JPS5951794A - 温度感受性多重複写プラスミド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は広くは遺伝子工学技術、より詳細には、温度に
よって複写数が制御されうる改良プラスミドｉよび該プ
ラスミドの担体である改良菌株に関する。該プラスミド
を含有する微生物は、アメリカンタイプカルチャーコレ
クションにＡＴＣ′Ｃ１３９１４２号として寄託されて
いる。

自然発生プラスミド類は、宿主染色体あたり安定しかつ
特徴的複写数で宿主細胞中に存する。本複写数は、宿主
間で、また培養成長速度、成長過ｉなどのある種生理的
環境に影響されることがありうるがおおむね一定である
。

宿主細胞株において与えられたプラスミドの複写数を決
定する因子のひとつは、プラスミド自体の複製システム
である。自然発生あるいは、野生−菌類に見い出された
典型的複写数よりはるかに多い複写数のプラスミド変異
株が単離されている。

十分明らかにされてはいないが、このような多複写数変
異株は、変容リプレッサーメカニズムの結果であると信
じられている。安定多複写数変異株はヨーロッパ特許第
００１’　５８３０号Ｃ１９８３年１月２６日公布）に
開示されている。

宿主細胞の表現メカニズムが生育しうるものであるなら
ば、多複写数シラスミド類の獲得は、それらプラスミド
類上の遺伝子によりコート９化され、複写数と同数の蛋
白質類の産生増加を可能にする。

したがって遺伝子工学での多複写数プラスミド９類の使
用は、本プシスミト９類により運搬される異質遺伝子類
の産生率を増加しうる方法を提供する。

ある環境下においては、異質遺伝子による多量の蛋白質
生成物の産生は、宿主菌に有害な影響をもつことがある
。そのような場合、多量の所望する蛋白質生成物を産生
する能力が、とりわけ大規模な工業的醗酵過程において
損われうる。したがって遺伝子操作された微生物におい
て異質遺伝子生成物の産生レベルを制御する手段を見い
出すことが所望されている。

表現プロモーター機構は、例えば特定物質を添加あるい
は枯渇させることで制御され５ることが知られている。

このようなプロモーター機構は、宿主菌が所望する生育
度まで生育できる機会を得、　るまで異質遺伝子生成物
の産□生を遅延させるた゛めに、多複写突然変異体につ
いて用いうる。しかしながら、工業規模においてはその
ような発現制御のための方法は、培養系に多量の誘発物
質を添加する必要があるため、あるいは所望する時点で
培養系より多量の誘発物質を除去する必要があることか
ら望ましくない。さらには、多複写数プラスミヒを含ん
だ宿主細胞は、本質的に“病的”であり、したがって工
業的規模で所望されるようには増殖しえない。

プラスミドの複製機構は温度感受性であると言われてい
る。したがってプラスミ自まある温度において低複写数
で存在し、さらに別の温度では非常に多数のあるいは急
激な複写数の上昇をもたらすべくすみやかに複製しうる
。該プラスミドば、上述のように表現機構によらず複製
機構を介した異質遺伝子生成物の産生のスイッチを入れ
るための所望された技術を提供する。したがって宿主細
胞の培養は、遺伝子操作されたプラスミドによってコー
ド化された異質遺伝子生成物の異常産生が起らぬよう生
育させるべく計画された条件下で行われるべきである。

いったん所望された生育状況に達すると、異質遺伝子生
成物の産生は、温度感受性プラスミドの多複写複製を誘
引する重度変化操作ニヨって非常に増加するかあるいは
スイッチが入れられる。

温度感受性複写プラスミド類の幾つかは先行技術におい
て周知であるが、該プラスミド類はある環境下、特には
大規模な工業的利用においては適してはいない。この理
由としては、前記先行技術によるプラスミド９類の多く
は不安定であり、適当な増殖のためには、強化培養液を
必要とするか、あるいは温度変化を伴って十分増殖がな
される前の対数期において宿主微生物の広範な生育が要
求されることが挙げられる。さらには、温度感受性複写
数プラスミドである先行技術プラスミド類のあるものは
、増殖される前に生育と希釈を繰り返す必要がある。

従って、本発明の目的は、改良された温度感受性複写数
プラスミドを提供することである。

本発明の別の目的は、Ｃｏ１Ｅ１型系統である温度感受
性複写数プラスミドを提供することである。

さらに本発明の目的は、温度感受性複写プラスミド瀑類
を含む改良微生物類を提供することである。

本発明のその他の目的は、添付した図面と関連した以下
の記述により当業者には自明のことでありうるこの場合
： 第１図は、本発明のプラスミド８調製に用いるｐＯＰ９
と呼称されるプラスミドの制限地図であり；第２図は、
本発明のプラスミド調製に用いるｐＥＷ２７と呼称され
るプラスミド９の制限地図であり；さらに 第６図は、本発明に従って構成されたｐＧＳ６と呼称さ
れるプラスミドの制限地図である。

非常に一般的には、本発明の安定多複写数プラスミド類
は、ＱｏＪＥ１型系統を有しかつ相当な温度上昇に起因
した宿主における細胞内複製を受ける。

さらに詳細には、本発明のプラスミド類は、プラスミド
類に著しく例外的な特徴をもたらすべく周知のＣｃ＋Ｉ
Ｅ１訪導プラスミドの一部を取込ませることで産生され
る。本プラスミド９は相対的に小さく（６キロ塩基以下
）さらに温度感受性複写数特性を提供する突然変異を含
む断片を有する。当然ながら、本プラスミドはまた、異
質ＤＮＡ挿入のための適切な部位をもって提供されさら
に、本異質ＤＮＡの表現をもたらす適当なプロモーター
を含有するかあるいは、異質ＤＮＡと共に該プロモータ
ーの挿入のために提供される。

本発明に基いた＃に適切な構造を第６図に示す。

本構造は、第１および２図に示された２個のプラスミド
から誘導された。第１図に示したプラスミドは、周知の
遺伝子工学技術に基いて以下に記述する如く調製された
ｃＯ／ａ１誘導体である。第２図に示したプラスミド、
ｐ　ＥＷ２７は、ＷＯｒＬｙ、Ｆ＆Ｍ、　。

ＭａｅｓｉｒＬｇ、Ｗｉ、　Ａ、　、　Ｐｏ１ｉｓｋ、
ｙ、　Ｂ＋がｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ｚ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　第７９巻８頁３５７０−３５７
４　（１９８２年）で開示したプラスミド９である。し
かしながら、本発明に基いたシラスミドを構成させるた
め、Ｇｏ、ｌ！Ｅｉプラスミドベクターの断片を含有す
る起源物の代りに他のｃｏ！Ｅ１型プラスミドからの断
片Ｃｃｏｐ）を担持する温度感受性突然変異体を使用す
る。

第６図に示した本発明のプラスミドは、第１図のプラス
ミドにおいてＥｃｏＲ１部位から右廻りにＰａｕＩＩ部
位までの断片を取込ませることで構成される。第６図の
プラスミドの残部は第２図のプラスミドより提供されｐ
ＥＷ２７中のＰｐａＩＩ部位からＥｃｏＲＩ部位まで右
廻りの断片に相当する。

コリシン抵抗性遺伝子を含有した本断片は複写数温度感
受性の特徴を提供する２種の突然変異体を含有する。第
６図に示すようなここで得られたプラスミドは、テトラ
サイクリンおよびアンピシリン抵抗性のマーカー遺伝子
を含有しており、さらには若し所望するならプロモータ
ーを伴って異質ＤＮＡを挿入するための数多くの好都合
な部位を含有している。

本発明プラスミド９を好ましい形態で操作する場合、Ｃ
Ｏ之Ｅ１プラスミド、ｐｏｐ６あるいは７）ＯＰｌ　６
が利用される。本プラスミドは、Ｇｇ１ｆαｎｄ、　Ｄ
、Ｈｏ。

５ｈｅｐａｒｄ、　Ｈ，Ｍ、、　Ｑ’　Ｆａｒｒｅｌｌ
、　Ｐ、　Ｈ，、Ｐｏ１ｉｔｋｙ、　Ｂ。

らがＰｒｏｃ、ＮａｔＬＡｃａｔＬ、Ｅ３ｃｔ、、　Ｕ
ＳＡ第、７５巻頁５８６９−５８７３（１９７８年）で
開示している。

ｐｏｐ６の３．ろｈｂ断片は最初に欠失される。そのた
めに、ｉＱｍＭ）リス−塩酸ｐＨ７５，６ｍＭＭｆＧ１
２．６７７μＭ２−メルカプトエタノール、１００μｌ
／ｍｌ牛血清アルブミンおよび６５ｍＭＮαＣ１を含む
２００μｌの反応液中で５０μｙのｐｏｐ６ＤＮＡを制
限エンドヌクレアーゼＢ！！！！ＬＨＩおよびＳｓｔ工
の各２０単位（最少１５単位）で３７Ｃにおいて２時間
、完全分解する。分解されたＤＮＡはフェノール抽出、
クロロホルム−インアミルアルコール（２４：　１　）
抽出、エタノール沈殿処理後、１０７１０７ＦＬスー塩
酸ｐＨ７，４、ＩＤｍＭＮαＣノ、ｉｍＭＥＤＴＡに再
懸濁される。

Ｅ）ｒｔｉ３’突出末端の除去およびＢ（Ｚ７７！ＨＩ
５’末端を“埋め込み”または修復のために、分解され
たＤＮＡは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理される
。本工程は、２段階反応で完了さ五る：２−ＯＣで行う
第一段階では１．＞Ｔリスラーゼの°−３７５／エキソ
″活性が、５’５ｓｔｌ突出末端を効果的に除去するた
めに期待されその後のＯＣでの反応ではエキソヌクレア
ーゼ活性は最小であり、ポリメラーゼ活性が５′鋳型ス
トランドを用いて隠ぺいされた６′−末端を修復する。

ＢａｍＨＩ　／Ｓｓ　ｔ　Ｉ分解ｐＯＰ６ＤＮＡの０．
２６ｐｍｏｌｅヲテオキシヌクレオチド６リン酸の各々
５００ｐｒｎｏ１ｇ　、４　［１ｍＭＫＰｏ４ｐＨ７，
４、／、、４　ｍＭ　ＭダＣ１２，１ｍＭ２−メルカプ
トエタノールおよび１００μｌ／ｍｌ牛血清アルブミン
を含む反応液５０μ！中で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１
２単位で２０Ｃ１０分間処理後ＯＣでさらに１５分間処
理される。

本ポリメラーゼ処理ＤＮＡは、フェノールで除蛋白後エ
タノール沈殿される。

分子内揃い末端結合を最大にするため、０．１ｐｍｏｌ
ｅの分解および修復ＤＮＡは５０ｍＭ）リス−塩酸ＰＨ
７，５，１０ｍＭ　ＭＩＧＩ２，１１０７７Ｌジチオス
レイトール、１００μｇ２乙ｄ結晶性牛血清アルブミン
、５００７１１ＭＡＴＰおよび０．１単位Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを含む５０μノの反応液中で２０Ｃ２時間結合さ
れる。

本結合されたＤ　Ｎ　Ａ　Ｑ、　０２　ｐｍｏｌｅ　（
１０Ｄ”Ｗ）は、適格ＤＧ７５を形質転換するため使用
される（Ｑ／Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｐ、　Ｈ，、Ｐｏ１ｉ
ｓｋｙ、　Ｂ、　、　Ｃｒｅｌｆａｎｄ、　Ｄ、　Ｈ。

Ｊ、Ｂａｃｔｇｒｉｏｌ、第１６４巻９頁６４５−６５
４（１９７８年））。被転換体類は、５０μ、！７Ｓ濃
度のアンピシリンを含有するＬ型プレート上で選択され
かつ： １）３．３＊ｉの欠失； ２）　　Ｅ３ｇ、、ｔ　ｌ制限エンドヌクレアーゼ部位
の欠損；および ６）新しく形成されたＢ良ｍＨｉ制限エンドヌクレアー
ゼ部位の存在 についてスクリーニングされる。

ｐｏｐ７と呼称する一被転換体が選別されさらにｐｏｐ
７中のＢａｍＨ）部位がその後、欠失される。

より有効な多複写数クローニング伝播体を構成するため
に、プラスミ）”７）ＢＦｔ３２２　由来のテトラサイ
クリン抵抗性（ＴＣＲ）機能をコード化したＤＮＡ断片
がｐｏｐ７の亜断片と結合される。ｐＢＲ”）２２由来
の本ＴＣ断片は、Ｂ（１７７ＺＨＩ切断部位を含有する
。したがってｐｏｐ７中の単−ＢａｍＨＩ　ｇ織部位は
、露出した５’　ＢＩＺ７７１ＨＩ付着端のポリメラー
ゼ修復合成によって除去される。

ｐＯＰ７ＤＮＡ　（’）　２５　ｐｇ　ハ、１００　ｍ
ＭＮａＧｌ、６ｍＭ　）　ＩＪ　スー塩酸ｐＨ７，９，
６７７１Ｍ２−メルカプトエタノールおよび１００μｇ
７ｒｒｔｉの牛血清アルブミンからなる１００μノの反
応液中で２０単位のＢａｍＨＩと３７Ｃで４−５時間完
全なまでに分解される。本分解ＤＮＡは、フェノールお
よびクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）
で逐次除蛋白されさらにエタノールで沈殿される。本Ｄ
ＮＡは、１０１０７Ｗリス−塩酸ｐＨ７，４，１ｍＭＥ
ＤＴＡにて５０ｒｇ／―濃度に再懸濁される。

５’　ＢｃｚｍＨＩ付着端の修復のために、ＢａｍＨＩ
分解ｐＯＰ７ＤＮＡ（１）　１０　ｐｇが３７ｒで１時
間、１゜ｐｍｏｌｇ　ｃＺＴＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＧ
ＴＰおよび８Ｑ　ｐｍｏｌｅ３ＨｄＧＴＰ、　４０ＷＬ
ＭＫＰＯ４ｐＨ７，５，６，４ｍＭ　ＭｙＧｌ２゜１ｍ
Ｍ　２−メルカプトエタノール、１ｏｏｐｙ７ｍｉの牛
血清アルブミンおよび０．７単位の大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼ断片Ａ　（Ｋｌｅｎｏｗ）を含む反応液５０μノ
中で処理される。本ＤＮＡはフェノールおよびクロロホ
ルム−イソアミルアルコ−＃（２４：１）で逐次除蛋白
後エタノール沈殿で濃縮される。

修復かつ濃縮された本ＤＮＡは、１単位Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ、ｌ　ｍＭＡＴＰ、５ＤｍＭ）リス−塩酸　１０ｍ
ＭＭｇＣ１２，１０フルＭジチオスレイトール、および
１００μｇ／１ｒｔｌｌの牛血清アルブミンを含有する
反応液１０μｌ中で０．５　ｐｇ＜ｏ、１μｍｏｔｅ＞
のＤＮＡと２ＤＣで８−１２時間結合される。適格ＤＣ
７５は、０．１μＩのＤＮＡで処理されさらに被転換体
は５０ｒｍ／／ｍｌにアンピシリンを含有するプレート
上で選択される。適格な被転換体の候補についてｐａｍ
Ｈｉ　制限エンドヌクレアーゼ切断部位の欠損がスクリ
ーニングされる。７１０Ｐ８と呼称する一被転換体が選
別された。

本ＰＯＰ３はその後ｐＯＰ９を得るべく修飾される。

そのために、ＦＢＲ３２２由来のｊｙｖａ　ｌ　（修復
流）−ＥＣＱＲＩＴＣＲ断片が最初に単離される。ＰＢ
Ｒ３２２の１００μＩは２０単位のかｔａｌによって６
ＤｍＭＮａＣｌ、６７７ＬＭ　トリス−塩酸、　ｐＨ８
，６ｍＭ２−　メルカプトエタノール、１０ｍＭ　Ｍ！
Ｉｃ１２および１００μｇ／―牛血清アルノミンを含有
する反応液５００μｌ中で６７Ｃにて６−７２時間完全
なまでに分解される。本分解ＤＮＡは除蛋白されさらに
エタノール沈殿により２μｙ／μｌまで濃縮される。

ＰＢＲ３２２のＡｖａ　ｌ末端の修復のため、８０ｒｇ
（５Ｑ　ｐｍｏ　Ｚ　ｅ末端）のＡｖａ　Ｉ分解ＦＢＲ
３２２は、１．４単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレ
ナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片により４０ｍＭＫＰｏ４　ｐ
ＨＺ６゜６、６　ｍＭ　ＭｙＧｌ　２．各々１ｏμＭの
ｄＴＴＰ　。

ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、１．Ｑ９ｎｗｔｏｌｅ　３ＨｄＧ
ＴＰ、　１ｍＭ　２−メルカプトエタノールおよび１０
０μｍ７７ｍ１牛血清アルブミンからなる反応液２００
μｌ中で１５分間２０Ｃで処理される。揃い末端をもつ
ＤＮＡは、除蛋白されついでエタノール沈殿によって１
．６μＩ／μｌまで濃縮される。フラッシュ−末端をも
つＤＮＡをｆｙｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで処理
してＦＢＲ３２２よりＴ、Ｒ断片を遊離させる。

ＤＮＡ７８μｇは、１００ｍＭ）ＩＪスス−酸７’Ｈ７
，５，５Ｄ　ｍＭＮａＣｌｌ、　５　ｍＭ　ＭｇＣ１２
および１００μｇ／−ゼラチンからなる１ＤＯμノの反
応液中１００単位のＥｃｏＲｌ　　と６７Ｃで１時間完
全なまでに分解される。１．４ｋｈ断片以下のものは、
０．６％アガロースゲル上で電気泳動的に大きい断片と
分離、抽出されさらに本ＤＮＡは、０．２μ９／ｐｉ（
０，２ｐｍ’ｌｌ／ｐｉ　）　マ’１Ｊ！縮サレル。

その後、ｐｏｐＢから−ＩＩ（部分的）−レリＲ１６５
６０ｂｐ断片が単離される。ｐＯＰ８９５μｙは、６ｍ
Ｍト’）スー塩酸、ＰＨ７，５，６０ｍＭ　Ｎａ１ｌ、
（５ｍＭ　Ｍ　ｙ　Ｃ１１２，６ｍＭ　２−１　／’　
カプトｘり／　−Ａ／および１００μ９７ｍ１のゼラチ
ンからなる＋ＳＯＤμ）の反応液中６０単位（最少１５
単位）のＰｖｕ、１１との３７１Ｚ’１０分間の２分割
反応で部分的に分解される。

フェノールによる脱蛋白およびエタノール沈殿につづい
て、各部分的ｐＯＰ８　也凪ＩＩ分解物は、ｆ５ｃｏ’
ｆｉＩ　により完全に分解される。ＤＮＡ８０μｇは、
５０ｒｒＬＭＮαＣｌ、１００μ、９／ｍｌゼラチンか
らなる２００μｌの反応液中１００単位のＦ、ｃｏＲＩ
で３７Ｃ１１５分間処理される。ここで得られる分解物
は、電気泳動的に識別し約”ｒ、５６ｋｈ断片が単離さ
れる。

１．４２ｋｈ　恥ユＲＩ−〜Ｊ（ＩＩ（修復）Ｔ謔断片
（８）および３．５６ｋｂをンＲＩ　　Ｐｔ）ｔｂ　ｌ
　Ｉ　ＡＰＲ断片（至）の結合および転換がその後完結
される。断片Ｂの０．５μｇおよび４．５μｇの断片Ａ
は、ｆｊ、ｃｏＲＩ末端の分子間結合を優先して進行さ
せるため２段階反応で結合させた。３０μノの反応液は
、該ＤＮＡ断片の他に５０ｍＭ）リス−塩酸ＰＨ７，５
，、１０ｍＭＭダＣ；Ａ２，１０ｍＭジチオスレイト−
／’　＋　４０　ｐｍｏｌｅＡＴＰ　および１μノ（約
ｏ、ｏｏｉ単位）のＴ４　ＤＮＡリザーゼを含有した。

結合反応は２５Ｃで開始されその後徐々に７時間以上を
かけて１２ｔＺ’まで冷却した。ＡＴＰ濃度を１ｍＭま
で増加しさらに約０．１単位のＴ４ＤＮＡリザーゼを追
加した。

適格なりＣ７５は、５μｌの結合反応混液により転換さ
れ、さらに被転換体は、アンピシリン（５０μｇβｌ）
あるいはアンピシリ％５０μｆｉ／ｒｎｌ）およびテト
ラザイクリン（１５μ９／ｍｌ）が共存するプレート上
で選別された。

選別された候補ＴＣＲおよびＡＰＲコロニーは、ｐＯＰ
８供与のコリシン免疫性、大きさおよび制限分解パター
ンがスクリーニングされた。

−候補で： １）多複写数； ２）　　ｈｐＲｐ ｓ）’ｒｃＲ； ４）コリシン免疫性； ５）狂ＯＲＩ、彰巴Ｈ１，均怨ＩＩ、かｄｌＩｌに対す
る単一制限エンド８ヌクレアーゼ部位；６）…’、ｎｃ
Ｉｉに対する２個の制限エンドヌクレアーゼ部位；およ
び ７）個有の大きさおよびＨｄ＄ＩＩＩ分解様式をもつも
のをｐＯＰ９　（第２図）と呼称した。

７）ＯＦ２（ツー）（第２図）の、７＞ＯＦ２　（ツ塙
６図）への転換を完遂させるため、ｐＥＷ２７由来の断
片を使用した。７）ＥＷ２７は、ＰＢＣＴＰ１２０由来
のニトロソグアニジン誘発変異株プラスミドである（　
Ｐｏ１ｉ′ｋｙ、　Ｂ、、　Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｒ，Ｊ、
、　Ｃｒｅｌｆａｎｄ、Ｄ、　Ｈ，。

Ｐｒｏ、Ｎａｔｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ第
７６巻頁６９００−３９０４（１９７６年））。本プラ
スミドは、上昇温度でプラスミド複写数を増加させるよ
うな温度−感受性複写数（ＣＯｐ）改変を含有している
。

本プラスミドの表現型は、本来、４１Ｃにおける’　　
Ｆ’１ａｃｌ！１宿主中でのベータザラクトシダーゼ生
合成の増加（ＣｒＣ１，ｆａｎｃｌ、　Ｄ、　Ｈ，、Ｅ
３ｈｅｐａｒｄ、　Ｈ，Ｍ、。

σＦａｒｒｅｌ、ｌ、　　Ｐ、Ｈ，、Ｐｏ１ｉｓ・ｋｙ
、　　Ｂ、、　　　Ｐｒすｃ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ第７５巻１頁５８６４−５
８７３（１９７８年））。および４１Ｃでのベーターラ
クタマーゼの増加（ＭＬＬｅＪＩｉｎｇ、　Ｍ、　Ｔａ
ｍｍ、　　Ｊ、　。

Ｓ／ｅｐａｒｄ、　Ｈ，Ｍ、、　Ｐｏｔｉｓｋｙ、　Ｂ
、　、　Ｃｄｌ　ｆ、２４巻。

頁２３５−２４２（１９８１年）；αＣａｌｌａｇｈａ
ｎ、　Ｃ。

Ｈ，、Ｍｏｒｒｉｓ、　Ａ、、　Ｋｉｒｂｙ、　Ｓ、　
Ｍ、、　Ｅ３Ａ、１ｎ４１ｅｒ、Ａ、　Ｈ。

往■工〜ヨ四二Ｏ０第１巻１頁２８３−２８８（１９７
２年））として検出された。ＰＥＷ２７は、ｐｏｐＢの
響ＩＩＡ断片と相同の２．６ｋｈ　Ｐｖｕ　ｌ　ｌ断片
を含有している。ｐＥＷ２７（およびｐＢＧＰ１２０゜
Ｐｏ１ｉｓｋｙ、　Ｂ、、　Ｂ１５ｈｉｐ、　Ｒ，Ｊ、
、　Ｇｅ１ｆａｎｄ、、　Ｄ、　Ｈ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ第
７６巻１頁６９００−３９０４（１９７６年））中の非
反復ＥｃｏＲＩサイトは、本断片中に存在する。ｐＥＷ
２７の１，６ｈｂをンＲＩ−Ｐｖｕ、　Ｉ■断片は、ｐ
ＯＰ９　（Ｃｏｐ−）の断片を含んだ１．６　ｋｈ　Ｅ
ｃｏＲＩ−Ｐｖｕ、ｌ　Ｉ起源と相同である。ＰＯＰ９
（ｃｏｐつをｐｃｓ３へ転換するため、１．６ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ−ｐｐｕｉ　Ｉ　断片が切換えられる。

７）ＥＷ２７ＤＮＡの５０μｇは、ｐｖｕｌｌついでセ
Ｒｉによって完全に分解された。ＤＮＡは、６７Ｃにて
９０分間、６ｍＭ）リス−塩酸ｐＨ７，５，６０ｍＭ　
Ｍａｉｌ　、　６ｍＭ　ＭｇＣｒ１ｌ　２．６　ｍＭ　
２−メルカプトエタノール、１００μ９７ｍ１の牛血清
アルブミンからなる１００μノの反応液中２５単位（最
少１５単位）Ｐｐａｉｉ　で分解された。本トリス−塩
酸濃度を１００　ｍＭまで増加し、さらにＥｃｏＲＩエ
ンドヌクレアーゼ（１００単位／６０単位最少）を９０
分間追加させた。本をンＲＩ−ＰＵＩＩ　　１．６ｋｈ
１Ｅ”　断片は、電気的抽出およびエタール沈殿にて濃
縮された。同様に、５０μＩのｐＯＰ９は、酬ＩＩおよ
びｆｌｃｏＲ−１によって完全に分解されさらに５．６
ｋｂ″′Ａ”断片が単離された。

０、３６　ｐｌｉ　（０，５２７ｐｍｏｌｅ）の７）Ｅ
Ｗ２７断片および０．３５　ｐｌｉ　（０，１６ｐｍｏ
ｌｅ＞のｐＯＰ９断片は、５０ｒｒＬＭトリスー塩酸ｐ
Ｈ７，５，１０ｍＭｆＧｉ２．１０ｍＭジチオスレイト
ール、１　ｍＭＡＴＰ、　１００μｊｊ／ｍｌの牛血清
アルブミンおよび０．１単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼからな
る２０μｌの反応液中で２５Ｃにて１６時間結合させら
れた。ＮＭ２９４は、１／２の本結合ＤＮＡと形質転換
されついでアンピシリン−テトラサイクリン抵抗性被転
換体が選別された。

候補となるコロニーは、最初６０Ｃおよび４１Ｃでベー
ターラクタマーゼ分析プレート上でスクリーニングされ
ミその後、３０Ｃおよび４１Ｃで生育後のプラスミ）”
ＤＮＡレベルが分析された。−候補をｐｃｓ３と呼称し
た。

本発明のプラスミド９類は、６０Ｃでは低複写数（１５
−２０）で存在する。宿主細胞自体それ以上増殖できな
いか、あるいは複製できない温度である４ＤＣにおいて
、−細胞の染色体あたり１５０−４００複写舷へと増加
させて、本プラスミド類へクローン移入された異質遺伝
子のいかなる産生物をも増大させる。本発明のプラスミ
ドは相対的に小サイズであり、したがって大ぎいプラス
ミド９類と比較したぶん自然欠失を受は朧いといえる。

例えば、本発明のプラスミド９類はシラスミド７）ＢＲ
３２２−Ｂｌ　ｔｒｐに存在するｔｒｐプｏモーターは
一タインターフェロンＥｃｏＲＩ　Ｌ／Ｘｈｏ　Ｉ　Ｉ
　断片をＦｅ１２中のＴＣＲ遺伝子上の晩＝ｏＲ■−Ｂ
ａｍＨＩ領域へクローン移入される。

大腸菌ｔｒｐプロモーターｔ　オ＜ｖ−ｐ−＋　ｔｙＬ
、リボゾーム結合部位および７＋ＢＲ３２２−Ｂ１ｔγ
ｐ由来のヒ）　ＩＦＮ−Ｂ１構造遺伝子の移入は、以下
の如〈実施される。ｐＢＲ３２２Ｂ１　ｔ”Ｐの臀およ
びＩＦＮ−Ｂ１配列は、′恥ヨＲＩ−ＸＡＯＩ　ｌ６２
０ｂｐ　ＤＮＡ断片として単離される。本ＤＮＡ断片は
、４．６ｋｈ起源およびＡ、、ＲＢａｍＨＩ／距？ＱＲ
Ｉ″Ａ′　　断片を利用して７）Ｏ８！、中の３７５　
ｈｐ均コＲＩ−ＢａｍＨｉＤＮＡ断片の代用にされる。

皆およびＩＦＮ−８１配列が最初に単離される。

５０　ｐｇ　Ｉ）ｐＢＲ５２２−Ｂ１−ｔｒｐは、１０
　ｍＭ　）リス−塩酸ＰＨ７，５，６ｍＭ　Ｍ、ｑＧ１
２．６ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１００μｆｉ
／ｍｌのゼラチンおよび５０単位（厳密に６０単位）の
ＸＡＩＩＩＩＩ　からなる２００μｌの反応液中で３２
Ｃ１６０分間完全なまでに分解された。さらにトリス−
塩酸濃度を１００ｍＭへ、ＮａＣ１濃度を５３　ｍＭへ
それぞれ増加しさらに３７Ｃで４０分間を要して１００
単位の恥ｐＲＩ　を添加して９７３　ｂＰ史ＩＩ”Ｃ”
断片を所望する６　２０　ｈｐ均？６ＲＩ−泣しＩＩ”
Ｉ）ｔｊ断片へ転換した。ここで所望した断片を電気泳
動により分画後、２％アガロースゲルより溶出しさらに
適当な分画なエタノール沈殿により濃縮した。

７）Ｃ８３イクターの調製のため、５０μｙのＰｃ５３
は、１０ｒｒＬＭトリスー塩酸、　ｐＨ７，５，６ｍＭ
ＭｇＣｊ１２゜５ｐｍＭ　ＮａＧ１，６ｍＭ　２−１ル
カプトｘり、／−＃および１０μｌ７ｍ１の牛血清アル
ブミンからなる反応液１００μｌ゛中で−ＨＩ　（３２
単位−１５単位最少）と反応させ完全に分解した。本ト
リス−塩酸濃度を１００ｍＭまで増加しさらに６７Ｃで
３０分を要して１００単位のＴｐｃｏＲｉを添加した。

分解されたＤＮＡは、フェノールおよびクロロホルム：
イソアミルアルコール（２４：１）混液で順次除蛋白さ
れ、さらにエタノール沈殿により濃縮された。

断片の結合および転換を実施した。即ち、０．６μｙの
分解ベクターおよび０．２μｇの精製標的断片は、、、
　５０　ｍ、Ｍ　トリス−塩酸ｐＨ７，５、ｉ　Ｑ　ｍ
ＭＭ、！７Ｃ１２，ｌ　［］　ｍＭジチオスレイトール
、１００μ、９／ｍｔｌの牛血清アルブミンおよは０．
００１単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼからなる反応液１０μぎ
中で１０Ｃにて１２時間結合される。本結合されたＤＮ
Ａは、６５°まで１０分間加熱され、ＮａＣ１が１００
ｍＭ　まで添加されさらに３７１ｍ’で６０分を要して
６単位の…ＨＩを添加して起源ベクター３７５　ｈｐ顕
ＲＩ−彫すＨＩ断片を含イｉしたベクター結合生成物を
不活化（線形化）した。適格なりＣ１，７５が結合され
たＤＮＡの１１５と転換され、さらに転換体は５０μｇ
／ｒｒ！濃度のアンピシリンな含みさらに５００μｇの
Ｌ−）リプトファンを前もって塗布したＬ型プレート上
で選別された。

候補となるコロニーは、次の点についてスクリーニング
にかけられた： １）ＴＣＲの欠損（！ツーＩＦＮベーター１配列のＴＣ
遺伝子の一部分での置換）： ２）正確なプラスミド９の大きさ； ３）ユニークＨｐ−α■部位（ｔｒｐプロモーター中）
の存在； ４）さらにｐｓｔ１部位（ユニークＥｃｏＲ■部位から
２５０　ｈＰのＩＦＮ−Ｂ１配列中）が存在すること； ５）　　ＰＢＲ３２２ベーター　１　ｔｒＰヨリ最初に
精製された６　２０　ｈｐ恥１ＲＩ−Ｘ、すＩＩ　断片
の存在とその適正なサイズ、 適正な候補のひとつをＰＣ８３ベーター１ｔｒｐあるい
はｐｃｓ４と呼称した。

本発明のプラスミド類はそのＣＯ！Ｅ１型系統故に、酵
素ＤＮＡポリメラーゼＩを絶対的に必要とし、さらにｐ
ＯｌＡｌ−（ＤＮＡポリメラーゼ欠損）宿主（Ｋｒ、ｎ
ｑｓｂｗｒｙ、　Ｄ、　Ｔ、、　Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、　
Ｄ、　Ｒ，。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ／１．ｙｓ、　ＲｅＪ？、
Ｃｒｏｍｍ１第４１巻９頁１５６８−１５４４（１９７
０年）　；　”Ｆａｌｋｏｗ、　Ｓ。

Ｉｎｆｅｃｔｉｏａｓ　Ｍｕ、１ｔｉｐｌｅ　Ｄｒｕ、
ｇ、　Ｒｅ５ｉｓｔａｎｃｅ　　（感染性多剤耐性）ピ
オン社、ロンドン、頁１５１−１５２（１９７５年））
中では複製しえない。本プラスミド類は細胞染色体あた
り１５−３０複写をもつことで特徴的に存在し、かつク
ロラムフェニコール、スベクチノマイシン、その他（蛋
白合成を抑制するある秘技生物質）の添加により増大さ
れうる（　Ｃｔｅｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、　　Ｊ、　Ｂ
ａ、ｃｔｅｒ乙ｏ１．第１１０巻１頁６６７−６７６（
１９７２年））。本発明プラスミド類の多複写数特性は
、おおむね変更されず、どちらかというとクロラムフェ
ニコールの添加でわずかに増加される。このことは、増
大が行われるために蛋白生合成の必要がないことを示し
ている。

したがって、本発明は、Ｃ０ＩＥ１型系統の安定多複写
数かつ温度感受性プしスミド類を提供するであることを
理解しうる。本プラスミド類は、温度感受性で相対的に
小サイズでありかつ３０Ｃから４０℃へ温度変化させる
ことで複写数の人怖な増大が起る。

前述の説明および添付の図面から当業者には不明細壱で
開示したものに加えて、本発明の種々の変更が自明のこ
とである。このような変更は、添付の特許清水の範凹内
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のプラスミド調製に用いるｐＯＰ　９
と呼称されるプラスミドの制限地図であり； 第２図は、本発明のプラスミド調製に用いるｐＥＷ２７
と呼称されるプラスミドの制限地図であり；さらに 第６図は、本発明に従って構成されたｐｃｓ　３と呼称
されるグラスミドの制限地図である。 （外４名） ＦＩＧ、　３ 手続補正書 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１０２５２０　　号２、発明の名称 温度感受性多重複写プラスミド類 ６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名称　　　シータス・コーポレーション５袖正の対象 明細書の〔特許請求の範囲〕の禰 （別紙） 〔特許請求の範囲〕を次のように訂正する。 「１．　　Ｃｏ１ＥＩ型系統であって宿主中で相当な温
度上昇に基いて充分な細胞内複製を行う安定な多複写数
プラスミド類。 ２　相当な温度上昇は、約６０℃から約４０℃への温度
変化である特許請求の範囲第１項に記載のプラスミド類
。 ３　約６キロ塩基以下でｐ　ＥＷ　２７のＰｖｕｌＩ／
ＥＣＯＲＩ断片を含有する特許請求の範囲第１項記載の
プラスミド類。 ４、　　Ｃｏ１ＥＩ型系統であって宿主中で相当な温度
上昇に基いて充分な細胞内複製を行う安定な多複写数プ
ラスミド類を含有する微生物。 ５、プラスミドｐＣ８３を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＡＴＣＣ＋３９１４２）で
ある特許ＭＦＪ求の範囲第４項記載の微生物。」 以　　」二

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　ＣＪＥｉ型系統であって宿主中で相当な温度上
   昇に基いて充分な細胞内複製を行う安定な多複写数プラ
   スミド類。 ２、相当な温度上昇は、約３００から約４００への温度
   変化である特許請求の範囲第１項に記載のプラスミド８
   類。 ３　約６キロ塩基以下で７）ＦＷ２７の−ＩＩ／Ｅ叩Ｒ
   Ｉ断片を含有する特許請求の範囲第１項記載のプラスミ
   ド８類。 ４、　プラスミドｐＧＥ３３（ＡＴＣＣ≠３９１４２）
   である特許請求の範囲第１項記載のプラスミド類。 ５、　　Ｃ０ＩＥＩ型系統であって宿主中で相当な温度
   上昇に基いて充分な細胞内複製を行う安定な多複写数プ
   ラスミド類を含有する微生物。