JPS5951788A

JPS5951788A - 細胞培養用ミクロキヤリア−

Info

Publication number: JPS5951788A
Application number: JP11498883A
Authority: JP
Inventors: ヴオルフガング・ケイ・ホラ−
Original assignee: FUROU GENERAL Inc
Current assignee: FUROU GENERAL Inc
Priority date: 1982-06-25
Filing date: 1983-06-25
Publication date: 1984-03-26
Also published as: EP0097907A3; EP0097907A2; AU1621783A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明の背景本発明は細胞培養用ミクロキャリアーに関する。

本発明はまた固定依存性細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ　ｄ
ｅｐｅｎ−ｄｅｎｔ　ｃｅｌｌ）の生育法および固定依
存性細胞ならびに同細胞生産物の製造法にも関する。更
に本発明は水をベースとするタン白溶液をミクロスフェ
アーに転換する装置にも関する。

細胞の試験管内培養は重要な研究手段であり、工業的に
有用な方法である。具体的には、細胞を生＋成したりか
つウィルスワクチン、ホルモンならびにインターフェロ
ンを含むその他の物質のような有用な細胞生産物を集取
することは重要である。

固定依存性でない細胞は、適当な培地に懸濁させた時、
自由に生育する。このような細胞について、研究段階か
ら工業的規模に拡大するのは特に難しいことではない。

この培養は本質的に均質であるからである。結局、細胞
や培地は試験用に容易にサンプリングできる。細胞の囲
りの培地は容易に除き、取り換え又は改良することもで
きる。

反対に、固定依存性細胞の大規模培養はいろいろな困難
を含む。伝統的には、このような細胞はボトルや皿の如
きガラス製又はプラスチック製容器の内面に生育させて
いた。大規模の適用では、これらの伝統的生育技術は限
られた生育面のために、酷しい限界がある。

更に、このような伝統的技術は生育培地を無駄にする傾
向がある。と言うのは、ボトルや皿のような容器の生育
分野対培地容量比はある値以上に増大し得ないからであ
る。培地は容易にサンプリングすることができないから
、生育中培地と細胞の性質を測定することは難しい。更
に、培地組成も容易に調整できない。

生育分野対容量比の改善は、サンプル培地の調整地にお
いて、細胞をセラミックリングやガラス管の如き固定式
固体床の表面に生育させる技術により行なわれた。その
ような技術では、培地は固定床循環させ、培地を検知し
そして循環ループの別の点で調整する。不幸にも、その
ように一面におゝわれた固定支持細胞培養生育力法はサ
ンプリングに利用できる細胞を供さない。更に不利なこ
とは、固定床は不可逆的に動かなくなり、段々と細胞は
死滅しかつ床の一部が生命支持循環培地に利用できなく
なるので目詰り（ｃｌｏｇｇｉｎｇ）をおこす。床の固
体の大きさを減らことにより生長分野対容量比を改善す
る試みがなされる場合、目詰まりの問題は特に重大にな
る。

固定依存性細胞を生育するプラクチスは、攪拌ミクロキ
ャリアー技術（均質な懸濁細胞培養のすべての利点を固
定依存性細胞に拡げるように企図されている）の導入に
よりかなり進歩した。原則には、細胞はキャリアー体又
は細胞培養ミクロキャリアーとして知られる小さなキャ
リアー粒子に生育する。これらの細胞培養ミクロキャリ
アーは攪拌生育培地にて懸濁されかつ流動される必要な
形、大きさおよび密度を有する。この細胞培養ミクロキ
ャリアーも細胞の生育を支持するのに適当な表面性を有
する（Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｌ，２１６　Ｎａｔｕｒｅ６４
−６５，１９６７参照）。

特に、細胞は市販のデキストランを基体とするアニオン
交換体の正電荷面に付着することをファン・ウエゼル（
Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｌ）は証明した。しかし、細胞培養用
ミクロキャリアーの使用は、細胞に対するミクロキャリ
アーの非特異的毒性により遅れた。この問題の原因を試
験して、イオン交換ビーズ上の正電荷数の減少は正荷電
デキストラン基体のミクロキャリアーによる毒性問題も
減少することをシリー（Ｔｈｉｌｌｙ）および共同研究
者は見出した（Ｌｅｕｉｎｅ等、Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ
ｌｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　３，１４９，１９７７；およ
びＬｅｕｉｎｅ等の米国特許第４，１８９，５３４号お
よび第４，２９３，６５４号明細書参照）。ポリアクリ
ルアミドを基体とする正荷電の他のミクロキャリアービ
ーズはモントニー（Ｍｏｎｔｈｏｎｙ）等の米国特許第
４，２３７，２１８号明細書に記載される。

このような正荷電イオン交換体ビーズはミクロキャリア
ーにうまく使用されているが、重大な欠点を有する。通
常、負荷電の細胞と正荷電のミクロキャリアー間の静電
気的相互反応のために、細胞の有意なフラクションの生
育力を減ぜずに、細胞をミクロキャリアーから除くこと
は難しい。結局、細胞又は細胞関連生産物の回収ならび
に付加的ミクロキャリアービーズに対する細胞の副次培
養（ｓｕｂｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）は依然として難し
くかつやっかいな処理である。したがって、当該技術の
研究者は、固定依存性細胞および固定依存性細胞生産物
を製造する改良方法を得るために改善された細胞培養用
ミクロキャリアーを探索した。

本発明の要約本発明は細胞付属物および細胞の生育に資する表面構造
を有する細胞培養用ミクロキャリアーを生産することに
より従来技術の問題点や欠点を克服する。本発明の細胞
培養用ミクロキャリアーは回収あるいは副次培養の目的
で細胞の除去に妨害となる静電気的相互反応を示さない
。更に、本発明の細胞培養用ミクロキャリアーは細胞に
非毒性であることが分った。

したがって、本発明の目的は回収又は副次培養の目的の
ために細胞の除去に静電気的妨害をせずに、細胞の付属
物および細胞の生育に資する表面構造を有する細胞培養
用ミクロキヤリアーを生産することである。

本発明の別の目的は細胞に非毒性の細胞培養用ミクロキ
ャリアーを生産することである。

更に別の目的は、細胞培養用ミクロキャリアーの表面に
ある物質をグラフトする必要がなく、単一方法で細胞培
養ミクロキャリアーを生産することである。

更に別の目的は、グラフトを必要とせず、細胞培養用ミ
クロキャリアービーズが殆んどの集取方法を通じて熱水
可溶性のまゝであり、クリーニングが容易かつ衛生的で
あり、細胞培養用ミクロキャリアー製造用物質に関連す
るポットライフの問題がなく、一定サイズ範囲外のミク
ロキャリアーを再循環することができかつ高サイズ均一
性を有する細胞培養用ミクロキャリアーが得られる方法
によって合理的なコストで細胞培養用ミクロキャリアー
を生産することである。

更に本発明の目的は、固定依存性細胞の生育に繰り返え
し使用できる細胞培養用ミクロキャリアーを供すること
である。

付着した固定依存性細胞をトリプシンの如きタン白分解
試薬又はＥＤＴＡの如きその他の試薬による温和な処理
により分別できる細胞培養用ミクロキャリアーを供する
ことも本発明の目的である。

本発明の付加的目的および利点は以下に記述されるが、
本発明の実施により自明のことでもある。

本発明の細胞培養用ミクロキャリアーは水不溶化タン白
質から放り、このタン白質はミクロキャリアーを実質的
に均質分布している。

更に、本発明の細胞培養用ミクロキャリアー製造方法は
、（ａ）タン白溶液の液滴をつくり、（ｂ）この液滴を
流体に懸濁させ、（ｃ）懸濁させた液滴を固化して、細
胞培養用ミクロキャリアーを得、そして（ｄ）そのミク
ロキャリアーを取り出すものである。

次に、本発明の固定依存性細胞用の生育方法は：（ａ）
細胞培養用ミクロキャリアー、同細胞の接種材料および
栄養生育培地から成るサスペンジョンをつくり、このミ
クロキャリアーは水不溶化タン白質を含み、タン白質は
ミクロキャリアー中実質的に均質分布しており、および（ｂ）このサスペンジョンを細胞生育条件下に維持する
。

本発明の固定依存性細胞の製造方法は：（ａ）細胞培養
用ミクロキャリアー、同細胞の接種材料、および栄養生
育培地を含むサスペンジョンをつくり、このミクロキャ
リアーは水不溶化タン白質を含み、タン白質はミクロキ
ャリアー中実質的に均質分布しており、（ｂ）このサスペンジョンを細胞生育条件下に維持し、
そして（ｃ）この細胞を回収する。

本発明の固定依存性細胞生産物の製造法は：（ａ）適当
な細胞培地にて、水不溶化タン白質から成る細胞培養用
ミクロキャリアーのサスペンジョンを生成し、タン白質
はミクロキャリアー中実質的に均質分布しており、（ｂ）この培養物に固定依存性細胞を接種して、細胞培
養物を得、（ｃ）この培養物を細胞生産物生成条件下に維持し、そ
して（ｄ）細胞生産物を回収する。

水をベースとするタン白溶液を本発明のミクロスフェア
ーに転換するための装置は：タン白溶液用のサーモスタットに調整された加熱された
貯蔵室；少なくとも１個の噴霧ヘッド；上記貯蔵室のタン白溶液を噴霧ヘッドに供給する要素；貯蔵室中のタン白溶液と少なくとも大体同じ温度でタン
白溶液を維持する供給要素に熱を加える要素；噴霧ヘッドでタン白溶液に所定の圧カを維持する要素；噴霧ヘッドより生じた液滴を受容するための噴霧ヘッド
の下に位置する少なくとも１個の容器；受容した液滴を
懸濁固化して、サスペンジョン液中連続ミクロスフェア
ーとする少なくとも１個の容器に対し、低温の水不混和
性サスペンジョン液を流すための要素；およびサスペンジョン液のミクロスフェアーを集取する要素。

水をベースとするタン白溶液を本発明のミクロスフェア
ーに転換する方法は：液体としてのタン白溶液を気体雰囲気に噴霧して、連続
液滴とし；タン白溶液と気体雰囲気（噴霧前タン白溶液の温度より
低い）間の温度差を維持し：連続液滴の落下経路に対し冷却水不混和性サスペンジョ
ン液を流し：そしてサスペンジョン液からミクロスフェアーを集取する。

望ましい実施対態様の説明本発明の望ましい実癩態様を実施例および図面を参照し
て説明する。

本発明によれは、細胞培養用ミクロキャリアーは水不溶
化タン白質から成る。望ましいタン白質はコラーゲン、
カゼイン、大豆タン白、シルク、ケラチン、卵タン白お
よび血液タン白である。更に望ましいタン白質はコラー
ゲンである。

ミクロキャリアーはタン白質と架橋剤の反応生成物から
成るものである。望ましくは、架橋剤は多官能性のもの
である。適当な多官能性架橋剤にはアルデヒド、エポキ
シ、ハロアルキル、ハロアリール、イソチオシアネート
、イソシアネート、ジアゾ、アリールニトレン、アジド
、アシルハライド、アシルアンヒドリド、ジオールカー
ボネート、クロロホルメート、イミドエステル、Ｎ−ヒ
ドロキシサクシンイミジルエステル、マレインイミド、
カルボキシジイミダゾー−ル、ホルミルエステルおよび
ハロトリアジンの如き官能基を含む。

多官能性架橋剤はグルタールアルデヒド又は１，４−ブ
タンジオールジグリシジルエーテルが望ましい。更に望
ましい架橋剤にはホルムアルデヒド、エピクロルヒドリ
ン、ホスゲンおよびアルデヒド澱粉がある。

細胞培養用ミクロキャリアーの直径は約５０から約３５
０ミクロンが望ましい。

本発明によれは、上記したタン白水溶液の液滴を生成す
る。周知のように、コラーゲンは加熱しかつ化学的に分
解してゼラチン水溶液に液化することができる。コラー
ゲンは周知の酸処理法により豚皮から得ることができる
。別法としては、ゼラチンタイプＡの如き市販の変性コ
ラーゲンが水中加熱溶解して利用できる。

得られた細胞培養用ミクロキャリアーを均一にするため
に、粘度、ブルーム評価、色、濁度、等電点およびｐＨ
の如き品質管理試験をコラーゲンその他のタン白質につ
いて行なうことができる。コラーゲンが十分の機械的強
度を有するために、コラーゲンのブルーム評価は約１５
０から約３００であるべきである。

タン白溶液の液滴は各種方法で生成することができる。

望ましい液滴生成方法には、タン白溶液を圧力ノズルか
ら噴射する方法、ガス推進噴霧ノズルから噴射する方法
、急速回転面から噴射する方法、超音波駆動ノズルから
噴射する方法および乳化する方法がある。適当な圧力ノ
ズル、ガス推進噴霧ノズル、急速回転面および超音波駆
動ノズルは市販されている。タン白溶液の乳化方法は公
知である。

本発明によれば、タン白溶液の液滴は流体に懸濁させる
。本発明の望ましい実施態様によれば、以下に詳述する
ように、液体媒質又はガス媒質である流体には、液滴用
の固化剤を含む。望ましい固化剤にはアンモニア、アル
デヒド、エポキシ化合物およびエピクロールヒドリンが
ある。アルデヒドは多官能性アルデヒドがよい。更に望
ましくは、多官能性アルデヒドは市販されているグルタ
ールアルデヒドである。

エポキシ化合物は多官能性エポキシ化合物が望ましい。

多官能性エポキシ化合物は市販されている１，４−ブタ
ンジオールジグリシジルエーテルがよい。

液滴用固化剤はホルムアルデヒドが特によい。

勿論、ホルムアルデヒドは市販されている。

本発明によれは、流体はガス媒質でも液体媒質でもよい
。望ましいガス媒質には空気、塩化水素、アンモニア、
ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、又はこれら
の組み合わせがある。ガス媒質は液滴の温度より低く維
持するのがよい。液滴温度は約５０℃そしてガス媒質は
室温又はそれ以下が望ましい。

液体媒質は不燃性で、液滴と不混和性で又は混和性がよ
い。液体媒質の温度は０°から１０℃の範囲に維持する
のがよい。しかし、液体媒質の温度はタン白溶液の凍結
点より以下であってはならない。液滴が凍結するとミク
ロキャリアー構造を機械的に破壊するからである。

液滴と不混和性の望ましい液体媒質はわずかに水に溶け
かつ残渣を残さずに５０℃以下で急速に蒸散するもので
ある。具体的に、望ましい不混和性液体媒質はハロゲン
化炭化水素である。望ましいハロゲン化炭化水素にはメ
チレンクロライド（ＣＨ２Ｃｌ２）、１，１，１−トリ
クロルエタン、トリクロルエチレンおよびジュポン社の
Ｆｒｅｏｎ（フロロカーボンおよび／又はフロロフロロ
カーボン含有、Ｆｒｅｏｎ　Ｔ．Ｆ．の名で市販）があ
る。

液滴と混和性の望ましい液体媒質には酸、塩基およびア
ルデヒドがある。酸は無機でも有機でもよい。望ましい
無機酸には硝酸、塩酸、リン峻および硫酸がある。望ま
しい有機酸には修酸と蟻酸がある。望ましい塩基にはア
ンモニア、水酸化アルカリおよびアミンがある。

アルデヒドは適当な液体媒質で、液滴と混和性である。

望ましいアルデヒドはホルムアルデヒドおよびグルター
ルアルデヒドである。

本発明によれば、懸濁液滴を固化して細胞培養用ミクロ
キャリアーとする。固化する場合、接触するミクロキャ
リアーは合体しない。タン白溶液の液滴と流体間の温度
差を維持して固化を行なうことができる。タン白溶液に
存するタン白質用の固化剤により固化を行なうことがで
きる。

タン白溶液の液滴と流体間の温度差を維持するについて
、流体は液滴より熱いか又は冷たくてよい。更に、流体
の温度は液滴の温度より熱くてよく、またタン白溶液は
下記するように、適当な固化剤を含んでよい。更に、固
化を行なうために、流体はガス媒質がよく、液滴より低
い温度に維持することができる。ガス媒質に懸濁させた
液滴は液体媒質中のサスペンジョンに導入することがで
き、この媒質は液滴より低温に維持することもできる。

液滴中固化剤の存在により固化を行なうについて、タン
白溶液が流体中の液滴として懸濁させる前に固化しない
ように、固化剤は十分遅効性であることは勿論必要であ
る。固化剤は水溶性である。

望ましい水溶性固化剤にはアルデヒド、酸および塩基が
ある。上記したように、アルデヒドはグルタールアルデ
ヒドのような多官能性アルデヒドでよく、又はホルムア
ルデヒドのようなモノ官能性アルデヒドでよい。酸は硝
酸、塩酸、リン酸および硫酸の如き無機酸又は修酸や蟻
酸の如き有機酸でよい。望ましい塩基はアンモニア、水
酸化アルカリおよびアミンがある。

本発明によれば、細胞培養用ミクロキャリアーは常法の
技術又は後述する技術を使って回収される。ある場合に
は、ミクロキャリアーを固化した後、ミクロキャリアー
の回収前に、細胞培養用ミクロキャリアーを更に硬化す
ることが望ましい。

硬化には架橋剤により行なうのがよい。

硬化を行うために、ミクロキャリアーを架橋剤含有の液
体媒賀又はガス媒質に懸濁することができる。望ましい
架橋剤は多官能性で、多官能性アルデヒドや多官能性エ
ポキシを含む。多官能性アルデヒドはグルタールアルデ
ヒドが望ましい。

更に望ましくは、グルタールアルデヒドを還元剤、望ま
しくはナトリウムジチオナイトとの併用である。ナトリ
ウムジチオナイトの如き還元剤をグルタールアルデヒド
に添加すると、殆んど無色に近い細胞培養用ミクロキャ
リアーが生成する。

他の望ましい架橋剤にはホルムアルデヒドや１，４−ブ
タンジオールジグリシジルエーテルがある。

架橋剤の硬化効果は熱により更に促進するのがよい。更
に望ましくは、架橋剤の硬化効果はミクロキャリアーを
液化せずに、加熱を増して促進する。これを行なうため
に、ミクロキャリアーを温度ランプに供し、その間時々
攪拌が必要なだけである。

本発明の特に望ましい実施態様において、タン白溶液は
コラーゲン溶液であり、硬化に使用する架橋剤はグルタ
ールアルデヒドである。熱は最初細胞培養用ミクロキャ
リアーに２５℃／約１〜２５時間、望ましくは１５〜２
０時間適用する。

ついで熱を７０℃／約１〜２５時間、望ましくは６〜１
０時間、更に望ましくは８時間増大する。

最後に、１００℃に加温し、約１〜２５時間、望ましく
は１５〜２０時間、更に望ましくは１６時間維持する。

温度ランプ以上に加熱する場合、細胞培養用ミクロキャ
リアーは液化せずに最初の温度で十分硬化することが分
った。続いて更に硬化するために、ミクロキャリアーを
液化せずに温度を上げることができる。

流体に固化剤を含み、固化剤はタン白溶液中に存在し、
又は硬化は架橋剤により行なう本発明方法の実施態様に
おいて、細胞培養用ミクロキャリアーの回収工程前、細
胞培養用ミクロキャリアーの過剰の固化剤又は架橋剤を
中和するのは非常に望ましいことが分った。

液滴を得るために使用する同じタン白質の稀薄溶液でミ
クロキャリアーを処理して中和を行なう。

勿論、その溶液は十分稀釈して、タン白質の固化を避け
ねばならない。特定のタン白質については、当業者は特
別の経験なしで、有効な中和を行なうのに中和溶液をど
の位稀釈すべきかは普通決定できる。コラーゲン溶液を
使用する場合、約０．５重量％のコラーゲン溶液が、中
和のために使用できる。

中和に加えて、回収工程前に、細胞培養用ミクロキャリ
アーを塩水で徹底的に洗うのも有利である。中和の前後
に、ミクロキャリアーを塩水で少なくとも一度洗うのが
よい。

更に、細胞培養用ミクロキャリアーの回収工程前又は後
に、ミクロキャリアーを殺菌することも望ましい。殺菌
技術には例えばスチーム殺菌が周知である。

本発明の細胞培養用ミクロキャリアーは固定依存性細胞
を生育するのに使用できる。細胞培養に関する広い知識
が容易に利用できる（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ出版、ニューヨーク、１９７３参照）。更
に、細胞培養用ミクロキャリアーに関する多くの情報は
「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ」のＶｏｌ．４６
（１９８０）と５０（１９８２）に記載される。

この文献に記載の事項は本明細書に含まれている。

本発明の細胞培養用ミクロキャリアーに生育する固定依
存性細胞および／又は固定依存性細胞生産物は常法の技
術により回収することができる。

既述した理由のために、本発明の細胞培養用ミクロキャ
リアーは副次培養を容易にする。組織培養における副次
培養の一般的技術は周知である。

ミクロキャリアー培養物の副次培養は従来行なうのが難
しかった。と言うのは、上記したように、キャリアーか
ら細胞を取り出しその後有効な細胞生育を行なうのは難
しかったからである。本発明による副次培養の所望技術
は、トリプシン処理によってミクロキャリアーから生育
細胞を分離し、続いて新たな細胞培養用ミクロキャリア
ーを導入する。別法として、生育細胞をトリプシン処理
して、細胞をミクロキャリアーから分離する。ついで細
胞を例えばスクリーニングにより栄養培地含有ミクロキ
ャリアーから取り出しそして新しい生育培地に加える。

この新しい培地に対し、新しい細胞培養用ミクロキャリ
アーを例えば上記ミクロキャリアーの数を倍にして加え
る。

図示した様に、上記した水をベースとするタン白溶液を
ミクロスフェアー例えば細胞培養用ミクロキャリアーに
転換するための本発明装置はタン白溶液用のサーモスタ
ット調節した加熱された貯蔵室を含む。第１図と第６図
に示したまうに、貯蔵室２０は箱様の容器で、安定温度
例えば５０℃にタン白溶液２２を維持する要素を有する
。

タン白溶液２２の基本的供給は貯蔵室２０内の第１コン
テナー２４に保つのがよく、コンテナーはバス２６に位
置し、安定な温度を維持するためにグリセリンや水など
の加熱流体を含む。第６図に示すように、サーモスタッ
ト３０により調節されるヒーター２８はバス２６に熱を
供する。

後記するように、装置をリンスしプライムするために、
貯蔵室２０には水３４を保持するために第２のコンテナ
ー３２を含む。第２のコンテナーはタン白溶液２２と同
一温度を維持するために、バス２６に位置する。

本発明によれば、本装置には少なくとも実質的に平行な
パイプを介してタン白溶液を貯蔵室から供給する要素を
含む。供給要素には貯蔵室からおよび後ろにループを有
し、そのループは細長い実質的に平行なパイプを含む。

態様に示すように、供給要素は、ループを介して第１の
コンテナー２４からタン白溶液を循環しそしてタン白溶
液の少なくとも一部を第１のコンテナーに戻すための高
圧ポンプ３８を含むループを形成する主液体連結チャン
ネル３６を含む。図解を簡略化するために、第１図の連
結チャンネル３６は完全なループを示していない。しか
し、完全なループは第６図に記号で示してある。

連結チャンネル３６の末端部にはホースのよう可撓性部
材３９ａ，ｂを含むべきである。可撓性部材３９ａ，ｂ
の一方又は両方は温水で糸をプライム又はフラッシュす
るために、第１と第２コンテナー２２，３４間を選択的
に動くことができる。装置には、第６図に記述したよう
に、ドレン４１を含むのがよい。必要な場合には、そこ
を通って系は排水できる。ドレンは勿論可撓性部材３９
ａ，ｂにより接近のために位置する。

コンテナー２４には、連結チャンネルに入ってくる異種
物質の可能性を最小限にするために、可撓性部材３９ａ
を介して連結チャンネル３６のインプット端に受容する
スクリーン又はフィルター４３を含むのも望ましい。

連結チャンネルには複数の噴霧ヘッド４２を一定間隔に
有する、細長い実質的に平行のパイプ４０を有する。わ
ずか３つの噴霧ヘッド４２が示されているが、任意の数
の噴霧ヘッドを利用できる。第１図および第６図に示す
ように、噴霧ヘッド４２は順列に並べるのがよい。

高圧ポンプ３８がピストン駆動ポンプである場合、連結
チャンネル３６はポンプにより循環タン白溶液におきる
任意のパルスを弱めるためのバッファー４４とリストリ
クター４６を含むべきである。利用するならば、バッフ
ァー４４とリストリクター４６はポンプ３８からすぐ下
流の連結チャンネル３６および確実にポンプと噴霧ヘッ
ド４２間に設置すべきがよい。リストリクター４６は必
要ならフィルターを含んでもよい（図示せず）。

本発明の噴霧ヘッド４２は第１図に示しかつ第３〜６図
に詳しく示したような構造が望ましい。

各噴霧ヘッド４２について、加熱されたタン白溶液は入
口４８を通って、噴霧ヘッド本体５２のキャビティ５０
に入る。タン白溶液はバリヤー５４に沿って噴霧溜め５
６に下りそしてノズル５８を通して外に噴射される。ノ
ズル５８は平らな上面を有するディスクとして形成され
かつ円形回転板６０は溜め５６とノズルディスク５８間
の噴霧ヘッド４２に設置されるのが望ましい。

第４図と第５図に更に詳しく示したように、円形回転板
６０はノズルディスク５８に対し回転板と７ラッシュの
底の、溜め５６から中心円形中空部分６４に通る、少な
くとも１対の溝６２をもって形づくられる。溝６２は回
転板６０のほゞ中心にシンメトリーにありそして中空部
分６４を接線方向に横断している。第４図に示すように
、溝６２は中空部分の反射面に同部分６４を横断してい
る。溝６２はＬ字形でよくかつ穴のような垂直部分６３
と水平部分６５で形成されうる。水平部分６５は回転板
６０の底のグルーブでよい。この構造は中空部分に回転
流動をおこず。タン白ジェット流は短い出口６６を通っ
てノズルを出るからである。ジェット流に伝えられた回
転流動運動はそのような運動なくして必要とされるより
一層遅いノズル速度でジェット流解体をおこす。

溜め５６は十分細かい横断スクリーン６８を設置され、
物質が出口６６の溝６２が目詰まりするのを防止する。

スクリーン６８は環状スペース７０と環状ガスケット７
２間にフランジで締めることができる。スペーサとガス
ケットは噴霧ヘッドの本体５２とねじやまのついたナッ
ト７４の間にロックされる。

必要の場合、ノズルディスク５８には、ディスクに強度
と硬度を与えかつディスクの外面に突き当ることなく、
出口噴榛コーン７８の出口スペースを供するために、そ
の底面にディプレッション７６を形成することができる
。

また、必要の場合、出口６６は、後で詳記するように、
噴霧コーン７８を形づくるために、円形の代りに、非円
形の細長いコーンから形成することができる。

溝６２の直径は約０．０４０″がよく、ノズルディスク
５８の出口６６は長さ約０．０１２″で直径０．００５
″であるのが望ましい。この噴霧ヘッドの構造はジェッ
ト流の不安定性とタン白ジェット訛の分解をおこし、液
滴とする。更に、比較的低噴霧圧と溶液高粘度で液滴を
形成させる。

噴霧ヘッド４２の内部寸法および溝６２と出口６６の直
径と共に、連結チャンネル３６と水平パイプ４０の直径
を含むループは、そのループを循環する少量のタン白溶
液がタン白溶液の１サイクル中噴霧へッドを通過するよ
うなものである。このデザインは後で詳記するように、
噴霧ヘッド中のタン白溶液の温度の安定性に寄与してい
る。

ノズル５８を通過しないタン白溶液はバリヤー５４の反
対側のキャビティ５０を上方に進み、出口７９を通って
水平パイプ４０に出る。

バリヤー壁５４内に熱センサー源８０があり、そこに噴
霧ヘッド４２の温度を検知する便利な装置がおかれる。

このような装置は光学モニター用のサーモメーター、あ
るいはコンピューター方式で温度を自記する更に精巧な
装置でもよい。

温度はタン白溶液の粘度に影響するから、噴霧ヘッドの
温度を安定にすることは非常に重要である。噴霧ヘッド
により付された噴霧速度および噴霧中の液滴のサイズ分
布に影響する粘度は重要なパラメーターである。最も望
ましくは、順列の１個以上の噴霧ヘッドを使用する時は
、入口４８のタン白溶液温度は出口７９のタン白溶液の
過度と同じである。

本発明の装置は、貯蔵室中のタン自溶液と少なくとも大
体同じ温度に噴霧ヘッドのタン白溶液を維持するために
、パイプに熱を与える要素を含む。

過剰の熱はタン白質を変性するから、貯蔵室２０中タン
白溶液を低温で貯蔵することが望ましいが、ポンプ輸送
可能な粘度を維持するのに十分高くかつタン白溶液が噴
霧ヘッドに近づく時タン白溶液を更に高い温度に加熱す
ることが望ましい。態様として、加熱要素には、選択し
た位置に細長い水平パイプ４０の囲りに被った加熱用ジ
ャケット８４を含む。加熱用ジャケットは噴霧ヘッドの
上方に位置するのが望ましい。

必要の場合、加熱ジャケットを噴霧ヘッド４２から離れ
た点で、連結チャンネル３６のまわりにおいて、タン白
溶液をポンプ可能な粘度で維持するのに十分高い温度を
維持することができる。この加熱ジャケットを使うこと
によって、所定の温度をループ中に維持させることがで
きる。

本発明によれば、水をベースとするタン白溶液をミクロ
スフェアーに転換する装置には、噴霧ヘッドのタン白溶
液に所定の圧力を維持する要素を含む。態様として、圧
力維持要素は、噴霧ヘッドにタン白溶液の圧力を調節す
るための調節可能なスロットルバルブ８６を含む。更に
、この装置には、ループ上の圧力を検知するための少な
くとも１つの圧力ゲージ８８を含む。

第６図に示すスロットルバルブ８６と圧力ゲージ８８は
、夫々手で操作もできるしかつ光学的観察もでき、又は
本発明装置の完全コントロールのために一層精巧な装置
である。

本発明の装置は、噴霧ヘッドにより生ずる液滴を受容す
るために噴霧ヘッドに少なくとも１つの容器が置かれて
いる。望ましくは、容器の数は噴霧ヘッドの数に等しい
。上記したように、平行パイプ４０に沿って複数の噴霧
ヘッド４２がありかつ噴霧ヘッドより生ずる、コーン７
８中の液滴を夫々受容するための複数の容器９０がある
のが望ましい。

本発明によれは、本装置には、低温・水不混和性サスペ
ンジョン液（上記した流体液体媒質）を、受容した液滴
を懸濁し固化するための容器に対し流して、液体サスペ
ンジョン中連続したミクロスフェアーとする要素を含む
。態様として、流動要素にはサスペンジョンを液体の供
給を含むための貯蔵室９２とポンプ９４を含む。ポンプ
９４は、各容器９０の一端にインプットを有するフィー
ドパイプ９６を介して、サスペンジョン液を貯蔵室９２
から駆動させる。サスペンジョン液は容器９０の長さに
沿って下流にかつコレクター１００に移す普通のドレン
９８に流れる。サクジョンパイプ１０２は、ループを完
全にするポンプ９４の出力下、サスペンジョン液をコレ
クター１００の底から貯蔵室９２に戻す。

上記したように、サスペンジョン液はＣＨ２Ｃｌ２、１
，１，１−トリクロルエタン、トリクロルエチレンおよ
びＦｒｅｏｎ　Ｔ．Ｆ．から成る群から選んだハロゲン
化炭化水素であるのが望ましい。

貯蔵室９２は、低温サスペンジョン液を大体０°〜１０
℃の温度かつタン白溶液の凍結点より低くない温度に維
持する冷却ユニットの如き要素を含む。サスペンジョン
液の低温度を維持するために、全体の装置を冷却室に設
置するか又はサスペンジョン液を通常のクーラー／熱交
換機（貯蔵室９２におくことができる）に通すことがで
きる。

容器９０は長方形をしている。各容器９０には、容器に
対しサスベンジョンメ液の流速を増すために、容器のイ
ンプット部に対しサスペンジョン液の圧力ヘッドを上げ
る要素を含む。態様として、圧力ヘッド・増進要素は容
器のインプット端に対するバリヤー１０４でありかつ容
器底部のすぐ上におかれている。したがって、サスペン
ジョン液の圧力ヘッドは第２図に示すように、バリヤー
１０４の下でおこり、液体１０６をバリヤー１０４の下
からかつ容器９０の底部に沿って増大された速度で押し
やる。

各容器９０は、長方形の容器９０に対しカスケードを生
成させるためにバリヤーの末端に押し下げた部分１０６
を含む。ついでサスペンジョン液は出口１０８を通って
各容器９０から流出し、普通のドレン９８となりかつコ
レクター１００にいく。

容器９０は、各噴霧ヘッドから生ずる液滴を容器中のサ
スペンジョン液の流れにのみ受答するな大きさでありか
つ位置していることがよい。上記したように、第８図に
示すが、ノズル５８の出口孔６６は必要ならば、円形で
なくてもよく、細長くてよく、容器９０の各コーンを画
定するのに役立つ、コーン７８を形づくり易い。

第１図に示すように、閉止可能なゲート要素１１０は、
１つ以上の噴霧ヘッドから排出液を直接受容するために
設けることができる。このような要素によって、１つ以
上の容器の噴霧コーンは合体の装置を閉止せずに容器に
入ってくるのを防ぐことができ、一方各容器はプライミ
ング、閉止および清浄操作中修理や取り換えられる。ド
ライブシャフト１３０を含む、閉止可能なゲート駆動要
素１１３は開放位置からシャッターのような閉止可能な
ゲートを動かすのに使われる。噴霧コーンは閉鎖位置に
対し容器に排出し、少なくとも１つの噴霧コーンは容器
に入るのを防止される。

噴霧コーン中の液滴は成体サスペンジョンの低温流に落
下すると、水をベースとするタン白溶液は液体溶液に混
和しない。結局、液滴は一構成要素のままでありかつ冷
サスペンジョン液で固化する。サスベンジョン液は液体
面のスフェアーの低定常状態濃度を維持するのに十分早
く動き、表面を浮遊する液關忙まだ液体の液面が衝突す
るのを防止することは肝要である。このような衝嚢によ
り２つ玉や塊りを生成し、望ましくない。

水をベースとするタン白溶液をミクロスフェア−に転換
する本発装置は、容器で発生したミクロスフェアーを液
体サスペンジョンから分離する要素を含む。上記したよ
うに、ミクロスフェアーを含有するサスペンジョン液は
普通の排液としてドレン９８に流れる。コレクター１０
０は普通の排液を受容し、ミクロスフェアーは望ましく
はコレクターに拡がるスクリーン１１２によりそこから
濾過される。スクリーン１１２のメッシュサイズは約５
００μｍが望ましく、任意の公知構造によりコレクター
１００に装着し移動可能である。

本発明は、上記したタン白溶液を液体として気体雰囲気
下（上記したガス媒質）に噴霧して、連続液滴とし、タ
ン白溶液と気体雰囲気（噴霧前のタン白溶液の温度より
低温）間の温度差を維持し、冷却した水不混和性サスペ
ンジョン液（上記した液体媒質）を連続液滴の落下経路
に流下して、冷却したサスペンジョン液に懸濁したスフ
ェアーを生成し、ついでこのミクロスフェアーをサスペ
ンジョン液から集取する、水をベースとするタン白質を
ミクロスフェアーに転換する方法を包含する。

本発明の詳細な工程は上に記述した構造の詳細および構
造の機能性と平行するものである。

次の実施例は本発明の教示を容易にするものである。

実砲例以下の方法は第７図に示した図に相当する。

１、　性分解した動物コラーゲン溶液の製造５ｌ容器で
、乾燥粒状の酸処理（タイプＡ）ゼラチン（ブルーム評
価２５０）４４０ｇを蒸留水３９６０ｍｌに溶解する。

粒状ゼラチンを冷水にて攪拌する。温度を６０℃に上げ
て、攪拌を続ける。

均質な粘性溶液が得られるまで、更に攪拌を続ける。泡
がなくなるまで、攪拌を中断し、均質になるまでゆっく
り攪拌する。

２、タン白質噴霧ループの開始第６図について、コンテナー３２と２４に夫々温水３４
と温タン白溶液２２（例えば上記の変性分解動物コラー
ゲン溶液）を充たし、この溶液には上記したように遅効
性の架橋剤を含有してもよい。サーモスタット３０を５
０℃にセットする。

ホース可撓性部材３９ａと３９ｂを熱水コンテナー３２
に入れる。スロットルバルブ８６を完全に開く。噴霧シ
ャッター閉鎖可能なゲート要素１１０を完全に閉じる。

ポンプ３８をスタートし、温度指示器が定常を示すまで
、熱水を循環させる。加熱ジャケット用の適当な出力セ
ットを予めタン白溶液について決めるか又は最初の実姉
で調節しなければならない。ホース可撓性部材３９ｂを
ドレン４１に動かす。ホース可撓性部材３９ａをタン白
溶液２２に動かす。タン白溶液がループ中の水と置き換
わると直ぐ、ホース３９ｂをドレンからタン白コンテナ
ー２４に動かす。予め適当にセットしてない場合、噴霧
ヘッド７８の指示器が６０℃を示しかつリターン１２０
の指示器が５０℃を示すまで、加熱ジャケット８４に対
する調節を行なう。圧力ゲージ８８が１７０ｐｓｉに達
するまで、スロットルを閉じる。勿論、当業者には自明
のことではあるが、大きな噴霧パターンを有する噴霧ヘ
ッドは他の圧力を必要とする。必要な場合には、加熱ジ
ャケットに出する出力を再調整する。これらの出力レベ
ルは注目すべきで、後の場合にも保持すべきである。こ
の段階で、熱タン白の噴霧を噴霧シャッター閉鎖可能ゲ
ート要素１１０に放出する。１０個の噴霧ヘッドが存在
する第６図のデザインでは（第６図にわずか３個の噴霧
ヘッド示す）、タン白溶液の消費速度は３００ｍｌ／分
である。大体４ｌのタン白溶液、例えば上で製造した約
４ｌのコラーゲン溶液の初期量は１０〜１５分で消費さ
れる。

６、サスペンジョン液循環ループの開始第１図について
、ポンプ９４をスタートし、ＣＨ２Ｃｌ２サスペンジョ
ン液流を大体３０ガロン／分に調節する。フィードパイ
プ９６とトレー容器９０間のバルブ（第１図に示してな
い）を一度永続的に調節して、全トレーに等しい流速を
与える。

この循環速度で、巾１２″の１０個のトレー容器の各々
（３個だけトレー容器を第１図に示してある）の液の０
．２５″深さの層が１０ｃｍ／秒の直線流速を生じる。

熱交換機／クーラー（第１図に図示せず）は、トレー中
０．１°から１０℃のサスペンジョン−液体温度を供す
るように調節する。変法では、サスペンジョン液は上記
したように、拡散性の架橋剤を含んでよい。別の態様で
は、上記した揮発性の拡散可能な架橋剤は、噴霧液滴と
サスペンジョン液と接触させる前に、噴霧コーンと接触
させることができる。

４、ＣＨ２Ｃｌ２中スフェアーサスペンジョンの製造噴
霧シャッター閉鎖可能ゲート要素１１０を開き、タン白
溶液の液滴をサスペンジョン液に衝突させ固化して、連
続スフェアーにする。固化タン白のスフェアーはコレク
タータンク１００中スクリーン１１２で集取する。スフ
ェアーのサイズ分布は２５０〜３３０μｍであるべきで
ある。スクリーンを通過するＣＨ２Ｃｌ２は冷却し、液
体サスペンジョン貯蔵室に再循環させる。殆んどすべて
のタン白溶液が消費された後、噴霧シャッターを閉じる
。ポンプ９４と貯蔵室９２の冷却要素を止める。リター
ンホース３９ｂをドレン４１に動かし、アスピレーター
ホース３９ａを熱水コンテナー３２に動かす。循環ル−
プを水で完全にフラッシュしたら、すべての出力を止め
る。

５、塩水中のタン白スフェアーサスペンジョンの処理（ａ）ＣＨ２Ｃｌ２除去集取タンク１００には１１２〜５００μｍメッシュサイ
ズのスクリーン上にタン白ミクロスフェアー（ビーズケ
ーキ）の粘着性ケーキを含む。ケーキを有するスクリー
ンを塩水コンテナーに浸漬し、ケーキをスクリーン上を
通して圧搾して、塩水中マッシュケーキを得る。

スクリーンは別の室コンテナーに組み入れ、スフェアー
のサスペンジョンを加圧せずにスクリーンに注ぐ。排出
した液体には若干のＣＨ２Ｃｌ２を含み、排出できる。

スクリーン上のケーキを再度塩水を含むコンテナーに圧
搾し、空気スターラーでサスペンジョンを攪拌する。ス
ターラーの剪断効果はスフェアーの粒度を減ずるのに役
立つ。更に微量のＣＨ２Ｃｌ２が除かれるまで攪拌を続
ける。この操作は普通換気施設で行なうべきである。

（ｂ）気泡と遊離タン白質の取り出し静置により、白色のサスペンジョンはスフェアーと気泡
の浮遊層に分れ、タン白スフェアーの多くは底に沈む。

澄明な中間層を除き、脱気冷塩水を加え、短時間ゆっく
り攪拌し静置後、この操作を繰り返えす。数回繰り返え
した後、サスペンジョンは澄明になり、すべてのスフェ
アーは底部に沈む。この操作により、１回の稼動で６ｌ
のビーズが得られた。

（ｃ）ビーズのスクリーン大き過ぎたり小さすきるビーズは洗滌・スクリーニング
、例えばウエット・スクリーニングにより除く。これら
のスフェアーは溶解して再循環させることができる。一
般的には、２６０〜３２０μｍのスクリーンサイズフラ
クションが保持される。

保持されたパックビーズの容量は大体５ｌである。

この時点で、架橋削がタン白質、ガス（流体気体媒質）
又はサスペンジョン液（流体液体媒質）に存在しない場
合、パイプやポンプ中に残るスフェアーやすべてのタン
白質は熱水に容易に溶ける。

このことは管理上特にスクリーンを洗う場合に非常に助
かる。更に、処理工程中揮発性ＣＨ２Ｃｌ２以外毒注の
ある化学物質がないことは重大である。

６、スフェアーの拡散硬化塩水中スクリーニングしたスフェアーのサスペンジョン
に硬化の目的で、架橋剤として２５％グルタールアルデ
ヒド水溶液約１ｌを加える。このサスペンジョンを室温
で１６時間ゆっくり攪拌する。ついで温度は温Ａ度ラン
プを通して上け、その間時々攪拌が必要なだけである。

代表的なランプは２５℃／１６時間、７０℃／８時間お
よび１００℃／１６時間である。すべてのグルタールア
ルデヒドが除かれるまで、塩水で徹底的に洗う。

上記したように、コラーゲンの稀溶液で中和を行なう。

中和後、スフェアーを１００℃／約１６時間処理し、つ
いで再度塩水で洗う。スフェアーは常法によりスチーム
殺菌することができる。続く熱処理はタン白質構造を堅
くし、スチーム殺菌可能なスフェアーにする。同時に、
スフェアーの寸法は元の大きさの約６０％に収縮し、容
量収縮因子は５となる。この実施例に記載の操作を行な
うことにより、直径１５０〜１９０μｍのアンバー色の
スフェアー１ｌが得られた。

こゝに記載の操作において、架橋剤として１，４−ブタ
ンジオールジグリシジルエーテル又はホルムアルデヒド
を使うと、無色のスフェアーが得られた。還元剤のナト
リウムジチオナイトをグルタールアルデヒド架橋剤に加
えると、殆んど無色のスフェアーを得た。しかし、上記
したスフェアーのスチーム殺菌性に関する試験は完全で
はなかった。

７、２倍体ヒト包皮線維芽細胞を生育するために細胞培
養用ミクロキャリアーの使用２倍体ヒト線維芽細胞ＦＳ−４の最初の細胞ストックを
ローラーボトルカルチャーから得る。細胞はトリプシン
処理によりボトル壁から回収する。

スターターのサスペンジョンを傅るために、ボトルの内
容物をズルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改良イーグル
培地プラス５％ｖ／ｖ牛胎児血清で稀釈し、細胞濃度４
×１０５ｍｌ−１を得る。

スターターサスペンジョン１００ｍｌに、１０ｍｌのパ
ックした細胞培養用ミクロキャリアーピーズを加える。

細胞とビーズ（ミクロキャリアー）を１０％ＣＯ２／９
０％空気雰囲気下３７℃で攪拌する。付着した細胞を毎
日計数する。代表的生育プロトコールは次の通りである
。

０日・・・・・・４×１０５細胞／ｍｌ（スターターサ
スペンジョン）１日・・・・・・５．６×１０５細胞／
ｍｌ２日・・・・・・１１×１０５細胞／ｍｌ３日・・
・・・・１１×１０５細胞／ｍｌ３日目に、ミクロキャ
リアー培養物を副次培養のために分ける。ミクロキャリ
アーを静置して、上澄液を頑瀉する。イーグル平衡の塩
溶液でビーズを洗い、各時間ビーズを最初の培養物容量
溶液１／２と混合し、ビーズを静置し、上澄液を傾潟す
る。

洗った後、ビーズと等容量の加温した（３７℃）トリプ
シン−ＥＤＴＡ溶液と混合し、細胞の脱着が始まる。サ
スペンジョンをゆっくり１０分間攪拌し、この時点です
べての細胞は分離する。牛胎児血清のビーズ容量１／２
を加え、ミクロキャリアーと細胞を２５０Ｇで１０分間
遠心分離する。上澄液は除く。

細胞とミクロキャリアーに、新しい細胞培養ミクロキャ
リアーを加え、サスペンジョンを３つのスピナー容器に
分散させ、容器の内容物を大体１００ｍｌグロスにする
。副次培養用の代表的生育プロトコールは次の通りであ
る。

３日・・・・・・３．６×１０５細胞／ｍｌ（分割初日
）４日・・・・・・５．３×１０５細胞／ｍｌ５日・・
・・・・１１×１０５細胞／ｍｌ

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のミクロスフェアーを製造する望ましい
装置の透視図である。第２図は第１図に示した液部受容用容器の断面図である
。第３図は第１図に示す、噴霧ヘッドの断面図である。第４図は第３図に示す、回転板の底面図である。第５図は第４図の回転板の断面図である。第６図は幾分詳しい第１図装置の略図である。第７図は本発明の細胞培養用ミクロキャリアー製造方法
を示すフローチャートである。第８図は第３図に示す、ノズルの底面図である。代理人　　浅　村　　　皓手続補正書（１幻特許庁長官殿１、事件の表示昭１＋＋５８年１、ゾ「間第１１４９８８　　号３、補
１１′をする者事ｆ′（との関係　特シ’１（（ｉ　ｌＬ’ｒ１人住　
　所氏　名　　フロラ　ジェネラル、インコーホレーテッド
（名　称）４、代理人昭和　　年　　月　　日６、補正により増加する発明の数８、補正の内容　　別紙のとおり明細書の浄書　（内容に変更なし）手続補正書（方式）％式％１、事件の表示ＩＩＮｆＩＩ　５８　　年１’ｉ７′ｌ願第　１１４９
８８　　　号３、補正をするＫ ”Ｉ；Ｉ’ｌとの門１．’ｉ４　　’ｌ’！１．：’ｌ
’：ＩＮ・：・１１人４、代理人５、補ｉ１Ｆ命令の１１４・Ｊ昭Ｆｌｌ　５Ｆ１年９月２７日６、補正により増加する発明の数７、　ｔ＋ｌｉ正の対象イｉ、１ｊ・Ｎ’１．、’ｌｌｌ：ｉ’：ｌｊ’１．’
人ｊｌ’ｙ′ｌｒ＋’Ｉｒ、、（ｊ：’ＩＩシシ＋に’
ｌｌ　ｌ’　、　’ニー＋・１．、Ｉ（〕７丁１１１’
ｈ１”１１１ｉ１１．、’ｌｌ、１４　　＋内’、’１
１１１．’ｌｌ’ｌｒ＋＋フ８、補正の内容　　別紙の
とおり４２５

Claims

【特許請求の範囲】

（１）水不溶化タン白質を含む細胞培養用ミクロキャリ
アーであって、タン白質はミクロキャリアーに実質的に
均質に分布している、上記ミクロキャリアー。
（２）タン白質はコラーゲン、カゼイン、大豆タン白、
シルク、ケラチン、卵タン白および血液タン白から成る
群から選択する、特許請求の範囲第１項記載のミクロキ
ャリアー。
（３）タン白質はコラーゲンである、特許請求の範囲第
２項記載のミクロキャリアー。
（４）ミクロキャリアーは、タン白質と架橋剤の反応生
成物を包含する。特許請求の範囲第１項記載のミクロキ
ャリアー。
（５）架橋剤は多官能性である、特許請求の範囲第４項
記載のミクロキャリアー。
（６）多官能性架橋剤にはアルデヒド、エポキシ、ハロ
アルキル、イソチオシアネート、イソシアネート、ジア
ゾ、アリールニトレン、アジド、アシルハライド、アシ
ルアンヒドリド、ジオールカーボネート、クロロホルメ
ート、イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジ
ルエステル、マレインイミド、カルボキシジイミダゾー
ル、ホルミルエステルおよびハロトリアジンから成る群
から選択する官能基を含む、特許請求の範囲第５項記載
のミクロキャリアー。
（７）多官能性架橋剤はグルタールアルデヒドである、
特許請求の範囲第６項記載のミクロキャリアー。
（８）多官能性架橋剤は１，４−ブタンジオールジグリ
シジルエーテルである、特許請求の範囲第６項記載のミ
クロキャリアー。
（９）架橋剤はホルムアルデヒド、エピクロルヒドリン
、ホスゲンおよびアルデヒド澱粉から成る群から選択す
る、特許請求の範囲第４項記載のミクロキャリアー。
（１０）ミクロキャリアーの直径は約５０から約３５０
ミクロンである、特許請求の範囲第１項記載のミクロキ
ャリアー。
（１１）細胞培養用ミクロキャリアーの製造法において
、（ａ）タン白質水溶液の液滴を形成し、（ｂ）この液滴
を流体に懸濁させ、（ｃ）この懸濁液滴を固化して、細胞培養用ミクロキャ
リアーとし、ついで（ｄ）細胞培養用ミクロキャリアーを回収することを特
徴とする、上記製造法。
（１２）タン白質はコラーゲン、カゼイン、大豆タン白
、ミルク、ケラチン、卵タン白および血液タン白から成
る群より選択する、特許請求の範囲第１１項記載の方法
。
（１３）タン白質はコラーゲンである、特許請求の範囲
第１２項記載の方法。
（１４）加圧ノズルからタン白溶液を噴霧して、液滴を
生成する特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（１５）ガス推進噴霧ノズルからタン白溶液を噴霧して
、液滴を生成する特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（１６）急速回転面からタン白溶液を噴霧して、液滴を
生成する、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（１７）超音波駆動ノズルからタン白溶液を噴霧して、
液滴を生成する、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（１８）タン白溶液を乳化して、液滴を生成する、特許
請求の範囲第１１項記載の方法。
（１９）流体には液滴用固化剤を含む、特許請求の範囲
第１１項記載の方法。
（２０）固化剤はアンモニア、アルデヒド、エポキシ化
合物およびエピクロルヒドリンから成る群から選択する
、特許請求の範囲第１９項記戦の方法。
（２１）アルデヒドは多官能性アルデヒドである、特許
請求の範囲第２０項記載の方法。
（２２）多官能性アルデヒドはグルタールアルデヒドで
ある、特許請求の範囲第２１項記載の方法。
（２３）エポキシ化合物は多官能性エポキシ化合物であ
る、特許請求の範囲第２０項記載の方法。
（２４）多官能性エポキシ化合物は１，４−ブタンジオ
ールジグリシジルエーテルである、特許請求の範囲第２
３項記載の方法。
（２５）アルデヒドはホルムアルデヒドである、特許請
求の範囲第２０項記載の方法。
（２６）流体はガス媒体である、特許請求の範囲第１１
項記載の方法。
（２７）ガス媒質は空気である、特許請求の範囲第２６
項記載の方法。
（２８）ガス媒質には塩化水素、アンモニア、ホルムア
ルデヒドおよびゲルタールアルデヒドから成る群から選
択する化合物を含む、特許請求の範囲第２６項記載の方
法。
（２９）流体は液体媒質である、特許請求の範囲第１１
項記載の方法。
（３０）液体媒質はタン白溶液の液滴と不混和性である
、特許請求の範囲第２９項記載の方法。
（３１）液体媒質はハロゲン化炭化水素である、特許請
求の範囲第３０項記載の方法。
（３２）ハロゲン化炭化水素はメチレンクロライド、１
，１，１−トリクロルエタン、トリクロルエチレンおよ
びクレオン　Ｔ．Ｆ．から成る群から選択する、特許請
求の範囲第３１項記載の方法。
（３３）液体媒質は液滴と混和性である、特許請求の範
囲第２９項記載の方法。
（３４）液体媒質は酸である、特許請求の範囲第３３項
記載の方法。
（３５）酸は無機酸である、特許請求の範囲第３４項記
載の方法。
（３６）無機酸は、硝酸、塩酸、リン酸および硫酸から
成る群から選択する、特許請求の範囲第３５項記載の方
法。
（３７）酸は有機酸である、特許請求の範囲第３４項記
載の方法。
（３８）有機酸は修酸と蟻酸から選択する、特許請求の
範囲第３７項記載の方法。
（３９）液体媒質は塩基である、特許請求の範囲第３３
項記載の方法。
（４０）塩基はアンモニア、水酸化アルカリおよびアミ
ンから選択する、特許請求の範囲第３９項記載の方法。
（４１）液体媒質はアルデヒドである、特許請求の範囲
第３３項記載の方法。
（４２）アルデヒドはホルムアルデヒドとゲルタールア
ルデヒドから選択する、特許請求の範囲第４１項記載の
方法。
（４３）タン白溶液の液滴と流体間の温度差を維持して
固化を行う、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（４４）流体はタン白溶液の液滴より熱い、特許請求の
範囲第４３項記載の方法。
（４５）流体はタン白溶液の液滴より冷たい、特許請求
の範囲第４３項記載の方法。
（４６）流体の温度はタン白溶液の液滴より熱く、溶液
には固化剤を含む、特許請求の範囲第４３項記載の方法
。
（４７）タン白溶液に存在する固化剤により固化を行な
う、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（４８）固化剤は水溶性であり、かつアルデヒド、酸お
よび塩基から成る群から選択する、特許請求の範囲第４
７項記載の方法。
（４９）固化工程の後および回収工程前に、硬化工程を
含む、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（５０）架橋剤を使って硬化を行なう、特許請求の範囲
第４９項記載の方法。
（５１）架橋剤の硬化効果は、加熱により促進される、
特許請求の範囲第５０項記載の方法。
（５２）架橋剤の硬化効果は、細胞培養用のミクロキャ
リアーを液化せずに、加熱により促進される、特許請求
の範囲第５１項記載の方法。
（５３）タン白質はコラーゲンであり、架橋剤はグルタ
ールアルデヒドであり、加熱は最初２５℃／１〜２５時
間で行ない、続いて７０℃／１〜２５時間に増し、つい
で１００℃／１〜２５時間加熱する、特許請求の範囲第
５２項記載の方法。
（５４）加熱は最初２５℃／１５〜２０時間、続いて７
０℃／６〜１０時間、更に１００℃／１５〜２０時間加
熱する、特許請求の範囲第５２項記載の方法。
（５５）架橋剤は多官能性である、特許請求の範囲第５
０項記載の方法。
（５６）多官能性架橋剤はアルデヒドとエポキシから選
択する、特許請求の範囲第５５項記載の方法。
（５７）アルデヒドはグルタールアルデヒドである、特
許請求の範囲第５６項記載の方法。
（５８）グルタールアルデヒドを還元剤と併用する、特
許請求の範囲第５７項記載の方法。
（５９）還元剤はナトリウムジチオナイトである、特許
請求の範囲第５８項記載の方法。
（６０）架橋剤はホルムアルデヒドである、特許請求の
範囲第５０項記載の方法。
（６１）回収工程前、細胞培養用ミクロキャリアーから
の過剰の固化剤又は架橋剤を中和する工程を含む、特許
請求の範囲第１９項から第２５項、第４７項、第４８項
および第５０項から第６０項のいずれか１項に記載の方
法。
（６２）ミクロキャリアーをタン白溶液で処理して、中
和を行ない、この溶液はタン白質の固化を避けるために
十分稀釈されている、特許請求の範囲第６１項記載の方
法。
（６３）中和工程後かつ回収工程前に、ミクロキャリア
ーの殺菌工程を含む、特許請求の範囲第６１項記載の方
法。
（６４）回収工程後、ミクロキャリアーの殺菌工程を含
む、特許請求の範囲第６１項記載の方法。
（６５）回収工程前、ミクロキャリアーの殺菌工程を含
む、特許請求の範囲第１１項から第１８項、第２６項か
ら第４６項および第４９項のいずれか１項に記載の方法
。
（６６）回収工程後、ミクロキャリアーの殺菌工程を含
む、第１１項から第１８項、第２６項から第４６項およ
び第４９項のいずれか１項に記載の方法。
（６７）液面をガス媒質にて生成し、流体は液体媒質で
ある、特許請求の範囲第１１項記載の方法。
（６８）液体媒質は液面と不混和性である、特許請求の
範囲第６７項記載の方法。
（６９）固定依存性細胞の生育方法において、（ａ）細
胞培養用ミクロキャリアー、この細胞の接種材料および
栄養生育培地を含むサスペンジョンをつくり、このミク
ロキャリアーは水不溶化タン白質を含み、タン白質はミ
クロキャリアー全体に実質的に均質分布しており、（ｂ
）このサスペンジョンを細胞生育条件下に維持すること
を特徴とする、上記生育方法。
（７０）固定依存性細胞の製造法において、（ａ）細胞
培養用ミクロキャリアー、この細胞の接種材料および栄
養生育培地を含むサスペンジョンをつくり、細胞ミクロ
キャリアーは水不溶化タン白を含み、タン白質はミクロ
キャリアー中実質的に均質分布しており、（ｂ）このサスペンジョンを細胞生育条件下に維持し、
そして（ｃ）この細胞を回収することを特徴とする、上記製造
法。
（７１）固定依存性細胞生産物の製造法において、（ａ
）適当な細胞培地中、水不溶化タン白を含む細胞培養用
ミクロキャリアーのサスペンジョンを生成し、タン白質
はミクロキャリアー中実質的に均質分布しており、（ｂ）この培地に固定依存性細胞を接種して、細胞培養
物を得、（ｃ）細胞生産物の生産条件下にこの細胞培養物を維持
し、ぞして（ｄ）細胞生産物を回収することを特徴とする、上記製
造法。
（７２）細胞生成物はインターフェロンである、特許請
求の範囲第７１項記載の方法。
（７３）細胞生育条件下サスペンジョンの維持工程直後
に、細胞を副培養する工程を含む、特許請求の範囲第６
９項から第７１項のいずれか１項に記載の方法。
（７４）細胞をミクロキャリアーから分離し、そして追
加の細胞培養用ミクロキャリアーをサスペンジョンに導
入して、副次培養を行なう、特許請求の範囲第７６項記
載の方法。
（７５）細胞をミクロキャリアーから分離し、この細胞
を培地とミクロキャリアーから取り出し、細胞を新たな
培地に移し、ついで新しい細胞培養用ミクロキャリアー
を細胞含有の新しい培地に加える、特許請求の範囲第７
３項記載の方法。
（７６）水をベースとしたタン白溶液をミクロスフェア
ーに転換する装置であって、タン白溶液用のサーモスタット調整された加熱貯蔵室；少なくとも１つの噴霧ヘッド；貯蔵室のタン白溶液を噴霧ヘッドに供給する要素；貯蔵室のタン白溶液と少なくとも大体同じ温度で、少な
くとも１つの噴霧ヘッド中のタン白溶液を維持する供給
要素に熱を加える要素；噴霧ヘッドでタン白溶液に所定
の圧力を維持する要素；噴霧ヘッドにより放出された液滴を受容する噴霧ヘッド
の下におかれた少なくとも１つの容器；受容した液滴を
懸濁固化して、サスペンジョン液に連続ミクロスフェア
ーとする少なくとも１つの容器に対して、低温・水不混
和性サスペンジョン液を流すための要素；およびミクロスフェアーをサスペンジョン液から集取する要素を包含する、上記装置。
（７７）供給要素には貯蔵室からおよび後ろにループを
含み、このループには伸長した実質的水平のパイプを含
む装置で、この装置には上記の伸長した水平パイプに対
し複数の噴霧ヘッド、噴霧ヘッドより出た液滴を別々に
受容する複数の容器およびループ中所定の温度を維持す
る要素を含む、特許請求の範囲第７６項記載の装置。
（７８）加熱容器には、水をベースとするタン白溶液含
有の第１区画と循環要素と噴霧ヘッドをプライムしかつ
フラツシングする水を含む第２区画を包含する、特許請
求の範囲第７７項記載の装置。
（７９）加熱容器には、第１区画と第２区画を大体５０
℃の温度に維持する要素を含む、特許請求の範囲第７８
項記載の装置。
（８０）供給要素には、タン白溶液をループを介して強
制するためのピストンポンプを含み、かつこのポンプに
より生ずるパルスを弱くするためにループ中バッファー
とリストリクターを含む、特許請求の範囲第７７項記載
の装置。
（８１）ループには、そのループのインプットに可撓性
部材およびループのアウトプットに可撓性部材を含み、
この可撓性部材はタン白溶液を循環する第１区画に又は
熱水を循環する第２区画に選択的に加入することができ
る、特許請求の範囲第７８項記載の装置。
（８２）ドレンを含みそして可撓性部材の一方又は両方
はドレンを選択的に排出できる、特許請求の範囲第８１
項記載の装置。
（８３）ループのインプットに可撓性部材のインプット
末端を受容するための第１区画中にスクリーンを有する
、特許請求の範囲第８１項記載の装置。
（８４）各噴霧ヘッドは、ループを介して循環するタン
白溶液の小さいフラクションのみを噴霧溶液として排出
するための大きさである、特許請求の範囲第７７項記載
の装置。
（８５）各噴霧ヘッドは同ヘッドから生じるジェット流
に回転を与えるための要素を含む、特許請求の範囲第８
４項記載の装置。
（８６）各噴霧ヘッドにはヘッドの温度を検知する要素
を含む、特許請求の範囲第８４項記載の装置。
（８７）各噴霧ヘッドには非循環伸長オリフィスを含む
、特許請求の範囲第８４項記載の装置。
（８８）加熱要素にはループ上に選択的に位置する加熱
ジャケットを含む、特許請求の範囲第７７項記載の装置
。
（８９）噴霧ヘッドの上流側面に加熱ジャケットを含む
、特許請求の範囲第８８項記載の装置。
（９０）圧力維持要素には、噴霧ヘッドにタン白溶液の
圧力を調節するための調節可能スロットルを含む、特許
請求の範囲第７７項記載の装置。
（９１）ループ中に圧力ゲージを含む、特許請求の範囲
第９０項記載の装置。
（９２）流動要素にはループを介してサスペンジョン液
を循環するための要素を含む、特許請求の範囲第７７項
記載の装置。
（９３）サスペンジョン液循環要素には貯蔵室とポンプ
を含む、特許請求の範囲第９２項記載の装置。
（９４）大体０°〜１０℃の温度、但しタン白溶液の凍
結点温度より低くない温度に低温サスペンジョン液を維
持するための要素を含む、特許請求の範囲第９２項記載
の装置。
（９５）各容器にはサスペンジョン液の流速を増すため
に、各容器のインプット区画に対しサスペンジョン液の
圧力ヘッドを増すための要素を含む、特許請求の範囲第
７７項、第９２項および第９４項のいずれか１項に記載
の装置。
（９６）各容器は実質的に長方形で、圧力ヘッド増進要
素は容器のインプット末端に対しバリアーであり、容器
底部のわずか上におかれており、かつ各容器は長方形の
容器に対してカスケードを生成するためのバリアーと反
対の端にくぼみを有する、特許請求の範囲第９５項記載
の装置。
（９７）容器はサスペンジョン液の流れに各噴霧ヘッド
のみから生する故滴を受容する大きさでありかつ位置し
ている、特許請求の範囲第９５項記載の装置。
（９８）噴霧ヘッドから容器に排出する入口を選択的に
防ぐ閉鎖可能なゲート要素を含む、特許請求の範囲第７
７項記載の装置。
（９９）サスペンジョン液はハロゲン化炭化水素である
、特許Ｆ請求の範囲第７７項記載の装置。
（１００）ハロゲン化炭化水素はＣＨ２Ｃｌ２、１，１
，１−トリクロルエタン、トリクロルエチレンおよびＦ
ｒｅｏｎ　ＴＦから成る群から選択する、特許請求の範
囲第９９項記載の装置。
（１０１）集取要素はサスペンジョン液からスフェアー
を分別する要素を含む、特許請求の範囲第７７項記載の
装置。
（１０２）容器用の普通の排出を含み、集取要素はこの
普通の排出にフィルターを含む、特許請求の範囲第９６
項記載の装置。
（１０３）フィルターは約５００μｍのメッシュを有す
るスクリーンである、特許請求の範囲第１０２項記載の
装置。
（１０４）水をベースとするタン白溶液をミクロスフェ
アーに転換する方法において、液体としてのタン白溶液を気体の雰囲気に噴霧して、連
続の液滴を得；タン白溶液と気体雰囲気（噴霧前タン白溶液の温度より
低い温度である）間の温度差を維持し；連続液部の落下
経路に対し冷水不混和性サスペンジョン液を流して、こ
の冷サスペンジョン液に懸濁したミクロスフェアーを得
；そしてサスペンジョン液から細胞培養用ミクロキャリ
アーを集取することを特徴とする、上記転換方法。
（１０５）噴霧工程には、複数の噴霧ヘッドに対しタン
白溶液の過剰供給を循環する工程を含む、特許請求の範
囲第１０４項記載の方法。
（１０６）タン白溶液の供給循環工程には約５０℃で循
環タン白溶液を維持する工程を含む、特許請求の範囲第
１０５項記載の方法。
（１０７）気体雰囲気は空気である、特許請求の範囲第
１０４項記載の方法。
（１０８）冷サスペンジョン液を流す工程は、ミクロス
フェアーの凍結温度より少し上にサスペンジョン液の温
度を維持する工程を含む、特許請求の範囲第１０４項記
載の方法。
（１０９）流動工程には、複数の噴霧ヘッドからの落下
に対し各流動経路を増進する工程を含む、特許請求の範
囲第１０５項記載の方法。
（１１０）噴霧ヘッドおよび夫々直接流動経路に噴霧コ
ーンを受容するための各流動経路から、噴霧コーンを形
づくる工程を含む、特許請求の範囲第１０９項記載の方
法。
（１１１）各流動経路を発現する工程は、カスケード中
の各噴霧コーンを受容するための流動経路にカスケード
を形成する工程を含む、特許請求の範囲第１０９項記載
の方法。
（１１２）カスケード形成工程は各流動経路に圧力ヘッ
ドを上げる工程および圧力ヘッドから下流する各流動経
路の一部を押し下げる工程を含む、特許請求の範囲第１
１１項記載の方法。
（１１３）スフェアーな集取する工程は、各流動経路を
結びつける工程および結合した流動経路からスフェアー
を分別する工程を含む、特許請求の範囲第１０９項記載
の方法。