JPS5963191A - 新規菌株およびそれを用いたイソプレノイド化合物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規菌株およびそれを用いたイソプレノイド
化合物の製法に関し、更に詳しくは、アルスロバクタ−
に属する新規菌株およびそれを用いたイソプレノイド化
合物、特にメナキノン−８（ＭＫ−８）の製法に関する
。

イソプレノイド化合物は生体内に存在し、生理活性物質
として重要な機能を有している。

インブレノイド化合物は、インペンテニルピロリン酸（
ＩＰＰ）やファルネシルピロリンｅ　（Ｆｐｐ）など種
々の化合物を原料として生体内で生産される。しかし、
ＩＰＰやＰＰＰは菌体内には取り込まれないため、ＩＰ
ＰやＰＰＰからのイソプレノイド化合物の細菌による生
産能力には限界があった。

本発明者は、アルスロバクタ−順、に朋する菌の代謝に
ついて研究を重ねるうち、ある種の菌株はＩＰＰおよび
ＦＰＰを取り込む能力を有しており、効率的にイソプレ
ノイド化合物を生産することを見い出し、本発明を完成
するに至った。

すなわち、本発明の要旨は、イソペンテニルピロリン酸
を取り込むことができ、アルスロバクタ−属に属する菌
株およびそわを培養し、生成した菌体よりイソプレノイ
ド化合物を採取することから成る製法に存する。

本発明の菌株は、土壌菌の中から検索した結果得られた
新規菌株であり、その１つであるアルスロバクタ＝（Ａ
ｒ、ｔｈｒｏｂａｃｔｅｔ　）ｓ　ｐ　、Ｋ　Ｉ）−２
は受託番号微工研菌寄第６７２６号として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。

このアルスロバクタ−８Ｐ、Ｋｌ）−２（以ド、Ｋ　Ｄ
　−２とい・う。）の菌学的性質は次のＪ、ｉＶｉりで
ある： ■、形能学的性質 肉汁培（１ｊｊ、中３０℃で１〜２日間日間静置上用も
のにつき観察を行った。

（１）細胞の大きさ、形 ０．５〜０．９μ×１．３〜２．６μ。

１日の肉汁斜面培養では上記の大きさの桿菌で（２）集
団　単独または１車鎖 （３）運動性　なし く４）胞子の有無　なし く５）ダラム染色性　陽性 ■、各培地における生育状態 各培地での培養は３０℃で３日間行った。

（１）肉汁１夜体培養 生育：中程度 皮膜　あり 沈渣、あり 混、′＠：あり １２）肉汁寒天平板培養 形状：正円 周縁゛全綴 表面隆起の形：半レンズ状 表面　平滑で輝光 色調：淡黄色 （３）肉汁寒天斜面培養 形状：糸状 表面：平滑で輝光 辺縁、金縁 色ｍ：淡黄色 （４）肉汁寒天穿刺培養 表面のみに生育 ■、生理学的性質 は）硝酸塩の還元性　− （２）脱窒反応　　　ニー （３）　Ｍ　Ｒテスト　　ニー ＋４）ＶＰテスト　　ニー （５）インドール生成　− （６）硫化水素生成　　十 （７）デンプンの加水分解ニー （８）クエン酸の利用：＋ （９）無械窒素源の利用：アンモニウム１奮、硝酸塩を
窒素源として利用 （１０）ウレアーゼ　、＋ （１１）オキシダーゼニー （１２）カタラーゼ　：＋ （１３）酸素に対する態塵：好気性 （１４）ゼラチンの液化ニー （１５）リドマスミルク：変化なし く】６）最適生育温間°３２℃ （１９牛育ｐＨ：５．Ｑ〜９．０ 最適生育ｐ）Ｉ：８．０ １１８）糖類からの酸およびガスの生成ニゲルコース、
ラクトース、グリセロールからの酸およびガスの生成は
認められない。

（１ｇ）炭素源の資化性 グルコース　＋、　メタノール　＋、 グリセロール＋、　　エタノール　＋、（２０）栄痺瞥
求性：なし 以トの菌学的諸１土質に従い、本発明の菌株（ＫＤ　−
２）の分類学的地１位をバージ−著「マニュアル・オブ
・デターミナテイブ・バクテリオロジー」（Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｉ）ｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇγ）第８版により
求めると、ダラム陽性で多形性を示し、運動性がなく、
好気性、カタラービ陽性、オキシダーゼ陰性とい・うこ
七から、この株はアルスロバクタ−属に嘆する。

本発明の新菌種１ζｏ−２は、土壌菌中より次のスクリ
ーニング方法により得ることができる。

土壌を減菌した生理食塩水に混合し、上澄部分から１白
金耳を五記スクリーニング用培地に移し、３０℃で３日
間振とう培養する。

培地組成　グリセリン５７、Ｋ２［Ｉ　Ｐ　０４７　Ｆ
、Ｋ１−１２　　ＰＯ４３Ｓ’　　１　　ＭｇＳＯ４−
７Ｈ２００，５９Ｐ、（ＮＨ４）２　ＨＰＯ４１Ｆ、イ
ーストナイトロジエン・ベース０．．５Ｆ、水１００ｉ
、　　ｐＨ７，０゜ この培養１１支の１白金耳を、上記と同様のスクリーニ
ング用培地に２グ／１００ｒｎ１．の寒天の入った平板
培地にス）　ＩＪ−りして３０℃で３１−１間静置培養
する。出現するコロニーのうち、ｉｊＩ目（−閑学的性
］釘の■（２）肉汁寒天平板培養における生育状態を満
足し、かつ粘稠性で大形（直径約３ｍｖｒ）のコロニー
を白金耳でつり、同様の培地で２回純化を行う。

次に、本発明の菌株Ｋ　Ｄ　−２を用いたイソプレノイ
ド化合物の製法を説明する。

培地には、使用する微生物が資化しうる炭素源（たとえ
ば、グリセリン、グルコース、糖蜜、クエン酸、エタノ
ーノへメタノールなど）、同ｆｌＳシうる窒素源（たと
えば、酵母エキス、ペグトン、コーンスチーブリカー、
アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなど
）および生育に必要な各種無機塩などをＩＰＰおよびＰ
ＰＰと共に包含させる。

培養は、迎常好気的な条件下、たとえは振とう培養法ま
たは通気攪拌培養法により、２０〜４０℃、好ましくは
２５〜３５゛℃、特に約３２′Ｃの培養温度で実施する
のが好ましい。この場合、培地のｐＨは５〜９、好まし
くは６〜９、特に約８に調整し、培養時間は、少なくと
も２４時Ｍであり、振とう培養の場合は好ましくは３〜
５日階１、ジャーファーメンタ−などを使用する・Ｊα
気鷹拌培猜アす１合は１゛任ましくけ２〜４日間である
。この様な条件下の培養によりインプレノイド化合物が
得られる。

醗酵終了後、遠心分離などの手段により集菌し、適当な
有機溶媒、たとえばクロロホルムでイソプレノイド化合
物を抽出する。

次に実施例を示し、本発明を説明する。

実施例１ 京都市左京区京都大学理学部構内から採取した土壌１２
をｒｌｉした生理食塩水５−のはいった試験管に加え、
よく振とうした。１分間静置後、上澄部分から１白金耳
を前記スクリーニング用培地５イを含む試験管に入れ、
綿栓をして往復振とう培養機により３０℃で３日間振と
う培養した（振とう速度１００回／分）。この培＃液の
１白金耳を、同様のスクリーニング用培地に２　Ｆ／１
００ｄの寒天の入った平板培地にストリークして３０℃
で３旧聞静置培養した。出現したコロニーのうち、前記
菌学的性質の■１２）肉汁寒天平板培養における生育状
態を満足し、かつ粘稠で大形（直径約３繭）のコロニー
を白金耳でつり、同様の培地で２回純化を行い、アルス
ロバ／）　ター　ｓ　ｐ　、　Ｋ　Ｄ　−２を得た。

実施例２ グリセリン５７、Ｋ２ＨＰＯ４７Ｆ、Ｋｉ（２Ｐ０４３
　ｙ、、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，５９ｐ、（Ｎｌ］４
）２ＨＰＯ４１ｆ！およびイースト・ナイトロジエン・
ベースｏ、５Ｌｉ！を水１１に溶解し、その１０−を試
＃管にきり殺菌した。これにＦ　Ｐ　Ｐ　Ｑ、　１ｍＭ
および　　ｃ−ＩＰＰ８７００００ｃｐｍ　　を加えた
。

一方、十記組成のうちＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ・７Ｈ２０の量を
０．１ｙ−にした培地でアルスロバクタ〜ｓｐ・ＫＤ−
２を３０℃で４８時間前培養した。

前培養液を先の試験管に２％になる様に移し、３０℃で
７２時間往復振とう培養した。

培養後、遠心分離（３０００ｒＰｍＸｉ５分間）により
集閘し、これを０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，
８）に懸濁した。この懸濁液にクロロホルム−メタノー
ル（１：１容量）７．２．ｎｌを加えて謙しく振とうし
た後、クロロホルム層を分液し、水で１回洗浄した。菌
またはクロロホルム層に在任するカウントを液体シンチ
レーションカウンタで測定したところ、菌には２５３０
００ｃｐｍ　　：クロロホルム層には１４４０００ｃｐ
ｍのカウントかあつた。

クロロホルム層をシリカゲルＧの薄層クロマトグラフィ
に付し、ベンゼン−酢酸エチル（９７：３　ｇ景）で展
開したところ、Ｒｆ□、５７のところに放射能カウント
のピークが見られ、これは、メナキノンであることが確
認さ扛た。さらに、ＵＶ吸収からもメナキノンであるこ
きが確認さねた。

また、散剤性でないＩＰＰを用いて同様に培養を行った
菌から抽出したキノン両分をマススペクトルにより分析
した所、親イオンのピークが７１８となり、これはメナ
キノン−８（２Ｈ）の標準品と一致した。

比較例Ｉ ＰＰＰを加えない以外は実施例１と同様に培養を行った
ところ、菌には７６００ｃｐｍ、クロロホルム層には１
２７０ｃｐｒｎのカウントがあった。

同様にＴＬＣに付して展開したが、メナキノンは確認さ
れなか−っだ。

特許出願人　ダイキン工業株式会社 代　理　人　弁埠士　青白　保（外２名）手　　続　　
補　　正　　店　（自発）昭和５７年１１月　８１１ 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１７２００８号 ２、発明の名称 新規菌株およびそれを用いた イソプレメイド化合物の製法 ３、補正をする者 事１′１との関係　特許出願人 １に所　大阪府大阪市北区梅田１丁目１２番３９号新阪
急ビル 名称　（２８５）　　ダイキン工業株式会社代表者　山
　１）　稔 ４、代理！（〒５４１ ５、補正命令の日付：　（自　発） ６、補正の対象ニ ア、補正の内容 １１７Ｉ　ｔｌｌｌｌｌｌ人中箇所を補正します。

１、特ＦＩＩＩｔ’ｊ求の範囲の損”Ｉ別紙のとおり。

２、発明の詳細な説明の欄 （１）２百７行、Ｉ（ＭＫ−８）ｌをＩ（２＋１）−１
に訂１１ミ。

（２）７頁６行、１−グリセリン１をｌ’Ｄｌ−メバロ
ン酸Ｊに訂正。

（３）７真上）〜９行、］イースト・ナイトロノエン・
ベース（１１，５８、」を削除。

（４）７頁９行、［１（月日をｒ　、＋　＋１０　ｆ月
に訂正。

（５）８頁１行、１グルフース、糖蜜、−１を削除。

（６）　　８％　Ｒ〜４行、［酸ｍエキス・川・・プリ
カー、−１を削除。

以上 ０１１紙） 特許請求の範囲 （１）　　インペンテニルピロリン酸を取り込むことが
でき、アルスロバクタ−属に属する菌株。

（２）　　アルスロバクタ−ｓＰ、Ｋｌ）−２（微工研
受託番号微工研菌寄第６７２６号うである特許請求の範
囲第１項記載の菌株。

（３）　　インペンテニルピロリン酸を取り込むことが
でき、アルスロバクタ−属に属する菌株を、インペンテ
ニルピロリン酸およびファルネンルピロリン酸を含む培
地で培養し、生成した菌体よりインプレノイド化合物を
採取することを特徴とするインプレノイド化合物の製法
。

（４）菌株が、アルスロバクタ−ｓ　１．’　、　Ｋ　
Ｉ）　−２０（微工研受託番号微工研菌寄第６７２６号
）である特許請求の範囲第３項記載の製法。

（５）　　イソプレメイド化合物がメナキノン−８（２
Ｈ）である特許請求の範囲第３項記載の製法。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）イソペンテニルピロリン酸を取り込むことができ
   、アルスロバクタ−属に舅する菌株。
2. （２）アルスロバクタ−８Ｐ、ＫＤ−２（微工研受託番
   号微工研閑寄第６７２６号）である特許請求の範囲第１
   項記載の菌株。
3. （３）インペンテニルピロリン酸を取り込むことができ
   、アルスロバクタ−属に興する菌株を、イソペンテニル
   ピロリン酸およびファルネシルピロリン酸を含む培地で
   培養し、生成した菌体よりイソプレメイド化合物を採取
   することを特徴とするインプレノイド化合物の製法。
4. （４）菌株が、アルスロバクタ−ｓ　ｐ　、　Ｋ　Ｄ　
   −２（微工研受託番号微工研菌寄第６７２６号）である
   特許請求の範囲第３項記載の製法。
5. （５）イソプレノイド化合物がメナキノン−８である特
   許請求の範囲第３項記載の製法。