JPS59501972A - 微生物によるインジゴの生成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「微生物によるインジゴの生成ｊ １且 本発明は、一般に微生物により染料を生成することに関連し。

より具体的には、インドールが存在しない培地内での微生物による生成に関連す る。

インジゴあるいはインジゴチンは、アジア、東インド、アフリカおよび南アメリ カに生育する多くの植物に、配糖体として存在し、長年にわたって青色染料とし て使用されてきた。インジゴは。

主にインジゴチンラ（江…１，５２ｊ３■）属およびイサθス（Ｉｓａｔｕｓ） 属の植物から得られ、最も古いものとして知られている織物、即ち、紀元前２０ ００年にまで遡るミイラのリネン巻重を青色に染めるのに使用された。１９世紀 の中頃には、インジゴはヨー口・７パと東洋の交易の主要品目となった。インジ ゴ分子の構造の解明と合成に成功する以前は、天然のインジゴを使用するには、 長時間の発酵プロセスを行い、染料を可溶性で無色のインジヵンの形で遊離させ て織物に浸透させた。織物とインジヵンをバットの中にｔ＋　？Ｍすれば、可溶 性のインジヵンは容易にグルコースとインドキシルに加水分解した。空気に曝す こと等の弱い酸化によって、インドキシルはインジゴに変わり、織物の繊維内で 色素が再生した。

１９世紀には、この価値のある化合物の構造を知るために多大な努力が成された 。化学式ｃ１６　Ｈｘｏ　Ｎ２０２に対応するインジゴの化学構造は、アドルフ ・フォノ・バイアー（Ａｄｏｌｆ　ｖｏｎ　Ｂａｅｙｅｒ）によって、その１８ 年に渡るこの染料の研究の後に、　１８８３年に発表された。しかし、商業的に 実施可能な製造プロセスは、　１８８７年頃まで開発されなかった。今日もなお 世界中で使用されているこの方法は、苛性ソーダとナトリウムアミドの混合物に フェニルグリシネート・ナトリウムを融解してインドキシルの合成を行う。産業 的に成功したプロセスはいずれも、インドキシルを空気酸化させてインジゴに転 化する最終過程がある。これまで、インジゴは主に木綿あるいは毛織物を濃紺色 の色合に染めるために使用されている。しかし、この化合物は太陽エネルギーを 集めるプロセスにも使用出来る可能性がある。〔英国特許１，５５４，１９２を 参照のこと。

微生物による青色色素の生成の先行観察が本発明の背景と関連がある。選択的培 養法を用いて、ある実験家が１９２７年に、インドールを分解して青色の結晶を 形成することのできるある土壌微生物シュードモナス菌・インドロキシダン（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　１ｎｄｏｌｏｘｉ幅）を分離した。その細菌を含む培養 に出現した青色の粒子は。

水、アルコール、エーテル、キジロールおよびペンゾールには熔けないが１強い 硫酸には溶けて、青い溶液が得られたが、この液は絹を青色に染めた。この実験 家は、インドキシルはおそらくこの微生物の細胞内で形成されるのではなく、青 い結晶の形成は。

増殖した細菌から拡散する細胞外酵素の生成によるものであると結論した。この 微生物は、エネルギー源としてインドールを用いることができず、そのうえ、追 加の炭素源が無いとインドールをインジゴチンに酸化することもできなかったが 、炭素が供給されるとインドールを酸化することが出来た。炭素対窒素の高比率 が。

シュードモナス菌・イントロキンダン（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　１ｎｄｏｌｏ ｘｉｄａ旦）の増殖とインジゴチンの生成に最も適しているように見えた。

さらにこの実験家が行った観察によると、インドールはこの微生物の成長を抑え るように見え、インドールが費消されるとすぐに微生物は急速に増殖した。イン ドールの酸化は、この微生物の増殖の初期段階にのみ起きることが観察された。

培養中にはインドキシルは全く見られず、インジゴチンはさらに酸化してイサチ ンになることはないように見えた。この実験者は、その他の２種類の土壌微生物 、ミコバクテリウム・グローベラルム（＄ｉｕｍ　ｌｏｂｅｒｕｌｕｍ）　オよ ヒマイクｔ１７７カス（肛肛匹匹赳辷鮭旦匹ｅｎｓｉｓ　）　モインドール細菌 培養基上でのみ少量のインジゴチンを生成できることに気づいた（Ｇｒｅｙ＋　 Ｐ、Ｈ８＋　’土壌細菌によるインドールからのインジゴチンの生成」、−勤狸 バい立、Ｐｒ匹より、１０２：２６３−２８０　（１９２７年）を参照のこと〕 。

「青色色素Ｊを生成するシゾフィラム・コミューン（匙…ｍｙＵＵｉｍ　ｃｏｍ ｍｕｎｅ　）菌類の単一突然変異体培養についても報告がある。この培養は、グ ルコース＋　（ＮＨ４）２　ＨＰＯ４、チアミン。

ＫＨ２ＰＯ４、に２　ＨＰＯ４、およびＭｇ５ｏ４　・７Ｈ２ｏを含む化学的な 性質が分かった合成培地が使用された。アンモニウム・イオンがその窒素源であ った。赤と青の両方の色素が、菌糸温浸物から採取された。この温浸物からクロ ロホルムを用いて抽出した青色色素が何であるかは、溶解度試験、吸収分光試験 、および化学分析によって確認された。これらの試験の結果は全て、青色の色素 がインジゴであるという結論と合致していた。（Ｍｉｌｅｓ。

Ｐｏ等、ｒシゾフィラム・コミューン（Ｓｃｈｉｚｏ　ｈ　ｌｌｕｍ　ｃｏｍｍ ｕｎｅ　）の突然変異体の培養から生成された色素としてインジゴの確認」。

生化学ならびに生物物理学の資料（勧並旦ｅｓ　ｏｆ　Ｂｉ匹抑７ａｎｄ　Ｂｉ ｏ　ｈ　５ｉｃｓ）　、　６２　：　１−５　（１９５６年）を参照のこと。〕 １９６２年に、微生物クロモバクテリウム・バイオラシム（島皿皿ｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　）による色素バイオラセインの生合成に関する研 究が実施され、この微生物はり、トリプトファンを容易にハイオラセインに変え たが、このアミノ酸を増殖には利用しなかった。実験家たちは、Ｌ、トリプトフ ァン専用の新規の微生物定量法を考案したが、この方法においては、生成された り、）リプトファンの量は試験量ンプル中のり、）リプトファン量の関数であっ た。

凍結乾燥した細胞とともにり、）リプトファンを装置すると、インドールが一時 的に形成され、４８時間の卿置後には濃い青色色素が合成された。着色物質は、 その色、吸収スペクトル、および薄層クロマトグラフィーの移動比値がらインジ ゴであることが分かった。実験家たちは、インドキシルがこの細菌内のインジゴ 経路の中間体であるという結論に達し、さらにトリプトファナーゼ、即ちトリプ トファン・シンセターゼの働きにより、クロモバクテリウム・バイオラシム（Ｃ ｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　）はり、）リプトファン をインドールに変化させることを見つけた。この微生物は、Ｌ、トリプトファン からだけでなく、インドールからもバイオラセインを合成した。バイオラセイン 経路の酵素を急速な凍結乾燥により不活性化すると、し、トリプトファンとイン ドールはいずれもインジゴに変化した。（Ｓｅｂｅｋ、　０．とＪａｅｇｅｒ； 　Ｈ，’クロモバクテリウム・バイオラシム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　Ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　）におけるインドール代、謝の分岐経路Ｊ　、　Ｎａｔ ｕｒｅ、　１９６　：　７９３−７９５（１９６２年）を参照のこと。〕 もっと最近の報告によると、実験家たちは、インドールを炭素および窒素の唯一 の供給源として用いた強化培養法により、土壌からある微生物を分離した。イン ドール、ＫＨ２ｐｏ、、、に２ＨＰＯ４、ＮａＣ１，ＭｇＳＯ４，水、および酵 母エキスを含んだ培地で成長させると急速にインドールを分解するある好気性グ ラ回インドールが加えられた。収穫した細胞は鮮明な青色をしており、基質１モ ルにつき１１〜１３＋１１ｉＩの酸素原子を／ｌ！ｉ貸してインドールを分解し た。この微生物の培養に、インドールに代えてアントラニル酸、グルコースある いはグリセリンを用いると、細胞はインドールの分解能力を示さず、その活性は 誘導的であることを示した。インドールを用いて増殖させると、この微生物はイ ントールをオキシインドール、アントラニル酸およびカテコールに分解した。こ の微生物の無細胞抽出液は、酵素のジオキシインドール・オキシゲナーゼを含み 、この酵素はジオキシインドールのアントラニル酸塩と二酸化炭素への変換の触 媒作用を行った。このジオキシインドール・オキシゲナーゼは、微生物をインド ールを用いて増殖する場合にのみ現れる誘導酸素であることが確認された。

これらの実験室が提唱したインドールの分解経路は、インドール−インドキシル 　−　ジオキシインドール　−　アントラニル酸　−カテコールであった。（Ｆ ｕｊｉｏｋａ、　Ｍ、と−ａｄａ、　Ｈ０＋　’細菌によるインドールの酸化ｊ 、生化学ならびに生物物理学の公式％式％（１９６８ 年）を参照のこと。〕 これまで、上記微生物のいずれも、インジゴの大規模な微生物による合成に用い られたことはない。これは、主に、インドールを基質として供給したり、あるい は増殖培地の厳密な栄養素のバランスを保持することに関連する経済的要因が不 利であることによるものと思われる。

動物の腸管に固有の腸内細菌（例えば、イー・コリ（Ｅ、ｃｏ旦））は、トリプ トファナーゼ構造遺伝子により生成される酵素であるトリプトファナーゼの活性 により、インドールを蓄積することができる〔例えば、　Ｐｏ５ｔ等、　Ｐ、Ｎ 、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ、　７６：１６９７−１７０１　（１９７９）を参照のこと 〕。分解用酵素と考えられるトリプトファナーゼは。

トリプトファンの分解の触媒作用を行い、インドール、ピルビン酸塩、およびア ンモニアの化学量論的生成が起きる。関連する酵素であるトリプトファン・シン セターゼも、インドール・グリセロール燐酸およびセリンからトリプトファンを 合成する触媒となる。イー・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）においては、トリプトファ ナーゼの合成は、トリプトファンによって誘導可能である。トリプトファナーゼ の構造遺伝子イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ１２のｔｎａ＾は、クローンが作 られ、配列が明らかにされている。

Ｄｅｅｌｅｙ、　Ｍ、等、「イー・コリ　（Ｅ、ｃｏ旦）　Ｋ１２のトリプトフ ァナーゼの構造遺伝子のヌクレオチド配列」、細菌学（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌｏ　。

ｌ）　、１４７：　７８７−７９６　（１９８１年）、およびＤｅｅｌｅｙ、　 Ｍ、等、「イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ１２のトリプトファナーゼ・プロモ ーターでの転写の開始」、細菌学（ム」匹印旦虱郊、Ｌ、＞　１５１　：　９４ ２−９５１（１’１８２年）を参照のこと。腸内細菌は単純な培地でも成長出来 るが、インドールをインジゴに変換する酵素的手段を持たない。

本発明の背景に特に関、係があるのは９本発明者の１９８２年９月２０日出願の 同時係属出願の合衆国特許出願第４１９，９５３号であり、Ｒ目は「芳香族炭化 水素の微生物による酸化の方法と材料Ｊで、その開示をここに参照して本明細書 に明確に編入する。この同時係属出願において、出願人は、とりわけ、遺伝可能 なプラスミドｐＥ３１７を記述しており、このプラスミドはシュードモナス菌・ プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ匹旦釦）由来のＤＮＡ配列を含み、この配列 はナフタリンのサリチル酸塩への酸化分解に関与する酵素の宿主微生物における 発現のコードを決める。端的に述べると、同時係属出願は、イー・コリ（Ｅ、ｃ ｏｌｉ　）等の微生物を形質転換して。

通常はナフタリン等の芳香族化合物の微生物による鉱化において過渡的に形成さ れる有用な中間物を選択的に生成且つ蓄積する能力を付与するために、　ｐ’Ｅ ３１７およびその他のプラスミドを使用することを開示するものである。プラス ミドｐＨ３１７がコードを定める酵素には、ナフタリン・ジオキシゲナーゼが含 まれる。この酵素は、ナフタリンのシス−１，２−ナフタリン・ジヒドロジオー ルへの転換の触媒作用を行う。本出願者ならびに彼の共同研究者は。

シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、ＮｃＩＢ　９８１６）から 得た多成分酵素システムによるナフタリンの酸化に関する徹底的な研究を以前に 実施しくＥｎｓｌｅｙ等、細菌学（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ　）　１４９　 ：９４８−９５４　（１９８２年）を参照のこと）、ナフタリンの酸化における 最初の反応を、３つの蛋白質成分から構成される酵素システムが関係するもので あるとした。

従って９本技術においては、微生物を用いてインジゴを生成する効率のよい方法 の信頼出来る説明はこれまで成されたことがない。インドールを合成し蓄積する ことができるある種の微生物およびインジ゛ゴ合成の基質としてインドールを用 いる能力があるある種のその他の微生物が存在することがわかっているにもかか わらず、これが実情である。

要約 本発明は、インドールが存在しない培地で増殖する遺伝学的な形質転換を行った 微生物内でのインジゴの微生物による生成の最初の例を提供するものである。

本発明の態様の一つとして１本発明は、インドールを生成し蓄積する代謝能力を 有する選択された微生物内でインジゴを微生物学的に生成するプロセスを提供す る。このプロセスは、一種以上の芳香族ジオキシゲナーゼ酵素を合成する能力を もつように、微生物に安定的な遺伝的な形質転換を行うことを含む。本発明にお いて操作できるジオキシゲナーゼ酵素は、微生物による芳香族炭化水素のシスジ ヒドロジオールへの酸化転換の触媒となる。形質転換された微生物は、インドー ルの酸化転換の触媒となるジオキシゲナーゼ酵素触媒の作用を促進する条件のも とで増殖される。

予測される酸化転換反応生成物は、シス−インドール−２，３−ジヒドロジオー ルである。この生成物は１次ぎに、インドキシルに転位するものと考えられ、そ してインドキシルは空気が存在するもとで縮合してインジゴとなる。そして、イ ンジゴは、微生物あるいはその増殖培地から分離される。

その現時点で最も望ましい形態の一つにおいて、インドールを生成し蓄積する代 謝能力を既に有する微生物内でのインジゴの微生物学的な製造は、大腸菌（Ｅ、 　ｃｏｌｉ　）を宿主細胞微生物として用いて達成される。遺伝的な形質転換過 程には、ピー・プティダ（ｈ匹旦鎖）ナフタリン鉱化プラスミド１ａｈ７から得 た。シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）由来の芳香族ジオキシゲナ ーゼであるナフタリン・ジオキシゲナーゼの発現のコードを定めるＤＮＡ配列を 含むＤＮＡベクターによる形質転換が含まれる。この目的に適切な発現ベクター は、同時係属出願第４１９．９５３号に記載されたｐＥ３１７である。

本発明のプロセスの実施には、トリプトファナーゼ酵素を合成する能力を持つよ うに安定的に且つ遺伝的に微生物を形質転換させる過程、そしてトリプトファン をピルビン酸塩とインドールに分解するトリプトファナーゼ触媒分解を促進する 条件のもとて微生物を増殖する過程を追加することも出来る。トリプトファナー ゼ酵素ならびに芳香族ジオキシゲナーゼ酵素を合成する能力を発生（あるいは促 進）するための宿主微生物の遺伝的な形質転換は。

両方のタイプの酵素のコードを持つＤＮＡ配列を含む単一のＤＮＡベクターを用 いて形質転換を行うとにより達成できる場合がある。

このように１本発明は、インドールを生成し蓄積する代謝能力を持たない選択さ れた微生物において、そしてまた、前述の能力を持つものにおいて、インジゴを 微生物によって製造するプロセスを提供する。「複合的に形質転換された」微生 物は、トリプトファンのインドールへの転換のトリプトファナーゼ酵素触媒作用 と、インドールの細胞内でさらに「処理ｊされてインジゴに転換する酸化形態へ のジオキシゲナーゼ酵素触媒酸化転換を共に促進する条件のもとで増殖させるこ とが出来る。インジゴは、その後に微生物および／あるいは周囲の培地から分離 することが出来る。

従って１本発明はさらに、微生物による芳香族ジオキシゲナーゼ酵素とトリプト ファナーゼ酵素との合成のコードを定めるＤＮＡ配列を含む新規のＤＮＡ形質転 換ベクターを提供する。「インジゴ・オペロンｊは、単一ベクターに組み込んで もよく、そのオペロンにおいては、トリプトファナーゼとジオキシゲナーゼの両 方の酵素のコード領域は単一のプロモーター／レギュレーターにより制御される 。オペロンのプロモーター／レギュレーターは、微生物宿主中において両酵素を 同時に働かせることを可能とし、トリプトファンからインドール、そしてインド ールからシス−インドール−２，３−ジヒドロジオール、そして最終的にインジ ゴへの連続的な触媒作用が起きる微生物のｒシンク」を生み出す。プロモーター ／レギュレーターは誘導物質あるいは培養温度の変化に敏感であることが望まし い。

本発明のさらに別の態様によると、一種あるいはそれ以上のジオキシゲナーゼ酵 素を合成する（ゲノムあるいはプラスミドを担体とするＤＮＡ配列の発現による ）能力をもつ微生物は、インドールが存在しない培地で増殖するとインジゴを生 成する能力を持つように遺伝的に変更される。このような遺伝的な変更は、トリ プトファナーゼ酵素を合成する能力を持たせるための安定した形質転換を伴う。

本発明のその他の態様および利点は、その現時点において望ましい実施！３様の 以下に示す詳細な説明を考慮すれば自ずと明らかになる。

詳１じｌ１肌 本発明の実例を示し且つ現時点における望ましい実施態様を成す方法および材料 は、特に、シュードモナス菌・プティダにｄｏｍｏｎａｓ　匹旦ｂ）由来のプラ スミドを担体とするＤＮＡ配列に関係し、これら配列は望みのインドール生成宿 主微生物種９例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）を形質転換するのに用いること が出来る。プロセスとＤＮＡ形質転換ベクターのこの実施態様により形質転換さ れた細胞は、　ＤＮＡ配列を最初のジオキシゲナーゼ酵素（あるいは酵素システ ム）の合成の形で発現し、この酵素は蓄積されたインドールをシス−インドール −２，３−ジヒドロジオールに変えることが可能である。次にジヒドロジオール は転位してインドキシルを形成し、インドキシルも選択された宿主微生物内に蓄 積する。後者の生成物は、空気の存在のもとで、インジゴに変換される。

本発明を実施する上で役立つジオキシゲナーゼ酵素のコードを持つＤＮＡ配列は 、芳香族炭化水素のシス−ジヒドロジオール型への微生物による酸化変換の触媒 となる一つ以上の酵素を合成し蓄積する能力を示す微生物種に組換え方法を用い て入手してもよい。

本発明に使用するＤＮＡ配列を特に提供することになると考えられるのは、増殖 培地に供給されたインドールをインジゴに変換する能力を持つことが経験的に確 認された微生物である。このような微生物の一つは、シュードモナス菌・プティ ダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ匹旦堕）　ＰｐＧ７で、遺伝可能なナフタリン分解 プラスミドｎａｈ７を含んでいる。この微生物は、同時係属特許出願第４１９， ９５３号に説明した芳香族炭化水素の酸化の選択的手順に使用されたプラスミド ｐＥ３１７の開発の親株である。ピー・プティダ（見工ＰＩ力ｂ−ＮＣＩ８９８ １６）も適切なりＮＡ配列をもたらすものと思われ、これはｎａｈ７に似通った （そして、おそら（同一である）遺伝可能なナフタリン分解プラスミドを含んで いる。これらの微生物はいずれも、それらの増殖培地の成分としてインドールが 供給されるとインジゴを生成することがこれまでに観察されている。

さらに本発明の実施のためのジオキシゲナーゼ酵素のコードを持つＤＮＡ配列の 有用な供給源になると思われるものは、ナフタリン以外の芳香族炭化水素（例え ば、トルエン、ベンゼンおよびその他）の酸化鉱化能力を持つ微生物であり、酵 素のコードを持つ遺伝子の担体がプラスミドであるかゲノムであるかは関係ない 。

このような微生物の例として、　Ｙｅｈ等、坦ｙ山狐、＆旦男躬１２蝕５−Ｃｏ ｍｍ、、　７８　：　４０１−４１０　（１９７７）に記載のＰｓｅｄｏ−ｍｏ ｎａｓ　ｕｔｉｄａ’ＴＯＬ　Ｊ　ｌおよびＧｉｂｓｏｎ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 、、　９　：　１６２６−１６３０　（１９７０）に記載のムーμ＋ｔｉｄａ　 ３９／Ｄを挙げることが出来る。これらの微生物はいずれも、トルエンの酸化の 生成物としてのシス−トルエン−２，３−ジヒドロジオールの形成の触媒作用を 行うジオキシゲナーゼ酵素を合成する能力を示す。これらの微生物はいずれも、 それらの増殖培地の成分としてインドールが供給されるとインジゴを生成する能 力を示すことが既に観察されている。

ジオキシゲナーゼ酵素のコードを持つＤＮＡ配列が適当なベクターによって、そ れ自身のトリプトファナーゼｇ！素を持つ微生物。

例えばイー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）に形質転換されると、この微生物はト リプトファンからインジゴを生成することが出来る。下記の説明的な例は、（１ ）アンピシリンを含む内容が明確な培地での増殖の際に本発明のベクターを持つ 微生物によって生成された青色色素が何であるかの確認、　（２１ＯＮ＾ベクタ ーのＤＮＡコード領域により生成されたナフタリン・ジオキシゲナーゼ酵素が、 イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）によって内部で生成されたインドールと反応し ていることの確認、そして、（３）組換えイー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）に よるインジゴ合成の速度の測定を取り扱う。

１ プラスミドｐＥ３１７は１合衆国特許出願第４１９，９５３号の例４に記載のと おりに開裂された。イー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）がｐＥ３１７によって形 質転換され、２００μｇ／ｍＡのアンピシリンを含むルリア（Ｌｕｒｉａ　）ブ ロスで増殖されると、−晩の情誼の後に青色色素が培養培地および細胞内に生成 するのが観察された。

青色色素は、下記の手順によって精製され何であるかが確認された。ｐＥ３１７ を含むイー・コリ　（Ｅ、ｃｏ旦）　ｌ（［１１０１は１８時間に渡って、（ｇ ／Ｌ）Ｌｏｇ　Ｋ２　ＨＰＯ４，３，５ｇ　Ｎａ　（ＮＨ４）ＨＰＯ４・４Ｈ２ ０，２，０ｇ　クエン酸・Ｈ２０，０，２ｇ　Ｍｇ３０４・７Ｈ２０から成る鉱 物塩培地２５０ｍｆに０．２５％グルコース、２５ｔａｇ／Ｌのプロリンとロイ シン、そして２．０　ｍｇ／　Ｌアンピシリンを加えたものを入れた２つの１！ フラスコ内で増殖された。フラスコは２５０回転／分で振り動かされ且つ３０℃ に保たれた。

増殖の後に、細胞は使用済みの培地から遠心沈澱法によって分離され、濃い青色 の細胞ペレットと透明な淡黄色の上澄（みが得られた。細胞ペレットは、２５ｍ Ａの沸騰クロロホルムによって８度に渡って抽出された。有機抽出物はまとめて 、アルゴンガスの流れのもとて１０ｍｊ！に減容された。有機抽出物は、無水硫 酸ナトリウムの上で乾燥され、クロロホルムの中で既に平衡にしたシリカ・ゲル ６０コラム（，２，５Ｘ　５　ｃｍ　）の上面に置かれた。青色色素はクロロホ ルムによってコラム内で洗われ、４．０ｍｊ＋の留分が得られた。青色色素を含 む留分は、クロロホルム：酢酸；メタノール＝４０：２：１（容積／容積）の溶 媒システムで展開した薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）・シート（ＥＭ試薬、 シリカ・ゲル６０Ｆ２５４）上のクロマトグラフィーによって純粋か否かを分析 された。

ＴＬＣによる分析の後に単一の紫外線吸収スポットを含むこれらの青色の留分は まとめて、真空のもとて溶媒を除去された。この手順の結果、　２６　ｍｇの濃 い青色の結晶が得られた。結晶は少量のクロロホルムに熔解され分析された。青 色の色素は１合成インジゴ（コダック（Ｋｏｄａｋ　）　）のクロマトグラフィ ー特性、可視、紫外。

質量および赤外スペクトルと同一のものを示した。このデータは。

組換えイー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）によって上述の条件のもとで増殖する 際にインジゴが生成されたことを示している。

輿１ クローンされたナフタリン・ジオキシゲナーゼ遺伝子から合成された酵素がイー ・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）によって内部で生成されたインドールと反応して いるという指摘は、下記の観察と合致する。

１、幾度か非選択的（即ち、フンピシリンを含まない）培地を続けて通した後に ５組換え微生物はインジゴを生成する能力を喪失する。これらの培養にナフタリ ンを酸化する能力がある力（分析すると、ナフタリンを酸化する活性も平行して 失われていることが分かる。形質転換されないイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　） は青色色素を生成することが出来ないので、これらの実験は、青色色素の形成に おけるナフタリン・ジオキシゲナーゼ遺伝子が不可欠であることを実証している 。

２、組換えイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）が１０　ｍＭのトリプトファンある いは１　ｍＭのインドールを補充した培養培地で増殖されると。

青色色素の形成は促進される。

３、組換えイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）が１％グルコースを補充した培地で 増殖されると、青色色素の形成は観察されない。高レベルのグルコースは、イー ・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）内のトリプトファナーゼ合成の異化代謝産物抑制 を起こす（Ｂｏｔｓｆｏｒｄ、　Ｊ、　Ｌ、およびＲ，Ｄ、　ＤｅＭｏｓｓ、　 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１０５　：３０３−３１２　（１９７１）　）。

４、　ナフタリン・ジオキシゲナーゼ酵素をＮ　ａ’ｈ　７ブラスミドに持つシ ュードモナス菌・プティダ（ハ匹並肚ｎａｓ匹旦鼓）　ＰｐＧ７を培養培地内で インドールとともに装置すると、青色色素の形成が観察される。この微生物はト リプトファナーゼ酵素システムを持たず９通常の物質代謝においてはインドール を生成しない。

ｍ１ 組換えイー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）によるインジゴの合成の割合が。

下記の手順で測定された。形質転換されたイー・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）と形 質転換されないイー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ、）とが１例１で述べた鉱物塩培 地を入れた２つのフラスコ内で増殖された。形質転換されないイー・コリ（Ｅ、 　ｃｏｌｔ　）を増殖するのに用いる鉱物塩培地からはアンピシリンは除かれた 。微生物の増殖は、５００　ｎｎに“おける吸光度を測定することによってモニ ターされた。インジゴの合成は１種々の時間間隔で各培養から１．０ｍｊ！のサ ンスルを取ることによってモニターされた。培養は２．Ｑｍ＃の酢酸エチルを用 いて抽出され、エマルジョンを分けるために遠心分離され、上層の一部（酢酸エ チル）はクベットに移された。各有機抽出物の６００ｎｍにおける真吸光度が測 定された。インジゴは、酢酸エチル内において６００　ｎｍで可視吸収極大を示 すことが経験的に測定された。

増殖中の容易に測定出来るインジゴの合成が、形質転換された細胞を含む培養に 観察されたが、形質転換されないイー・コリ（Ｌｃｏｌｉ　）を含む培養では、 インジゴの合成は測定されなかった。

上記の各側は、実験したイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）細胞内の内在性トリプ トファナーゼ酵素はトリプトファンをインドール（そして、おそらくピルビン酸 塩とアンモニア）に変換することを実証している。ナフタリン・ジオキシゲナー ゼの微生物による合成のコードを持つＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクターを用いる イー・コリ（ｌｉ、　ｃｏｌｔ　）の形質転換の結果、芳香族ジオキシゲナーゼ が細胞内で生成される。本発明の実施において、インドールからインジゴへの変 換の際に形成される中間物は、方向を定めるほどには確定していない。しかしな がら、ジオキシゲナーゼ酵素が触媒作用をするインドキシルの変換の最初の生成 物はシス−インドール−２゜３−ジヒドロジオールであると思われる。ジオール の転位反応はインドキシルを生成し、そして空気の存在のもとてのインドキシル の縮合はインジゴを生成する。

このような手順において形成されるインジゴの量は、トリプトファナーゼ酵素の コードを持つＤＮＡ配列を安定的に取り込むように微生物をさらに形質転換すれ ば、大幅に増加させることができる。Ｄｅｅｌｅｙ等、上記を参照のこと。

イー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）はそれ自身のトリプトファナーゼ酵素コード 領域を持っているが、その領域およびその調整メカニズムは染色体にあり、１細 胞当たり１つのコピーをもたらすだけである。高コピー数ＤＮＡプラスミド・ベ クターにおいては、トリプトファナーゼ酵素コード領域の多くのコピーが細胞内 に分散することができ、トリプトファンのインドールへの変換のより高い効率と より高い率とをもたらす。このトリプトファンの代謝の増大は。

イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）の内在性トリプトファン・シンセターゼ酵素調 整メカニズムを活性化してインドール・グリセロール鱗酸塩およびセリンをトリ プトファンに変換すると考えられる。トリプトファナーゼ酵素およびジオキシゲ ナーゼ酵素のＤＮＡベクター・コード領域が同じＤＮＡベクター上にあり、且つ 同じプロモーターに制御されている場合は、それらは共に同時に活性化される可 能性がある。このようなベクターを持つイー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）細菌 細胞が最適レベルにまで成長すると、プラスミドの両酵素コード領域は同時に活 性化されて細胞内のトリプトファンをインドールとピルビン酸塩に、そしてイン ドールをインドキシルに、そして最終的にインジゴに、細胞内に生成されたトリ プトファンが全て費消されるまで、変換を続ける。そうして生成されたインジゴ はしばしば培地内において、そして細胞そのものの中で結晶となり、簡単な化学 的および機械的な方法で取り出すことが出来る。

宿主微生物が、インドールを生成し蓄積する内在的な代謝能力を持たない場合は 、トリプトファナーゼ酵素および芳香族ジオキシゲナーゼ酵素のコードを持つＤ ＮＡ配列を共に含むＤＮＡベクターによる微生物の形質転換は、微生物にまずト リプトファンをインドールに、その後にインドールをインジゴに変換する能力を 付与・するように働く。

望ましい形感においては９本発明の１インジゴ・オペロンＪ　ＤＮＡ形質形質転 換ツクタープロモーター／レギュレーターに同時的に制御されるトリプトファナ ーゼ酵素とジオキシゲナーゼ酵素とを共に含むであろう。このようなインジゴ・ オペロンの一つは。

ｐＨ３１７のように、ピー・プリダ（ム」ｕｕ虹）ナフタリン鉱化プラスミドｎ ａｈ７の小さな部分から成り、それはナフタリン・ジオキシゲナーゼ酵素発現を 調整する能力を保持したオペロンを含むＤＮＡ断片を含む。ＤＮＡ形質転換ベク ター上には、ジオキリゲナーゼ遺伝子とともに、　Ｄｅｅｌｅｙ等、上記が記載 したようなトリプトファナーゼ酵素コード領域が存在するであろう。

このようなインジゴ・オペロンの作成に潜在的に役立つ温度に鋭敏なプロモータ ー／レギュレーターの一例は、　ｃＩ　８５７の制御下にあるＡＰＬファージで ある。この極めて能率の高いプロモーター（ＰＬ）は、γリプレッサー蛋白質Ｃ Ｉによって調整することができ、γリプレッサー蛋白質ｃＩはイー・コリ　（Ｅ 、　ｃｏｌｉ　）　ｒ溶原菌内で自生的に調整される生成物である。突然変異体 リプレッサー蛋白質ｃＩ　８５Ｔは、３２°Ｃを下回る温度においてはＰＬプロ モーターを不活性化する。３２℃から４１”Ｃの間の温度では、　ｃｌ　８５７ は不活性化され、それによってＰＬプロモーターの制御のもとに転写を開始する 。Ｓｈｉｍａｔａｋａ、　Ｈ，等、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９２　：　１２８−１ ３１　（１９８１）およびＳｕｓｓｍａｎ、　Ｒ，等、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 Ｐａｒｉｓ、　２５４　：　１５１７−１５１９（１９６２）を参照のこと。細 胞の成長および遺伝子の発現の調整に温度に鋭敏なプロモーター／レギュレータ ーを用いることの利点は極めて明白であるが、トリプトファナーゼおよび／ある いはジオキシゲナーゼの活性の低下という潜在的な欠点に照らして考慮せねばな らない。

これまで述べた説明的な各側および詳細な説明は主に、インジゴの生成に結び付 く仕方でインドールを「処理」する遺伝的手段を持たない、即ち、適切なジオキ シゲナーゼ酵素を合成する能力を持たない微生物によるインジゴの生成を可能と することに向けられている。当業者には本発明が適切なジオキシゲナーゼ酵素を 合成する能力を既に持つ微生物の培養増殖によりインジゴの生成を可能とするこ とを含むものであることは明らかであろう。これは前述の微生物を遺伝的に形質 転換して、トリプトファナーゼ酵素の合成の仕様を定めるＤＮＡ配列を安定的に 取込み、それによって、細胞のトリプトファンを処理してジオキシゲナーゼ酵素 の作用を受けるようにインドール基質に変換することによって達成される。微生 物の内在性のトリプトファナーゼ合成能力をトリプトファナーゼ遺伝子の多数の ｒ余分の」コピーを挿入することによって増大する場合と同様に１選択された宿 主細胞の内在性のジオキシゲナーゼ合成能力を「インジゴ・オペロン１を含むプ ラスミドの多数のコピーを挿入することによって増大することには多くの利点が ある。

現時点においては１本発明のこの態様を実施するために最も相応しい宿主細胞と 思われるものは、先にジオキシゲナーゼ遺伝子の適切な供給源として述べたシュ ードモナス菌・プティダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　匹旦鎖）　、即ち、　Ｐｐ Ｇ７．　ＮＣＩＢ　９８１６．７ＴＯＬ　Ｊおよび３９／Ｄである。

当業者には上記の本発明の多くの変更態様が可能と思われるので１本発明には添 付の請求の範囲の限定のみを加えるものとする。

ｍ際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インドールを生成し蓄積する代謝能力を持つ選択された微生物内での微生物 によるインジゴの製造のプロセスで、前述のプロセスが。 （１１安定的に遺伝的に微生物を形質転換して芳香族ジオキシゲナーゼ酵素を合 成する能力を持たせ。 （２）形質転換した微生物をジオキシゲナーゼ酵素が触媒として作用するインド ールの酸化変換を促進する条件のもとで増殖し。 （３）　前述の微生物からインジゴを分離することから成るもの。 ２、請求の範囲第１項のプロセスで、微生物がイー・コリ（Ｅ、　ｃ蛙Ｌ）であ るもの。 ３、請求の範囲第１項のプロセスで、前述の遺伝的形質転換過程が、芳香族ジオ キシゲナーゼ酵素の合成のコードを持つＤＮＡ配列゛を含むＤＮＡヘクターによ る形質転換を含むもの。 ４、請求の範囲第１項のプロセスで、芳香族ジオキシゲナーゼ酵素がナフタリン ・ジオキシゲナーゼであるもの。 ５、請求の範囲第１項のプロセスで、芳香族ジオキシゲナーゼ酵素がシュードモ ナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）由来のものであるもの。 ６、請求の範囲第１項のプロセスで、さらに安定的に遺伝的に微生物を形質転換 してトリプトファナーゼ酵素を合成する能力を持たせ且つ形質転換した微生物を トリプトファンのインドールとピルビン酸塩への分解のトリプトファナーゼ酵素 触媒作用を促進する条件のもとで増殖する過程を含むもの。 ７、請求の範囲第６項のプロセスで、前述の両形質転換が、芳香族ジオキシゲナ ーゼ酵素およびトリプトファナーゼ酵素の合成のコードを持つＤＮＡ配列を含む 単一のＤＮＡヘクターによる形質転換によって達成されるもの。 ８、請求の範囲第７項のプロセスで１両酵素コード配列の発現が単一の選択され たプロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列に制御されるもの。 ９、請求の範囲第８項のプロセスで、プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列 がλＰＬファージ温度鋭敏配列であるもの。 １０、　ＯＮ＾形質転換ベクターで、芳香族ジオキシゲナーゼ酵素およびトリプ トファナーゼ酵素の微生物による合成のコードを持つＤＮＡ配列を持つもの。 １１、請求の範囲第１０項に基づ（ＤＮＡ形質転換で、前述のＤＮＡ配列が同じ プロモーター／レギュレーターＤＮＡ配列の制御のもとにあるもの。 １２、インドールを生成し蓄積する代謝能力を持たない選択された微生物内での 微生物によるインジゴの生産のためのプロセスで。 前述のプロセスが。 （１）安定的に遺伝的に微生物を形質転換してトリプトファナーゼ酵素を合成す る能力を持たせ。 （２）　安定的に遺伝的に微生物を形質転換して芳香族ジオキシゲナーゼ酵素を 合成する能力を持たせ。 （３）形質転換した微生物を、トリプトファンからインドールへの変換のトリプ トファナーゼ酵素による触媒作用およびインドールの酸化変換のジオキシゲナー ゼ酵素による触媒作用を促進する条件のもとで増殖する ことから成るもの。 １７、遺伝的に形質転換された微生物のインドールの存在しない培地での増殖に よって製造されたインジゴ。