ｍ　ＫＣＩで溶出する。勾度勾配による溶出の後ｉ　Ｍ　ＫＣｊ！　ｉ含有する５ｍｌの緩衝液Ａでカラムを洗浄する。（１５ｍｌの緩衝液Ａで洗うことによシカラムを再生すると七ができる。）最初に加えたＤＮＡのうち約４．５係がＤＮＡ−１として、４．６％がＤＮＡ　−２として回収される。

この試験のために生物から抽出した天然のＤＮＡ−Ｌの精製混合液を使用することが可能であるが、本発明者１は純粋のクローン化しｉ”ｃもＤを好んで用いる。これは一度方法が確立すればよりコストが安くより便利である。またクローン化したものは、種々の因子（すなわちＤＮＡ−Ｌ調製液に混在している他のＤＮＡ、　）が混ざる可能性を排除するし、ま１こクローン化ＤＮＡはどの試験においても全く同一なため、科学的にはより好ましい。

従って本発明者はクローニングベクターとしてＰＢＲろ２２プラスミツドを用いろクロー二／グを実施した。

以下の例はＤＩＮＡ−１に関するものではあるが、ＤＮＡ、　−２又はＤＮＡ− Ｌ　混合液のクローン化も本質的には同じである。ここで用いる一般的な方法Ｉｒ１ＢＯｈｌ　、　Ｍａｒｌａｎｓ。

に記載の方法ｖ′ｃ基く。不法は５ｃｈｅ１．ｌｅｒ、　Ｄｌｃｋｅｒｓｏｎ。

Ｂｏｙｅｒ、Ｒｉ、ｇｇｓ、　ａｎｄ、　Ｉｔａｋｕｒａのクローニングに有効な（１９７７）に記載の＝ｌＩ　！ｉＭ　ｍ　Ｚ　Ｂａｍ１に感受性の「リンカ −」を使用する。又はＳａｎｇｅｒ、　Ｃｏｕ、］、ｓｏｎ、　Ｂａ、ｒｒｅｌＪＳｍｊ、ｔｈ　ａｎｄ　Ｒｏｅ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ’ｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ　（１９８０）１４３：１６１−１７８に記載の一本鎖Ｍ１ろファージを用いるクローニング法を使用してもよい。

例６−　ＤＮＡ　−１のクローニングＱ、７　Ｍのトリス・Ｈ”　（ｐＨ７，６）とＱ、１ＭのＭｇＣｌ２より成るリン酸化緩衝液を調製する。この緩衝液１マイクロリツトルに０．０１　ｒｔ　ＡＴＰ　（３，５マイタロリツトル、［Ｊ、Ｏｉ　ＭＤＴＴ　５マイクロリツトル、４．５ｍｙ／ｍｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、ａｎｄ　Ｂ工ｏ１ａｂｓ社）１マイクロリツトルを混合する。次に１マイクロリツトルの水に溶解させたＢａｍ　ＩＪアンーを５０Ｑ　ｎｇ加え、さらに水を加えて容量を１０マイクロリツトルにする。

混合液を６７°Ｃで１時間反応させてから、−２０°Ｃて凍結保存する。この混合液を「リン酸化Ｂａｎ　ＩＪンカ−」又は［ＰＢＭ　Ｊ　と呼ふ。

０．００７１ＡＭｇＣＪ−２と７０マイクロＭＡＴＰを含有する８２マイクロリツトルの０．０７　Ｍ　トリス・ＨＣＪ！　（ＰＨ７，５）中１０単位のＴ　４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社）を含有する混合液を調製する。ここに例６の標識ＤＮＡ−１１０マイクログラムと、水１８マイクロリットル中１．８マイクログラムのＰＢＭを添加する。こうして得られる１００マイクロリツトル液を１５°Ｃで一晩反応させた後、混合液を６０００に１０分間保って反応を停止させる。こうしてＤＮＡ　−　ＩＪアンー分子を含む混合液が得られる。

この混合液に水１０マイクロリットル中の１００単位のＢａｍ　Ｈ工とＢａｍｉＯＸｌ＆衝ａ　＜　ｏ．２Ｍ　）リス、　ＨＣＪ−（　２１４　８．０　）、０，０　７　Ｍ　ＭｇＣＪ　２、０．０　２　Ｍ　ＢＭＥ，　Ｉ　ＭＮａ（Ｊ　）　ｉ　２マイクロリツトルを加える。この液を６７°Ｃで６時間反応させた後、０．２　Ｍ　Ｎａ２　ＥＤＴＡ　１　２マイクロリットルを加え反応を停止させる。これでＤＮＡ−リンカ−分子からＰＢＭが切り離される。

ＤＮＡ−リンカ−分子をフェノールとエーテルの順で処理してＤＮＡ　−　ＩＪアンーを抽出する。この抽出液の上に窒素ガスを流して抽出液の容量を２０マイクロリツトルに減少させる。

濃縮された抽出液を、０．０　１　Ｍ　トリス・Ｈｃｔ　（　ｐＨ７．８　）（　Ｑ．Ｑ　５　Ｍ　ＮａＣｆを含有）で平衝化させたセファデックス（］　−　５　０　（ファルマ／ア社）のカラム１ｍｅに通し、ミクロフユージ管に流出両分を１滴すつ採取する。

３２Ｐの放射能の検出によりＤＮＡ　−　ＩＪンカ−の位置を決定し、ＤＮＡ− ＩＪアンーを含有する溶液の量を」１１定する（約Ｑ．１ｍｌ）。３Ｍの酢酸ナトリウム１０マイクロリツトルとエタノールＱ．２ｍｌを添加してＤＮＡ−リンカ−を回収する。どの混合液を一２０°Ｃで一晩放置する。

沈澱したＤＮＡ−リンカ−を遠心分離してペレット状にし、真空中で乾燥させ、る。このペレットをろＯマイクロリットルの水に溶解し、−２０°Ｃで保、存する。

１マイクログラムのｐＩ３Ｉ（　３　２　２　（　ＢＲＬ　Ｌａｂｓ　）をＢＡＭ工と細菌性アルカリ性ホスファターゼで処理し、５マイクロリツトルの水に加えろ。ここに１０Ｘリガーゼ緩衝液（２マイクロリツトル中２　０　単位（１）　Ｔ　４ＤＮＡリガーゼ含有）２マイクロリツトルと、水２マイクロリットル中の１マイクログラムのＤＮＡ−リンカンペレットを加える。水を加えて容量を２ｏマイクロリツトルに調整する。混合液を１５°Ｃで一晩反応させると、ＤＮＡ −リンカ−がｐＢＲ　３　２　’２ベクターに連結し、これで混合液はＤＮＡ　 −　リンカー−ｐＢＲ６２２ベクターを含有することとなる。

次にＨ　Ｂ　１　０　１　Ｆ２．　ｃｏｌｉ　（大腸菌）をＤＮＡ−リンカー− 　−　ｐＢＲろ２２ベクターで感染させる。宿主である）ＩＢｌ　０１細胞は冷０．　１　Ｍ　ＣａＣ１２で前処理し、４℃で１５分間反応させ、遠心分離して回収する。細胞ペレットＯ．６ｍｌに１００ｍ＆のベクターを加える。次にこのＥ．　ｃｏｌｉ　／ベクター混合液を氷の上に１０分間放置した後、６７°Ｃで６０秒の熱ショックを与える。次にに．　ｃｏｌｉ　／ベクターを氷の上で９０分間インキュベートする。

１％バクトペデトン、０．５％酵母エキス、そして０、５％ＮａＣＡで１ＭＬｔｇ地」を調製する。次［ＭＬ培地２　ｍｌをＥ．　ｃｏｌｉ　／ベクター混合液に加え、これを６７℃で６０分間インキュベートする。この混合液にアンぎシリンを４０マイクログラ、ム／ｍｌになるように加え、ろ７°Ｃで３０分間インキュベーションを続ける。

５０マイクログラム／ｍ１４のアンビンリンを含有スるＭ　Ｌ培地−」二に、この混合液１．５ｍｌを広ける。１：１０希釈の混合液を用いて別の平板を作る。

平板を６７℃で一晩培養後コロニーを数える。

アンビンリンとテトラサイクリンについてレプリカ平板を作る。目的とするＥ．　ｃｏｌｊはテトラサイクリンに対する耐性を失ない、アンビンリンに対する耐性を保持しているものである。最初のアンビンリン含有プレートにみられる約６０口のコロニーのうち、生き残るのはｒ＞５−１０コロニーである。

各Ｅ．　ｃｏｌｉ　コｏ　＝−を、別々に１０ｍｌのＭＬ培地中でろ７８Ｃで７時間増殖させる。次にクロラムフェニコールを１００マイクログラム／ｍｔの濃度になるように加えて、ろ７°Ｃで一晩培養を続ける。各溶液を集めて遠Ｉシ・分離して細胞ペレットを回収する。このペレットを０．７ｍｌのＳＴＥＴ緩衝液（８％のショ糖、５％のトリト．／−Ｘ−１００、ｉ］，５　Ｍ　ノＥＤＴＡを含有すル０．０５Ｍ（７）　）　ＩＪ　ス・ｎｃｆ　（　ｐＨ　８．０））　ＶＣｆｇカＬ、、：、＝にｓｏマイクロリットルのリソゝチーム（　１０　ｍｃｙ／ｍｅ　）を添加する。

この混合液をただちに室温で１２，０００ｇで１０分間遠心分離り、得られた上清はマイクロフユージ管に移す。等量（約３．４　ｍｔＶ）のイソゾロパノールを加えて混合液を１時間−２０°Ｃに保った後、遠心分離する。

こうして得られるＤＮＡペレットをエタノールで洗い、Ｑ．５ｍｌの緩衝ｇ（　０．Ｑ　Ｉ　Ｍ　ＥＤＴＡ　、　０．１　Ｍ　Ｎａ（！１を含有する０．０　２　Ｍ　）リス・Ｈｃｉ（　ＰＨ　８．１　）　）に再浮遊させ、最終濃度が１００マイクログラム／　ｍｅのＲＮＡｓｅ−Ａ（ミリポア社）、２５Ｕ／ｍｌＶのＲＮＡｓｅ　Ｔ　１　（シグマ社）、そしてＯ．［３　２　５　ｍ９７ｍｅの）０ロテイナーゼＫ（ＥＭＢｌｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ　）を用いろ７°Ｃで５時間処理する。

次に混合液をフェノールを飽和させた３、５ｍｌの緩衝液で抽出し、５分間振盪し、クロロホルム＜０．１６６ｍ１）で５分間抽出する。水層をエーテルで抽出してフェノールとクロロホルムを除く。水層に６Ｍ酢酸ナトリウム０．０５ｍ１を加え、次に２倍量の冷エタノールを加える。混合液を一晩−２０’Ｃに保つ。

沈澱したＤＮＡをエタノールで洗い、真空乾燥し、適当量（約１００ｍ１の０．００５　Ｍ　）リス・Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，４）（０，０００１Ｍ　ＥＤＴＡを含有）に再浮遊させる。

次にこのＤＮＡを試験する必要がある。Ｒｊ　ＤＮＡ　ｙ’にリスラーゼを阻害する能力によりこのＤＮＡが確認される。このＤＮＡをｐＢＲろ２２ベクターから切り離すことにより試験する。これは「ダイジエスチョンミックス」（”Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　Ｍｉｘ”　）を調製し、使用することにより可能である。ダイジエスチョンミックスは１００ｍ９７　ｍｌの牛血清アルブミン；　０．０２　Ｍのトリス・１ｃｆ（ＰＨ７，０）　；　０．Ｉ　ＭのＮａＣＪ、：　Ｏ−００７ＭのＭｇ（Ｊ２：そして０．００２　Ｍの２−メルカプトエタノールである。

グイジェスチョンミソクスＱ、１ｍｌに挿入部を持つ５０マイクログラムのｐＢＲろ２２　ＤＮＡと５０単位のＢＡＭ　ＨＩを添加する。混合液を６７°Ｃで１時間反応させる。

次にシラスミツドＤＮＡの挿入部をケ８ル電気泳動で分離する。０．０８　Ｍのｔｒｉｚｍａ、塩基、０．０３３．Ｍの酢酸ナトリウム、０．０６６ＭのＮａＣｆ　、そして０．００４　ｈＡのＫＤＴＡの緩衝液で２％アガロ−スケゞルを用いる。

別のクローニング法を用いてもよい。二本＠ＤＮＡの混合液又は例２で得られる［Ｄｘｑｈ−Ｔ、混合液」を、０．０１１ｔのｌ・リス・ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，８）中ＫＣｆｆｉのＯから１．Ｕ　Ｍ″！での直線的濃度勾配を用いて、ＤＥＡＥ　−セルロース（ワットマン社）で再びクロマトグラフィーを行なう。ＤＮＡは０．４４−０．５　Ｍで浴出するので、以後ＤＥＡＥ−１１ＤＮＡと呼ぶ。

ＤＫＡＥ−［Ｉ　ＤＮＡを含有する溶出画分ヲポリエチレングリコールに対して透析し濃縮する。この精製操作により分解したＤＮＡが除かれ、より純度の高い、二本鎖の、不均質なりＮＡの混合液が得られる。この混合液はＤＮＡ−１とＤＮＡ−２を含む。別の方法としては、ＤＮＡ−１とＤＮＡ−２は実施例５に記載した方法で調製することもできる。前記したＤＮＡ画分のどの画分についても、下記の操作法で、バクテリアファージＭ１３ｍｐ３を、用いることによりクローニングが可能０．００６７　Ｍ　Ｍｇ（４２，０，０１Ｍ　２−メルカプトエタノール、そして２５　Ｍ　ｄＧＴＰ　Ｘ、　ｄｃ！ＴＰ　、　ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰを含有する溶液２５マイクロリツトルに浮遊させる。

次Ｋ　Ｔ　４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、、Ｍｄ、　）を０．０１４単位／ｍ９ＤＮＡ加えて、１５°Ｃで２時間インキュペー／ヨンを続ける。これはＯｈａｌｌｂｅｒｇａｎｄ　ＫｎｇｌｕｎｄかＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５　：ろ９−４３（１９８０）に記載している方法の変法である。この方法によりＤＮＡ分子上に［鈍い末端Ｊ　（”　ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄｓ”）が形成される。

ファージＭ１ろｍｐ　８の複製型ＤＮＡ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｃｌ−Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓ、　）の２マイクログラムをＳｍａ工制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、　ＢｅＶｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓ、　）で切断し、エタノールで沈澱させる。この操作により環状複製型が直鎖状ＤＮＡに変わる。この直鎖状ＤＮＡを２５マイクロリットルの０．０１　Ｍ　）リスＰＨ７，８に再浮遊させ、２８０単位の細菌性アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）を加える。混合液を６５°Ｃで１時間インキュベートした後、フェノールとエーテルの順に抽出する。

０．０５　Ｍ　トリス、ｐＨ７，８中Ｏ０ろ一１０ナノグラムの鈍い末端のＤＮＡ、１０ナノグラムのＭｌろファージＤＮＡ　、そして８０単位のＴ　４　ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＫｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　；　［］、Ｑ　１Ｍ　ＭｇＣｆ２　；　０．Ｑ　２Ｍジチオスレイトール、０．００１Ｍ　ＡＴＰ　；そして５０マイクログラム／　ｍｌｌ牛血清アルブミンヌクレアーゼが混ざってないもの、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）を２０マイクロリツトル中に含む連結混合液（］−ｉｇａｔｉｏｎ　ｍｉｘ　）を調製する。この混合液を１５°Ｃで一晩インキユベートすることによりＤＮＡかＭ１３ファージに連結され、直鎖状ＤＮＡが再び環状になる。

次にこのクローニングすべＤＮＡを含む再び環状になったＤＮＡを、ＤＮＡが複製できる適当な宿主に入れることが必要である。これはＤＮＡ感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　）と呼ばれ、Ｍａｎｄｅｌ　ａｎｄ　Ｈｉｇａ　（Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ５３：１５４（１９７０））の方法の変法を実施する。

Ｅ、　Ｃ０１ｉ　Ｊ　Ｍ　１０６株を２　Ｘ　ＹＴ培地（１６ｍ９７ｍｌバク）　−）　ＩＪデトン、１Ｑ　ｍ９／　ｍｔｌ酵母エキス、１Ｑ　ｍ９／　ｍｌ：Ｎａ４Ｊ　）中で対数期（Ａ６００、約０．４）になるまで増殖させる。培養液２５ｍ１を氷の上に１５分間装いた後、遠心分離により細胞をペレットにし、ｉＱｍｌの氷冷０．０１　Ｍ　ＮａＣ’ｆに再浮遊させる。その後細胞を遠心分離で再びペレット状にし、１０ｍ１の氷冷Ｑ、　ｉ　Ｍ　ＣａＣｆ２中に再浮遊させ、氷の上に２０分間放置する。細胞を次にペレット状にし２ｍｌの氷冷０−　Ｉ　ＭＣａＣ’　２　Ｋ　再浮遊し、さらに１５分間氷の上でインキュベートする。細胞０．３ｍｌを連結したＤＮＡに加え、３０秒間３７°の水浴に入れてお（。混合液を９０分間氷の上に置いておきときどき攪拌する。この細胞を、Ｍｅｓｓｉｎｇの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、１９３ろ）により、インゾロビルチオガラクトサイド（ＩＰＴＧ　）とジブロモ−ジクロロ−インドールガラクトサイド（ｘｇａｌ　）を含有する平板培地に広げる。ろ７°Ｃで一晩培養後、さらにスクリーニングするために明瞭なプラークを選ぶ。

次にＳａｎｇｅｒ、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ｂａｒｒｅｌｌ、　Ｓｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｒｏｓｅｉｎ　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｉ　４ろ：　１６１　（１９８０）の方法を少し変更した方法で、一本領ファージＤＮＡを得る。ようじでファージのプラークをとり、１７×１００ｍｍ培養試験管中の２ＸＹＴ培地中の対数期のＪＭｉ　Ｑろ細胞（Ａ６５０、約０．６）１ｍｌ中に加える。

試験管を６７°Ｃで４−８時間、３００　ｒｐｍで回転する（キャップは空気が通るように通気孔がある）。各試験管内の液を１．５ｍＡエツペンドルフ遠心分離管に移し、エッペンドルフ遠心分離機で５分間遠心分離する。上澄を２番目のエツベンドルフ遠心分離管に移し、２．５ＭＮａＣｊ！中２０％のポリエチレングリコール６０００を２００マイクロリットル加える。次に遠心管を混合して、エツペンドルフ遠心分離機中で室温で少なくとも１５分間インキュベートする。

先を引き伸ばして毛細管にしたパスツールピペットを用いて、上澄をできるだけ完全に除く。ペレットを１００マイクロリットルの０．０１　Ｍ　）リス（ｐＨ７，８）　（０，０００１Ｍ　ＥＤＴＡ含有）Ｋ再浮遊し、５０マイクロリットルの中和したフェノールで抽出する。ＤＮＡをエタノール沈澱させ、最終液量を２５マイクロリットルにする。この方法により約５マイクログラムのＤＮＡが回収される。

５マイクロリツトルのＤＮＡ溶′ｇ！Ｌ（約１マイクログラムのＤＮＡを含有）に１マイクロリットルの１５塩基対Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａ、ｓｓ、　）、１マイクロリツトルの緩衝ｉ（０，０７ＭトＩＪスｈＣｆ、ｐＨ７，５：０．０７　Ｍ　ＭｇＣＪ、２　；　Ｑ、５　Ｍ　Ｎａ（Ｊ　）および６マイクロリツトルのＨ２Ｏを混せる。この混合液を毛細管に取り、その両端を炎で焼いて密封した後、試験管（１ろＸ１００＋ｎｍ）内の水の中に入れ５分間ｉｏｏ’ｃに維持する。

Ａｎｃｌｅｒｓｏｎ、　Ｇａ１ｔ、　ＭａＶｏｌ、　ａｎｄ　ＹｏｕｎｇがＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲ８ＳｅａｒＣｈ　８　：　１７３１　（１９８０）に記載した方法に従い、この混合液を６０分間試験管内の湯に浸したまま室温まで下げる。

各毛細管の内容液をエソペンドルフチューブに入れ、ここに１マイクロリツトルの０．１　Ｍジチオスレイトール、２マイクロリツトルの４つの＋１ＮＴＰＯ各０．００２２Ｍ溶液、１単位のＤＮＡボリノラ−セ゛工のに１ｅｎＯｗ断片（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）を加えろ。このＤＮＡ含有液を室温で２０分間インキュベートし、２０分目に下記の試薬を加える。１ｔｒａ９／　ｍ１３のヌクレアーゼの混ざってない牛血清アルブミｙ　（Ｂｅｔｈａｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａ’ｂＯｒａｔＯｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍｄ、　）　０．５マイクロリツトルおよび５単位のＥｃｏ　ＲＩ　（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｅｌｋｈａｒｔ、　Ｉｌｌ、　）と５単位のＢａｍ　Ｈ工（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓ、　）。６７°Ｃで１時間インキュベーションを続ける。

こうして得られた試料を２％アガロ−スケゞルで電気泳動を行なう。流す緩衝液の組成は、０，０８ＭトリスＨｃｚ　Ｐｉｌ　７．ｓ、ＯｌＯろＭ酢酸ナトリウム、０．０３６　Ｍ塩化ナトリウム、０．００４　Ｍ　ＥＤＴＡ　、および０．５マイクログラム／　ｍｅの臭化エチジウムより成る。ケゞルはミニゲル装置（Ｃ，Ｂ、Ｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｄｅｌ　Ｍａｒ、　Ｃａ１．　）に沈め、２３　ｍＡの定電流で行なう。追跡用の色素であるブロムフェノールブルーか原点から６ｃｍ又は４ｃ７ｎ泳動した時に、ケゞルに紫外線を当てて親祭して、各ＤＮＡの泳動を測定することができる。

−７００で凍結した培養ｒＬ１ｍｅからｉＱｍｌの試料をスクリーンするために、上記は１ｍｌの培養液を供するのに使うプラーりからのファージを、プラークから＠接とったファージの代りにすることができろ。

ファージ培養液を２　ＸＹＴ培地中の対数期のＥ、　ｃｏ１ｉＪＭ１０１株（Ａ６００、約０．６）　２００−５００　ｍｌに加える。これを６７°Ｃで４時間振盪後、クロラムフェニコールを１００マイクログラム／　ｍｌ！になるように加え、さらに２−３時間インキュベーションを続けろ。

Ｈｏｌｍｅｅ　ａｎａ　Ｑｕｉｇｌｙｅ　がＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１４：１９ろ（１９８１）に記載した方法に従って、複製型を精製する。細胞を遠心分離してペレット状にし、０．０１　Ｍ　ｌ−リス、０．００２　Ｍ　ＫＤＴＡで洗い、次に遠心分離し、２０−６５　ｍｌの８％ンヨ糖、５％トリトンＸ１００．０．０５　Ｍ　ＥＤＴＡ　、および０．０５　Ｍ　）リス、ｐＨ８，３（５ＴＫＴ緩衝液）ニ浮遊させる。５０１１１９／ｍ／！のリゾチーム（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｆｒｅｅｈｏｌｄ。

Ｎ、Ｊ、　）の原２２０−５０マイクロリツトルを加える。

細胞浮遊液を炎の上で沸騰させ、那騰水浴中に４０秒間入れ、ただちに１２，０００ｘｏで１０分間遠ノし・分離する。複製型ＤＮＡを含む上清をデカノドして移し、ＤＮＡをインプロパツールで沈澱させる。複製型は臭化エチジウムを用い、ＣｓＣｆ密度勾配遠心分離でさらに精製した。ＣｓＣＴＪ−ｍ和イソフ０ロバノールで２回抽出して、ＤＮｐ、＠Ｗより臭化エチジウムを除去した。次にこの試料を０．０１　Ｍ　トリス、ｐＨ７，８：　０．０００１１ＡｗＤＴＡに対して透析し、同じ緩衝液中の３０％ポリエチレングリコールに対して濃縮した。

制限酵素Ｂａｍ　ＩＩとＥｃｏ　ＲＩを用いて挿入部を切り、スクリーニング法で述べたように２％アガロ−スケ９ルでベクターＤＮＡから分離する。Ｙａｎｇ、　Ｌｉｓ　ａｎｄ　Ｗｕ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎＺ　ｙｍｏｌｏ　ｇ３’　６　８　：　１　７　６　（１９７９）　の方法を用いて、挿入帯をアガロースの溝の中に電気溶出させ、エタノールで沈澱し、適当な緩衝液に浴かｔ。

特異性基（ＤＮＡ’ｌ確認するために、クローン化したＤＮＡ−Ｌにつ℃・て分析藤験を実施した。Ｍｏｐｃ　−２１癌組織からクローン化した６つのＤＥＡＥ −Ｉ　ＤＮＡの部分的配列は以下の如くである。

クローン「Ａ」の配列（長さ２１０　ｂｐ　）１　１１　２１　３１ＡＡＣＣＡＣＧＣＴＴ　ＴＴＣｋＣＣＡＡＣＣＯＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧ　Ｇ（）ＴＧＡＴＧＣＣＡ１６１ＣＯＴＴＣＴＣＣＴ　、、、。

クローンｒＢＪの配列ＴＧＴＴＡＣＴＣＡＣＴＯＡＧＧＣＴＣＡＴ　ＴＧＴＧＴＧＡ、、、。

クローン「Ｃ」の配列１　１１　２１　３１ＴＧＡＴＴＴＴＣｉＡＧ　ＡＴＴＴＣＴＴＧＣＯＡＴＡＴＴＣＩＣＡＣＧ　ＴＣＣ！ＴＡＣＡＧＴＧ１ＧＣｉＡＴＴＴＯＴＡ、、、。

ＤＮＡ　−１のクローン化のあと、クローン化法の部分の証明が早くできるようにするために「標識」することが望ましい。さらに下記の悪性腫瘍試験法では「標識」ＤＮＡ（すなわち物理的に又は化学的に処理したＤＮＡ　）を使用する必要があり、それにより以後の操作で追跡および測定が可能である。このような目的にはふワう放射性物質により分子を標識する。本出願人はＤＮＡ−Ｌの標識にはリンろ２　（３２ｐ　）とトリチウム（３Ｈ）が特に有用および有効な同位体であることを見出した。′ｆ、た標識したものを目で見ることがてきるようにするために、色素や螢光性複合体のような光学的に活性のある標識物、および放射線不透過性の物質を用いることは当該技術分野においては公知である。

従って（請求の範囲に示したように）標識と℃・う概念の中にはこれらに相当する方法は全て含まれて（・る。

さらに競合的結合に用いられる標識ＤＮＡは、本試験の天然の腫瘍のＤＮＡが結合する酵素に対する親和性により選はれた腫瘍Ｄ　ＮＡを若干変更したものでもよい。

そのような場合この変更したＤＮＡは、本試験のＤＮＡ７０ローブとして天然のＤＮＡのがわりに使用することができる。

放射能標識化合物は下記の酵素的方法によりＤＮＡ分子に挿入される。下記の例はＤＮＡ　Ｉに関するものであるが、ＤＮＡ　−２、又はＤＮＡ　−１、ＤＮＡ　−２よりクローン化したＤＮＡ　（すなわちＤＮＡ　−Ｌ　）に対する方法も実質的に同一である。下記の「ＤＮＡ５ｅ工」という言葉は２本鎖ＤＮＡ分子に一本鎖の部分又はすき間を導入することができる細菌性酵素を意味する。ここで使用するＤＮＡ８８■酵素はミリポア社より人手したものであるが、その他の会社からも入手できる。

アルファ位に標識したキャリアを含まない放射能標識（”２Ｐ　）デオキシヌクレオシド三’）　７　酸（ａｃＴ：ｐ　）を５０００マイクロキユリー含有する混合液を１．０ｍｌの０．０１　Ｍ　トリス・Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ７，４）中に調製する。同じ緩衝液を使用して、０．２ナノモル／マイクロリットルの各非標識デオキシヌクレオシド６リン酸（当該技術分野において　ｄｃＴＰＸｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰとして公知である）４種類の溶液を別々に調製する。次に２０マイクロリツトルの放射能標識３２ｐデオキシヌクレオシドろリン酸、１０マイクロリツトルの各非標識デオキソヌクレオシド３　’）　ン’Ｈ（ａｏＴｐ。

ｄＡＴＰ　、およびＴＴＰ　）、そして２マイクロリツトルの非標識ｄｃＴＰを含有する混合液を調製する。次に１゜マイクロリットルの１０×反応緩衝液と２マイクロリツトル中２マイクログラムの例６のＤＮＡを調製する。

混合してから蒸留水を加えて総量を９７マイクロリソトルにする。これを「標識混合液」と呼ぶ。

「活性化緩衝液」は１０ｍ１）リス−ＨＣｊ！　（ｐ１４７．６　）　；０、Ｏ０５ＭＭｇＣＪ２；およびヌクレアーゼを含まないｊ　ｍ９／　ｍｌ、″のＢＳＡを混合して調製する。９マイクロリツトルのや性化緩衝液を１００マイクログラム／　ｍｌのＤＮＡ５ｏＩヲ含有する溶′ｔＬ１マイクロリットル（０，１マイクログラムのＤＮＡ５ｅ■に等しい）と混合し、４°Ｃに２時間放置する。これン「活性化ＤＮＡ８ｅＩ　Ｊと呼ぶ。

１マイクロリットルの活性化ＤＮＡ８８　工を９７マイクロリツトルの標識混合液に加え、得られた混合ｇを１５°Ｃで１０分間インキュベートする。次にこの混合液に、２マイクロリツトルのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中２単位のＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ”１（１単位／マイクロリットル）を加える。この緩衝液は２−メルカプトエタノールが０．００１　Ｍで５０パー゛セントのグリセロールを含有する。反応を１時間続けてから０．２ｍｌの０．ろＭＮａ２　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）　ｔｒ　加エテ反応を停止させる。次にこのＤｒｕ　ｔセファデックスＧ−５０（微粒子クレード）（ファルマ／ア社）のカラムでクロマトグラフィーを行な℃・残っている放射性物質から分離する。このカラｌ、はＱ、Ｑ　Ｑ　３１Ｍ　Ｂ１ａ２　ＥＤＴＡを含有する適当量のＱ、Ｑ　ｉ　ｒｔ　ｈリス−ＨＣ，！　（ｐＨ８，０）て平衡化させておく。

０．１％の臭化エチジウム溶液１．Ｑｍｔに、１０マイクログラムＤＮＡ−Ｌ　／　ｍｅ金含有る１、０ｍｌの溶液？加える。

混合液をセファデックスＧ−１００カラムでケ８ル濾過し、反応しなかった臭化エチジウムを除く。実施例６０−０００１　Ｍ　Ｎａ２　ＥＤＴＡ　ｔ、２含有するＯ１○ｉ　Ｍ　）リス・ＨＣＪ　（ｐｔｌ　８．０　）に回収する。

臭化エチジウムはＩ）ＮＡの二重らせんの鎖の間にはいる。これは５１８　ｎｍで励起され６　’、　Ｏｎｍで螢Ｍ：、を発ビオチン化チオキシウリジン三リン酸（ａＵＴＰ）４用し・、例７の方法と同様のトニック翻訳−１法（″ＸｎｉＣｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　”）を使用する。この方法のヒトツバＧａｒｄｎｅｒの非放射性ＤＮＡ標識二二トロセルロろ８−４１　（１９８３）に記載されている。

このビオチン化　（］、ＵＴＰは例７第１段落の３２Ｐ標識デオキシヌクレオシド三リン酸のがわりに用いる。たとえば１ＱＱｎモルのビオチン化デオキシヌクレオシド三リン酸（ａｕＴｐ　）　ｔ、ｔ　２マイクロリツトルの０．０１　Ｍトリス（ｐＨ７゜４）中に作る。ビオチン化してないヂオキ／ヌクレオシド三リン酸（ｃｌＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＭＰ、ＴＴＰ　）をこの同じ緩衝液に別々に、２マイクロリツトルがビオチン化してないデオキシヌクレオシド三リン酸をおのおの５０ｎモル含有するように作る。次にビオチン化ｄＵＴＰ　２マイクロリツトルとビオチン化しないヂオキシヌクレオシド三リン酸をおのおの２マイクロリットル含有する混合液を調製する。次に１０×反応緩衝液１０マイクロリットルと、２マイクロリツトル中例乙のＤＮＡを２マイクログラム含む液乞調製する。混合してから蒸留水を加えて全量を９７マイクロリツトルとする。これを「標識混合液」と呼ぶ。

次に例７の第２段落および第６段落に記載した方法を実施する。

次にヤギ抗ビオチン抗体のＩｇＧ画分とフルオレセインイソチオンアネー）　（ＦＩＴＣ）−結合ウサギ抗ヤイ抗体（Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈ、ｅｍ社）で、ビオチン化ＤＮＡ上のビオチンな検出する。ヤキ゛抗ビオチン抗体がＤＮＡ中のビオチンに結合し、次にＦ工ＴＣウサギ抗ヤギ抗体がヤギ抗ビオチン抗体に結合する。このＤＮＡの分子量は免疫グロブリンの分子量とほぼ同じである。従って１マイクログラムのビオチン化ＤＮＡはヤギ抗ビオチン抗体のＩｇＧ画分の１マイクログラムと反応し、そのあとに１マイクログラムのＦＩＴＣ結合ウサギつヤギ抗体と反応する。このＤＮＡ、と抗体の複合体全体を放射能標識ＤＮＡと同様に試験に用℃・ろ。

他の種の他の組織中にはＤＮＡ　−Ｌにより選択的に阻害されうるいくつかの酵素が存在する可能性がある。

本出願人はこの試験に有効な酵素をまだひとつしが見出して℃・ないが、試行錯誤により、ここに記載した技術に基（試験に有効な他の酵素も開発できるであろう。

そのような酵素は本発明の範囲内にあると考えられる。

ここで用いる酵素はＲ−１ＤＮＡポリメラーゼであり、これはＡｎａｌｙｔｉｃ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８７　：　４１１　（１９７８）（前記）の方法によりネズミの骨髄腫より抽出した。

本発明者は、血液やその他の体液に存在しうる他のＤＮＡ試料を用いてＲ−ｉ　ＤＮＡポリメラーゼ乞試験し、これらのＤＮＡのいずれもＲ−１ＤＮＡポリメラーゼヲ特異的に阻害、（選択的に結合）はしないようであること乞見出した。

同シＣＮＢｒ活性化セファロース又はポリビーズを用いて例ろ又は４の方法を実施する。例５の前処理を実施する。Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉ：ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４０　ニア５８−７７０（１９８０）（前記）の方法で酵素含量を定量し記録する。

こうして得られる生成物はここに記載した試験に使用するのに適したＲ　−Ｉ　ＤＮＡポリメラーゼ酵素結合マトリックスである。これは４°Ｃで少なくとも３か月間安定である。これはｉＭＫ（Ｊで洗いその後定量用緩衝液で洗うことにより、繰返し使用するための再生ができる。

血清試料は少量の１異種ＤＮＡ」、すなわちＤＮＡ　−Ｌに無関係のＤＮＡを含有する。このような異種ＤＮＡは酵素結合マトリックス上のＲ−Ｉ　ＤＮＡポリメラーゼのいくつかに結合して試験の正確度を妨害することがあり得る。しかしこのような異種ＤＮＡはＲ−ｉ　ＤＮＡポリメラーゼゞに特異的ではない。従ってこれは適当なマトリックス上の異種酵素を使用することにより「クリーンアンプ」することができる。Ｒａｕｓｃｈｅｒ白血病ウィルスから得られる逆転写酵素はＤＮＡ　−１、ＤＮＡ　−２、又はＤＮＡ−Ｌに阻害されないが、広範囲の他の異種ＤＮＡに阻害されろ。この酵素の調製法はＲｏｓｓ、　５ｃＯ１ｎｉｋ。

Ｔｏｄａｒｏ、　ａｎｄ　Ａａｒｏｕｓｏｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂ１０１０ｇ３’　２３１　：１６ろ−７０（１９７１）に記載されている。この酵素は下記の様に、試料の精製用マトリックスの調製に用いることができる。

約０．１グラムのポリビーズ小球ヲリン酸カリウム緩衝Ｗ　（ｐＨ７，２−７，６）で洗う。このリン酸カリウム緩衝ｉ７５マイクロリットル中へ約２５マイクロリツトルのビーズＪ）濃縮浮遊液を、１１７ｍ１の１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルポジイミド（ＥＣＤ工）の水溶液１０マイクロリツトルと一緒に加えろ。この混合液を室温（２４°Ｃ）で３０分間培養する。ビーズをこのリン酸カリウム緩衝液で洗い、４％のグリセロールを含有するこの緩衝液７５マイクロリットルに再浮遊させ、ビーズはこのままの状態で保存してお（。

保存しておいたビーズ約７５マイクロリツトルを試験管に入れ、液量が１００マイクロリツトルになるまで８製した逆転写酵素（０，５−”　１．０マイクログラム／マイクロリツトル）を加える。次にこの混合液を室温（２４°Ｃ）で３０分間反応させる。

次にこの混合液に０．２Ｍグリシン（ｐＨ７，６−８，０）の１０マイクロリツトル、あるいは牛血清アルブミン液（２０ｍｙ／ｍｅ　）の１０マイクロリツトルをゆっくり加え、定°期的に攪拌しながら室温（２４°Ｃ）で６０分間培養する・。次にビーズを［−保存緩衝液Ｊ（０，０５ＭトリスｐＨ７，８：　０．００４　Ｍベーターメルカプトエタノール；　０．０４　Ｍ　ｘｃｚ　０．２　Ｉｎ９／、ｍｌｔ牛血清アルブミン；０．０００１　Ｍ　ＭｎＣｊ！２２０％グリセロール）で２回洗い、この緩衝液５０マイクロリツトルに再浮遊させ、使用するときまで保存しておく。使用する前に、保存緩衝液中０．１％の変性サケ精子ＤＮＡ溶液で洗った後、保存緩衝液で注ぎ洗いする。これが１精製用マトリツクス」の精製例１の被験試料約１ＣＣに例８Ａの精製用マトリックス１０マイクロリツトル乞混合する。この混合液ヲ激しく振盪し、６０分間室温（２４°Ｃ）に保った後、１０００ｇで１０分間遠心分離する。

得られる上澄が「精製被験試料」である。ビーズは回収し再使用ができる。

前記した如（本発明は「競合的結合」を用℃・ろ腫瘍ＤＮＡ　（大量に生産される場合悪性腫瘍に関係して（・ろＤＮＡ）の有無の検出に関する。標識された腫瘍ＤＮＡ　ｉま、酵素結合マ）　ＩＪラックス中酵素の結合部位に対し、被験者の血液（又は他の体液）中に存在する腫瘍ＤＮＡと１競合」する（ｆなわちＤＮＡプローブとして働く）。

酵素結合マトリックスは他のＤＮＡ　（たとえばサケ精子ＤＮＡ　）で１−でに前処理をされて℃・るため、（ＤＮＡ−Ｌのよ５な目的の腫瘍ＤＩ鯖に対する特異的親和性ではな（）　ＤＮＡに対する一般的親和性を有する、酵素結合マトリックス上の結合部位はすでにふさかれており、従って本試験を妨害しない。又いくつかの酵素（その中にはおそら（Ｒ−ｉ　ＤＮＡポリメラーゼも含まれろ）結合部位に結合するために本試験を妨害しつる異種ＤＮｆｉ。

の存在の可能性は、被験試料を精製用マ）　ＩＪソクスで前処理することにより打ち消すことができる。標識した腫瘍ＤＮＡか酵素結合マ）　ＩＪソクスに結合する比率は、被験者の血液（又は他の体液）中の腫瘍ＤＮＡとの競合の有無に関係している。競合するＤＮＡが存在しない場合は、酵素結合マトリックスに結合する標識した腫瘍ＤＮＡの量は最大であり、もし競合するＤＮＡが存在する場合はより少量の標識ＤＮＡか酵素結合マ１．　ＩＪソクスに結合する。従ってこういう条件下では標識ＤＮＡ　（ＤＮＡ）０ロ−グ）が酵素結合マ）　ＩＪνクスに結合する比率は、被験者の血液又はその他の体液中に腫瘍ＤＮＡが存在するか否かの示標となる。

本試験は、被験者の血液又は他の体液から被験試料を調製する段階（例１）；精製用マトリックスによりこの試料を精製する段階（例８Ａおよび８Ｂ）；標識ＤＮＡ　（例７）（好ましくは天然のものよりクローン化したＤＮＡ　（例６））を精製した被験試料と混合する段階；標識ＤＮＡを含有する被験試料（［ＤＮＡ／試料混合液」、）を酵素結合マトリックス（例８）に１導入」する段階；そして最後に、酵素結合マトリックスに結合した標識ＤＮＡを足置する段階２含む。

ＤＮＡ　／試料混合液を酵素結合マ）　ＩＪノクスに「導入」するためには、既知量のＤＮＡ　／試料混合液を緩衝液と既知量の前処理した酵素結合マトリックス（例８）と混合する。この酵素結合マ）　ＩＪノクスには既知量の酵素か含まれている。こうして得られる混合液を２５°Ｃで１５分間反応させる。次に遠心分離により、ＤＮＡ　／試料混合液と緩衝液の残液よりマトリックスを分離する。最良の結果を得ろためには、被験試料中の目的の腫瘍ＤＮＡ　（白血病の場合はＤＮＡ　−Ｌ　）の予想される濃度において、正常血液試料と「悪性腫瘍」血液試料の結果にはかなり大きな差（たとえば１０％対９０％）が存在するような関係になるように、標識ＤＮＡと酵素結合マトリックスの相対濃度が存在していなければならない。この結果がうまく得られるのは、（１）被験試料に加えたＤＮＡ　−Ｌの量が酵素結合マ）　１１ツクス中の酵素量（分子数換算で）より若干多く、酵素ｑ結合部位にはすべて添加したＤＮＡ　−Ｌか結合してもまだ若干の過剰のＤＮＡ　−Ｌが存在するとき、そして（２）患者が悪性腫瘍の場合被験試料中の天然のＤＮＡ　−Ｌの量が酵素量より（分子数換算で）少なくとも数倍多し・ときである。

１分子のＤＮＡは１分子の酵素と結合し；　ＤＮＡ　−Ｌの分子量はＲ−１ＤＮＡポリメラ−セ゛の分子量の約０．６５であり、従って精製したＤＮＡ　−Ｌ　Ｏ，６５ナノグラムの分子数と純粋な酵素１．０ナノグラムの分子数は同じであり；　０．６５ナノグラムのＤＮＡ　−Ｔ、には１．０ナノグラムのＲ−１ＤＮＡポリメラーゼか結合する、などと不発明者は考えている。さらに酵素の分子量は約２００，０００であり、ＤＮＡ　−Ｌの分子量は約１ろｏ、ｏ　ｏ　ｏであると考えられろ。以下の例は梢製したＤＮＡ　−Ｌと、実質的に均一でなるまで梢製しまたＲ　−１ＤＩ払ポリメラーゼで考えて記載しである。

標識ＤＮＡの結合の試験法は少な（とも２つある。ひとつは酵素結合マ）　ＩＪソックケ除去した後残っている蔽を試験することてある。もし残液中にム％の標識ＤＮＡ　（ＤＮＡ７０ローブ）が存在するなら、酵素結合マトリックスには１００−Ｘ％結合して（・る。もうひとつの方法は酵素結合マトリックスを試験することであり、それには結合した標識ＤＮＡの実質的に全てをマトリックスから抽出し標識ＤＮＡな狙１定する。理論的にはこの２方法は相補的であり、残液中の標識ＤＮＡの量と酵素結合マ）　ＩＪソクス中の標識ＤＮＡの量の合計は、被験血清に添加した標識ＤＮＡの量に等しいはすである。

しかしながら実験誤差があるため必すしもこうはならない。最初の方法（残液測定法）が最も正確であると考えられる。２番目の方法（マトリックス測定法）は洗浄や不光分な抽出などによる損失があり、これが約２５％にもなると考えられる。この推定値は本発明者の°実施した以下の試験に基き得られた。すなわち１００％の標識ＤＮＡ　−Ｌと被験血清を使用し、結合可能な酵素部位より過剰のＤＮＡ　−Ｌが存在するようにしく従って約５０％すつ各分画に存在するであろう）、２つの方法を実施し、損失のすべてはマトリックス測定法に由来すると考えた。

従って少なくともＤＮＡ−Ｌおよび白血病試験については、好適な態様はマ）　ＩＪラックス定法ではな（残液棋１１定法である。しかし前者の方法は後者をチェックするのに使用できる。さらにマトリックス狙１定法は残液測定法より操作が煩雑であり時間がかかる。

以下の例は全てＤＮＡ　−１に関する。本発明者の知る限り、ＤＮＡ　−２からはＤＮＡ　−１と全（同じ結果が得られ、どちらも使用してもあるいはＤＮＡ　 −１とＤＮＡ　−２を含有する混合液を使用しても全く差はない。またヒトトマウスのＤＮＡ　−Ｌは同一ではなし・と考えられているが、ヒト由来又はマウス由来のクローン化ＤＮＡ　−Ｌを使用した結果には全（差は見られない。しかし種々ツクローン化ＤＮＡの使用、および異なるリンパ性腫瘍を有する種々の患者の血清の使用に帰因する差が結果に出るかもしれない。

正常と考えられる実験室マウスより血清ｉ、ｏｃｃｖ得る。例１ＶＣ従い被験試料を調製し、実施例３Ａ−８Ｂを含有する緩衝混合ｉｏ、ｓｃｃを加えろ。このＤＮＡ　Ｈ液は例６の１マイクログラム／　ＣＣの純粋な、標識クローン化ＤＮＡ　−１ｔ；ｘ含有し、従って全量で５００ナノグラム含有する。この溶ｒＬ乞完全に混合し、得られるＤＮＡ／試料混合液は酵素結合マ）　ＩＪソクスに「導入」する用意ができろ。

６５０ナノグラムのＲ−ｉ　ＤＮＡボリメラーセ゛を含有する迎］定し前処理した酵素結合マトリックス浮遊液Ｑ、５　ｍｌ　ｒ（ＤＮＡ　／試料混合液に加える。、２５°Ｃで１５分間反応後、遠心分離によりマ）　ＩＪソクスを回収し、別にとっておく。

残液を集め液体シンチレーション分光法で標識ＤＮＡ＝１を測定する。残液には標識ＤＮＡ−１が７８ナノグラム含まれ、これは本来ＤＮＡ　／試料混合液中に存在していた量の１６％である。

このマウスを６０日間生かしておいてから殺す。このとき悪性腫瘍の徴候はみられない。

例１０　正常マウスの試験（マ）　ＩＪソックス定法）マトリックスについて液体シンチレーノヨン分光法を使用して例９の試験を行なう。

マトリックスに２８ナノグラムの標識ＤＮＡ、　−１が結合したことがわかる。

これは本来ＤＮＡ　／血清混合液中に存在した量の５６係である。

多発性骨髄腫を持つ実験室マウスについて、例９の第１段落から第６段落の方法を行なう。残液測定法を使用する。

残液に標識ＤＮＡ　−１が４１０ナノグラム含有されることがわかる。これは本来ＤＮＡ　／試料混合液中に存在した量の８２係であり、例９（正常マウス）の比率との比は約５，１対１である。

マウスを殺し死体を検査すると骨髄腫の典型的な徴候が見られる。

白血病細胞の小さなコロニーの早期発見に使用するための不法の感度を証明するため、希釈した白血病試料を調製しつる。例１１のマウスから得た精製した被験試料を、例９の正常マウスから得た精製した被験試料で１：１０００に希釈する。予想される少量のＤＮＡ−Ｌが測定できるように前記の方法を変更する。

稀釈した精製被験試料洗ついて例９の方法を行なう。

稀釈した精製被験試料Ｑ、５ｃｃに、例７の純粋な標識した、クローン化ＤＮＡ　−ｉを１ナノグラム／　Ｃｒ−含有する緩衝混合液を０．５ＣＣ（すなわち全量で０．５ナノグラム）加える。同様に０．６５ナノグラムの酵素を使用する。

残液測定法を実施した結果、残液は０．４ナノグラムの標識ＤＮＡ　（これはもともとの量の８０％である）を含有する。

例９の混合してない「正常Ｊ被験血清で同じ試験を行なう。残液測定法を実施した結果、残液は０．０８ナノグラｌ、の標識ＤＮＡ　−１を含有しており、これはもともとの量の１６係である。２つの係の比率は５．１での方法に従い被験試料を調製し、実施例３Ａ−３Ｂの方法に従い精製する。

精製した被験試料Ｑ、’５ｃｃに、クローン化ＤＥＡ！　−１１溶液（例７に従い標識した）を含有する緩衝混合液０．５ｃｃを加える。このＤＮＡ溶液は、例６Ａの純粋な標識した、クローン化したネズミのＤＮＡ−Ｌを１．０マイクログラム／　Ｃｒ−含有する。従って全量で５００ナノグラムである。この溶液を完全に混合すると、得られるＤＮＡ／試料混合液は酵素結合マ）　ＩＪラックスの「導入」の準備ができる。

約６５０ナノグラムの純粋なＲ−１ＤＮＡＪリメラ−ゼを含有する前処理した定量した酵素結合マ）　ＩＪソックス浮遊液０．５ｍｌを、ＤＮＡ／試料混合液に加える。

２５°Ｃで１５分間反応後、遠心分離によりマトリックスを回収し、再使用するためにとっておく。

残液を集め、液体シンチレーション分光法で標識ＤＮＡ　−１を測定する。残液は７０ナノグラムの標識ＤＮＡを含有することがわかる。これは本来ＤＮＡ　／試料混合液中に存在した量の１４％である。

このヒトを６か月後検査すると、白血病の徴候は全白血病を持っていることがわかっているヒトにつき、例１ろの第１段落から第６段落の方向を行なう。残液測定法を用いる。

残液は４３０ナノグラムの標識ＤＮＡを含有することがわかる。これは本来ＤＮＡ　／試料混合液中に存在した量の８６係である。例１ろ（正常人）で得られた結果との比率は約６．１対１である。患者の死体解剖の結果典型的な白血病の徴候が見られる。

白血病細胞の小コロニーの早期発見に使用のための水沫の感度を証明するため、稀釈した白血病試料を調製しつる。例１４のヒト被験者から得た精製した被験血清試料を、例１ろの正常人より得た精製した被験試料で１゛１０ＯＯの比で稀釈する。予想される少量のＤＮＡ　−Ｌが測定できるように前記の方法を変更する。

精製した稀釈被験試料について例１ろの方法を行なう。精製した稀釈被験試料３．５ｃｃに、例６Ａの純粋な、標識したクローン化ＤＥＡＥ　−■ＤＮＡを１．０ナノグラム／　ｃｃ金含有る緩衝混合液をＱ、５ｃｃ（すなわち全量で０．５ナノグラム）加える。同様に０．６５ナノグラムの酵素を使用する。残液測定法により、残液はｏ、４２ナノグラムの標識ＤＮＡ　（これは本来の量の８４係）を含有することがわかる。

例１６の混合していない「正常」被験血清について同じ試験を行なう。残液測定法により、残液は０．ｏ９ナノグラムの標識ＤＮＡ　（これは本来の量の１８％）を含有することがわかる。２つの方法の結果の比率はＦＤＡ　（食品医薬凸周）の要求（すなわち、「二重盲検」により偽陽性と偽陰性がないことの証明）を満たすのに必要と考えられる大規模なスクリーニングと試験を促進するため、また比較的不慣れな実験者でも測定を可能にするため、試験キットと専用の試験装置を用いる改良法を開発した。

まず、あらかじめ混合した試薬を用いる標準化した試験法を使用し、すぐ試験ができるようにする。このキットはあらかじめ調製した標識ＤＮＡ物質（ここで標識物は蛍光性色素であり、蛍光性複合体も含む）；あらかじめ調製した酵素結合マトリックス、およびあらかじめ調製した「精製用マトリックス」より成る。第２に専用の蛍光測定装置を用いる。これは白血病試験用に特別に改造し較正しである。これは前記の放射定量法はと正確ではないかもしれないが、はるかに簡単を使用することもできるが、放射能測定装置は下記の蛍光測定装置よりはるかに高価である。）白血病により死んだことがわかっている患者の血清より得たＤＮＡ　−Ｌから純粋なりローン化ＤＥＡＥ　−■ＤＮＡを調製する。例６Ａの方法を使用する。

０．００５　Ｍ　）リス・ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）に前段落のＤＮＡ　３．５　ｍ９混合し、実施例７Ａに従い、蛍光性標識物置で標識する。（前記したように、このかわりにたとえば３２ｐ又は３Ｈを標識物として使用することができる。又実施例７Ｂの方法も用いることができる。）混合後、Ｕ、Ｓ、Ｐ、生理食塩水（たとえばＢａｘｔｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　社）を加えて総量を５００　Ｃｒ−とする。

この混合液を０．５Ｃ１？−（標識ＤＮＡ　５００ナノグラム）ずつ約１０００本のｊ、Ｑｃｃバイアルにピペットで加える。バイアル（「ＤＮＡバイアル」）を密封し、約５°Ｃで冷蔵庫に入れて保存する。

ＤＮＡバイアルの内容物を１００　ｍ、ｌの目盛のついた容器に注ぐ。生理食塩水を加え容量を５０ｍ１とする。この稀釈したＤＮＡ溶液を０．５　ｍｌ　（ＤＮＡ　５ナノグラム）ずつ約１０口本の１００のバイアルにピペットで加える。

このバイアル（ｒ　１　：　１０ＱＤ＋、＋Ａバイアル」）を密封し、約５°Ｃで冷蔵庫に入れて保存する。

例１７Ａ−キット用酵素結合マトリックス例４の＆　ＩＪビーズ小球（「ビーズ」）約１０グラムをリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）で洗う。ビーズの濃縮浮遊液約２５０　ｍｌを、１０　ＱｍｌノＥＣＤＩ　（１９／ｍｌ水）と共に同じリン酸カリウム緩衝液７５０　ｍｌに加える。混合液を室温で１時間反応させた後、同じ緩衝液でビーズを洗い、４チグリセロールを含有する緩衝液に再浮遊させる。

ビーズ約７５０　ｍｌをビーカーに入れる。例６に記載の精製したＲ−ＩＤＮＡＪリメラーゼ（約８マイクログラム／　ｍｌの酵素を含有することが測定によりわかっている）を、混合液が約１．Ｏｔになるまで加える。混合液を４°Ｃで約１時間インキュベートする。これでビーズは合計約２　ｍ９のＲ−ｉＤＮＡ　ポリメラーゼを含有する。

次、にコノ混合液に１００ｍ１の０．２Ｍグリシ７　（ｐｔ（７，６−８，０）又は１０口ｍｌの牛血清アルプミ７　（２０ｍ９／ｍｌ　）を静かに加え、室温（２４°Ｃ）で６０分間、定期的に撹拌しながら反応させる。次にビーズを「保存緩衝液」（０，０５麻トリスｐ８７．８　：　ｌ］、０００４Ｍベーターメルカプトエタノール：０．０４　Ｍ　ＫＣ７０，２ｍり／　ｍｌ牛血清アルブミン；０．０ＣＣＩ　Ｍ　ＭｎＣＡ２２０係グリセロール）で２回洗う；そして５０ｍ１の保存緩衝液に再浮遊させる。Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４　Ｑ　：　７５８−３０（前記）に記載の方法に従い混合液の酵素含量を測定する。混合液Ｑ、５ｍｌの酵素含量は６５０ナノグラムよりわずかに多い。本例の第１段落のビーズを十分加えて、この混合ｉｏ、ｓｍｚの酵素含量を６５０ナノグラムとする。

この混合液に、１ｒｒｙ／ｍｌのアルカリ変性サケ精子ＤＮＡ　（ｓ、リボア社）５ｃＱを、４°Ｇで撹拌しながら加える。混合液を４°Ｃで６０分間静かに撹拌する。次にこの物質を保存緩衝液で洗い、適当量の保存緩衝液中で保存して液量を１゜５ｔとする。

これを約０．５ＣＣ（酵素６５０ｎｇ）ずつ約３０００本の１　ｃｃのバイアルに入れろ。バイアル（［マトリックスバイアル」′）を密封し、約５°Ｃで冷蔵庫で保存する。

マトリックスバイアルの内容物を１００ｍ１の目盛付容器に注き、生理食塩水を加えて液量を５Ｑｍｌとする。

約１０００木の１ＱＱバイアルに稀釈溶液を３．５ｍｌずつピペットで加える。

バイアル（ｒｌ：１００マトリツクスバイアル」）を密封し約５°Ｃで冷蔵庫で保存する。

例ろＡのポリビーズ小球（「ビーズ」）約１０．？をリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）で洗う。ビーズの濃縮浮遊液約２５０１１１ＪをＥＯＤＩ　（ｉ　ｇ、７ｍｌ水）１００ｍｌと共に７５０ｍ１の同じ緩衝液に加える。混合液を室温で１時間反応させる。次にビーズを同じ緩衝液で洗い、４係グリセロール含有緩衝液に再浮遊させる。

約７５０ｍ１のビーズをビーカーに入れる。水２５０ｍｅ中約２５ｍ９の精製した逆転写酵素（例８Ａ）を液量が約１１口ｔになるまで加える。混合液を４°Ｃで約１時間インキュベートする。

この混合液にｊＱＱｍ（！のＱ、２Ｍグリシ：／（ＰＨ７，６−８，０）又は１００ｍ１の牛血清アルブミン（２ＣＪ”９／ｍｌ）を静かに加え、室温（２４° Ｃ）でろ口分間定期的に混合しながら反応させる。次にビーズを「保存緩衝液」（０，０５Ｍ　）リスｐＨ７，８：　０．０００４　Ｍベ−ターノルカフ０トエタノール；　０，０４　Ｍ　ＫＣｊ！　０．２　ｍｙ　／　ｍｌ牛血清アルブミン：　０．０００１　Ｍ　ＭｎＣ！２２　Ｑ　４グリ七〇　−ル）で２回洗い、５ｆＪＪｍｌの保存緩衝液に再浮遊させる。

この混合液に１ｍ９７ｍ！アルカリ変性サケ精子ＤＮＡ（ミリポア社）５ｃｃを、４°Ｃで撹拌しながら加える。

この混合液を４°Ｃでろ０分間静かに撹拌する。これを次に保存緩衝液で洗い、適当量の保存緩衝液で約１．５ｔにして保存する。

この液を０．５Ｃｒ−ずつ約６０００本ノ１．０Ｃｒ−バイアルニ入れる。バイアル（ｒ−７）リツクスパイアル」）を密封し約５°Ｃで冷蔵庫に入れて保存する。

例１８　キットの使用例１に従い被験試料を調製する。２　ｃｃ−のバイアル（［試験バイアルｊ）に被験試料Ｑ、５ｃ、ｃを入れる。次に実施例１７Ｂの精製用マ）　ＩＪソクスパイアルを開けて、同じ２　ＣＣの試験バイアル中に注ぐ。混合液を２５°Ｃ（室温）で１５分間完全に振盪する。試験バイアルを遠心分離して（１００口、！９）ビーズと上澄液を分離する。（ビーズは回収し再使用する。）上澄を回収して同じ又は別の２印の試験バイアルに入れる。例１６のＤＮＡバイアルを開封し、２ｃｒ−の試験バイアル中の上澄に加える。この２つの溶液を激しく振盪して完全に混合する。

例１７Ａのマトリックスバイアルを開封し２Ｃｒ−の試験バイアルに注ぐ。激しく振盪して溶液を完全に混合する。この試験バイアルを室温（２５°Ｃ）で１５分間放置しておく。

試験バイアルを遠心分離しく１００口ｇ）ビーズと上澄液を分離す′る。（ビーズは回収し再使用のためにとっておく。）下記の定量法のために、上澄１ｃｃを１印のバイアル（「測定バイアル」）に入れる。

Ｂ、装　置例１８の上澄液の蛍光を測定する専用の装置を用いて定量を行なう。装置は図１に示す。これは遠近法で、断面を切断した図で、試験バイアルより少し高い見やすい位置で横に数フィート離れた位置から見た図である。装置の枠は木の箱−月一であり、図１には底２の表面、そして箱見の壁４と６の内表面のみを描いである。壁４と６は観察者から遠くにあるものであり、近くにあるはずの壁は切り取られており図１には記されていない。試験実施中は取りはずし可能なフタ８が箱をおおっている。箱およびフタの内面は黒く塗っである。

縦の穴１０がフタ８の中に位置しており、この穴１０の径は例１８の測定バイアル１２の径よりわずかに大きい。測定バイアル１２の中には被験試料である実施例１８の上澄液１４がはいっており、この液は蛍光色素で含有したＤＮＡ　−Ｌを含有している。穴１０の真下の底２の中に浅い穴又はへこみ１６があり、穴１０に入れた測定バイアル１２の底部は底２の決められた位置にきちんと収まるようになって（・る。

壁４に穴１８がおいており、これは壁６との距離は穴１０や１２とほぼ同じである。紫外線の光源（図には示してない）から光が穴１８を通過する。紫外線光源は４ワツトの紫外線ランプが好ましく、最大放出波長は３６０　ｎｍ　（ゼネラルエレクトリック社ＮＦ４Ｔ４／ＢＬ）である。異種の周波数を除去するために紫外線光源と測定バイアル１２０間にフィルターを入れることもできる。

壁６に穴２０がおいており、壁４からの距離は穴１０や１６とほぼ同じである。

光検出装置２０Ａ（図１には示してない）は穴２０のうしろにある。この光検出装置２０Ａは適当な光感受性装置てあｉｔば何でもよい。たとえばそれは光増幅管（たとえばハフマツ光増幅光増幅管）は便利である。装置２０Ａと測定バイアル１２の間にフィルター（図には示してない）を入牙ｔてもよい。

この装置を使うには、例１８の測定バイアル１２を穴１０を通して穴１６にのせる。紫外線光源を活性化させて（電源とスイッチは図示してない）、紫外線恭は測定バイアル１２の液１４を通過する。紫外線は色素を活性化して蛍光を出させ、可視光が全方向に放射放射は実質的に存在しない。蛍光ヱの強度を光検出装置２０Ａで測定し、装置２０Ａの出力は紫外線二に実質的に影響されない。

装置２０Ａの出力を処理し、図２に示した装置で表示させる。この回路が出力を増幅し較正し、市販の王権用デジタル電圧計（［ＤＶＭＪ）ディスシレーにうまく表示され、これは０００から９９９までの目盛がある。たとえば装置２０Ａの出力を匠とすると、回路の出力はｙ　＝　ａ　ｘ　−１−ｂとすることができる。ここでｙはＤＶＭディスプレイ上の読み値であり、ａとｂは、実施例１３の残液中に蛍光色素で標識したＤＮＡ　−Ｌが約つ例１４と１５の残液中に蛍光色素で標識したＤＮＡ　−りが約７０係存在するときにｙ−約７０口になるように選ばれた定数である。（これらの読み値はそれぞれ「悪性腫瘍なし」と「悪性腫瘍の可能性あり」に対応する。

図２に示したように光検出装置２０Ａの出力は前置増幅器２２に送られる。この前置増幅器は多数の市販の操作用増幅器チップのどれかでよく、好ましくは■ＯＴ、　７６１１又は■ＣＬ　７６２１なとのデュアルオペアンプ０チソゾがよ（・。Ｒａ（電位差計２４）の調節により増幅度が制（至）され、式ｙ＝ａｘ十すのａを制御する。

（前置増幅器２２の出力はＲａ／Ｒ×入力である。）前置増幅器２２の出力は加算器２６に逆られる。Ｒｂ（電位差計２８）の出力も加算器２６に送られ、ここで２つの入力が合計されろ。Ｒｂを調節することにより式ｙ＝ａｘ＋ｂ　のｂが制御される。加算器は演算増幅器又は差動増幅チップでよいが、好ましくはＩＣＬ７６２１（たとえばＲａｄｉｏ　５ｈａｃｋ　Ｎｏ、　ＲＳ　２７６−２６３１）のような演算増幅器又はデュアルチップ上の２番目のオペアンプでもよい。

加算器２６の出力は式ｙ−ａｘ十すのｙを表わす。

これはアナログデジタル変換器、増幅器およびデジタルディジレイより成るＤＶＭ装置３０に送られる。このような装置はテレダイン半導体チツ７°（’Ｔｅ’ ｌｅｄｙｎｅＥｒｅｍｉｃｏｎｄ、ｕｃｔｏｒ　Ｃｈｉｐ　）　７１Ｑ　７やろ個のＬＥＤ又はＬＣＤ表示チソチップ　Ｒａｄｉｏ　５ｈａｃｋ　Ｎｏ、　Ｒ８２７２−０５３又はＲａｃｌｉｏ　５ｈａｃｋ　Ｎｏ、　Ｒ８２７６−Ｑ　７５　）のような半導体装置で作り得る。あるいは増幅器、アナログデジタル変換器、ディスプレイ、バッテリーなどを内破する市販のＤＶＭを用いてもうまくいく。そのような装置の典型的なもののひとつはＦｌｕｋｅ　ＤＶＭＭｏｄｅｌ　Ｎｏ、３０２２　Ｂであり、もうひとつはＲａｄｉ。

５ｈａｃｋ　Ｎｏ、　Ｒ８２２−１９１である。

前記の装置は例１６−１８に記載のキットと共に使用した鳴合、残液中の標識ＤＮＡ　−Ｌのおよその係を示す数値を自動的に与える。以後この装置を「ＤＮＡ　−Ｌ装置」と呼ぶ。

特に、異なるパッチの反応物は異なる酵素的又は色素の活性を有しているため、ＤＮＡ−Ｌ装置を時々較正する必要がある。

例１９−　ＤＮＡ　−Ｌ装置の較正例１６の１．　Ｑ　ｃ、ｃのＤＮＡバイア＃　（Ｑ、５　Ｃｍ中５０口ｎｇのＤＮＡ　）を「バイアルＡ」と書いて、開ける。バイアルへの内容液の５分の１（３，１ｃｃ中Ｉ　Ｄ　ＯｎｇのＤＮＡ　）を別の１．０００バイアルに移し、「バイアルＢ」と書く。

各バイアルに生理食塩水を加えて液量を１．Ｑｃｃとする。

バイアルＡより０．１２５ＣＣをピペットで取り、捨てる。

バイアルＡに生理食塩水を加え液量を１．０Ｃｒ−とする。

これでバイア／ｌ／　Ａは１．０ｃｃ−中３５０　ｎｇのＤＮＡを含有し、バイアルＢは１．０ＣＱ中１００　ｎｇのＤＮＡを含有する。

バイアルＡをＤＮＡ　−Ｌ装置の穴１０と１６に入れる。

電位差計ＲａとＲ’ｂはそれぞれの中間点のあたりにセットしておく。紫外線の電源も含み、装置の電源を入れる。

もしディスシレーの読み値が７００より大きいか又は小さいとき、Ｒａを調節して読み値が以前の読み値と７００の中間にくるようにする。電源を切りバイアルＡをとりのそく。そこへ今度はバイアルＢを入れる。

装置に電源７入れる。もしディスプレイの読み値が２０口より大きいか又は小さいとき、Ｒｂを調節して読み値を以前の読み値と２０口のほぼ中間にくるようにする。電源を切りバイアルＢをとり出しそのかわりバイアルＡを入れる。

前記２段落の操作をそれぞれの読み値が７００および２００になるまで繰返す。

例２０ＤＮＡ−Ｌ装置の使用例１８の１．ＱＣＣ−の測定バイアルを較正法のＤＮＡ　−Ｌ装置に入れる。電源を入れＤＶＭの読み値を記録する。

正常被験者については記録計の読み値は約２００であり、活性の白血病を有する人では読み値は７０口か又はそれ以上となる。読み値が２００と７００の間にあるときは結論は得られず、試験誤差又は白血病の初期の可能性があるため２回目の試験が必要である。もし２回目の試験の読み値が２００と７００の間にくるときは例２１の方法を実施する。

白血病の初期であることが疑われる患者（たとえば実施例２０の最終段落の方法において読み値が２００−７［］０であるため）から得た被験試料について、例１Ｂの方法を行なう。しかしふつうのＤＮＡやマトリックスバイアルのかわりに、ここでは例１６や１７Ａの１′１０Ｑ　ＤＮＡやマトリックスバイアルを用（・る。

例１６のＤＮＡバイアルのかわりに例１６の１　’　１００ＤＮＡバイアルを用 ℃・Ａ′とＢ′として、例１９に従いＤＮＡ−り装置を再較正する。（Ａ′はＡに対応しＢ′はＢに対応する。バイアルＡ′は１．Ｑｃｃ中３−５　ｎｇのＤＮＡを含有し、バイアルＢ′は１．Ｑｃｃ中１　ｎｇのＤＮＡを含有する。）較正後、例２０の方法を実施する。読み値が約２００の嚇合は患者試料中にＤＮＡ　 −Ｌが存在しないことを示している。読み値が５００又はそれ以上のときは患者試料中にＤＮＡ　−Ｌが存在することを示しており、白血病の可能性を示唆している。従ってこの診断を確定するためにさらに綿密な検査が必要であることを示して前記の方法はこれまで医学において未知であった全く新しい診断法を与える。提供者から得られそれから精製しなければならない物質（酵素を除く）以外は、純粋な実験室で作った反応物質（たとえばクローン化ＤＮＡ　）を、この方法において使用することが重要であると考えられる。前記の方法はＤＮＡ　−Ｌ　（ＤＮＡ　ｌおよびＤＮＡ　−２と考えられるＤＮＡ　）を使用しているが、他の悪性腫瘍（すなわちリンパ系の腫瘍以外）に関連するＤＮＡが見つかり、前記した方法を若干変更した方法において有効であることがわかり、同嘩の方法で同じタイプの結果が得られるであろうと本発明者は考えている。

さらに適当な酵素結合マトリックスの調製に他のマこともできる［７、酵素が化学的に結合したポリスチレン又はラテックスビーズを用いることもできる。後者の例としては親水性ラテックス球（「コバスフイアＭＸ」又は「ＦＸ」、コパレントテクノロジー社、ＡｎｎＡｒｂｏｒ　、　Ｍｉｃｈｉ（４ａｎ　）がある。

酵素の結合しうる実質的に不溶性の物質は酵素結合マトリックスの調製に使用できるので、このような物質を使って本発明を実施することができる。関連するＤＮＡに対し選択的親和性を有する（すなわち選、択的に結合できる）酵素も使用できる。従ってここで使用される「酵素結合マトリックス」とは、ここに記載したＤＮＡと選択的に結合（又は選択的に阻害される又は「選択的親和性を有する」）する酵素に対し結合し５るようなマトリックスを包括するものである。

本発明は主に具体的かつ好適の態様に関して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなくさらに変更することは可能である。そのような変更法のうちいくつかは前述した。本発明は、一般に本発明の原理に従い、本発明の関係する分野で公知の又は習慣的な方法内蹟あるか、又は当業者にあきらかな、本開示からの逸脱も含む、全ての変法、使用法、又は改良法を含んでいる。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．　ヒト又は動物体内における悪性腫瘍の有無を測定する方法において、１）試料を被験者又は被験動物より取った体液試料より調製する工程、２）この試料を少なくともひとつのＤＮＡ　（その体液中に存在することが、この試験において検出する目的の悪性腫瘍と関係があり、標識されている）を含有する調製液と混合する工程、ろ）この混合液を、前記ＤＮＡが選択的親和性を有する酵素の結合した酵素結合マ）　ＩＪソクスに導入する工程、そして４）酵素結合マトリックスに結合している又は結合していない標識ＤＮＡの比率を定量する工程より成る、上記悪性腫瘍の検査方法。２　標識ＤＮＡ　ＩＪ″；　ＤＮＡ　−Ｌであり、悪性腫瘍が白血病である、請求の範囲第１項記載の方法。ろ　酵素Ｒ−ｉＤＮＡ　ポリメラーゼが酵素結合マトリックスに結合している、請求の範囲第１項記載の方法。４　第３工程の前に酵素結合マ）　ＩＪソクスを、体液中に存在すること゛がこの試験において検出する目的の悪性腫瘍に関係のあるＤｊｌ　Ａ以外の少なくともひとつのＤＮＡで前処理する、請求の範囲第１項記載の方法。５、ＤＮＡが蛍光色素で標識しである、請求の範囲第１項記載の方法。６、ＤＮＡがリン６２とトリチウムより成る群の一員で標識しである、請求の範囲第１項記載の方法。７　精製マトリックスを用いて、試料より異質ＤＮＡを精製除去する工程を、第１工程と第２工程の間にさらに含む、請求の範囲第１項記載の方法。８　ヒトの患者の白血病の存在の有無を測定する検査方法において、１）患者の血液から試料を調製する工程、２）この試料を、標識ＤＮＡ　−Ｌを含有する調製液と混合する工程、３）混合液を、Ｒ−ｉ　ＤＩ、ＩＡポリメラーゼの結合した酵素結合マトリックスに導入する工程、そして４）酵素結合マトリックスに結合している又は結合していない標識ＤＮＡ　−Ｌの比率を定量する工程より成る、上記白血病の検査法。９　第３工穆の前に、酵素結合マトリックスをＤＮＡ−Ｌ以外のＤＮＡて前処理する、請求の範囲第８項記載の方法。１０　悪性腫瘍の有無の検査に使用するのに適した酵素結合マ）　ＩＪラックス調製する方法において；る目的の悪性腫瘍の存在と関係がある最初のＤＮＡを選択する工程；最初のＤＮＡが選択的親和性を有する酵素を選択する工程；上記酵素の結合する実質的に不溶性のマトリックス物質を選択する工程；この物質から上記酵素の結合した酵素結合マ）　ＩＪラックス調製する工程；最初のＤＮＡ以外の少なくともひとつの２番目のＤＮＡで、上記マトリックスを前処理する工程、より成る、上記調製方法。１１、悪性腫瘍が白血病であり、最初のＤＮＡ　＃″−ＤＮＡ　−Ｌである、請求の範囲第１０項記載の方法。１２、酵素がＲ−ｉＤＮＡポリメラーゼである、請求の範囲第１０項記載の方法。１ろ、白血病の有無の検査如使用するのに適した酵素結合マトリックスの調製方法において、１）　Ｒ−ｉ　ＤＮＡポリメラーゼが結合しうる、実質的に不溶性のマ）　ＩＪラックス質を選択する工程；２）マトリックス物質と酵素の溶液を完全に混合する工程；３）このマトリックス物質の水を除去し、洗浄する工程；そして４）トのマトリックスをＤＮＡ　−Ｌ以外のＤＮＡで処理する工程、より成る、上記酵素結合マトリックスの調製方法。１４、体内に存在することカ１″−悪性腫瘍の存在と関係のあるＤＮＡに対し選択的親和性を有する酵素の結合ｔ、たマトリックスより成る、悪性腫瘍の有無の検出に使用するのに適した酵素結合マトリックス。１５　悪性腫瘍が白血病であり、ＤＮＡ　；／ｌ″：　ＤＮＡ　−Ｌである、請求の範囲第１４項記載の酵素結合マトリックス。１６　酵素がＲ−１ＤＮＡポリメラーゼである、請求の範囲第１５項記載の酵素結合マトリックス。１７　他のＤＮＡが実質的に混在していない実質的に純粋なりＮＡ　−Ｌ　０１８、ＤＮＡ　−ＬがＤＮＡ　−１である、請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ− Ｌｏｉ９．　ＤＮＡ　−ＬがＤＮＡ　−２、特許請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ　 −Ｌｏ２０、　ＤＮＡ　−Ｌが標識ＤＮＡ　−Ｌである、請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ−Ｌ　。２１　標識ＤＮＡ　−Ｌをリン３２とトリチウムより成る群の一員により標識する、請求の範囲第２０項記載のＤＮＡ　−Ｌ　０２２、他のＤＮＡが実質的に混在していない、ＤＮＡ　−１とＤＮＡ　−２の実質的に純粋な標識混合物。２ろ　他のＤＮＡが実質的に混在して〜・ない実質的に純粋なりＮＡ　−Ｌを標識した化合物のあらかじめ測定した量を含む第１の容器と、あらかじめ測定した量のＲ−１ＤＮＡポリメラーゼの結合した酵素結合マトリックスを含む第２の容器、より成る製造品。２４、　ＤＮＡ　−Ｌが蛍光色素で標識される、請求の範囲第２６項記載の製造品。２５、第１の容器のＤＮＡ　−Ｌの分子の数が、第２の容器中の酵素の活性酵素部位の数より若干多い、請求の範囲第２６項記載の製造品。２６　精製用マ）　ＩＪソクスを含む第６の容器のある、請求の範囲第２６項記載の製造品。２Ｚ　白血病又はリンパ性悪性腫瘍に関係があるＤＮＡの存在の有無を体液試料について測定する装置において、支持装置に対しあらかじめ決められた位置に容器を保持する、容器を支持するように改造した支持装置；蛍光色素で標識したＩ）ＮＡ　−Ｌの溶液を含む、上記支持装置で支持された、実質的に透明の容器；上記容器中の上記溶液を発光させる様に配置させた、発光体を有する、上記支持装置に隣接する発光装置；上記支持装置に隣接し、上記発光体から離れている光検出器で、容器中の標識ＤＮＡ　 −Ｌの溶液がもし光を発する場合はその光を受け取るように配置させ、容器中のこの容器に発光装置より光を当てた場合、電気出力を発生するように作り、その電気出力は容器中の蛍光色素で標識したＤＮＡ−Ｌの溶液の蛍光強度に応答するような光検出器；そしてこの電気出力を記録する装置、より成る、上記測定装置。