JPH07114702B2 - ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 - Google Patents
ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ（以下、IGF
−Ｉという）の改良された製造法に関するものである。
−Ｉという）の改良された製造法に関するものである。
より詳しくは、この発明は、保護ペプチド脱離反応によ
ってIGF−Ｉに導くことができる、保護ペプチドと融合
したIGF−Ｉ（以下融合IGF−Ｉという）の改良された製
造法およびその目的のための発現プラスミドに関するも
のである。
ってIGF−Ｉに導くことができる、保護ペプチドと融合
したIGF−Ｉ（以下融合IGF−Ｉという）の改良された製
造法およびその目的のための発現プラスミドに関するも
のである。
IGF−Ｉが下記に示すような70個のアミノ酸から成るこ
とは既に知られている。
とは既に知られている。
この発明の発明者らは、次の各工程を用いることによ
り、IGF−Ｉを好収率で製造することに成功した： 工程１ 融合IGF−Ｉをコードする遺伝子（以下融合IGF−Ｉ遺伝
子という）を製造する工程。
り、IGF−Ｉを好収率で製造することに成功した： 工程１ 融合IGF−Ｉをコードする遺伝子（以下融合IGF−Ｉ遺伝
子という）を製造する工程。
工程２ ロツプ遺伝子（以下rop遺伝子という）を切り取られたC
olE1プラスミドに該融合IGF−Ｉ遺伝子を挿入すること
からなる発現プラスミド製造工程。
olE1プラスミドに該融合IGF−Ｉ遺伝子を挿入すること
からなる発現プラスミド製造工程。
好適な「ColE1プラスミド」には、PBR322等が含まれ
る。
る。
工程３ 該発現プラスミドにより宿主生物を形質転換することか
らなる形質転換体製造工程。
らなる形質転換体製造工程。
工程４ 該形質転換体を適当な培地中で培養することからなる融
合IGF−Ｉ製造工程。
合IGF−Ｉ製造工程。
工程５ 宿主生物細胞から融合IGF−Ｉを単離する工程。
工程６ 該融合IGF−Ｉを保護ペプチド脱離反応に付すことから
なるIGF−Ｉ製造工程。
なるIGF−Ｉ製造工程。
保護ペプチドは、宿主生物の細胞中のプロテアーゼによ
る分解からIGF−Ｉを保護するために使用され、前記融
合IGF−Ｉの保護ペプチド脱離反応によって除去され
る。
る分解からIGF−Ｉを保護するために使用され、前記融
合IGF−Ｉの保護ペプチド脱離反応によって除去され
る。
すなわち、該融合IGF−Ｉは脱離反応によってIGF−Ｉを
製造するための中間体であり、従って、該保護ペプチド
は、天然または合成の蛋白から、天然または合成のペプ
チドから、あるいはそれらの断片から誘導された任意の
脱離可能なペプチドであってよい。
製造するための中間体であり、従って、該保護ペプチド
は、天然または合成の蛋白から、天然または合成のペプ
チドから、あるいはそれらの断片から誘導された任意の
脱離可能なペプチドであってよい。
好適な「融合IGF−Ｉ」には、蛋白ペプチドのメチオニ
ンを介して蛋白ペプチドと融合したIGF−Ｉが包含され
る。
ンを介して蛋白ペプチドと融合したIGF−Ｉが包含され
る。
蛋白ペプチドの好適な例の一つは「蛋白ペプチドLH」で
あり、そのアミノ酸配列は次の通りである。
あり、そのアミノ酸配列は次の通りである。
蛋白ペプチドLHと融合したIGF−Ｉをコードする好適な
遺伝子（422bp）は次の通りである。
遺伝子（422bp）は次の通りである。
この発明のプロセスは、rop遺伝子を含めたある程度の
長さの遺伝子を切り取られたプラスミドを用いる。この
場合、切り取りが広すぎて、本質的に必要な遺伝子部分
に及んでいる場合、例えばターミネーター領域を含む遺
伝子を該rop遺伝子と共に除去した場合には、同じ機能
を持つ人工合成遺伝子を該遺伝子部分の代りに再挿入す
ればよい。
長さの遺伝子を切り取られたプラスミドを用いる。この
場合、切り取りが広すぎて、本質的に必要な遺伝子部分
に及んでいる場合、例えばターミネーター領域を含む遺
伝子を該rop遺伝子と共に除去した場合には、同じ機能
を持つ人工合成遺伝子を該遺伝子部分の代りに再挿入す
ればよい。
好適なプロモーター遺伝子には、通常採用されるプロモ
ーター遺伝子（たとえばtrpプロモーター遺伝子等）な
らびに合成プロモーター遺伝子が包含される。プロモー
ター遺伝子の好適な例としては、この発明の発明者らに
より合成された合成trpプロモーターＩ遺伝子（107bp）
が挙げられ、そのDNA配列は次の通りである。
ーター遺伝子（たとえばtrpプロモーター遺伝子等）な
らびに合成プロモーター遺伝子が包含される。プロモー
ター遺伝子の好適な例としては、この発明の発明者らに
より合成された合成trpプロモーターＩ遺伝子（107bp）
が挙げられ、そのDNA配列は次の通りである。
この発明のプロセスでは、発現プラスミドは、rop遺伝
子を含めたある程度の長さの遺伝子を切り取られた発現
プラスミドを得るためのプラスミドに、１個あるいは２
個以上の融合IGF−Ｉ遺伝子を順次挿入することによっ
て得ることができる。
子を含めたある程度の長さの遺伝子を切り取られた発現
プラスミドを得るためのプラスミドに、１個あるいは２
個以上の融合IGF−Ｉ遺伝子を順次挿入することによっ
て得ることができる。
プロモーター遺伝子および融合IGF−Ｉ遺伝子を適切な
プラスミドと、所望により適切なDNA断片（たとえばリ
ンカー、他の制限部位等）を用いて、常法（たとえば制
限酵素による消化、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てのホスホリル化、T4DNAリガーゼを用いてのライゲー
ション）により順次、環状に連結することにより、発現
プラスミドを得ることができる。
プラスミドと、所望により適切なDNA断片（たとえばリ
ンカー、他の制限部位等）を用いて、常法（たとえば制
限酵素による消化、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い
てのホスホリル化、T4DNAリガーゼを用いてのライゲー
ション）により順次、環状に連結することにより、発現
プラスミドを得ることができる。
次いで発現プラスミドを常法（たとえば形質転換、顕微
注射等）により微生物（宿主細胞）に挿入することによ
り、形質転換体を得ることができる。
注射等）により微生物（宿主細胞）に挿入することによ
り、形質転換体を得ることができる。
適当な宿主生物には、エシエリキア（Escherichia;以下
E.という）コリ（coli）（たとえばE.coli HB101等）な
どが包含される。
E.という）コリ（coli）（たとえばE.coli HB101等）な
どが包含される。
この発明の方法によって融合IGF−Ｉを製造するには、
このようにして得た発現プラスミド含有形質転換体を栄
養培地中で培養する。
このようにして得た発現プラスミド含有形質転換体を栄
養培地中で培養する。
栄養培地は炭素源（たとえばグルコース、グリセリン、
マンニトール、フルクトース、ラクトース等）および無
機または有機の窒素源（硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキス、ポリペプト
ン、バクトトリプトン、牛肉エキス等）を含有する。所
望により、他の栄養源［たとえば無機塩類（たとえばリ
ン酸一ナトリウムまたはカリウム、リン酸水素二カリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム）、ビタミン類（たとえばビタミンB1）、抗生物質
（たとえばアンピシリン）等］を培地に加えてもよい。
マンニトール、フルクトース、ラクトース等）および無
機または有機の窒素源（硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキス、ポリペプト
ン、バクトトリプトン、牛肉エキス等）を含有する。所
望により、他の栄養源［たとえば無機塩類（たとえばリ
ン酸一ナトリウムまたはカリウム、リン酸水素二カリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム）、ビタミン類（たとえばビタミンB1）、抗生物質
（たとえばアンピシリン）等］を培地に加えてもよい。
形質転換体の培養は一般に、pH5.5〜8.5（好ましくはpH
7〜7.5）、18〜40℃（好ましくは25〜38℃）で、５〜50
時間にわたって行えばよい。
7〜7.5）、18〜40℃（好ましくは25〜38℃）で、５〜50
時間にわたって行えばよい。
こうして生産された融合IGF−Ｉは培養された形質転換
体の細胞中に存在するのが普通であるので、細胞を濾過
または遠心分離によって集め、それらの細胞壁および／
または細胞膜を常法（たとえば超音波処理および／また
はリソチーム処理等）により破壊して、デブリスを得
る。このデブリスから、天然または合成の蛋白を単離、
精製するのに一般に採用される常法［たとえば適当な溶
媒（たとえば8M尿素水溶液、6M塩酸グアニジン等）を用
いての蛋白の溶解、透析、ゲル濾過、カラムクロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィー等］により、融
合IGF−Ｉを単離、精製できる。
体の細胞中に存在するのが普通であるので、細胞を濾過
または遠心分離によって集め、それらの細胞壁および／
または細胞膜を常法（たとえば超音波処理および／また
はリソチーム処理等）により破壊して、デブリスを得
る。このデブリスから、天然または合成の蛋白を単離、
精製するのに一般に採用される常法［たとえば適当な溶
媒（たとえば8M尿素水溶液、6M塩酸グアニジン等）を用
いての蛋白の溶解、透析、ゲル濾過、カラムクロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィー等］により、融
合IGF−Ｉを単離、精製できる。
かくして得られた融合IGF−Ｉの好適な例の一つとし
て、「蛋白ペプチドLHと融合したIGF−Ｉ」が挙げら
れ、そのアミノ酸配列は次の通りである。
て、「蛋白ペプチドLHと融合したIGF−Ｉ」が挙げら
れ、そのアミノ酸配列は次の通りである。
本発明における保護ペプチド脱離反応は、反応に悪影響
を及ぼさない慣用の溶媒中で、緩和な条件下で実施する
ことができる。
を及ぼさない慣用の溶媒中で、緩和な条件下で実施する
ことができる。
この明細書中の配列において、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそ
れぞれ式 を意味し、５′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味し、３′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味する。
れぞれ式 を意味し、５′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味し、３′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味する。
以下の実施例は本発明を説明するために記載するもので
ある。
ある。
実施例１ オリゴヌクレオチドの調製 次のオリゴヌクレオチドを常法によって調製した。
（１）HOApApTpTpCpApTpGpGpGpTOH（A1） （２）HOTpTpTpCpApGpGpApCpCpCpApTpGOH（A2） （３）HOCpCPTpGpApApApCpTpCpTpGpTpGOH（B1） （４）HOCpApGpCpGpCpCpGpCpApCpApGpApGOH（B2） （５）HOCpGpGpCpGpCpTpGpApApCpTpGpGpTOH（C1） （６）HOApGpApGpCpGpTpCpApApCpCpApGpTpTOH（C2） （７）HOTpGpApCpGpCpTpCpTpGpCpApApTpTpTOH（D1） （８）HOCpCpApCpApTpApCpApApApTpTpGpCOH（D2） （９）HOGpTpApTpGpTpGpGpTpGpApTpCpGpTOH（E1） （10）HOTpApGpApApApCpCpApCpGpApTpCpAOH（E2） （11）HOGpGpTpTpTpCpTpApCpTpTpCpApApCOH（F1） （12）HOGpGpTpCpGpGpTpTpTpGpTpTpGpApApGOH（F2） （13）HOApApApCpCpGpApCpCpGpGpCpTpApTpGOH（G1） （14）HOGpCpTpGpGpApGpCpCpApTpApGpCpCOH（G2） （15）HOGpCpTpCpCpApGpCpTpCpTpCpGpTpCOH（H1） （16）HOCpGpGpTpGpCpGpCpGpApCpGpApGpAOH（H2） （17）HOGpCpGpCpApCpCpGpCpApGpApCpTpGOH（I1） （18）HOCpTpApCpGpApTpApCpCpApGpTpCpTpGOH（I2） （19）HOGpTpApTpCpGpTpApGpApCpGpApApTpGOH（J1） （20）HOGpApApApApCpApGpCpApTpTpCpGpTOH（J2） （21）HOCpTpGpTpTpTpTpCpGpTpTpCpTpTpGOH（K1） （22）HOGpGpApGpApTpCpGpCpApApGpApApCOH（K2） （23）HOCpGpApTpCpTpCpCpGpCpCpGpTpCpTOH（L1） （24）HOTpApCpApTpTpTpCpCpApGpApCpGpGpCOH（L2） （25）HOGpGpApApApTpGpTpApCpTpGpTpGpCpTOH（M1） （26）HOTpTpCpApGpTpGpGpApGpCpApCpApGOH（M2） （27）HOCpCpApCpTpGpApApGpCpCpApGpCpAOH（N1） （28）HOGpCpGpGpApTpTpTpTpGpCpTpGpGpCOH（N2） （29）HOApApApTpCpCpGpCpGpTpGpApTpApGOH（O1） （30）HOGpApTpCpCpTpApTpCpApCOH（O2） （31）HOApApTpTpCpApTpGpTpGpTpTOH（a1） （32）HOApCpTpGpCpCpApGpGpApCpCpCpApTOH（a2） （33）HOApTpGpTpApApApApGpApApGpCpApGOH（a3） （34）HOTpGpGpCpApGpTpApApCpApCpApTpGOH（a4） （35）HOTpTpTpApCpApTpApTpGpGpGpTpCpCOH（a5） （36）HOApApGpGpTpTpTpTpCpTpGpCpTpTpCpTOH（a6） （37）HOApApApApCpCpTpTpApApGpApApApTpAOH（b1） （38）HOCpTpTpTpApApTpGpCpApGpGpTpCpAOH（b2） （39）HOTpTpCpApGpApTpGpTpApGpCpGpGpAOH（b3） （40）HOApTpTpApApApGpTpApTpTpTpCpTpTOH（b4） （41）HOApTpCpTpGpApApTpGpApCpCpTpGpCOH（b5） （42）HOTpTpCpCpApTpTpApTpCpCpGpCpTpApCOH（b6） （43）HOTpApApTpGpGpApApCpTpCpTpTpTpTpCOH（c1） （44）HOTpTpApGpGpCpApTpTpTpTpGpApApGOH（c2） （45）HOApApTpTpGpGpApApApGpApGpGpApGOH（c3） （46）HOTpGpCpCpTpApApGpApApApApGpApGOH（c4） （47）HOTpCpCpApApTpTpCpTpTpCpApApApAOH（c5） （48）HOCpTpGpTpCpApCpTpCpTpCpCpTpCpTpTOH（c6） （49）HOApGpTpGpApCpApGpApApApApApTpAOH（d1） （50）HOApTpGpCpApGpApGpCpCpApApApTpTOH（d2） （51）HOGpTpCpTpCpCpTpTpTpTpApCpTpTOH（d3） （52）HOCpTpCpTpGpCpApTpTpApTpTpTpTpTOH（d4） （53）HOApGpGpApGpApCpApApTpTpTpGpGOH（d5） （54）HOApApApGpCpTpTpGpApApGpTpApApAOH（d6） （55）HOCpApApGpCpTpTpTpTpCpApApApApAOH（e1） （56）HOCpTpTpTpApApGpGpApTpGpApCpCpAOH（e2） （57）HOGpApGpCpApTpCpCpApApApApGpApGOH（e3） （58）HOCpCpTpTpApApApGpTpTpTpTpTpGpAOH（e4） （59）HOGpGpApTpGpCpTpCpTpGpGpTpCpApTOH（e5） （60）HOTpGpTpGpTpApApTpGpApTpApGOH（l1） （61）HOTpApCpApCpApCpTpCpTpTpTpTOH（l2） （62）HOGpApTpCpCpTpApTpCpApTOH（l3） （63）HOApGpCpTpTpGpApApGpTpApApApApCpApTpGOH（m
1） （64）HOApApTpTpCpApTpGpTpTpTpTpApCpTpTpCpAOH（m
2） （65）HOApGpCpTpTpGpApApGpTpApTpGpGpGOH（LA） （66）HOGpApCpCpCpCpApTpApCpTpTpCpAOH（LB） （67）HOApApTpTpCpGpGpCpCpCpCpGpCpGpGOH（LC） （68）HOGpApCpCpCpGpCpGpGpGpGpCpCpGOH（LD） （69）HOApApTpTpTpGpCpCpGpApCpAOH（Ａ） （70）HOCpGpTpTpApTpGpApTpGpTpCpGpGpCpAOH（Ｂ） （71）HOTpCpApTpApApCpGpGpTpTpCpTpGpGpCOH（Ｃ） （72）HOGpApApTpApTpTpTpGpCpCpApGpApApCOH（Ｄ） （73）HOApApApTpApTpTpCpTpGpApApApTpGpAOH（Ｅ） （74）HOTpCpApApCpApGpCpTpCpApTpTpTpCpAOH（Ｆ） （75）HOGpCpTpGpTpTpGpApCpApApTpTpApApTOH（Ｇ） （76）HOGpTpTpCpGpApTpGpApTpTpApApTpTpGOH（Ｈ） （77）HOCpApTpCpGpApApCpTpApGpTpTpApApCOH（Ｉ） （78）HOGpCpGpTpApCpTpApGpTpTpApApCpTpAOH（Ｊ） （79）HOTpApGpTpApCpGpCpApApGpTpTpCpApCOH（Ｋ） （80）HOCpTpTpTpTpTpApCpGpTpGpApApCpTpTOH（Ｌ） （81）HOGpTpApApApApApGpGpGpTpApTpCpGOH（Ｍ） （82）HOApApTpTpCpGpApTpApCpCOH（Ｎ） （83）HOApApTpTpCpApTpGpGpCpTOH（SA） （84）HOGpGpTpTpGpTpApApGpApApCpTpTpCpTOH（SB） （85）HOTpTpTpGpGpApApGpApCpTpTpTOH（SC） （86）HOCpApCpTpTpCpGpTpGpTpTpGpApTpApGOH（SD） （87）HOTpTpApCpApApCpCpApGpCpCpApTpGOH（SE） （88）HOCpCpApApApApGpApApGpTpTpCOH（SF） （89）HOCpGpApApGpTpGpApApApGpTpCpTpTOH（SG） （90）HOGpApTpCpCpTpApTpCpApApCpAOH（SH） （91）HOGpApTpCpCpTpCpGpApGpApTpCpApAOH（Ａ′） （92）HOGpCpCpTpTpTpApApTpTpCpApTpCpTpCpGpApGOH
（Ｂ′） （93）HOTpTpApApApGpGpCpTpCpCpTpTpTpTpGpGpAOH
（Ｃ′） （94）HOApApApApApGpGpCpTpCpCpApApApApGpGpAOH
（Ｄ′） （95）HOGpCpCpTpTpTpTpTpTpTpTpTpTpGOH（Ｅ′） （96）HOTpCpGpApCpApApApApAOH（Ｆ′） （97）HOGpApTpCpCpTpCpGpApGpCpTOH（Ｇ′） （98）HOGpTpTpTpApApTpCpApGpCpTpCpGpApGOH（Ｈ′） （99）HOGpApTpTpApApApCpCpGpApApTpCpApAOH（Ｉ′） （100）HOGpCpCpTpTpTpApApTpTpGpApTpTpGpGOH（Ｊ′） （101）HOGpCpCpTpTpTpTpTpTpTpTpTpTOH（Ｋ′） （102）HOTpCpTpCpCpApApApApAOH（Ｌ′） （103）HOGpGpApGpApCpApApCpGOH（Ｍ′） （104）HOTpCpGpApCpGpTpTpGOH（Ｎ′） 上記のオリゴヌクレオチドについて、次の略号を用い
た。
1） （64）HOApApTpTpCpApTpGpTpTpTpTpApCpTpTpCpAOH（m
2） （65）HOApGpCpTpTpGpApApGpTpApTpGpGpGOH（LA） （66）HOGpApCpCpCpCpApTpApCpTpTpCpAOH（LB） （67）HOApApTpTpCpGpGpCpCpCpCpGpCpGpGOH（LC） （68）HOGpApCpCpCpGpCpGpGpGpGpCpCpGOH（LD） （69）HOApApTpTpTpGpCpCpGpApCpAOH（Ａ） （70）HOCpGpTpTpApTpGpApTpGpTpCpGpGpCpAOH（Ｂ） （71）HOTpCpApTpApApCpGpGpTpTpCpTpGpGpCOH（Ｃ） （72）HOGpApApTpApTpTpTpGpCpCpApGpApApCOH（Ｄ） （73）HOApApApTpApTpTpCpTpGpApApApTpGpAOH（Ｅ） （74）HOTpCpApApCpApGpCpTpCpApTpTpTpCpAOH（Ｆ） （75）HOGpCpTpGpTpTpGpApCpApApTpTpApApTOH（Ｇ） （76）HOGpTpTpCpGpApTpGpApTpTpApApTpTpGOH（Ｈ） （77）HOCpApTpCpGpApApCpTpApGpTpTpApApCOH（Ｉ） （78）HOGpCpGpTpApCpTpApGpTpTpApApCpTpAOH（Ｊ） （79）HOTpApGpTpApCpGpCpApApGpTpTpCpApCOH（Ｋ） （80）HOCpTpTpTpTpTpApCpGpTpGpApApCpTpTOH（Ｌ） （81）HOGpTpApApApApApGpGpGpTpApTpCpGOH（Ｍ） （82）HOApApTpTpCpGpApTpApCpCOH（Ｎ） （83）HOApApTpTpCpApTpGpGpCpTOH（SA） （84）HOGpGpTpTpGpTpApApGpApApCpTpTpCpTOH（SB） （85）HOTpTpTpGpGpApApGpApCpTpTpTOH（SC） （86）HOCpApCpTpTpCpGpTpGpTpTpGpApTpApGOH（SD） （87）HOTpTpApCpApApCpCpApGpCpCpApTpGOH（SE） （88）HOCpCpApApApApGpApApGpTpTpCOH（SF） （89）HOCpGpApApGpTpGpApApApGpTpCpTpTOH（SG） （90）HOGpApTpCpCpTpApTpCpApApCpAOH（SH） （91）HOGpApTpCpCpTpCpGpApGpApTpCpApAOH（Ａ′） （92）HOGpCpCpTpTpTpApApTpTpCpApTpCpTpCpGpApGOH
（Ｂ′） （93）HOTpTpApApApGpGpCpTpCpCpTpTpTpTpGpGpAOH
（Ｃ′） （94）HOApApApApApGpGpCpTpCpCpApApApApGpGpAOH
（Ｄ′） （95）HOGpCpCpTpTpTpTpTpTpTpTpTpTpGOH（Ｅ′） （96）HOTpCpGpApCpApApApApAOH（Ｆ′） （97）HOGpApTpCpCpTpCpGpApGpCpTOH（Ｇ′） （98）HOGpTpTpTpApApTpCpApGpCpTpCpGpApGOH（Ｈ′） （99）HOGpApTpTpApApApCpCpGpApApTpCpApAOH（Ｉ′） （100）HOGpCpCpTpTpTpApApTpTpGpApTpTpGpGOH（Ｊ′） （101）HOGpCpCpTpTpTpTpTpTpTpTpTpTOH（Ｋ′） （102）HOTpCpTpCpCpApApApApAOH（Ｌ′） （103）HOGpGpApGpApCpApApCpGOH（Ｍ′） （104）HOTpCpGpApCpGpTpTpGOH（Ｎ′） 上記のオリゴヌクレオチドについて、次の略号を用い
た。
Ap、Gp、Cp、およびTpはそれぞれ式 を意味し、３′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味する。
実施例２ IGF−Ｉ遺伝子の調製： オリゴヌクレオチドA1−02（各々0.4mM）を、74mMトリ
ス−HCl（pH7.6）、10mMジチオスレイトール（以下DTT
という）、1.6mMメルカプトエタノール、10mM MgCl2お
よび0.5mM ATPを含有する溶液100μ中で、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（BRL）製］４単位を用いて、37℃で20分間リン酸化
した。反応終了後、反応混合物中の酵素を、100℃で５
分間インキユベートすることにより不活化した。リン酸
化オリゴヌクレオチド類のライゲーシヨンを、第１図に
示したように実施して、まず10ブロックを断片を得、最
終的にクローニング用IGF−Ｉ遺伝子を得た。それらラ
イゲーシヨンは、100mM ATP含有溶液（0.5μ）中、T4
DNAリガーゼ（７単位）を用いて、４℃で23時間（標準
条件）行った。各段階のライゲーシヨン生成物は、トリ
ス−酢酸−EDTA緩衝液中２〜16％勾配のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（以下PAGEという）で溶出した後臭化
エチジウム染色を行って同定、確認した。
ス−HCl（pH7.6）、10mMジチオスレイトール（以下DTT
という）、1.6mMメルカプトエタノール、10mM MgCl2お
よび0.5mM ATPを含有する溶液100μ中で、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（BRL）製］４単位を用いて、37℃で20分間リン酸化
した。反応終了後、反応混合物中の酵素を、100℃で５
分間インキユベートすることにより不活化した。リン酸
化オリゴヌクレオチド類のライゲーシヨンを、第１図に
示したように実施して、まず10ブロックを断片を得、最
終的にクローニング用IGF−Ｉ遺伝子を得た。それらラ
イゲーシヨンは、100mM ATP含有溶液（0.5μ）中、T4
DNAリガーゼ（７単位）を用いて、４℃で23時間（標準
条件）行った。各段階のライゲーシヨン生成物は、トリ
ス−酢酸−EDTA緩衝液中２〜16％勾配のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（以下PAGEという）で溶出した後臭化
エチジウム染色を行って同定、確認した。
実施例３ IGF−Ｉ遺伝子のクローニング： プラスミドpBr322を制限エンドヌクレアーゼBamH Iおよ
びEcoR Iで消化した。65℃で５分間加熱して反応を停止
させ、各断片を0.5％アガロースゲル電気泳動により分
離した。pBR322からの3985bpの大きい断片を回収し、T4
DNAリガーゼを用いて12℃で18時間224bpのIGF−Ｉ遺伝
子にライゲートした。ライゲートした混合物を用いて、
クシユナー（Kushner）の方法により、E.coli HB101を
形質転換し、テトラサイクリン（25μg/ml）含有プレー
ト上でアンピシリン抵抗性形質転換体を選択した。アン
ピシリンに抵抗性で、テトラサイクリンに感受性の５つ
のクローンの１つから単離したプラスミドをEcoR Iおよ
びBamH Iで消化し、適当なサイズマーカーと比較した。
期待通りの224bpのIGF−Ｉ断片が生じていた。このプラ
スミドはIGF−Ｉ遺伝子の完全なヌクレオチド配列によ
り特徴付けられ、pSdM1と名付け、発現プラスミドの構
築に用いた。このプロセスを第２図に示す。
びEcoR Iで消化した。65℃で５分間加熱して反応を停止
させ、各断片を0.5％アガロースゲル電気泳動により分
離した。pBR322からの3985bpの大きい断片を回収し、T4
DNAリガーゼを用いて12℃で18時間224bpのIGF−Ｉ遺伝
子にライゲートした。ライゲートした混合物を用いて、
クシユナー（Kushner）の方法により、E.coli HB101を
形質転換し、テトラサイクリン（25μg/ml）含有プレー
ト上でアンピシリン抵抗性形質転換体を選択した。アン
ピシリンに抵抗性で、テトラサイクリンに感受性の５つ
のクローンの１つから単離したプラスミドをEcoR Iおよ
びBamH Iで消化し、適当なサイズマーカーと比較した。
期待通りの224bpのIGF−Ｉ断片が生じていた。このプラ
スミドはIGF−Ｉ遺伝子の完全なヌクレオチド配列によ
り特徴付けられ、pSdM1と名付け、発現プラスミドの構
築に用いた。このプロセスを第２図に示す。
実施例４ 合成trpプロモーターII遺伝子の調製： ブロックＩ、II、IIIおよびIVの各オリゴヌクレオチド
（Ｂ〜SH）をT4ヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化
し、ついで上記のようにT4DNAリガーゼを用いてライゲ
ートした。これらのブロック（Ｉ〜IV）およびリン酸化
されていないオリゴヌクレオチド（ＡおよびSH）を順次
縮合した。最後のライゲーション生成物を分取用7.5％P
AGEにより精製して、合成trpプロモーターII遺伝子（適
切なDNA断片をもつ合成trpプロモーターＩ遺伝子）（16
3bp）を得た。このプルセスを第３図に示す。かくして
得た合成trpプロモーターII遺伝子（163bp）は次の通り
である： 実施例５ 合成trpプロモーターII遺伝子のクローニング： 実施例４で構築したtrpプロモーターII遺伝子を、pBR32
2のEcoR I、BamH I断片とライゲートし、つぎに、ライ
ゲーシヨン生成物を用いてE.coli HB101を形質転換し
た。rAmpでかつsTetの形質転換体から得たプラスミドを
Hpa Iで消化してPAGEでバンド（4.1kbp）を確認し、つ
ぎにBamH Iで消化して90bpのバンドを確認した。さら
に、EcoR I−BamH I消化による56bpの断片をPAGEでのサ
イズマーカーとの比較により確認した。このプラスミド
をpTrpEB7と名付け、発現プラスミドの構築に用いた。
このプロセスを第４図に示す。
（Ｂ〜SH）をT4ヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化
し、ついで上記のようにT4DNAリガーゼを用いてライゲ
ートした。これらのブロック（Ｉ〜IV）およびリン酸化
されていないオリゴヌクレオチド（ＡおよびSH）を順次
縮合した。最後のライゲーション生成物を分取用7.5％P
AGEにより精製して、合成trpプロモーターII遺伝子（適
切なDNA断片をもつ合成trpプロモーターＩ遺伝子）（16
3bp）を得た。このプルセスを第３図に示す。かくして
得た合成trpプロモーターII遺伝子（163bp）は次の通り
である： 実施例５ 合成trpプロモーターII遺伝子のクローニング： 実施例４で構築したtrpプロモーターII遺伝子を、pBR32
2のEcoR I、BamH I断片とライゲートし、つぎに、ライ
ゲーシヨン生成物を用いてE.coli HB101を形質転換し
た。rAmpでかつsTetの形質転換体から得たプラスミドを
Hpa Iで消化してPAGEでバンド（4.1kbp）を確認し、つ
ぎにBamH Iで消化して90bpのバンドを確認した。さら
に、EcoR I−BamH I消化による56bpの断片をPAGEでのサ
イズマーカーとの比較により確認した。このプラスミド
をpTrpEB7と名付け、発現プラスミドの構築に用いた。
このプロセスを第４図に示す。
実施例６ 蛋白ペプチドLH遺伝子の調製： オリゴヌクレオチドa2〜l2（各々0.4mM）を、50mMトリ
ス−HCl（pH7.6）、20mM DTT、50μ/mlウシ血清アル
ブミン（以下BSAという）、1mMスペルミジン、10mM MgC
l2および2mM ATPを含有する溶液40μ中、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ2.5単位を用いて、37℃で３時間リン
酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を、100℃
で５分間インキユベートして不活化した。リン酸化オリ
ゴヌクレオチド類および２種のオリゴヌクレオチド（a1
とl3）のライゲーシヨンを第５図に示したように行っ
て、まず６ブロックの断片を得、最後にクローニング用
蛋白ペプチドLH遺伝子（236bp）を得た。ライゲーシヨ
ンは、T4DNAリガーゼ（５単位）を用いて16℃で５時間
行った。各段階でのオリゴヌクレオチドのライゲーシヨ
ン生成物は、トリス−酢酸−EDTA緩衝液中での２〜16％
勾配PAGE溶出に続く臭化エチジウム染色により同定、確
認した。このプロセスを第５図に示す。
ス−HCl（pH7.6）、20mM DTT、50μ/mlウシ血清アル
ブミン（以下BSAという）、1mMスペルミジン、10mM MgC
l2および2mM ATPを含有する溶液40μ中、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ2.5単位を用いて、37℃で３時間リン
酸化した。反応終了後、反応混合物中の酵素を、100℃
で５分間インキユベートして不活化した。リン酸化オリ
ゴヌクレオチド類および２種のオリゴヌクレオチド（a1
とl3）のライゲーシヨンを第５図に示したように行っ
て、まず６ブロックの断片を得、最後にクローニング用
蛋白ペプチドLH遺伝子（236bp）を得た。ライゲーシヨ
ンは、T4DNAリガーゼ（５単位）を用いて16℃で５時間
行った。各段階でのオリゴヌクレオチドのライゲーシヨ
ン生成物は、トリス−酢酸−EDTA緩衝液中での２〜16％
勾配PAGE溶出に続く臭化エチジウム染色により同定、確
認した。このプロセスを第５図に示す。
実施例７ 蛋白ペプチドLH遺伝子のクローニング： 上記のようにして合成した蛋白ペプチドLH遺伝子（236b
p）を実施例３と同様にしてpBR322に組込んだ。E.coli
HB101の形質転換体から得たプラスミド（pLH107）は、
制限酵素分析により、蛋白ペプチドLH遺伝子（236bp）
をもつことが明らかにされた。このプロセスを第６図に
示す。
p）を実施例３と同様にしてpBR322に組込んだ。E.coli
HB101の形質転換体から得たプラスミド（pLH107）は、
制限酵素分析により、蛋白ペプチドLH遺伝子（236bp）
をもつことが明らかにされた。このプロセスを第６図に
示す。
実施例８ 蛋白ペプチドLH発現プラスミド（pLHtrp）の構築： 実施例５で調製したプラスミドpTrpEB7をEcoR IおよびB
amH Iで消化して、分取アガロースゲル電気泳動により
大きい断片（4.1kbp）を得た。この断片を、プラスミド
pLH107からEcoR IおよびBamH Iによる消化で調製した蛋
白ペプチドLH遺伝子とライゲートした。ライゲーシヨン
混合物を用いてE.coli HB101を形質転換して、アンピシ
リ抵抗性、テトラサイクリン感受性の形質転換体を得
た。その形質転換体から得たプラスミド（pLHtrp）をEc
oR IおよびBamH Iで消化して、7.5％PAGEにより蛋白ペ
プチドLH遺伝子（236bp）を確認した。このプロセスを
第７図に示す。
amH Iで消化して、分取アガロースゲル電気泳動により
大きい断片（4.1kbp）を得た。この断片を、プラスミド
pLH107からEcoR IおよびBamH Iによる消化で調製した蛋
白ペプチドLH遺伝子とライゲートした。ライゲーシヨン
混合物を用いてE.coli HB101を形質転換して、アンピシ
リ抵抗性、テトラサイクリン感受性の形質転換体を得
た。その形質転換体から得たプラスミド（pLHtrp）をEc
oR IおよびBamH Iで消化して、7.5％PAGEにより蛋白ペ
プチドLH遺伝子（236bp）を確認した。このプロセスを
第７図に示す。
実施例９ IGF−Ｉ発現プラスミドpLHSdMmtrpの構築： プラスミドpSdM1をEcoR IおよびBamH Iで消化して、IGF
−Ｉ遺伝子（224bp）を得た。一方、実施例１で製造し
たオリゴヌクレオチド（m2）を、実施例２記載の方法
で、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し
た。リン酸化オリゴヌクレオチド、実施例１で調製した
オリゴヌクレオチドm1およびIGF−Ｉ遺伝子（224bp）を
混合し、４℃で20時間、T4リガーゼで処理した。ライゲ
ーシヨン混合物をBamH1で消化し、つぎに分取PAGEで精
製して、リンカーをもつIGF−Ｉ遺伝子（242bp）を得
た。その遺伝子（242bp）を、pLHtrpからHind III−Bam
H I消化により得た大きな断片とライゲートし、つぎに
ライゲーシヨン混合物を用いてE.coli HB101を形質転換
した。プラスミドpLHSdMmtrpを含有するE.coli HB101は
E.coli F−６と名付け、1984年９月17日付で寄託番号FE
RM P−7848の下に工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託した。この菌株は1985年２月28日付でブダペスト条約
ルートに切換えられ、、新しい寄託番号FERM BP−729が
付されている。形質転換体から得たプラスミド（pLHSdM
mtrp）をEcoR IおよびBamH I（198、、224bp）、Hind I
IIおよびBamH I（242bp）Hpa I−BamH I（456bp）で消
化して、7.5％PAGEに付し、合成trpプロモーターＩ、蛋
白ペプチドLHおよびIGF−Ｉの各遺伝子を確認した。こ
のプロセスを第８図に示す。
−Ｉ遺伝子（224bp）を得た。一方、実施例１で製造し
たオリゴヌクレオチド（m2）を、実施例２記載の方法
で、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し
た。リン酸化オリゴヌクレオチド、実施例１で調製した
オリゴヌクレオチドm1およびIGF−Ｉ遺伝子（224bp）を
混合し、４℃で20時間、T4リガーゼで処理した。ライゲ
ーシヨン混合物をBamH1で消化し、つぎに分取PAGEで精
製して、リンカーをもつIGF−Ｉ遺伝子（242bp）を得
た。その遺伝子（242bp）を、pLHtrpからHind III−Bam
H I消化により得た大きな断片とライゲートし、つぎに
ライゲーシヨン混合物を用いてE.coli HB101を形質転換
した。プラスミドpLHSdMmtrpを含有するE.coli HB101は
E.coli F−６と名付け、1984年９月17日付で寄託番号FE
RM P−7848の下に工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託した。この菌株は1985年２月28日付でブダペスト条約
ルートに切換えられ、、新しい寄託番号FERM BP−729が
付されている。形質転換体から得たプラスミド（pLHSdM
mtrp）をEcoR IおよびBamH I（198、、224bp）、Hind I
IIおよびBamH I（242bp）Hpa I−BamH I（456bp）で消
化して、7.5％PAGEに付し、合成trpプロモーターＩ、蛋
白ペプチドLHおよびIGF−Ｉの各遺伝子を確認した。こ
のプロセスを第８図に示す。
実施例10 プラスミドpUC−SS1の構築： 蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉ発現プラスミド（pLHSdMmtr
p）（100μｇ）を、Hpa I消化用緩衝液中37℃で１時間H
pa I（180単位）で消化した。0.8％アガロースゲル上で
完全消化を検知したのち、混合物に1M NaclおよびPst I
（180単位）を加え、混合物を37℃で１時間インキユベ
ートして、２つの断片（3.7kbpおよび0.8kbp）を得た。
大きい方の断片（3.7kbp）を0.8％アガロースゲル分取
電気泳動で分離し、DEAE−トヨパール650M（ジエチルア
ミノエチルを有するアニオン交換樹脂、東洋曹達製）カ
ラムクロマトグラフイーで精製し、エタノール沈殿でHp
a I−Pst I消化断片（3.7kbp）（40μｇ）を得た。その
断片（35μｇ）をHinc II緩衝液中37℃で18分間Hinc II
（63単位）で部分消化して６種の断片（3690、3417、29
58、732、459および273bp）を得た。732bpの断片（２μ
ｇ）を0.8％アガロースゲル分取電気泳動およびDEAEト
ヨパール650Mカラムクロマトグラフイーにより精製し
た。
p）（100μｇ）を、Hpa I消化用緩衝液中37℃で１時間H
pa I（180単位）で消化した。0.8％アガロースゲル上で
完全消化を検知したのち、混合物に1M NaclおよびPst I
（180単位）を加え、混合物を37℃で１時間インキユベ
ートして、２つの断片（3.7kbpおよび0.8kbp）を得た。
大きい方の断片（3.7kbp）を0.8％アガロースゲル分取
電気泳動で分離し、DEAE−トヨパール650M（ジエチルア
ミノエチルを有するアニオン交換樹脂、東洋曹達製）カ
ラムクロマトグラフイーで精製し、エタノール沈殿でHp
a I−Pst I消化断片（3.7kbp）（40μｇ）を得た。その
断片（35μｇ）をHinc II緩衝液中37℃で18分間Hinc II
（63単位）で部分消化して６種の断片（3690、3417、29
58、732、459および273bp）を得た。732bpの断片（２μ
ｇ）を0.8％アガロースゲル分取電気泳動およびDEAEト
ヨパール650Mカラムクロマトグラフイーにより精製し
た。
他方、プラスミドpUC9（フアルマシアから購入）（10μ
ｇ）を37℃で１時間Hinc II（120単位）消化して、pUC9
のHinc II消化断片（２μｇ）を得た。このDNA（1.9μ
ｇ）を37℃で30分間仔牛腸アルカリフオスフアターゼ
（以下CIPという）ベーリンガーマイハイムから購入）
（20単位）と共にインキユベートし、つぎに追加のCIP
（20単位）と共に37℃で30分間インキユベートした。65
℃で15分間加熱して酵素を不活化したのち、DNAをフエ
ノール−クロロホルム抽出、セフアデツクスＧ−50スー
パーフアインスパンカラムクロマトグラフイーおよびエ
タノール沈殿で精製して、pUC9の脱リン酸化Hinc II消
化断片1.5μｇを得た。このDNA（1.2μｇ）を、上で調
製した蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉ遺伝子含有Hpa I−Hi
nc II消化断片（732bp）と、ライゲーシヨン緩衝液中、
T4DNAリガーゼ（８単位）および2mM ATPの存在下に16℃
で20時間ライゲートした。ライゲーシヨン混合物を用い
てE.coli MM294を形質転換して、多数のアンピリシン抵
抗性コロニーを得た。それら22コロニー中の一つが所望
のプラスミドpUC−SS1で、これをPst I（3.4kbp）およ
びBamH I（2.9kbpおよび0.45kbp）を用いた制限エンド
ヌクレアーゼ分析により確認した。このプロセスを第９
図および第10図に示す。
ｇ）を37℃で１時間Hinc II（120単位）消化して、pUC9
のHinc II消化断片（２μｇ）を得た。このDNA（1.9μ
ｇ）を37℃で30分間仔牛腸アルカリフオスフアターゼ
（以下CIPという）ベーリンガーマイハイムから購入）
（20単位）と共にインキユベートし、つぎに追加のCIP
（20単位）と共に37℃で30分間インキユベートした。65
℃で15分間加熱して酵素を不活化したのち、DNAをフエ
ノール−クロロホルム抽出、セフアデツクスＧ−50スー
パーフアインスパンカラムクロマトグラフイーおよびエ
タノール沈殿で精製して、pUC9の脱リン酸化Hinc II消
化断片1.5μｇを得た。このDNA（1.2μｇ）を、上で調
製した蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉ遺伝子含有Hpa I−Hi
nc II消化断片（732bp）と、ライゲーシヨン緩衝液中、
T4DNAリガーゼ（８単位）および2mM ATPの存在下に16℃
で20時間ライゲートした。ライゲーシヨン混合物を用い
てE.coli MM294を形質転換して、多数のアンピリシン抵
抗性コロニーを得た。それら22コロニー中の一つが所望
のプラスミドpUC−SS1で、これをPst I（3.4kbp）およ
びBamH I（2.9kbpおよび0.45kbp）を用いた制限エンド
ヌクレアーゼ分析により確認した。このプロセスを第９
図および第10図に示す。
実施例11 発現プラスミドpLS−T2およびpLS−T3の構築： プラスミドpLHSdMmtrp（50μｇ）をBamH I消化用緩衝液
中37℃で１時間BamH I（120単位）により消化し、続い
て0.8％アガロースゲル分取電気泳動によりDNA断片（4.
5kbp）20μｇを得た。このDNA断片（16μｇ）をCIPで処
理して、pLHSdMmtrpの脱リン酸化BamH I消化断片（４μ
ｇ）を得た。
中37℃で１時間BamH I（120単位）により消化し、続い
て0.8％アガロースゲル分取電気泳動によりDNA断片（4.
5kbp）20μｇを得た。このDNA断片（16μｇ）をCIPで処
理して、pLHSdMmtrpの脱リン酸化BamH I消化断片（４μ
ｇ）を得た。
他方、pUC−SS1（10μｇ）をBamH I（60単位）で消化し
て２つの断片（2.6kbpおよび464bp）を得た。小さい方
の断片（464bp）を0.8％アガロースゲル分取電気泳動に
より精製した。得られたBamH I消化断片（464bp）（36n
g）および上記pLHSdMmtrpの脱リン酸化BamH I消化断片
（200ng）を、T4DNAリガーゼ（４単位）の存在下に16℃
で20時間インキユベートした。ライゲーシヨン混合物で
E.coli HB101を形質転換してアンピシリン抵抗性のコロ
ニーを得た。12コロニー中７コロニーが２つのシストロ
ン性蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉ遺伝子をもつプラスミ
ド（pLS−T2と名付ける）であり、１コロニーが３つの
シストロン性蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉ遺伝子を有す
るプラスミド（pLS−T3と名付ける）であって、これら
は制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した［pLS−T
2:Pst I−Pvu II（1.5、3.4kbp）、EcoR I（198、266b
p）、Pst I−Sal I（3.0、2.0kbp）、Hpa I（4.98kb
p）;pLS−T3:Pst I−Pvu II（1.5、3Kbp）、EcoR I（19
8、266bp）、Pst I−Sal I（3.0、2.5kbp）、Hpa I（5.
45kbp）］。このプロセスを第11図および第12図に示
す。
て２つの断片（2.6kbpおよび464bp）を得た。小さい方
の断片（464bp）を0.8％アガロースゲル分取電気泳動に
より精製した。得られたBamH I消化断片（464bp）（36n
g）および上記pLHSdMmtrpの脱リン酸化BamH I消化断片
（200ng）を、T4DNAリガーゼ（４単位）の存在下に16℃
で20時間インキユベートした。ライゲーシヨン混合物で
E.coli HB101を形質転換してアンピシリン抵抗性のコロ
ニーを得た。12コロニー中７コロニーが２つのシストロ
ン性蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉ遺伝子をもつプラスミ
ド（pLS−T2と名付ける）であり、１コロニーが３つの
シストロン性蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉ遺伝子を有す
るプラスミド（pLS−T3と名付ける）であって、これら
は制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した［pLS−T
2:Pst I−Pvu II（1.5、3.4kbp）、EcoR I（198、266b
p）、Pst I−Sal I（3.0、2.0kbp）、Hpa I（4.98kb
p）;pLS−T3:Pst I−Pvu II（1.5、3Kbp）、EcoR I（19
8、266bp）、Pst I−Sal I（3.0、2.5kbp）、Hpa I（5.
45kbp）］。このプロセスを第11図および第12図に示
す。
実施例12 ターミネーターＳ遺伝子の調製： 各オリゴヌクレオチド（Ｂ′、Ｃ′、Ｄ′およびＥ′）
をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、つ
ぎに実施例２の記載に従いT4DNAリガーゼで処理した。
ライゲーシヨン混合物および２種のオリゴヌクレオチド
（Ａ′およびＦ′）を混合し、T4DNAリガーゼで処理し
てライゲーシヨン生成物を得た。このプロセスを第13図
に示す。このターミネーターＳ遺伝子は次の通りであ
る： 実施例13 ターミネーターＳ遺伝子のクローニング： ライゲーシヨン生成物を分取PAGEにより精製し、pBR322
のBamH I−Sal I消化による大きい方の断片と混合し
た。混合物のライゲーシヨンを標準条件下にT4リガーゼ
を用いて実施した。ライゲーシヨン混合物を用いてクシ
ユナー法によりE.coli HB101を形質転換し、テトラサイ
クリン含有プレート上でアンピシリン抵抗性形質転換体
を選択した。アンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感
受性をクローンから単離したプラスミドDNAをAva Iで消
化して817bp断片を証明し、BamH I−Sal Iで消化してタ
ーミネーターＳ遺伝子（47bp）を確認した。このプラス
ミドをpTerS21と名付け、発現プラスミドの構築に用い
た。このプロセスを第14図に示す。
をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化し、つ
ぎに実施例２の記載に従いT4DNAリガーゼで処理した。
ライゲーシヨン混合物および２種のオリゴヌクレオチド
（Ａ′およびＦ′）を混合し、T4DNAリガーゼで処理し
てライゲーシヨン生成物を得た。このプロセスを第13図
に示す。このターミネーターＳ遺伝子は次の通りであ
る： 実施例13 ターミネーターＳ遺伝子のクローニング： ライゲーシヨン生成物を分取PAGEにより精製し、pBR322
のBamH I−Sal I消化による大きい方の断片と混合し
た。混合物のライゲーシヨンを標準条件下にT4リガーゼ
を用いて実施した。ライゲーシヨン混合物を用いてクシ
ユナー法によりE.coli HB101を形質転換し、テトラサイ
クリン含有プレート上でアンピシリン抵抗性形質転換体
を選択した。アンピシリン抵抗性、テトラサイクリン感
受性をクローンから単離したプラスミドDNAをAva Iで消
化して817bp断片を証明し、BamH I−Sal Iで消化してタ
ーミネーターＳ遺伝子（47bp）を確認した。このプラス
ミドをpTerS21と名付け、発現プラスミドの構築に用い
た。このプロセスを第14図に示す。
実施例14 pLHSdMmTerの構築： プラスミドpTerS21（20μｇ）を37℃で１時間Pst I（40
単位）およびBamH I（40単位）により消化した。長い断
片（3kbp）を1.5％アガロースゲル分取電気泳動および
それに続くDEAEトヨパール650Mカラムクロマトグラフイ
ーにより精製して、ターミネーターＳ遺伝子含有断片
（２μｇ）を得た。
単位）およびBamH I（40単位）により消化した。長い断
片（3kbp）を1.5％アガロースゲル分取電気泳動および
それに続くDEAEトヨパール650Mカラムクロマトグラフイ
ーにより精製して、ターミネーターＳ遺伝子含有断片
（２μｇ）を得た。
一方、プラスミドpLS−T2（20μｇ）をPst IおよびBamH
Iで消化して、1.3kbpのPast I−BamH I断片（２μｇ）
を得た。この、融合IGF−Ｉ遺伝子含有断片（1.3kbp、2
00ng）を上記断片（3kbp、200ng）と、T4DNAリガーゼ
（１μ）の存在下に16℃に２時間にわたりライゲート
した。ライゲーシヨン混合物を用いてE.coli DH1を形質
転換してアンピリシン抵抗性のコロニーを得た。形質転
換体から得たプラスミドをpLHSdMmTerと名付け、制限エ
ンドヌクレアーゼ分析により確認した［Xho I（4.3kb
p）、Pst I−Hind III（3.3kbpおよび1.0kbp）］。この
プロセスを第15図に示す。
Iで消化して、1.3kbpのPast I−BamH I断片（２μｇ）
を得た。この、融合IGF−Ｉ遺伝子含有断片（1.3kbp、2
00ng）を上記断片（3kbp、200ng）と、T4DNAリガーゼ
（１μ）の存在下に16℃に２時間にわたりライゲート
した。ライゲーシヨン混合物を用いてE.coli DH1を形質
転換してアンピリシン抵抗性のコロニーを得た。形質転
換体から得たプラスミドをpLHSdMmTerと名付け、制限エ
ンドヌクレアーゼ分析により確認した［Xho I（4.3kb
p）、Pst I−Hind III（3.3kbpおよび1.0kbp）］。この
プロセスを第15図に示す。
実施例15 発現プラスミドpLS−D1の構築： プラスミドpLHSdMmTer（50μｇ）をSal I（80単位）お
よびPvu II（80単位）で消化して２種の断片（2.9kbpお
よび1.4kbp）を得た。分離、精製後、Sal I−Pvu II断
片（2.9kbp）（１μｇ）を、ニツク（Nick）トランスレ
ーシヨン緩衝液中、DNAポリメラーゼＩ（ラージフラグ
メント）（BRLから購入）（２単位）および0.1mMの4dNT
P種（等モルのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP）と共に16
℃で１時間インキユベートした。70℃で５分間加熱して
酵素を不活化したのち、DNAを0.8％アガロースゲル分取
電気泳動により精製した。回収したDNA（200ng）をライ
ゲーシヨン緩衝液中16℃で20分間T4DNAリガーゼおよび2
mM ATPで処理した。ライゲーシヨン混合物でE.coli HB1
01を形質転換してアンピシリン抵抗性の形質転換体を得
た。その形質転換体から得たプラスミドをpLS−D1と名
付けた。プラスミドpLS−D1を含有するE.coli HB101を
E.coli F−12と名付けた。形質転換体から得た上記プラ
スミド（pLS−D1）は、制限エンドヌクレアーゼ分析に
より確認した［Pst−BamH I（1.3kbp）、Hpa I−BamH I
（456bp）］。このプロセスを第16図に示す。
よびPvu II（80単位）で消化して２種の断片（2.9kbpお
よび1.4kbp）を得た。分離、精製後、Sal I−Pvu II断
片（2.9kbp）（１μｇ）を、ニツク（Nick）トランスレ
ーシヨン緩衝液中、DNAポリメラーゼＩ（ラージフラグ
メント）（BRLから購入）（２単位）および0.1mMの4dNT
P種（等モルのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP）と共に16
℃で１時間インキユベートした。70℃で５分間加熱して
酵素を不活化したのち、DNAを0.8％アガロースゲル分取
電気泳動により精製した。回収したDNA（200ng）をライ
ゲーシヨン緩衝液中16℃で20分間T4DNAリガーゼおよび2
mM ATPで処理した。ライゲーシヨン混合物でE.coli HB1
01を形質転換してアンピシリン抵抗性の形質転換体を得
た。その形質転換体から得たプラスミドをpLS−D1と名
付けた。プラスミドpLS−D1を含有するE.coli HB101を
E.coli F−12と名付けた。形質転換体から得た上記プラ
スミド（pLS−D1）は、制限エンドヌクレアーゼ分析に
より確認した［Pst−BamH I（1.3kbp）、Hpa I−BamH I
（456bp）］。このプロセスを第16図に示す。
実施例16 発現プラスミドpLS−D2の構築： プラスミドpLS−D1（10μｇ）をBamH I（30単位）で消
化して、DNA断片（５μｇ）を得た。そのDAN（2.5μ
ｇ）をCIPで処理して、脱リン酸化BamH I pLS−D1断片
（２μｇ）を得た。この脱リン酸化BamH I断片（200n
g）を、実施例11で調製した融合IGF−Ｉ遺伝子含有BamH
I断片（464bp）と、T4DNAリガーゼおよび2mMのAPTの存
在下に16℃で20時間にわたってライゲートした。ライゲ
ーシヨン混合物でE.coli HB101を形質転換した。アンピ
シリン抵抗性形質転換体から得たプラスミドをpLS−D2
と名付けた。プラスミドpLS−D2を含有するE.coli HB10
1ををE.coli F−13と名付ける。該形質転換体から得た
プラスミド（pLS−D2）はPst I（3.3kbp）、Pst I−Bam
H I消化（1.6kbp、1.3kbpおよび464bp）ならびにBamH I
消化（2.9kbp、464bp）により確認した。このプロセス
を第17図に示す。
化して、DNA断片（５μｇ）を得た。そのDAN（2.5μ
ｇ）をCIPで処理して、脱リン酸化BamH I pLS−D1断片
（２μｇ）を得た。この脱リン酸化BamH I断片（200n
g）を、実施例11で調製した融合IGF−Ｉ遺伝子含有BamH
I断片（464bp）と、T4DNAリガーゼおよび2mMのAPTの存
在下に16℃で20時間にわたってライゲートした。ライゲ
ーシヨン混合物でE.coli HB101を形質転換した。アンピ
シリン抵抗性形質転換体から得たプラスミドをpLS−D2
と名付けた。プラスミドpLS−D2を含有するE.coli HB10
1ををE.coli F−13と名付ける。該形質転換体から得た
プラスミド（pLS−D2）はPst I（3.3kbp）、Pst I−Bam
H I消化（1.6kbp、1.3kbpおよび464bp）ならびにBamH I
消化（2.9kbp、464bp）により確認した。このプロセス
を第17図に示す。
実施例17 発現プラスミドpLS−DD1の構築： プラスミドpLS−D1（40μｇ）をPst I（43単位）で消化
して、DNA断片（20μｇ）を得た。このDNAをCIPで処理
して脱リン酸化Pst I消化pLS−D1（20μｇ）を得た。プ
ラスミドpLS−D2（40μｇ）をPst I（24単位）で消化し
た。得られたPst I消化pLS−D2（１μｇ）および脱リン
酸化Pst I消化pLS−D1（５μｇ）を、T4DNAリガーゼ
（１μｇ）および2mMのATPの存在下に16℃で20時間イン
キユベートした。ライゲーシヨン混合物を用いてE.coli
HB101を形質転換して、アンピシリン抵抗性の形質転換
体を得た。形質転換体から得たプラスミドをpLS−DD1と
名付けた。プラスミドpLS−DD1を含有するE.coli HB101
をE.coli F−14と名付けた。形質転換体から得たプラス
ミドは制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した［Sa
l I（3.3kbpおよび2.9kbp）、Hpa I（3.3kbpおよび2.9k
bp）およびHpa I−Sal I（2.4kbp、503bpおよび967b
p）］。このプロセスを第18図に示す。
して、DNA断片（20μｇ）を得た。このDNAをCIPで処理
して脱リン酸化Pst I消化pLS−D1（20μｇ）を得た。プ
ラスミドpLS−D2（40μｇ）をPst I（24単位）で消化し
た。得られたPst I消化pLS−D2（１μｇ）および脱リン
酸化Pst I消化pLS−D1（５μｇ）を、T4DNAリガーゼ
（１μｇ）および2mMのATPの存在下に16℃で20時間イン
キユベートした。ライゲーシヨン混合物を用いてE.coli
HB101を形質転換して、アンピシリン抵抗性の形質転換
体を得た。形質転換体から得たプラスミドをpLS−DD1と
名付けた。プラスミドpLS−DD1を含有するE.coli HB101
をE.coli F−14と名付けた。形質転換体から得たプラス
ミドは制限エンドヌクレアーゼ分析により確認した［Sa
l I（3.3kbpおよび2.9kbp）、Hpa I（3.3kbpおよび2.9k
bp）およびHpa I−Sal I（2.4kbp、503bpおよび967b
p）］。このプロセスを第18図に示す。
実施例18 蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉをコードする遺伝子のE.col
i F−12における発現： 50μg/mlのアンピシリンを含有するＬブロス中でE.coli
F−12（プラスミドpLS−D1を含有するE.coli HB101）
を一夜培養したものを、0.2％のグルコース、0.5％のカ
ザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、50μg/mlのビタミン
B1および25μg/mlのアンピシリンを含有するM9培地で1:
20に稀釈した。β−インドールアクリル酸を、A600が約
0.5となったときに、最終濃度が10μg/mlとなるよう加
えた。つぎに、細胞をインキユベートし、アリコート
（培養液20mlずつ）を遠心分離（7Krpm、４℃、５分
間）により集めた。
i F−12における発現： 50μg/mlのアンピシリンを含有するＬブロス中でE.coli
F−12（プラスミドpLS−D1を含有するE.coli HB101）
を一夜培養したものを、0.2％のグルコース、0.5％のカ
ザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、50μg/mlのビタミン
B1および25μg/mlのアンピシリンを含有するM9培地で1:
20に稀釈した。β−インドールアクリル酸を、A600が約
0.5となったときに、最終濃度が10μg/mlとなるよう加
えた。つぎに、細胞をインキユベートし、アリコート
（培養液20mlずつ）を遠心分離（7Krpm、４℃、５分
間）により集めた。
実施例19 蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉをコードする遺伝子のE.col
i F−13における発現： 50μg/mlのアンピシリンを含有するＬブロス中でE.coli
F−13（プラスミドpLS−D2を含有するE.coli HB101）
を一夜培養したものを、0.2％のグルコース、0.5％のカ
ザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、50μg/mlのビタミン
B1および25μg/mlのアンピシリンを含有するM9培地で1:
20に稀釈した。A600が約0.5のときに、β−インドール
アクリル酸を最終濃度が10μg/mlとなるよう加えた。つ
いで、細胞をインキユベートし、アリコート（培養液20
mlずつ）を遠心分離（7Krpm、４℃、５分間）により集
めた。
i F−13における発現： 50μg/mlのアンピシリンを含有するＬブロス中でE.coli
F−13（プラスミドpLS−D2を含有するE.coli HB101）
を一夜培養したものを、0.2％のグルコース、0.5％のカ
ザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、50μg/mlのビタミン
B1および25μg/mlのアンピシリンを含有するM9培地で1:
20に稀釈した。A600が約0.5のときに、β−インドール
アクリル酸を最終濃度が10μg/mlとなるよう加えた。つ
いで、細胞をインキユベートし、アリコート（培養液20
mlずつ）を遠心分離（7Krpm、４℃、５分間）により集
めた。
実施例20 蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉをコードする遺伝子のE.col
i F−14における発現： 50μg/mlのアンピシリンを含有するＬブロス中でE.coli
F−14（プラスミドpLS−DD1を含有するE.coli HB101）
を一夜培養したものを、0.2％のグルコース、0.5％のカ
ザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、50μg/mlのビタミン
B1および25μg/mlのアンピシリンを含有するM9培地で1:
20に稀釈した。A600が約0.5となったとき、β−インド
ールアクリル酸を最終濃度が10μg/mlまで加えた。つい
で、細胞をインキユベートし、アリコート（培養液20ml
ずつ）を遠心分離（7Krpm、４℃、５分間）により集め
た。
i F−14における発現： 50μg/mlのアンピシリンを含有するＬブロス中でE.coli
F−14（プラスミドpLS−DD1を含有するE.coli HB101）
を一夜培養したものを、0.2％のグルコース、0.5％のカ
ザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、50μg/mlのビタミン
B1および25μg/mlのアンピシリンを含有するM9培地で1:
20に稀釈した。A600が約0.5となったとき、β−インド
ールアクリル酸を最終濃度が10μg/mlまで加えた。つい
で、細胞をインキユベートし、アリコート（培養液20ml
ずつ）を遠心分離（7Krpm、４℃、５分間）により集め
た。
実施例21 淡泊ペプチドLH融合IGF−Ｉの単離と精製 E.coli F−12を誘導後４時間培養し、遠心分離（14Krp
m、４℃）で集めた。湿潤細胞ペースト（120g:培養液20
リットルから）を10mMリン酸緩衝食塩水（以下PBSとい
う）−10mM EDTA（pH8.0）300mlに懸濁し、−80℃で凍
結した。この混合物を融解し、0.5MEDTA50mlおよび10mg
/mlリソチーム溶液50mlに加えた。０℃で１時間かき混
ぜたのち、混合物をホモジナイズした。細胞デブリスを
25mM PBS−10mM EDTA−0.5％サルコシルナトリウム（pH
8.0）２リットル中に懸濁し、つぎにこの混合物をホモ
ジナイズした。０℃で１時間かき混ぜたのち、混合物を
7,000rpm、４℃で35分間遠心分離にかけた。ペレットを
10mM PBS−10mM EDTA（pH8.0）に懸濁した。混合物をホ
モジナイズし、上と同じ方法で遠心分離した。ペレット
を6M塩酸グアニジン−100mM Tris塩酸塩−10mM EDTA−1
0mM DTT（pH8.0）200mlに溶解し、40Krpm、20℃で１時
間遠心分離した。上澄みを集め、0.1MTris−HC1（pH8.
0）/8M尿素および10mM 2−メルカプトエタノールで平衡
化したセフアクリルS300スーパーフアインカラム（5.0
×86.6cm;樹脂1700ml）にかけた。溶出は、平衡化緩衝
液を用い、流速0.6ml/分で、４℃で行った。セフアクリ
ルS300クロマトグラフイーを行って、35mlの画分を集め
た。セフアクリルS300（フアルマシア製）を用いたカラ
ムクロマトグラフイーを実施した。全てのクロマトグラ
フイー工程について、分画の直後にアツセイを行った。
活性画分を集め、プールした画分500mlを、1M酢酸水溶
液16リットルに対して室温で３時間透析し、つぎに新鮮
な1M酢酸水溶液16リットルに対して一夜透析した。透析
ずみの画分を凍結乾燥して、所望の成分を含有する蛋白
ペプチドLH融合IGF−Ｉ（1.30g）を得た。この蛋白ペプ
チドLH融合IGF−Ｉは、15％ SDS PAGE（ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）において分
子量15,500の位置にバンドを示す。
m、４℃）で集めた。湿潤細胞ペースト（120g:培養液20
リットルから）を10mMリン酸緩衝食塩水（以下PBSとい
う）−10mM EDTA（pH8.0）300mlに懸濁し、−80℃で凍
結した。この混合物を融解し、0.5MEDTA50mlおよび10mg
/mlリソチーム溶液50mlに加えた。０℃で１時間かき混
ぜたのち、混合物をホモジナイズした。細胞デブリスを
25mM PBS−10mM EDTA−0.5％サルコシルナトリウム（pH
8.0）２リットル中に懸濁し、つぎにこの混合物をホモ
ジナイズした。０℃で１時間かき混ぜたのち、混合物を
7,000rpm、４℃で35分間遠心分離にかけた。ペレットを
10mM PBS−10mM EDTA（pH8.0）に懸濁した。混合物をホ
モジナイズし、上と同じ方法で遠心分離した。ペレット
を6M塩酸グアニジン−100mM Tris塩酸塩−10mM EDTA−1
0mM DTT（pH8.0）200mlに溶解し、40Krpm、20℃で１時
間遠心分離した。上澄みを集め、0.1MTris−HC1（pH8.
0）/8M尿素および10mM 2−メルカプトエタノールで平衡
化したセフアクリルS300スーパーフアインカラム（5.0
×86.6cm;樹脂1700ml）にかけた。溶出は、平衡化緩衝
液を用い、流速0.6ml/分で、４℃で行った。セフアクリ
ルS300クロマトグラフイーを行って、35mlの画分を集め
た。セフアクリルS300（フアルマシア製）を用いたカラ
ムクロマトグラフイーを実施した。全てのクロマトグラ
フイー工程について、分画の直後にアツセイを行った。
活性画分を集め、プールした画分500mlを、1M酢酸水溶
液16リットルに対して室温で３時間透析し、つぎに新鮮
な1M酢酸水溶液16リットルに対して一夜透析した。透析
ずみの画分を凍結乾燥して、所望の成分を含有する蛋白
ペプチドLH融合IGF−Ｉ（1.30g）を得た。この蛋白ペプ
チドLH融合IGF−Ｉは、15％ SDS PAGE（ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）において分
子量15,500の位置にバンドを示す。
実施例22 培養液中の蛋白ペプチドLH融合IGF−Ｉの含量を、放射
免疫検定法（以下RIAという）を用いて測定し、IGF−Ｉ
含量として計算した。
免疫検定法（以下RIAという）を用いて測定し、IGF−Ｉ
含量として計算した。
IGF−Ｉの放射免疫検定は、矢内原の方法［矢内原ら：
ペプチド・ホルモンズ・イン・パンクレアス、３、28
（1983）］に従って実施した。
ペプチド・ホルモンズ・イン・パンクレアス、３、28
（1983）］に従って実施した。
方法： 上記の試料または標準試料［IGF−Ｉ断片（26−46）］
0.1mlと試料緩衝液［0.01M PBS中の0.5％BSA、0.025M E
DTA（pH7.4）（0.4ml）］、IGF−Ｉ（26−46）のウサギ
抗血清（0.1ml）および125I−IGF−Ｉ（26−46）（0.1m
l）を混合した。混合物を４℃で48時間放置し、つぎ
に、ウサギ血清（0.1ml）、ウサギγ−グロブリン抗血
清（0.1ml）および５％pEG6000（0.9ml）を添加した。
さらに２時間４℃に放置したのち、遠心分離（3Krpm、
４℃、30分間）によってペレットを集め、γ−カウンタ
ーにより放射能を測定した。この放射能からIGF−Ｉ含
量を計算した。
0.1mlと試料緩衝液［0.01M PBS中の0.5％BSA、0.025M E
DTA（pH7.4）（0.4ml）］、IGF−Ｉ（26−46）のウサギ
抗血清（0.1ml）および125I−IGF−Ｉ（26−46）（0.1m
l）を混合した。混合物を４℃で48時間放置し、つぎ
に、ウサギ血清（0.1ml）、ウサギγ−グロブリン抗血
清（0.1ml）および５％pEG6000（0.9ml）を添加した。
さらに２時間４℃に放置したのち、遠心分離（3Krpm、
４℃、30分間）によってペレットを集め、γ−カウンタ
ーにより放射能を測定した。この放射能からIGF−Ｉ含
量を計算した。
結果： それぞれ実施例18、実施例19および実施例20に記載の方
法によって調製した培養液（20ml）（M9ブロス中でE.co
li F−12、E.coli F−13およびE.coli F−14を培養した
液）を7.000rpmで遠心分離した。得られた細胞を8M尿
素、10mMEDTA（pH8.0）（2ml）に懸濁し、つぎに超音波
により破壊した。懸濁液を遠心分離し（18,000rpm、30
分間、４℃）、上澄みを0.5％BSA、10mM PBS、25ml EDT
Aで稀釈し、RIAおよびHPLC（高速液体クロマトグラフイ
ー）用の試料として使用した。
法によって調製した培養液（20ml）（M9ブロス中でE.co
li F−12、E.coli F−13およびE.coli F−14を培養した
液）を7.000rpmで遠心分離した。得られた細胞を8M尿
素、10mMEDTA（pH8.0）（2ml）に懸濁し、つぎに超音波
により破壊した。懸濁液を遠心分離し（18,000rpm、30
分間、４℃）、上澄みを0.5％BSA、10mM PBS、25ml EDT
Aで稀釈し、RIAおよびHPLC（高速液体クロマトグラフイ
ー）用の試料として使用した。
IGF−Ｉ含量を、発言プラスミドpLHSdMmtrpを含有する
E.coli F−６を用いて同様にして調製した培養液のそれ
と比較した。
E.coli F−６を用いて同様にして調製した培養液のそれ
と比較した。
実施例23 臭化シアンによる融合IGF−Ｉからの蛋白ペプチドLHの
除去： 上記手順によって得た融合IGF−Ｉ（225mg）を60％ぎ酸
36mlに溶かした。臭化シアン（36mg）を加え、混合物を
かき混ぜながら25℃以下で３時間反応させた。蒸留水23
4mlを加えたのち、ぎ酸および臭化シアンを凍結乾燥に
より除去した。残渣を、1Mトリス−HCl（pH8.0）/8M尿
素および50mM2−メルカプトエタノールの36mlに溶かし
た。生じた溶液を0.01M酢酸アンモニウム（pH4.6）/8M
尿素および50mM2−メルカプトエタノール（緩衝液Ａ）
の400mlに対して室温で３時間ずつ２回透析した。透析
ずみ溶液を、緩衝液Ａで平衡化したカチオン交換樹脂CM
25のカラム（1.6×7.5cm;樹脂量15ml）にかけた。カラ
ムを室温で緩衝液Ａ（60ml）により流速0.25ml/分で洗
い、緩衝液Ａ（120ml）から0.2M酢酸アンモニウム/8M尿
素および50mM2−メルカプトエタノール（120ml）への直
線勾配により溶出した。2.9mlの画分（No.57〜No.100）
を集めた。高速液体クロマトグラフイー： 上で得たプールした画分をこれにかけた。
除去： 上記手順によって得た融合IGF−Ｉ（225mg）を60％ぎ酸
36mlに溶かした。臭化シアン（36mg）を加え、混合物を
かき混ぜながら25℃以下で３時間反応させた。蒸留水23
4mlを加えたのち、ぎ酸および臭化シアンを凍結乾燥に
より除去した。残渣を、1Mトリス−HCl（pH8.0）/8M尿
素および50mM2−メルカプトエタノールの36mlに溶かし
た。生じた溶液を0.01M酢酸アンモニウム（pH4.6）/8M
尿素および50mM2−メルカプトエタノール（緩衝液Ａ）
の400mlに対して室温で３時間ずつ２回透析した。透析
ずみ溶液を、緩衝液Ａで平衡化したカチオン交換樹脂CM
25のカラム（1.6×7.5cm;樹脂量15ml）にかけた。カラ
ムを室温で緩衝液Ａ（60ml）により流速0.25ml/分で洗
い、緩衝液Ａ（120ml）から0.2M酢酸アンモニウム/8M尿
素および50mM2−メルカプトエタノール（120ml）への直
線勾配により溶出した。2.9mlの画分（No.57〜No.100）
を集めた。高速液体クロマトグラフイー： 上で得たプールした画分をこれにかけた。
カラム：ベツクマンウルトラポアRPSC （商標；ベツクマン製）（4.6×75mm） 流速:1ml/分 溶出:50分間かけての0.01Mトリフルオロ酢酸中アセトニ
トリル10％から60％への直線勾配 このクロマトグラフイーを15回くり返し、還元型IGF−
Ｉを含有する画分を集めた。保持時間29.32分の主ピー
クが還元型IGF−Ｉに相当する。かくして還元型IGF−Ｉ
が上記手順により約2.4mg得られた。この還元型IGF−Ｉ
の通例のリホールディング法により酸化型IGF−Ｉに転
化した。このIGF−Ｉは、HPLCにおいてハンベル博士（D
r.Humbel）から分与を受けた標準IGF−Ｉと重なった。
トリル10％から60％への直線勾配 このクロマトグラフイーを15回くり返し、還元型IGF−
Ｉを含有する画分を集めた。保持時間29.32分の主ピー
クが還元型IGF−Ｉに相当する。かくして還元型IGF−Ｉ
が上記手順により約2.4mg得られた。この還元型IGF−Ｉ
の通例のリホールディング法により酸化型IGF−Ｉに転
化した。このIGF−Ｉは、HPLCにおいてハンベル博士（D
r.Humbel）から分与を受けた標準IGF−Ｉと重なった。
IGF−Ｉのアミン酸分析および配列分析： IGF−Ｉのアミノ酸組成はウオールターズ（Walters）ア
ミノ酸分析システムを用いて求めた。IGF−Ｉのアミノ
酸配列は、第19図に示すように、DIBITC法（エドマン法
の変法）［J.Y.チャングら：バイオケミカル・ジヤーナ
ル第153巻607ページ（1976年）、ピオキミカ・エト・ビ
オフィジカ・アクタ第578巻188ページ（1979年）］およ
びカルボキシペプチダーゼ法の組合せによって求めた。
ミノ酸分析システムを用いて求めた。IGF−Ｉのアミノ
酸配列は、第19図に示すように、DIBITC法（エドマン法
の変法）［J.Y.チャングら：バイオケミカル・ジヤーナ
ル第153巻607ページ（1976年）、ピオキミカ・エト・ビ
オフィジカ・アクタ第578巻188ページ（1979年）］およ
びカルボキシペプチダーゼ法の組合せによって求めた。
【図面の簡単な説明】 第１図はIGF−Ｉ遺伝子の調製の手順を示す図であり、
第２図はプラスミドpSdM1の調製の手順を示す図であ
り、第３図は合成trpプロモーターIIの調製の手順を示
す図であり、第４図はプラスミドpTrpEB7の調製の手順
を示す図であり、第５図は蛋白ペプチドLH遺伝子の調製
の手順を示す図であり、第６図はプラスミドpLH107の調
製の手順を示す図であり、第７図はプラスミドpLHtrpの
調製の手順を示す図であり、第８図はプラスミドpLHSdM
mtrpの調製の手順を示す図であり、第９図および第10図
はプラスミドpUC−SS1の調製の手順を示す図であり、第
11図および第12図はプラスミドpLS−T2およびpLS−T3の
調製の手順を示す図であり、第13図はターミネーターＳ
遺伝子の調製の手順を示す図であり、第14図はプラスミ
ドpTerS21の調製の手順を示す図であり、第15図はプラ
スミドpLHSdMmTerの調製の手順を示す図であり、第16図
はプラスミドpLS−D1の調製の手順を示す図であり、第1
7図はプラスミドpLS−D2の手順を示す図であり、第18図
はプラスミドpLS−DD1の調製の手順を示す図であり、第
19図はIGF−Ｉのアミノ酸配列を示す図である。
第２図はプラスミドpSdM1の調製の手順を示す図であ
り、第３図は合成trpプロモーターIIの調製の手順を示
す図であり、第４図はプラスミドpTrpEB7の調製の手順
を示す図であり、第５図は蛋白ペプチドLH遺伝子の調製
の手順を示す図であり、第６図はプラスミドpLH107の調
製の手順を示す図であり、第７図はプラスミドpLHtrpの
調製の手順を示す図であり、第８図はプラスミドpLHSdM
mtrpの調製の手順を示す図であり、第９図および第10図
はプラスミドpUC−SS1の調製の手順を示す図であり、第
11図および第12図はプラスミドpLS−T2およびpLS−T3の
調製の手順を示す図であり、第13図はターミネーターＳ
遺伝子の調製の手順を示す図であり、第14図はプラスミ
ドpTerS21の調製の手順を示す図であり、第15図はプラ
スミドpLHSdMmTerの調製の手順を示す図であり、第16図
はプラスミドpLS−D1の調製の手順を示す図であり、第1
7図はプラスミドpLS−D2の手順を示す図であり、第18図
はプラスミドpLS−DD1の調製の手順を示す図であり、第
19図はIGF−Ｉのアミノ酸配列を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭60−156389（ＪＰ，Ａ) 欧州特許155655（ＥＰ，Ｂ) Ｇｅｎｅ 31（1984）Ｐ．155−164
Claims (2)
- 【請求項１】保護ペプチドと融合したヒトインスリン様
成長因子Ｉをコードする遺伝子を有し、ロップ遺伝子を
切りとられている下記で示されるpLS−D1,pLS−D2およ
びpLS−DD1より選ばれた発現プラスミド。 pLS−D1 a.制限酵素開裂地図 b.分子量 2.9K pLS−D2 a.制限酵素開裂地図 b.分子量 3.3K pLS−DD1 a.制限酵素開裂地図 ｂ）分子量 6.2K - 【請求項２】保護ペプチドと融合したヒトインスリン様
成長因子Ｉをコードする遺伝子を有し、ロップ遺伝子を
切りとられている下記で示されるpLS−D1、pLS−D2およ
びpLS−DD1より選ばれた発現プラスミドにより形質転換
されたた細菌。 pLS−D1 a.制限酵素開裂地図 b.分子量 2.9K pLS−D2 a.制限酵素開裂地図 b.分子量 3.3K pLS−DD1 a.制限酵素開裂地図 ｂ）分子量 6.2K
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8525929 | 1985-10-21 | ||
| GB858525929A GB8525929D0 (en) | 1985-10-21 | 1985-10-21 | Production of insulin-like growth factor |
| GB868617073A GB8617073D0 (en) | 1986-07-14 | 1986-07-14 | Insulin-like growth factor i |
| GB8617073 | 1986-07-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62175192A JPS62175192A (ja) | 1987-07-31 |
| JPH07114702B2 true JPH07114702B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=26289914
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| JP61246740A Expired - Fee Related JPH07114702B2 (ja) | 1985-10-21 | 1986-10-16 | ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 |
Country Status (10)
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|---|---|
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| JP (1) | JPH07114702B2 (ja) |
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| DE (1) | DE3681398D1 (ja) |
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| GR (1) | GR3002696T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE3789550T2 (de) * | 1986-12-31 | 1994-08-25 | Lucky Ltd | Verfahren zur herstellung eines rinderwachstumshormons mittels eines kunstgens. |
| US7049102B1 (en) | 1989-09-22 | 2006-05-23 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Multi-gene expression profile |
| KR920003787B1 (ko) * | 1990-03-05 | 1992-05-14 | 한국과학기술 연구원 | 신규 플라스미드 제조 및 그를 함유한 균주를 배양하여 아이 지 에프-1(igf-1)을 생산하는 방법 |
| JP2574549B2 (ja) * | 1991-03-08 | 1997-01-22 | 萩原 義秀 | 新規プラスミド |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| JPH10504971A (ja) * | 1994-09-08 | 1998-05-19 | カイロン コーポレイション | インスリン様増殖因子の改善された生産方法 |
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|---|---|---|---|---|
| DE3486491T2 (de) * | 1983-04-25 | 2003-01-16 | Chiron Corp., Emeryville | Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren |
| IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| SE8303626D0 (sv) * | 1983-06-23 | 1983-06-23 | Kabigen Ab | A recombinant plasmid a transformant microorganism, a polydoxyrebonucleotide segment, a process for producing a biologically active protein, and the protein thus produced |
| WO1985000831A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of insulin-like growth factor |
| HU194307B (en) * | 1983-09-16 | 1988-01-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for producing plasmidvectors of high copy number |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
-
1986
- 1986-10-16 EP EP86114321A patent/EP0219814B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-16 DE DE8686114321T patent/DE3681398D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-10-16 ES ES198686114321T patent/ES2029785T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-16 AT AT86114321T patent/ATE67243T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-16 JP JP61246740A patent/JPH07114702B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1986-10-20 DK DK502786A patent/DK502786A/da unknown
- 1986-10-21 CA CA000520933A patent/CA1297814C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-10-21 IL IL80376A patent/IL80376A0/xx unknown
- 1986-10-24 KR KR1019860008945A patent/KR880001813A/ko not_active Ceased
-
1991
- 1991-09-12 GR GR91401142T patent/GR3002696T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ３１（１９８４）Ｐ．１５５−１６４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62175192A (ja) | 1987-07-31 |
| IL80376A0 (en) | 1987-01-30 |
| DK502786D0 (da) | 1986-10-20 |
| DK502786A (da) | 1987-04-22 |
| ATE67243T1 (de) | 1991-09-15 |
| EP0219814A1 (en) | 1987-04-29 |
| DE3681398D1 (de) | 1991-10-17 |
| CA1297814C (en) | 1992-03-24 |
| ES2029785T3 (es) | 1992-10-01 |
| GR3002696T3 (en) | 1993-01-25 |
| EP0219814B1 (en) | 1991-09-11 |
| KR880001813A (ko) | 1988-04-27 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |