JPS597265A - リンパ球群中のｂ細胞及びｔ細胞の相対量の同時測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物標本中のＴ細胞及びＢ細胞の存在を同時
に測定する分析法、更に詳しくは、識別し１Ｍる粒子を
用いてＴ細胞及びＢ細胞を特定的にラベル付けし、この
粒子を顕微鏡で数えることによってＴ細胞及びＢ細胞並
びにそれらのサブ群（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）
の相対量を測定する免疫分析法に関するものである。

人を含めたを椎動物において、Ｔｌｌ胞及びＢ細胞は２
つの主要なリンパ球群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　）を
形成する。抗原を用いての刺激に対して、Ｂ細胞は、こ
の抗原に対して特異な抗体を分泌するプラズマ細胞（ｐ
ｌａｓｍａ　ｃｅｌｌｓ）に分化する。Ｔｌ１ｌｌ胞の
役割は充分に明確にされてはいないが、Ｔ細胞が遅延過
敏症（ｄｅｌａｙｅｄ　ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉ
ｔｙ）　、免疫監視（ｉｍｍｕｎｅ　５ｕｒｖｅｉｌｌ
ａｎｃｅ　）及び植皮拒絶（ｇｒａｆｔｒ６ｊｅｃｔｉ
ｏｎ　）のような細胞の免疫反応に介在することは確か
である。また、ある種のＴ細胞サブ群（ｓｕｂｐｏｐｕ
ｌａｔｉｏｎｓ）は、抗原に対するＢ細胞の反応を規制
する役割を果たす。

圧密な固体において、末梢血液中のリンパ球群は約７０
〜８０％のＴ細胞と約ｌＯ〜２０％のＢ細胞と残りはナ
ル（ｎｕｌｌ）細胞に属する細胞とからなっている。Ｔ
細胞及び８Ｍ胞の相対数の測定は、先天性伴性の無性グ
ロブリン血液（ｃｏｎｇｅｎｉ　ｔａｌ　５ｅｘ−１ｉ
ｎｋｅｄ　ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）の
ような、リンパ腫（Ｉｕｍｐｈｏｍａｓ　）　、リンノ
々球の白血病（Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ　ｌｅｕｋｅｍ
ｉａｓ　）及び種々の免疫欠乏病（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含めた広範囲
の免疫学的に介在した疾病を診断する上で臨床的に重要
である。また、この測定は、免疫力、及び全身狼癒紅斑
（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　１ｕｐｕｓ　ｅｒｔｈｅｍａｔｏ
ｓｕｓ　）のような、自己免疫疾病（ｓｕｔｏｉｍｍｕ
ｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　）においで組織のｔｉ傷の過
程を評価する上で有用である。

Ｔｌ［胞群及びＢ細胞群は更に、細胞表面膜上の特異な
抗原の存在にって区別されるサブ群に区分される。Ｔ細
胞の主要なサブ群は、体液の免疫反応に作用する、ヘル
パー（ＴＨ）及びサプレサー（Ｔｓ）細胞である。主要
なり細胞サブ群は、細胞表面上に存在し、刺激後プラズ
マ細胞によって生成されるイミューノグロプリン（Ｉｇ
）　　（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のクラスに相
当する。Ｂ細胞サブ群及びＴ細胞サブ群の相対量の測定
もまた、臨床的重要性を有している。

このように、人の血液のような生物試料中のＴ細胞とＢ
細胞とそれらのサブ群の相、対量を測定する簡便且つ正
確な方法を提供することは有用であり、切望されている
。

従来、人のＢｉ！ｌｉｔ胞は膜に結合したイミューノグ
ロプリンの存在に基づいて同定されていた。典型的には
、ラベル付けしたアンチ−（ヒューマンイミューノグロ
プリン）抗体（ａｎｔｉ−（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏ
ｇｌｏｂｕｌｉｎ）　ａｎｔｉｂｏｄｙ）がＢ細胞群を
分離若しくは同定するために用いられている。ポリアク
リルアミドのビーズ（ｂｅａｄｓ　）に結合（ｃｏｕｐ
ｌｅ）　Ｌ／たポリクロナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａ＋）
アンチ−（ヒユーマン　イミューノグロプリン）抗体の
使用がジャブス（Ｊａｂｓ）等の“アイデンティファイ
ンダ　ヒユーマン　リンパサイト　サブボピュレーショ
ンズ（Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｙｍｐ
ｈｏｃｙｔｅ　５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　）　　
”、ラブ、マナグ、　　（Ｌａｂ、　Ｍａｎａｇ、　）
、（１９８０年１月）において議論されている。上記ビ
ーズはカリフォルニア州すソチモンドのバイオ−ラッド
　ラボラトリーズから入手できる。酵素のラベル付けし
たやぎのアンチ−（ヒューマンイミューノグロプリン）
抗体は、ミズーリ州セントルイスのシグマ　ケミカル　
カンパニーのテクニカル　ブリトラン（Ｔｅｃｈｎｉｃ
ａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）　Ｎａ　９５に記載されてい
る。

Ｔ細胞は、自発的にひつじの赤血球と結合して通常の光
顕微鏡（ｌｉｇｈｔ　ｍ１ｃｒｏｓｃｏｐｅ）で目視で
きるロゼツトを形成する能力によって都合良く同定され
ている。この技術の記載は、ハドソン（Ｍｕｄｓｏｎ）
等の“プラクティカル　イミューノロジ（Ｐｒａｃｔｉ
−ｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　　”、プランケル
　サイエンティフィック　パブリケーションズ（Ｂｌａ
ｃｋｗｅｌ　ｌ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ　）　、オックスフォード、３０１〜３０２
頁（１９８０年）に見られる。

人の血液中のＢ細胞群とＴ細胞群の分析のために、市販
の装置が現在用い得る。そのような装置の一つは、テキ
サス州オースチンのカレスタドラボラトリーズ　インコ
ーポレーティドから入手でき、それは、Ｂ細胞検出用と
してラベル付けしたアンチ−（ヒユーマン　イミューノ
グロプリン）抗体を、及び分離工程においてＴ細胞同定
用としてひつじの赤血球を用いている。別の装置は、カ
リフォルニア州　ラジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）のハイ
ブリチク　インコーポレーティドによって製造された”
　ＴＡＢ　　セル　リージエント　セ’７）（ＴＡＢ　
Ｃｅ１ｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ　５ｅｔ）　”として見分け
られ、それは、螢光顕微鏡分析を用いてＴ及びＢ細胞の
計数のためにラベル付けしたアンチ−Ｔ細胞抗体〔モノ
クロナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａり　）とラベル付けした
アンチ−Ｂ細胞抗体〔モノクロナル〕とを結合している
。

本発明は、血液又は骨髄に通常由来するリンパ球群中の
Ｂ細胞及びＴ細胞並びにそれらのサブ群の相対量の同時
測定方法及びその装置を提供するものである。

本発明の装置は少なくとも２種類の視覚によって識別し
得るラベルを含む。第１番目の種類のラベルは、Ｂ細胞
に対して特異的で、且つ、不溶性担体粒子、典型的には
約０．５〜２０ミクロンのサイズ範囲内の小さな重合体
の粒子上に固定される結合プロティンから通常なってい
る。第２番目の種類のラベルは、Ｔ細胞に対して特異的
で、且つ通常、必ずしもそうである必要はないが、第１
番目の種類のラベルのものと同様の粒子上に固定される
結合プロティンから通常なっている。上記結合プロティ
ンの固定化前又は固定化後、上記２種のラベルの少なく
とも一つは、顕微鏡で視覚的に識別し得るようにマーク
が付けられる。典型的には、これは、結合プロティンの
付着前又は付着後、−・方又は両方の種類のラベルの担
体粒子を染色することによって達成される。

本発明の方法は、Ｂ細胞とＴ細胞とを識別するごとに限
定されるものではなく、種々のＢ細胞サブ群及びＴ細胞
サブ群を識別することにも通用できる。一般に、本発明
の方法は、細胞表面膜上の特異な抗原の場所（ａｎｔｊ
ｇｅｎｉｃ　５ｉｔｅ）の存在によって特徴づけられ、
且つ特異な結合プロティンが存在し又は得られるサブ群
を識別するために適用することができる。これらの視覚
的に識別し得るラベルは、上述した方法で製造できる。

本発明の方法を実施する際においては、先ず、リンパ球
群を単離する必要がある。血液のリンパ球の場合には、
これは通常、密度勾配遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ　ｇｒ
ａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　）によ
って達成できる。単離後、リンパ球群は、Ｂ細胞ラベル
及びＴ細胞ラベル（適当なサブ群に対して特異なラベル
を含む）両方に、Ｂ細胞及びＴ細胞の全部と共にロゼツ
トを形成するのに十分な時間同時にさらされる。ロゼツ
トは顕微鏡で視覚的に識別でき、Ｂ細胞ロゼツトとＴ細
胞ロゼツトの総数が試料中のＢｍ胞とＴ細胞の相対数を
直接示している。

リンパ球の調製試料の混入物であるマクロファージ（Ｍ
ａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　）は、本発明の装置の一部であ
る重合体のビーズを摂取する能力によって同定できる。

本発明を、Ｂ細胞とＴ細胞の相対量が測定される好例に
ついて以下に詳細に説明する。この場合においては、Ｂ
１１胞及びＴ細胞それぞれに対し特異な２種のラベルの
みが要求される。本発明は、Ｂ細胞サブ群又はＴ細胞サ
ブ群の１種以上がその特定のサブ群の細胞に対して特異
なラベルを与えることによって同時に測定される方法を
包含することを理解すべきである。

林料 １、粒子状担体 粒子状担体は種々の材料から構成でき、単一材料である
必要はない。この材料は、結合プロティンや染料とカッ
プリング（ｃｏａｐｌ　ｉｎｇ）できるものでなければ
ならない。また、この材料は、本発明の方法において有
用である、０．５〜２０ミクロンのサイズ範囲内の小さ
な粒子を形成できるものでなければならない。

上記材料は、種々の重合体材料、例えば、ポリエチレン
、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニト
リル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート及びそれ
らの共重合体のようなポリビニル化合物、ポリスチレン
、ナイロン、ポリテレフタレート、セルロース等を含む
群から選択される。上記群は、天然産出重合体；特に変
性した天然産出重合体、及び合成付加及び縮合重合体を
含む。又、架橋デキストラン粒子、及び結合プロティン
や染料と結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）できる種々のガ
ラスのような無機材料も有用である。

特に、加水分解した形態で０．５〜２０ミクロン、通常
約５〜１５ミクロ゛ンの粒子サイズを有する加水分解し
た架橋ポリアクリルアミド粒子が好ましい。粒子のサイ
ズは、一般にリンパ球のサイズ、即ち約７〜１０ミクロ
ン、好ましくは８〜９ミクロンにその９０％を集中させ
た粒子サイズ分布を有するサイズに相当することが望ま
しい。好適なビーズは、Ｐ−６マイクロビーズ（Ｍｉｃ
ｒｏａｂｅａｄｓ）（登録商標）として表示されたもの
で、これはカリフォルニア州すッチモンドのバイオ−ラ
ンド　ラボラトリーズから入手できる。このＰ−６マイ
クロビーズは、使用前に、上記の望ましい粒子サイズ分
布となるようにサイズの選別をすべきである。

結合プ鬼コテイン固定化は種々の公知技術により達成で
きる。特定の結合プロティンの他に材料にもよるが、物
理的吸収又は吸着が使用できる。しかし、好ましくは、
結合プロティンは粒子に共有結合する。例えば、粒子表
面上のカルボキシル基は、結合プロティン上の有効なア
ミノ基と反応せしめることができる。これは、染料が同
様にアミノ基を介してビーズに結合されている場合に、
特に有用であり、本発明において好ましい技術である。

アミド、アミジン又はアミノ結合を形成するために、活
性化カルボン酸、カルボジイミド、イミドエステル、活
性ハロゲン化アルキルなどを用いてプロティンと他の分
子を表面に結合することに関して広範囲の文献がある。

好適なＰ−６マイクロビーズば、２Ｎ−水酸化ナトリウ
ム中で加水分解することによって活性化できる。ビーズ
を染色する場合には、少なくとも５ｍｅｑ　　（ミリ当
量）７ｇｍの結合能力（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｐａｃｉ
ｔｙ）まで加水分解すべきであり、典型的には室温で３
日間必要とされる。ビーズを染色しない場合には、３　
ｍｅｑ／ｇｍの結合能力で十分であり、室温で１８〜２
４時間加水分解すればよい。加水分解した！−６マイク
ロビーズはそれから、以下に詳述する如く、結合プロテ
ィン及び染料と共に培養する前にカンプリング緩衝液（
ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　）に対して平衡させ
る。

２．８細胞ラベルの調製 本発明は、Ｂ細胞結合プロティン（即ち、Ｂ細胞に対し
特異的に結合し得るプロティン）を、固相の粒子、典型
的には上述したような不溶性のビーズからなる粒子に固
定することを必要とする。

Ｂ細胞結合プロティンは通常、モノクロナルか又はポリ
クロナルのアンチ−（ヒユーマン　イミューノグロプリ
ン）抗体である。ポリクロナル　アンチ−（ヒユーマン
　イミューノグロプリン）抗体は、ニューヨーク州　ウ
ェストバリーのアキュリト　ケミカル　アンド　サイエ
ンティフィンクコ−ポレーション〔デンマークのクコに
よって製造されたうさぎのアンチ−（ヒユーマン　イミ
ューノグ１コブリン）抗血清〕、及びインディアナ州の
エルクハートのマイルズ　ラボラトリーズを含む多くの
所から入手できる。更に特定のＢ細胞サブ群間を識別す
ることを望む場合には、勿論、Ｂ細胞の表面膜上に存在
するイミューノグロプリンの特定の種類に対し特異な抗
体、即ち、ＩｇＧ　、ＩｇＭ　、ＩｇＡ　、、ｒｇＤ及
びＩｇＥを用いることが必要である。

上述の活性化したＰ−６マイクロビーズを用いて、抗体
を次のようにして共有結合させることができる。うさぎ
のアンチ−（ヒユーマン　イミューノグロプリン）抗血
清のイミューノグロプリンフラクションを、カップリン
グ緩衝液（例えば、ｐ１１６．３の０．００３Ｍ−リン
酸ナトリウム）に対して一夜冷却して透析し、予め測定
しておいた量のイミューノグロプリンを活性化したビー
ズに加え、ｐＨを６．２〜６．４の範囲内に調整する。

室温で３０分間放置後、ＥＤＡＣ（１−エチル−３（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＭＣＩ〕
を加え、約５〜１５時間冷却してカップリング反応させ
る。反応したイミューノグロプリンの量は重要ではない
が、十分なアンデーＴｇ抗体がＢ細胞に結合する能力を
確保するためにビーズに結合していることが必要である
。上記の方法においては、イミューノグロプリン濃度は
イミューノグロプリン８〜４８ｍｇ／ビーズ１ｇであり
、適当な濃度であることが確認されている。

３、Ｔ細胞ラベルの調製 好ましいＴ細胞結合プロティン（即ぢ、Ｔ細胞に対して
特異的に結合し得るプロティン）は、ミュアライン　ハ
イブリドマ　セル　ライン（Ｍｕｒｉｎｅ　Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅ）　、ＡＴ　ＣＣｎｏ、
　ＣＲＬ−８０２３から得られるＴ１０１ような、モノ
クロナル　アンチ−（Ｔ細胞）抗体である。新たに単離
したハイブリドマ培養菌は試験管内で培養でき、モノク
ロナル抗体が上澄み液から回収できる。

また、多量の、ハイブリドマ由来の抗体は、腫瘍環のハ
イブリドマ　ライン（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｉｃ　ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ　１ｉｎｅ）を組織適合性（又は無免疫性
）のねずみに注入することによって製造できる。この方
法は公知であり、ハドソン（ＨｕｄＳｏｎ）等のイド（
Ｉｄ）３２０〜３２１頁に記載されている。

ねずみから得られる腹水（ａｓｃｉｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ
　）はしばしば１０ｍｇ／ｍｌまでの抗体を含有してい
るばかりでなく、他のプロティン類も含有している。

抗体は、プロティン　Ａ−セファローズ　ＣＬ４Ｂ（登
録商標、ニューシャーシー州ビス力タウェイのファーマ
シア　ファイン　ケミカルズ製）のような固定化したプ
ロティンＡ上に親和性クロマトグラフィーによって精製
することができる。腹水の硫酸アンモニウムのフラクシ
ョンを緩衝液（ρＩ！　８．０　）に対して透析し、カ
ラムに入れる。０．１Ｍ−ホスフェ−１・緩衝液（ｐｌ
（８，０）で洗浄後、モノクロナル抗体を０．１Ｍ−ク
エン酸ナトリウム（ｐＨ３，０）で熔離し、ホスフェー
ト緩ｉＩｊ化塩類（ＰＢＳ）に対してｐｌｌ７．２で一
夜冷却して透析する。

精製したモノクロナル抗体は、前述の如く調製した、加
水分解したＰ−６マイクロヒーズに結合（ｃｏｕｐｌｅ
）させることができる。カップリング緩衝液に対して透
析した後、精製したモノクロナル抗体を加水分解したＰ
−６マイクロビーズに、抗体５〜４０ｍｇ／マイクロビ
ーズＩｇ、好ましくは抗体１０ｍｇ／マイクロビーズ１
ｇの濃度で加え、ｐｌｌを６．２〜６．４の範囲内に調
整する。室温で３０分間放置後、この混合物にＥＤＡＣ
をその濃度が０．２〜０．５　ｍｇ／　ｇの範囲内とな
るように加える。

ｐｌｌを６．２〜６．４の範囲内に調整し、冷却して約
５〜１５時間反応を継続させる。ビーズは、典型的には
、エンド−オーバー−エンド　ロッカー（ｅｎｄ−ｏｖ
ｅｒ−ｅｎｄ　ｒｏｃｋｅｒ　）又はオーバーヘッド攪
拌装置（ｏｖｅｒｈｅａｄ　ｓｔｉｒｒｉｎｇ　ｄｅｖ
ｉｃｅ）を用いて懸濁状に保持される。

培養後、ビーズを、０，１％ボウバイン血清アルブミン
（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、　Ｂ　
Ｓ　Ａ）のＰＩ３５熔液で３回、１．４　Ｍ　−ＮａＣ
ｌ及び０．１％ＢＳへのＰＢＳ溶液で３回、及び０．１
％ＢＳＡのＰＢＳｉ９液で３回洗浄する。

４、ラベルの染色 ラベルは、顕微鏡で観察したときにＢ８Ｉ胞がＴ細胞と
視覚的に識別しＩＭる、簡便な方法でマークされなけれ
ばならない。最も簡便には、これは、Ｂ細胞ラベル及び
Ｔ細胞ラベルの一つ又は両者を染色することによって達
成でき、この染色は通電、光顕微鏡で目視できる染料を
共有結合することよって達成できる。従来においては、
本発明で用いられる重合体の粒子のような小さな粒子は
染色されていようといまいと何れにせよ、光顕微鏡で識
別することは困難であった。以下に述べる特別な方法は
、この問題を解決するものである。

好ましい実施態様においては、Ｂ細胞ラベルは、粒子が
アンチ−（ヒユーマン　イミｊ４−ノグロプリン）抗血
清に結合した後に染色する。Ｔ細胞ラベルを染色する場
合も同様にして行われる。更に、充分な活性化した場所
が結合プロティンを結合するだめの粒子上に残存してい
る限りは、結合プロティンを結合する前にラベルの粒子
を染色することができる。結合プロティンの結合後にラ
ベルを染色する場合、結合プロティンの不活性化を防止
するために染料の濃度を限定することが望ましい。

Ｂ細胞とＴ細胞のみを識別する場合（それらのサブ群は
識別しない）、２つの異なった色の間より染色と無染色
との間を識別するほうが容易であるので、２つのラベル
のうち一つのみを染色することが好ましい。

しかし、更に、それらのサブ群を分析する場合には、各
々の特定ラベルが識別できるように−・以上のラベルを
し染色する必要がある。

粒子は、ビーズを遠心分離し、上澄み液をデカントし、
０．２重量％ビスマルク　ブラウンＹ　（Ｂｉｓｍａｒ
ｋ’Ｂｒｏｗｎ　Ｙ　）　　（参照：ウエルサー、“オ
ルガニック　アナライティカル　リージエント（Ｏｒｇ
ａｎｉｃ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　
）　　”、パン　ノースランド　カンパニー、ニューヨ
ーク、１９４８年１のカップリング緩衝液中に、染料約
８容量に列しビーズｌ容量の濃度でビーズを再懸濁する
ことにより、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の次の結合（
ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　）を直接染色できる。３０分
後、ＥＤＡＣ（２５０ｍｇ／ビーズＩｇ）を加え、冷却
して５〜１５時間反応させる。それからビーズを０．１
％ＢＳＡのＰＢＳ溶液、及び１．４　Ｍ　−ＮａＣ１及
び１％ＢＳＡのＰＢＳ熔液で前記の如く洗浄する。

加水分解したビーズに染料を結合（ｃｕｏｐｌｅ）させ
るためにＥＤＡＣを用いる」二記の方法は、Ｍ　Ａｌｌ
アミノ基を有する染料に対して適用できる。染料１は、
ビーズ内部の加水分解した基と反応し、結合プロティン
に対しては無効であるように、分子量が５０００以下、
通常１０００以下であることが好−ましい。

好ましい実施態様では、可視光顕微鏡で識別できるよう
に染色されたラベルを用いるが、本発明は、螢光顕微鏡
で視覚的に識別できる螢光性染料やビーズの表面で又は
その付近で色原体を生成する酵素系などを用いることも
できる。

５、試薬の開裂 試料中のＢ細胞及びＴ細胞と反応するのに有効である、
充分なラベルを確保するために、ラベル／１１？胞の割
合が過剰に、典型的にはＢ細胞及びＴ細胞１個ごとにラ
ベル約５０〜１００個の範囲内に保持されていることが
必要である。試料に添加される試薬溶液中のマーカーの
絶対濃度は、勿論、試料のサイズや試料中のＢ細胞及び
Ｔ細胞の濃度に依存する。

１抜 １、リンパ球群の単離 本発明の方法は、を椎動物から単離したリンパ球群に実
施することができる。例えば、肺臓、リンパ節、量、ま
たは脚線のような種々の器官から、これらの器官を、細
胞が組織培養基に押し出されるようにかん子で別々にけ
ば立てることにより、或いは器官を微細なワイヤーメジ
シュ又は茶こし器ごしに細いかん子でけば立てることに
より開裂することができる。

上記懸濁液を調製する特殊な方法は、ハドソン等のＩｄ
、１９頁に議論されている。主文に開示された、特定の
Ｂ細胞結合プロティン及びＴ細胞結合プロティンは、勿
論、人のリンパ球群に対して特異的であり、他の結合プ
ロティンは人以外の種のために必要とされるであろう。

通常、本発明の方法は、血液試料からｆｉることのでき
る人の血液のリンパ球群に用いられる。その場合、分析
前に血液から赤血球を分離又は除去することが必要であ
る。多種多様の方法が上記の分離を達成するのに利用で
きる。迅速で且つ高純度のリンパ球の調製をもたらす密
度勾配の分画遠心法（ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｃｅ
ｎｔｒＨｕｇａｔｉｏｎ　）が好ましい。

密度勾配遠心分離の方法は次の通りである。

適当に希釈した血液（３〜５ｍ１）を、赤血球及びグラ
ニュロサイＩ−（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）がペレッ
トを形成するように公式化した密度勾配に重層する。

好適な密度勾配の調製は、フィコルーバキュ（登録商標
、ニューシャーシー州ビス力タウエイのファーマシア　
ファイン　ケミカルズ製）及びヒスドパキュー１０７７
　（登録商標、ミズーリ州セントルイスのシグマ　ケミ
カル　カンパニー製）を含む。それから、試料を１８〜
２０°Ｃで２０分間４００Ｇで遠心分離する。マクロフ
ァージが混入したリンパ球がプラズマ／密度勾配の界面
に現れる。それから、リンパ球を、調整塩溶液（ｂａｌ
ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）で１〜３回
洗浄し、１８〜２０℃で５〜１０分間１００−１５０Ｇ
で遠心分！ｉｓ＋ｔによってペレット化する。分離した
細胞は、リンパ球（Ｂ　ＩＩ胞、Ｔ細胞及びナル細胞）
やマクロファージを含有しており、それらのすべては光
顕微鏡で識別することができない。

密度勾配遠心分離の別の方法としては、先ず完全な血液
中の赤血球を分離し、分離した赤血球を洗い流すことに
よって血液試料から赤血球を除去することができる。こ
の方法は機能的であるが、リンパ球はグラニュロサイト
（白血球の別のタイプ）で汚染されている。多くのグラ
ニュロサイトは食細胞であり、Ｔ−Ｂ細胞の割合を著し
く変えないが、それらの存在は、上記割合の統計的に信
頼しうる測定を提供するために充分な数のリンパ球を計
数する期間を長く必要とするリンパ球の絶対濃度を減少
させる。

２、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びマクロファージの同定単離後、
リンパ球群を、濃度（ラベル／細胞）が１０：１以上、
好ましくは少なくとも５０：１以上で上限がｓｏｏ：ｔ
の濃度でＢ細胞ラベル及びＴ細胞ラベルとともに培養す
る。ラベルは、Ｔ細胞のまわりにひつじの赤血球によっ
て形成されたロゼツトと同様な方法で、同族の細胞（ラ
ベルの特異性に基づく、Ｂ又はＴ又はそれらの特定のサ
ブ群）の周囲に結合することによってロゼノ１−を形成
するであろう。ロゼツトを形成するラベルは、それから
、染色した結果暗色となったことにより識別されるＢ細
胞のロゼツトとともに、可視光顕微鏡で計数することが
できる。全細胞群に対するＢ細胞とＴ細胞の割合を測定
するため、少なくとも１００、好ましくは、２００の数
のロゼツトを計数する。

培養は、少なくとも５分間、好ましくは３０分間若しく
はそれ以上の期間室温で行う。長期の培養は、マクロフ
ァージにＢ細胞ラベル及びＴ細胞ラベル両方の摂取を行
わせしめる。マクロファージの摂取は、顕微鏡で明確に
目視でき、摂取が行われない場合には識別することので
きない残存リンパ球群（ナル細胞）とマクロファージと
を識別することができる。

犬詣週 Ｂ細胞及びＴＩＩ［ｌ胞のマーカーを、前述したように
、Ｐ−６マイクロビーズ、Ｔｌ０Ｉモノクロナル　アン
デー（Ｔ細胞）抗体及びポリクロナルアンチ−（ヒユー
マン　イミューノグロプリン）抗体（ダコ製）を用いて
調製した。

正常人の血液の試料（４ｍｌ）をＰＢＳで希釈しく１　
：　１）　、フィ、コルーパキヱ（３ｍｌ）に重層し、
２０分間、４００Ｇで遠心分離した。白血球の層を除去
し、０．１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で１回洗浄し、リンパ
球からサイトフィリンク（ｃｙｔｏｐｈｉｌｉｃ）　Ｉ
ｇを放出させるために３７℃で３０分間培養した。ＰＢ
Ｓで２回洗浄後、細胞濃度を約１０７細胞／ｍｌに調整
した。細胞（１００μｌ）及びラベル（両者のラベルそ
れぞれほぼ同じ濃度で２００μｌｌ）を試験管に入れ、
室温で３０分間培養した。３分間遠心分離した後、細胞
をＰＢＳ中に再懸濁し、０．０３％ｌ−リパンブルーの
ＰＢＳ熔液１００μｌを加え、懸濁液の一滴を顕微鏡の
スライド上に置いた。ロゼツト（２００（１Ｂ＞を無作
為に計数し、Ｂ細胞ロゼツトとＴ細胞ロゼツトの数を記
録した。生育しうる細胞（即ち、トリバンプルー染料を
排除したもの）のみを計数した。その結果は、Ｔ細胞７
５．８％、Ｂ細胞１３．３％及びナル細胞７．７％であ
った。これらの結果は、予想された範囲内のものであっ
た。また、細胞内のビーズを伴ったマクロファージも明
確に同定できた。

慢性リンパ系白血病であると診断された患者からの血液
を同様にして分析した。その結果は、Ｔ細胞２１％、Ｂ
細胞７１％及びナル細胞８％であった。

本発明を実施する上で考えられる最良の方法をここに記
載したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、
本発明の範囲内に入る様々の変更がなされうろことは勿
論である。

特許出願人 バイオ−ラッド　ラボラｌ−リーズ インコーボレイテノド 代理人　弁理士 羽　　　鳥　　　　　　　　修

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１を推動物のリンパ球群中のＢ細胞及びＴ細胞の相
   対量を同時に測定する方法であって、Ｂ細胞結合プロテ
   ィンに結合された、水性溶液に不溶性の粒子からなり顕
   微鏡で識別されるＢ細胞ラベル、及びＴ細胞結合プロテ
   ィンに結合された、水性溶液に不溶性の粒子からなり顕
   微鏡で識別されるＴ細胞ラベルを用い、上記リンパ球群
   を上記Ｂ細胞ラベル及び上記Ｔ細胞ラベルと共に、上記
   Ｂ細胞及び上記Ｔ細胞の全てに対して対応するラベルで
   ロゼツトを特異的に形成するのに充分な時間同時に培養
   し、Ｂ細胞ロゼツト及びＴ細胞ロゼツトの数を顕微鏡で
   計数することを特徴とするリンパ球群中のＢ細胞及びＴ
   細胞の相対量の同時測定方法。 （２）リンパ球群が密度勾配遠心分離により血液から単
   離される特許請求の範囲第＋１１項記載のリンパ球群中
   のＢ細胞及びＴ細胞の相対量の同時測定方法。 （３）リンパ球群が、赤血球を分離し、この分離した赤
   血球を除去することにより血液から単離される特許請求
   の範囲第（１）項記載のリンパ球群中のＢ細胞及びＴ細
   胞の相対量の同時測定方法。 （４）リンパ球群が骨髄から単離される特許請求の範囲
   第（１）項記載のリンパ球群中のＢ１１胞及びＴ細胞の
   相対量の同時測定方法。 （５）不溶性粒子が約０．５〜２０ミクロンのサイズ範
   囲内の重合体の粒子である特許請求の範囲第（１）項記
   載のリンパ球群中のＢ細胞及びＴ細胞の相対量の同時測
   定方法。 （６）Ｂ細胞ラベルが重合体の粒子に共有結合したアン
   チ−（ヒユーマン　イミューノグロプリン）抗体からな
   る特許請求の範囲第（５）項記載のリンパ球群中のＢ細
   胞及びＴ細胞の相対量の同時測定方法。 （７）Ｔ細胞ラベルが重合体の粒子に共有結合したモノ
   クし１ナル　アンチ−（１゛細１！！り抗体からなる特
   許請求の範囲第（５）項又は第（６）項記載のリンパ球
   ＢＹ中の１３１ｔｌ胞及び′Ｆ細胞の相対量の同時測定
   方法。 （８）Ｔ細胞ラベルがミュアライン　ハイブリドマセル
   　ライン、ＡＴＣＣｎｏ、　ＣＲ１，、−８０２３に由
   来するＴｌ０Ｉモノクロナル抗体からなる特許請求の範
   囲第（５）項又は第（６）項記載のリンパ球群中のＢ細
   胞及びＴ細胞の相対量の同時測定方法。 （９）重合体の粒子がポリアクリルアミドである特許請
   求の範囲第（５）項記載のリンパ球群中のＢ細胞及び１
   ゛細胞の相対量の同時測定方法。 （１０）ビーズを摂取した細胞の数を監視することによ
   りマクロファージの数を計数する工程を特徴とする特許
   請求の範囲第（１１項記載のリンパ球群中のＢ細胞及び
   Ｔ細胞の相対量の同時測定方法。 （１１）　Ｂ８１１１胞ラヘル及びＴ細胞ラベルのうち
   の少なくとも１つを染色した結果としてＢ細胞ラベルと
   ゛■゛細胞ラベルが可視光顕微鏡で識別できる特許請求
   の範囲第（１１項記載のリンパ球群中のＢ細胞及び１゛
   細胞の相対量の同時測定方法。 （１２）染料が染色ラヘルに共有的にカップルされる特
   許請求の範囲第（１１）項記載のリンパ球群中のＢ細胞
   及びＴ８（１１胞の相り・１量の同時測定方法。 （１３）　Ｂ細胞ラベルがＢ細胞の異なるサブ群に対し
   て特異な、視覚により識別できる種類を少なくとも２つ
   包含しており、上記サブ群のそれぞれに関連したりゼソ
   １−の数を計数することを特徴とする特許請求の範囲第
   （１１項記載のリンパ球群中のＢ細胞及びＴ細胞の相対
   量の同時測定方法。 （１４）　Ｂ細胞サブ群がＩｇＧ　、　ＩｇＭ　、Ｉｇ
   ＾、ＩｇＤ及びＩｇＥを表面に示すＢ細胞から選択され
   る特許請求の範囲第（１３）項記載のリンパ球群中のＢ
   細胞及びＴ細胞の相対量の同時測定方法。 （１５）　Ｔ細胞ラベルがＴ細胞の異なるサブ群に対し
   て特異な、視覚により識別できる種類を少なくとも２つ
   包含しており、上記サブ群のそれぞれに関連したロゼツ
   トの数を計数することを特徴とする特許請求の範囲第（
   １）項記載のリンパ球群中のＢ細胞及び’１１胞の相対
   量の同時測定方法。 （１６）　Ｔ細胞サブ群がＴＨＩＩＩ胞及びＴｓ細胞か
   ら選択される特許請求の範囲第（１５）項記載のリンパ
   球群中のＢ細胞及びＴ細胞の相対量の同時測定方法・ （１７）染料が染料のアミノ基を介して染色ラベルにカ
   ップルされるビスマルク　ブラウンＹである特許請求の
   範囲第（１２）項記載のリンパ球群中のＢ細胞及びＴ細
   胞の相対量の同時測定方法。