JPS597695B2 - 免疫制御作用を有するペプタイド製剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫制御作用を有するペプタイドを主成分とす
る免疫制御剤に関するものである。

血清中における免疫抑制作用物の存在の発見は１９５９
年、Ｂ．Ｂ．カムリン（ Ｂ ， Ｂ ， Ｋａｍｒｉ
ｎ ）によってなされたＣＢ．Ｂ．カムリン：プロシー
デイングス オブ ザ ソサイエテイ フォア エキス
ペリメンタル バイオロジイ アンド メデイシ７（
Ｐｒｏｃ ， ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃ ， ｆｏｒ Ｅ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ ＆Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ ）第１００巻、第５８ページ、１９５９）。

この報文には、その有効成分がα２−グロプリンの豊富
なコーン画分に含まれること、ヒト血清の有効因子はラ
ットに対しても有効であり、種の区別を越えて作用する
ことが報告されている。

その後、このものは１９７３年にオクチノ（Ｏ ｃｃｈ
ｉｎｏ ）らによってヒトの血清のコーンＥＶ−１から
単離され、グロプリン類との非共有結合が酸によって解
かれた分子量約５０００のべプタイドであることが判明
した〔ザ ジャーナル オブインムノロジイ（ Ｔｈｅ
Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆＩ ｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ
）第１１０巻第３号、１９７３年〕。

そのペプタイドはＩ Ｒ Ａ （ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇ
ｕｌｏｔｏｒｙα−ｇｌｏｂｕｌｉｎ）とボストン大学
のクーパーバンド（ Ｃｏｏｐｅｒｂａｎｄ ）らによ
って呼ばれている。

本明細書においてもこのペプタイドをＩＲＡと略称する
。

オクチノらの用いた方法は、コーンの■画分中に含まれ
るＩＲＡの４５％の活性量を含むコーンのｒｖ−ｉ画分
を出発原料とし、４０％の硫安飽和において沈殿する画
分中のＩＲＡをＤＥＡＥ−セルロースのような強塩基性
陰イオンセルロースニ吸着させ、イオン強度０．３の酢
酸ナトリウム水溶液で溶出、次いで溶出液を酸性におい
て透析し、透析液にＩＲＡを集めるという方法である。

この方法によると、ＩＲＡの精製度はよいが、取得率は
低く、画分■からの回収率は０．４％にしか過ぎない。

本発明の目的は、工業的に回収率よくヒトの血液からＩ
ＲＡ製剤を提供するにある。

また他の目的はＩＲＡ注射薬の提供にある。

上記の目的は、ヒトの血液又はそのα２−グロプリン含
有画分の水溶液をｐＨ５．０以下において酸で処理し、
処理溶液を限外濾過することによって、分子量１３００
０より小さなペプチド類を濾液中に集め、濾液に含まれ
る不純物を陽イオン交換体に吸着させて除去し、次いで
濾液中のＩＲＡを無機吸着体に吸着させ、これを溶出し
て、注射することのできるＩＲＡの本発明製剤が得られ
る。

本発明に用いられる原料のヒトの血液とは単に通常の血
液のみならず、溶血した血液、例えば胎盤血をも含むも
のである。

血液はそのまま用いることもできるが、好まし《は、α
２−グロプリンを含む画分をあらかじめ採取して、これ
を用いる。

このようにして、上記血液のα２−グロプリンを濃縮含
有する血漿画分であって、しかもアルブミンなどの価値
のある血清成分を採取する際に通常、廃棄されるコーン
の■画分、更に好まし《はコーンの■−１画分は、本発
明の原料として好適である。

血液そのものを用いる場合は、これを希釈して用いるの
が好ましい。

例えば、胎盤血を水又は食塩水で抽出して得られる血液
抽出物はそのまま本発明に用いることができる。

原料となる血液又はα２−グロプリン含有両分の水溶液
は、ｐＨ５．０以下において酸で処理される。

用いられる酸は、塩酸、リン酸、硫酸などの鉱酸又は酢
酸、ギ酸などの有機酸であって、原料水溶液を、これら
の酸又は緩衝剤の添加によってｐＨ５．０以下、好まし
くはｐＨ１．５〜５．０、更に好ましくは、２．０〜３
．５に保つ。

処理温度は室温で十分であり、処理時間は３０分ないし
２４時間である。

上記の処理によって、原料水溶液中のＩＲＡはグロプリ
ンとの非共有結合が断たれ遊離の状態となる。

遊離したＩＲＡを分離するために分子量が１３０００よ
り小さい両分を限外濾過によって、選択的に濾過して取
り出す。

このための好ましい方法は、適当な中空（ホロー）ファ
イバーを用いることであり、これによって操作は迅速、
かつ効果的となる。

すなわち、米国、アミコン社製ダイアファイバーＪＤｉ
ａｆｉｂｅｒ ） （分子量、１００００より小のもの
の濾過用）、旭化成社製ウルトラフィルトレーション■
（分子量１３０００より小のものの濾過用）などで作ら
れたホローファイバーが用いられる。

この限外濾過によって原料中のタンパク質が除去される
。

濾液として得られたタンパク質を除いた溶液を陽イオン
交換体、例えばＣＭ−セルロース（カルボキシメチルセ
ルロース、生化学工業株式会社販売）、ＣＭ−セファテ
ツクス（カルボキシメチル交サ結合デキストリン、生化
学工業株式会社販売）、及びＰ−セルロース（ホスホセ
ルロース、生化学工業株式会社販売）のような酸性基含
有多糖質イオン交換体と接触させ、含まれる抗原性の高
い夾雑物質を吸着させて除去する。

この工程で血圧降下性物質も除去され、以後の新たな生
成も最小となる。

この工程の処理条件としては、ｐＨ２〜７、好ましくは
ｐＨ４〜５．５、塩濃度０．１〜０．５Ｍの緩衝液で平
衡させたイオン交換体を用いることが好ましい。

この夾雑物を除いたＩＲＡ溶液を無機吸着体と接触させ
るとＩＲＡは吸着体に吸着される。

無機吸着体によるＩＲＡの収得は発明者らが全《新規に
見いだしたものであり、オクチノらの陰イオン交換体の
使用に比して極めて安価であり、更に効果的であって、
処理が簡単であり、工業的製法として極めて有効な方法
である。

用いられる無機吸着体としては、シリカゲル、ベントナ
イト酸性白土及び活性炭などが挙げられ、このうち、無
機吸着体の使用量は限定的ではないが、通常ＩＲＡ溶液
１００容量当り、１〜５容量の割合に用いられる。

その時、溶液のｐＨを５．５〜９．０に，好まし《はｐ
Ｈ７．０〜８．０に調整することによって良結果が得ら
れる。

ＩＲＡ溶液と吸着体との混合物を室温で、３０分間かき
まぜることによって、ＩＲＡの約７５〜９５％は剤着体
に吸着される。

夾雑物は水溶液に残り、ＩＲＡは、それを吸着した無機
吸着体から溶出させることによって回収する。

この無機吸着体からのＩＲＡの溶出は、酸性で行う。

溶出液の好ましいｐＨは２〜４であり、その調節には、
塩酸、リン酸、硫酸及びギ酸、酢酸などの無機又は有機
酸が用いられる。

溶出されたＩＲＡ溶液を、要すれば中和した後、通常の
方法に従って減圧乾燥するか、又は凍結乾燥して、粉末
状のＩＲＡを得る。

本発明の場合、コーンの画分■からの回収率は約１．２
％である。

またその精製は、約１日間で行うことができ、従来の３
〜４日間の工程に比して、極めて効率的である。

この得られたＩＲＡの活性は、約１００〜１０００γ（
窒素として）で、ＰＨＡ法Ｃクーパーバ／ドＳ，Ｒ ．
（ Ｃ ｏｏｐｅｒｂａｎｄ， Ｓ ． Ｒ ， ）
ら（ザ ジャーナルオプ インムノロジイ、第１０９巻
第１号、第１５４ページ、１９７２年）〕によって７０
〜１００％の免疫抑制作用を示す。

この結果は、従来提供されているＩＲＡと同程度の活性
を示すものである。

このＩＲＡの性状は５６℃、３０分間の熱処理に対して
安定であり、セルロースアセテート膜電気泳動ではβ−
グロプリン領域にバンドが認められる。

本物質は、セファデックスゲル濾過法による分子量が約
５０００のペプチドである．このようにして製造された
ＩＲＡは原料が血漿胎盤血などの人体由来のものを出発
物質としているので、抗原性の心配な《、極めて安全な
医薬ということができる。

また補体の存在下で、ヒトのリンパ細胞に対して細胞毒
性をほとんど、あるいは全く示さず、またＥ．ロゼット
試験〔メンゾイアンら（ Ｍｅｎｚｏｉａｎ ｅｔ ａ
ｌ ）ザ ジャーナル オブ インムノロジイ第１１３
巻第２６６ページ（１９７４））では免疫細胞の凝集を
阻止する。

更に純度のよいＩＲＡを望む場合は、無機吸着体からの
溶出液を有機溶媒、例えばクロロホルムなどの塩素化炭
化水素、ジエチルエーテルなどのエーテル類によってＩ
ＲＡを抽出、精製することができる。

この方法によって純度は著し，く向上する。

この抽出処理は、無機吸着体からＩＲＡを溶出させる工
程と組み合せることもできる。

すなわち、溶出を上記有機溶媒と溶出液とを混合して行
うことができる。

このような操作においては、水と混合する溶媒、例えば
アセトンやアルコールを混合すべき溶媒として用いるこ
ともできる。

また本発明のＩＲＡは、血圧降下性物質をほとんど含ま
ず、注射に際して安全である。

肝炎ウイルスは通常はそとんどその活性は認められない
が、原料によってはこれの混入は考えられる。

そこで、本発明によって、肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の不
活化処理を施したＩＲＡをも提供するものである。

本発明によるＩＲＡはその水溶液において前述のように
かなり熱に対して安定であるとはいえ、血漿タンパク成
分のＨＢＶ不活化処理として知られる６０℃の温度にお
いて１０時間の加熱に対してはその活性は減少する。

本発明者らはＩＲＡ水溶液が中性アミノ酸、単糖類、二
糖類又は糖アルコールなどの存在において熱に対して安
定化され、肝炎ウイルスの不活化に要する、例えば６０
℃における１０時間の加熱に対しても、その活性を著し
く失うことがないことを見いだした。

本発明において、上記の熱安定化加熱処理は製造中のい
かなる工程におけるＩＲＡ水溶液にも適用できる。

しかしながら、この処理はＩＲＡ水溶液を酸処理する前
の工程に組み入れることが好ましい。

安定剤の例は、グリシン、アラニン、パリン、ロイシン
、イソロイシンなどの中性アミノ酸（モノアミノモノカ
ルボン酸）、グルコース、マンノース、ガラクトース、
果糖などの単糖類、シヨ糖、麦芽糖、乳糖などの二糖類
、及びマンニット、ソルビット、キシリットなどの糖ア
ルコール類である。

用いられる安定剤の量は水溶液に対して５％（Ｗ／Ｖ）
以上であるが、好ましくは１５〜２０％である。

肝炎ウイルス不活化のための加熱は、常法によって行わ
れ、最も一般的な６０℃、１０時間の加熱処理において
適量の安定剤の添加によってＩＲＡの活性はなお９５％
保持されている。

ＨＢＶの不活化処理を行った水溶液中に残存する安定剤
はＩＲＡを前記の吸着剤に吸着させて分離するか、又は
透析によって除去することができる。

かくして、本発明によってＨＢＶの不活化処理が施され
血圧降下性物質の含量を最小とした注射することのでき
るヒトの血液由来のＩＲＡ製剤が提供される。

この製剤は移植性の拒絶反応を抑制することから移植手
術に際して、拒絶反応の予防、治療及び手術後の良状態
維持に有効に用いることができ、また細胞性免疫疾患の
治療にも用いられる。

このＩＲＡを医薬として治療に用いる時の最も好ましい
形態としては注射薬であり、静脈注射することが最適で
ある。

その投与量としては、１日、５〜４０■／ｋｇの投与で
十分と考えられる。

ラットの皮膚移植実験では１日、２０η／ｋｇのＩＲＡ
を静脈注射で２０日連続投与した結果、２０日目の観察
で、８５％の生着が認められた。

更に、このＩＲＡの急性毒性実験をマウスを用いて５０
０ｍ９／ｋｇ、１ ０ ０ ０■／ｋｙを投与したが、
４８時間後の観察で死亡例は認められなかった。

実施例 １ コーンのアルコール分画法で得られるＰＨＡ法で、４ｒ
ｎ９／ｍｌで７０％の阻害活性を有するコーンのＩＶ−
１画分のペース｝１ｋｇを冷蒸留水４ｌに懸濁し、４℃
で２時間かきまぜる。

遠心分離を行って不溶物を除き、得られた上清に氷酢酸
を加えてｐＨ３．５に調整し、１時間、緩やかにかきま
ぜる。

この液をホローファイバー（旭化成社製）による濾過に
かげ、分子量１３０００以下の低分子量部分を集める。

この低分子量部分にＣＭ−セルロース（生化学工業社製
）を１容量％の割今に加え、３０分間かきまぜて、活性
のない夾雑物質を吸着させ、ＩＲＡ活性部分を濾液とし
て得る。

この濾液に活性炭を４容量％の割合に加え、ｐＨを８．
０に調整して活性部分を活性炭に吸着させる。

活性分の溶出にはＩＭ酢酸を用いる。

溶出液を凍結乾燥して精製Ｉ Ｒ Ａ ６ ？を得た。

セルロースアセテート膜電気泳動では、β−グロプリン
領域にバンドが認められ、その分子量は約５０００であ
った。

実施例 ２ 実施例１と同様に操作して得られたＩＲＡを吸着した活
性炭を同容量のクロロホルムと混合し、かきまぜた後ク
ロロホルム層を分取し、これを減圧乾燥法で、クロロホ
ルムを揮散させ、精製ＩＲＡ５．ｌ’を得た。

このＩＲＡ２Ｏｒ／ｍｌはＰＨＡ法で、６０％、５ ０
０ １ ７ｍｌでほぼ１００％の阻害活性を示した。

実施例 ３ ヒトの胎盤１００個を細断し、０．１Ｍの塩化ナトリウ
ム溶液１０ｌに懸濁し、少時かきまぜる。

遠心分離を行い、澄明な抽出液約２０１を得る。

抽出液を集め、２Ｎ塩酸を用いてｐＨ２．０に調整し、
室温にて２時間、緩やかにかきまぜる。

ホローファイバー（米国アミコン社製）を用いて分子量
約１００００より小さい低分子量部分を集める。

得られた水溶液にＣＭ−セファデツクスを１容量％の割
合に加え、３０分間かきまぜ、次いで濾過してＩＲＡ水
溶液を得る。

この水溶液にシリカゲル５容量％を添加しＩＮ水酸化ナ
トリウムでｐＨ９．０に調整する。

約３０分間かきまぜた後、東洋濾紙Ａ２を用いて吸着に
用いたシリカゲルを濾し集める。

０． １ Ｍギ酸で溶出後、減圧乾燥すると精製された
ＩＲＡ９００叩を得た。

このＩＲＡ５００ｒ／ｍｌはＰＨＡ法で８５％の阻害活
性を示した。

電気泳動的、分子量的分析によってＩＲＡと確認された
。

実施例 ４ 実施例３と同様に操作して得られたＩＲＡを吸着させた
シリカゲルを、約％容量のアセトンと混合し、かきまぜ
、ＩＲＡを溶出させ、溶出液を減圧乾燥して、精製ＩＲ
Ａ７５０ｍ９を得た。

このＩＲＡは２０ｒ／Ｉ７１ｌで、ＰＨＡ法で約６５％
、５００γ／１′ＩＬｌでほぼ完全な阻害活性を示した
。

実施例 ５ 実施例１と同じ方法で得られたコーンのＩＶ−１画分ペ
ーストの水抽出液にギ酸を加えて、ｐＨ４．５に調整し
、２時間放置した。

実施例１において用いたのと同しホローファイバー（旭
化成社製）による濾過にかげ低分子量部分（分子量１３
０００以下）を集めＰ−セルロース（生化学工業社製）
を２容量％加え、更にＩＮ水酸化ナトリウムでｐＨ７．
０とした。

夾雑物を吸着したＰ−セルロースを濾別し、濾液に酸性
白土３重量％加えて、ＩＲＡを酸性白土へ吸着させた。

０．５Ｎ酢酸で溶出後更にクロロホルムで抽出した濃厚
ＩＲＡ溶液を減圧乾燥してＩＲＡ約４．７１を得た。

このものの免疫抑制作用をＰＨＡ共で測定し、５００γ
／ｍｌで８５％の阻害活性を示した。

電気泳動的，分子量的分析によってＩＲＡと確認された
。

実施例 ６ ヒトの胎盤８００個を用い、これを細かく粉砕し、０．
１Ｍの塩化ナ１・リウム溶液１００ｌを加え、小時かき
まぜる。

抽出された胎盤血を遠心分離にかげ澄明な抽出液２００
ｌを得た。

この胎盤抽出液から硫安５０％飽和によって沈殿する全
タンパクを得た。

この沈殿１ｋｇ当り、４〜６ｌの蒸留水を加えて溶解し
、この溶解液に少量の塩酸を加えて、ｐＨ５．０に調整
し、室温にて２時間、緩やかにかきまぜた。

ホローファイバー（旭化成社製）を用いて分子量約１
３０００より小さい低分子量部分を集めた。

この集めた溶液をＣＭ−セルロースのｐＨ５．０、０．
１５Ｍのリン酸緩衝液で平衡化したカラムを用いて展開
した。

十分量の水を流して、溶出液を集めた。

この溶出液に酸性白土を４重量％加えて、ＩＲＡを吸着
させた。

この吸着させた酸土白土を取り出し、実施例５に準じて
０．ＩＮ塩酸で溶出させ、減圧乾燥して、精製ＩＲＡ８
グを得た。

この■ＲＡ５００γ／ｒＩｌｌはＰＨＡ法で９０％の阻
害活性を示した。

電気泳動的、分子量的分析によってＩＲＡと確認された
。

実施例 ７ コーンのアルコール分画法で得られるＰＨＡ法で４ ｍ
９／ｍｌで、７０％の阻害活性を有するＩＶ−１画分ペ
ースト１ｋｇを冷蒸留水４ｌに懸濁し、４℃で、２時間
かきまぜた。

遠心分離して不溶物を除いて、得られた上清に、グリシ
ンを１５％（Ｗ／Ｖ）の濃度に溶解した溶液を６０℃で
、１０時間加熱した。

加熱後、蒸留水で透析し、生じた沈殿を遠心分離して除
去し、澄明な溶液を得た。

その溶液に氷酢酸を加えてｐＨ３．５に調整した。

この液をホローファイハー（旭化成社製）による濾過に
かげ、分子量１３０００より小さい低分子量部分を集め
た。

この低分子量部分にＣＭ−セルロース（生化学工業社製
）を１重量％の割合に加え、かきまぜて活性のない夾雑
物質を吸着さ゛せ、ＩＲＡ活性部分を濾液中に得た。

この濾液に活性炭を４重量％の割今に加え、ｐＨ＠３８
％アンモニア液によって８．０に調整して活性部分を活
性炭に吸着させた。

溶出には、０．ＩＮ塩酸を用いた。得られた溶出液は減
圧乾燥して、精製ＩＲＡ１０．ＯＰを得た。

このＩ ＲＡ５ ０ ０ １ ／ｒｎｌはＰＨＡ法で７
４％の阻害活性を示した。

セルロースアセテート膜電気泳動では、β−グロプリン
領域にバンドが認められ、その分子量は約５０００であ
り、ＩＲＡと確認された。

また、ＨＢＶ活性の測定をオウスリア−１２５（ Ａｕ
ｓｒｉａ −１ ２ ５■）（アボッ１・社製）ニヨル
ラジオインムノアッセイ法（特開昭４８−４９９１ ９
号）で行った結果は陰性であった。

血圧降下性物質の測定を、成犬を用い、薬液投与前の平
均動脈血圧に対する降下率によって検定の結果、降下率
は約７５％で陰性と判断された。

実施例 ８ 実施例７と同様にして得られた溶出液に約％容量のエー
テルを加え、十分にかきまぜた後、エーテル層を分取し
、減圧乾燥して、精製ＩＲＡ約６１を得た。

このＩ ＲＡ ２ ０ １ ／ｍｌはＰＨＡ法で約６５
％、５００ｒ／ｍｌでほぼ完全な阻害活性を示した。

電気泳動的、分子量分析によってＩＲＡと確認され、又
ＨＢＶ及び血圧降下性物質は陰性であった。

実施例 ９ ヒトの胎盤１００個を細断し、０．１Ｍの塩化ナトリウ
ム溶液１０ｌに懸濁し、少時かきまぜる。

遠心分離によって澄明な抽出液約２０７を得た。

抽出液を集め、マンニットを約１５％Ｗ／Ｖの濃度に添
加して、６０℃、１０時間の加熱処理した。

加熱後の溶液を生埋食塩液で透析し、生じた沈殿を遠心
分離して除去し、澄明な溶液を得た。

その溶液を２Ｎ塩酸を用いてｐＨ２．０に調整し、室温
にて２時間、緩やかにかきまぜた。

ホローファイバー（アミコン社製）を用いて約１０００
０以下の低分子量部分を集め、実施例１に準じてＣＭ−
セファデックス処理を行った。

次にシリカゲル５重量％を投与し、ＩＮ水酸化ナ｝ Ｉ
ＪウムでｐＨ９．０に調整した。

約３０分間かきまぜた後、東洋濾紙Ａ２を用いて吸着に
用いたシリカゲルを濾集した。

シリカゲルと同容量のジエチルエーテルとメタノールと
の等量混合液で溶出後、除菌濾過し、濾液を減圧乾燥し
て精製ＩＲＡ９００ｍｇを得た。

このＩＲＡ５００γ／ＴｌｌはＰＨＡ法で１００％の阻
害活性を示した。

電気泳動的、分子量的分析によってＩＲＡと確認された
。

又、ＨＢＶ活性は陰性であり、血圧降下性物質の存在も
陰性であった。

試１験例 １ （薬埋効果の確認及び安全性） 実施例８及び９で得られた、それぞれ血漿及び胎盤由来
のＩＲＡを用いて動物試験を行った。

マウス１５匹を用い、その内５例は胎盤血性ＩＲＡ、他
の５例には血漿由来ＩＲＡを、それぞれ２０η／ｋｇ／
日、２０日間連続静脈投与し、ＩＲＡの皮膚移植実験に
対する効果をみた。

ＩＲＡは実施例８及び９で得たＩＲＡ粉末をそのまま、
生埋食塩水で溶解し、１０重量％ＩＲＡ水溶液を作った
。

移植実験開始２４時間前にあらかじめ２０ｒｒＩ９／ｋ
ｇを投与し、その後１日１回、２０日間投与した。

２０日後の表面観察では、両ＩＲＡ投与群はコントロー
ルの０％に対して約８５〜１００％の生着率を示した。

このことは、本ＩＲＡ注射液の免疫抑制剤としての薬埋
効果の有効性を示唆するものである。

試験例 ２ （急性毒性） 実施例８及び９で得られたＩＲＡを用いて急性毒性試験
を行った。

マウス２０匹を用いて、１０例に５００ｍ９７ｋｇ及び
１０例に１ ０ ０ ０ 雫／ｋｙノＩＲＡをそれぞれ
溶かした液を、静脈投与して４８時間の観察を行ったが
、両例共死亡例は認められなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 肝炎ウイルスが不活性化され、血圧降下性物質が除
   去されたヒトの血液由来の免疫抑制α−グロプリン製剤
   。 ２ 免疫抑制α−グロプリンを１００〜１０００１／ｖ
   ｔｌ含み、そのＰＨＡ法によって測定された阻害活性を
   ７０〜１００％有する特許請求の範囲第１項による製剤
   。 ３ 免疫抑制α−グロプリンが胎盤血由来である特許請
   求の範囲第１項又は第２項による製剤。 ４ 免疫抑制α−グロプリンが血漿由来である特許請求
   の範囲第１項又は第２項による製剤。 ５ 免疫抑制α−グロプリンが注射用製剤である特許請
   求の範囲第１項による製剤。 ６ 中性アミノ酸、可溶性糖アルコール、単糖類二糖類
   からなる群から選ばれ、安定剤の存在下で肝炎ウイルス
   を加熱処理して不活性化し、その後安定剤を除去するこ
   とからなる特許請求の範囲第１項による製剤。 ７ 加熱処理を６０℃で、１０時間行う特許請求の範囲
   第６項による製剤。 ８ 中性アミノ酸が、グリシン、アラニン、パリン、ロ
   イシン、イソロイシンである特許請求の範囲第６項によ
   る製剤。 ９ 単糖類が、グルコース、マンノース、ガラクトース
   、果糖である特許請求の範囲第６項による製剤。 １〇 二糖類カ、シュクロース、マルトース、ラクト
   ースである特許請求の範囲第６項による製剤。 １１可溶性糖アルコールカ、マンニトール、ソルビトー
   ル、キシリトールである特許請求の範囲第６項による製
   剤。 １２ 安定剤の除去を透析によって行う特許請求の範
   囲第６項による製剤。 １３ 安定剤の添加量が、少なくとも５％（Ｗ／Ｖ）
   である特許請求の範囲第６項による製剤。 １４ 安定剤の添加量が、１５〜２０％（Ｗ／Ｖ）で
   ある特許請求の範囲第１３項による製剤。