JPS5978687A - 固定化酵素配合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素配合体（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅ
ｎｚｙｍｅ　　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）及びそのような固
定化酵素配合体の製造法に関する。

本質的に蛋白質でめり及び通常水内性である酵素が多く
の且つ様々な生活有機体内で起こる化合反応を調節する
のに役立つ生機触媒（ｏｉｏｃａ−ｔａｌｙｓｔｓ）と
して作用することは公知である。

酵素は分離もでき、分析、医薬及び工業の用途に使用さ
れている。例えばそれはチーズ又ｔ」・七ンのような食
品の製造において並びにアルコール性飲料の製造におい
て工業的に使用されている。酵素グルコースインメラー
ゼは１＾フルクトースのコーンシロラグの製造において
グルコースをフルクトースへ舎転換するのに良く使用さ
れているう酵素は通常水浴性てあり亜ひに一般に不安定
であり１従って不活性化を受けるから、それを利用した
浴液から魯使用のだめに取り出すことが困難であり、ま
たそれは延長された期間に亘ってその触媒活性を保持し
えない、これらの難点は、酵素をしばしば交換する必要
性があるために、１６業的規模の運転で酵素を用いると
き費用の増大をもたらすう酵素の交換による高い費用を
減するために、酵素をその使用に先立って固定化する又
は不浴化する種々の方法が工夫されてきた。この酵素の
固定化Ｑ、ｊその再使用をｏＪ能にしｔさも々けれは酵
素は使用した反応媒体中で不活性化を受は或いは失なわ
れる。これらの固定化酵素系は生化学的に反応させる物
質の性質に依存して裡々の反応器系、例えば充填塔及び
撹拌式タンク反応器で使用することができる。

酵素の同定化を行なうためには、いくつかの一般的な方
法並びに多くのその改変法が報告されている。

米国！Ｆｌｆ￥「第３．７９６．６５４号には、ポリア
ミンをコロイド状の、寸法を統一した粒子の表面上に吸
着させ、このポリアミンを通常のアミンと反応する架橋
剤、例えばグルタルアルデヒドで架（Ｉ！５シ、得られ
る反応生成物をＮａＢＨ，で処理してアルデヒド基を還
えし且つこれによってアルデヒド基及びｔ整素のアミノ
基間での共有結合を防止し、及びコロイド状吸看剤が酵
素分子と反対の正の電荷を有し、そのイオン結合が他の
非共有結合力を助けるようなｐＨにおいて酵素を粒子の
処理した表面上に吸着させることを含む固に化法が開示
されている。この特許は暇着剤粒子を面径約５０〜約２
０．０００Ｘ％好ましくは約１００〜２００Ｘの範囲の
ものとして記述し、また吸治剤が活性炭−ヒドロキシア
パタイト、アルミナＣガンマ、及びベントナイトである
ことを述べている。この系は、酵素を処理した粒子に結
合させることを電荷の相互作用に依存している。この紳
す、「１の結合は・イオン的相互作用がこの’４＋ｆｉ
の結合に対する環境条件１例えばｐＨ−％イオン強度及
びＴ昌度に敏感であるが故に共有結合の形成より望まし
くない。

Ｌｉｕ　　られ［、Ｂｉｏｔｅｃｈ、ｎｏｌ、。Ｂｉｏ
ｅｎｇ。

１７．１６９５〜１６９６（１９７５）において、２ク
ターゼの粒状炭への固定化法を開示している、この方法
はｐ−アミンフェノール又は１−フエノ−ルー２−アミ
ノ−４−スルホン酸の炭素への吸着を含む。これらの吸
着された化合物はグルタルアルデヒドが反応し、順次酵
素の結合するアミン基を提供する、酊及されたアミン基
Ω有化合物はポリエチレンイミンのようなポリアミンと
異なる化学的及び物理的性質を有する単量体である、他
（ＩＪ　り／Ｌ、−プ（Ｏｈｏら、工ｍｍｏｂ１１ｘｚ
ａｔ１ｏｎｏｆ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ　　ｏｎ　Ａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ　　Ｃａｒｂｏｎ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　
　ｏｆ　　工ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＧｌｕｃｏａｍｙｌ
ａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅ　　０ｘ１ｄａｓｅａｎｄ　　
Ｇ１１１００ｎＯ１ａＯｔＯｎａＳ６＋、　　Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏ’ｌ。

Ｂｉｏｅｎｇ、２且、１６５１〜１６６５（１９７Ｂ）
）も、共有結合によシ酵素を粒状炭に固定化した。

この方法においては、粒状炭をカルボソイミドで活性化
し１次いで酵素でカルボジイミドを直換し、酵素−炭素
複合体を形成させる、 米国特許第４．１４１．８５７号（１９７９年２月２７
日付け）はｔ無機の有孔性担体材料、例えば細孔直径約
１００〜約５５．０００　Ｘ及び表面積約１００〜５ｏ
ｏｚ／ｒを有するｒ−アルミナを、水浴性ポリアミンの
ｔＲ液で処理し、この処理した担体拐料を２官能性単量
体物負、例えばグルタルアルデヒドのｌ得液と接触させ
ることを含むｅ素の固定化法を開示している。この処理
により、酵素との反応で酵素とペンダントのアルデヒド
基トの間に共有結合を形成させるのに匈当な担体材料が
得られる。この特許の実施例ＩＩには、有孔性のアルミ
ナ球を続いてポリエチレンイミン、グルタルアルデヒド
及びグルコアミラーゼの溶液で処理することによる固定
化ＲＸ＜配合体の埴造法が記述されている。

粒状活性炭の使用は〜その多くの魅力的な性質及び理に
かなった価格にもかかわらず、固定化酵素に対する担体
として殆んど注目されなかつ九粒状炭はシロラグ及び他
の食品生成物％　！ｌＩ！奈学的生学的生成物酸及び柚
々の他の化学品の、連続式カラム透過法による精製に対
して工業的に使用されている。

本発明は、 ａ）有孔性の（ｐｏｒｏｕｓ）粒状活性炭を、ペンダン
トのアミン基を有するポリアミン化合物の溶液と接触さ
せて、ポリアミンを底面への吸沼及び＃ＩＩｌ孔内への
捕捉の双方により活性炭にＵ層させ； ｂ）活性炭との接力×による水及びそｔしに分赦しだ付
オｉしてないポリアミンを除去し、及びこれを多官能性
有機ハライド、多官能性無水′１シθ、多官能性アゾ化
合物、多官能性インチオシアネート又は多官能性イソシ
アネートであるアミンと反応する物質の水性分散液と接
触させてこの反応性基の１つをペンダントのアミン基と
反応させ且つ更なる反応のために存在するアミンと反応
する残基を残し；及び Ｃ）活性炭との接触による水及びそれに分肢した未反応
のアミンと反応する物質を除去いそしてこの活性級を固
定化すべき１′１１“索の水τ６液と接ブ独させて、口
ｉ素のアミン基を共有結合の形成によって未反応のアミ
ンと反１５する残基と反応させ、これによってＧ１１　
素’に固定化する、工１呈をゴんでなる固定化■素配ａ
体の東゛Ｌ造法を菖゛む。

本発明で用いるのに適当なる乙状炭は、典型的には米国
ふるい系において１２〜４０メツシユのね径を有するで
あろう、細孔の寸法は好ましくは直径で、３５ス〜１０
００Ｘであり、′土た村状炭用体例利は２００〜６００
ｍ’／ｆの表面積を肩する。

本発明で用いるのに適当なポリアミンの例は、ポリアミ
ンがポリエチレンノアミン１．Ｉ？リエチレンイミンー
ボリへキサメチレンーヅアミン、ポリメチレンジシクロ
ヘキシルアミン〜ホリメチレンソアニリン、ポリテトラ
エチレンペンタミン、及びボリフエニレンソアミンを含
むうエビハロヒドリン及びアルキレンポリアミンの共重
合体も適当であることがわかった。ポリアミンの分子帳
は厳密なように見えないけれど、５００〜ｉｏｏ、ｏｏ
。

の分子鴛−範囲の重合体は好適である、水浴ｒトのポリ
アミンはその水溶赦から活性炭に適用され、一方非水浴
性の重合体は有Ｗｎ７媒１例えばメチルアルコール１エ
チルアルコール、グロビルアルコール、イソプロピルア
ルコール、ｔ−ブチルアルコール、アセトン、メチルエ
ーテル、エチルエーテル、アロビルエーテル１イソグロ
ビルエーテル、゛トルエン１ベンゼン、キシレン、ヘキ
サン−シクロペンタン及びシクロヘキサンから適用され
る、活性炭を１普通溶媒１１に対して重合体１〜１００
ｆのσ、１４度であるポリアミン溶液と接触させること
によ、す１ポリアミンが活性炭粒子の表面に付滑するよ
うになる。重合体の１部は枯性緘粒子の表面に吸着され
るけれど、多く、の部分は巨大分子が細孔から突き出て
、更なる反応のために官能！、ｉ２（アミノ糸）を残す
ように有孔性４１体の孔の中に何者するであろう、これ
は［」ＩＪ述した米国’ｔ’ｌ　ｉｅ’Ｆ　１↓へ７９
６．　ｂ　５４号に記スホされる方法、即ち炭素イ分末
ヲポリエチレンイミンのＩＪ　ｌｌ’ｊ−で処セ１ルて
その表面１に荷を変化させ、これによって酵素を担体に
付着させるという方法とメ−・」比される。この方法は
本発明の方法で生成する共南結合よりも非常に望ましく
ない電荷での相互作用にイコｌ（存する。処置した活性
炭をポリアミン浴液との接触から例えばθ１過によって
除去し１好ましくは脱イオン〔Ｄ工）水で洗浄していず
れかの付着してない重合体を除去する。

次いで重合体で処理した活性炭を、多官能性のアミンと
反応する物質１例えばグルタルアルデヒド、ビス−ジア
ゾペンジノン−２，２１−ジスルホン酸ｉ　４　、４’
−ノフルオルー３，６Ｉ−ソニトロソフェニルスルホン
；ジフェニル−４，４′−ソチオシアネー）　−２、２
／−ジスルホン酸：３−メトキシソフェニルメタン−４
、４／−ツインシフ°ネート；トルエン−２−インシア
ネート−４−イソチオシアネート；トルエン−２，４−
ヅインチオシアネート；ジアゾペンツノン；ジアゾペン
ツジン−シアヌル酸り日ライド又は１，５−ノンルオル
ー２．４−ソニトロベンゼンであるアミンと反応スる試
剤を約１〜１ｏｏｒ／ｌで金山する水ｆＭ　７＋４と接
触させることによって処理する。アルデヒドが遊離のア
ミノ基を誘導化するのに十分な時間に亘つて反応を進行
させた彼、処理した活性炭をアルデヒド浴液から除去し
、好ましくは脱イオン水で数回洗浄する、本明細ｊｌに
用いる如き、「ｄδ塀体化」とは活性炭に結合したψ−
合体分子のアミン亡能基及びアミンの反応する試剤のア
ミンと反応する残基間の反応生成物を生成することを意
味するう粒状炭の孔内に捕捉され且つ髄清ぢれたホ合体
物賀に結合しているアミンと反応する５１ζ青と反応し
うるアミノ基を含有する缶、素はいずれでもネ方法で固
定化することができる。これらのＥｆｆ’Ｐ素は例、ｔ
ばｌＪプシン、ノぐノ４イン１ヘギソキナーゼ１フィシ
ン、ブロメリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、
グルコースインメラーゼ、グルコアミラーゼ、キモトリ
ジシン１プロナーゼｔアシラーゼ〜イソペルターゼ、ア
ミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペグシンルニン及
びｕｉプロテアーゼを含む、誘導化された活性炭を酵素
の水石液と混合する。これはバッチ型又は基型反応器中
で行なうことができる。活性炭を酵素１ｄ液から除去し
１次いで水洗することにより、生後へ′口媒転化反応に
用いるのに適当な活性炭固定化酵素を看ｆる。

本発明の酵素固定化法の予期を越えン’ｊ観点の１つは
、粒状炭がその処理したものが未処理のものよシ微粉炭
を生成しないという意味において強靭になったというこ
とである。この性質は次の実験で例示されるように不均
一生機触媒を考える輛に非常に重要である： 粒状炭の５つの試料を、ポリエチレンイミンＣＰ用工）
の１農度を０〜α５多（水中Ｗ／ｖ）で変えて処理した
。このＰＥ工処理後に、活性炭試料を洗浄し、次いで０
０２Ｍホウ酸塩緩衝液中ｐ　Ｈ９，０において１％グル
タルアルデヒド（ＧＡ）（ｗ／ｖ水）で処理した。グル
タルアルデヒド浴液中の試料を回転振とう機に取シつけ
４時間Ｊ嵐押した１次いで液体を活性炭からＩ’、？ｌ
斜い懸濁液中の活性炭微粉末の程度を０〜５の相対尺度
で評価した。ゼロ値は活性体微粉末の観察されなかった
ことを表わい一方５の値は完全に不透明になる活性炭微
粉末の懸濁を表わす。次の表は撹拌中に生成する活性炭
微粉末の程度を要約する。

ＰＢ工処理　　　　　　　＋１．￥律・：、Ｉ微粉末対
照ＰＥＩなし　　　　　　　５ ００１５％　ｐｇ工　　　　　　６ ００５％　　ＰＦｉ工　　　　　　　２０１５−　　Ｐ
Ｅ工　　　　　　　１ （Ｌ５チ　　　ｐｇ工　　　　　　０．５粒状炭粒子上
に見かけ上生成する保Ｎ’７Ｊコーティング又は層は、
存在するＰｇ工の卆１．に依存するととがわかる０本方
法は酵素を活性炭粒子に固定するばかりでなく、活性炭
粒子を強化してその崩解を減少させる。

本固定化法の他の独特な特徴は、先に使用した粒状炭が
塩基−酸洗浄を含む簡単な方法での再生後に固定化に使
用できるということである。本方法のこの性質はそれが
使用者を廃棄の問題からｊ管放し且つ同様に潜在的な経
済的節約を提供するということで重装である。この再生
の可能性は、ｐｚニーＧＡ法によって固定化されだ酵素
を有する粒状炭を乾煙し、次のように再生する実願によ
って例示される： １．５０ｒａｌ！の乾燥した活性体複合体をＤＩ水でス
ラリーとし１Ｄ工水の数倍容量で洗浄する〜１　　水を
傾斜し、（Ｌ　５　Ｎ〕ＮａＯＨ２５０−を添加し、数
分間混合し、１時間放置する。

＆　アルカリ溶液を傾斜し、活性炭を多量の水で洗浄す
る。

４、　水の傾斜後、０．５ＮのＨＣ！１２５０ｍ／を添
加し、数分間混合し、次いで１時間放置する、５゜酸を
傾斜し、洗浄水のｐＨが６６になる寸で多量の水で洗浄
するっ この方法で再生成した活性炭を、続いてｐｂニーＧＡ法
によるグルコアミラーゼの固定化に便用した。この活性
炭で１１０単（ｒ７．　／　ｍｅの活性が得られた。こ
れは固定化のためにｆｒＬい粒状炭を用いた時にイ１ら
れる１３０単位／ｍｆと非常に良く一致した。

本固定化法は酵素及び粒状炭に吸着した重合体間に、非
常に安定な結合を生成させる。ここに液化したトウモロ
コシの殿粉の阻ｒｄ液を固定化＃累の床中を通過させた
時、活性炭粒子は蛋白質又は他の物質が覆ったり、それ
によって汚れたりしないということが発見された。

次の実施例は本発明を夾に例示する。実施例中、すべて
の寸法は米国標準ふるい系に基づくものである。

実施例　１ アミノグルコシダーゼの、ＰＫＩｉＪ導体化粒状炭への
固定 固定化に使用する前に粒状炭を次のようにル２洗洋した
： ｉ、−２０〜４０メツシユの粒状活性炭（Ｄａｒｃｏ）
ｉ　ｏ　ｏｍｅ’を濃塩酸と混合し、室潟で数時間放ｉ
Ｎした。この時活性炭を完全に浸すのに十分な酸を使用
した。

２、　次いで多量の脱イオン水を活性炭スラリーに添加
しｔ活性炭が沈降した後に１頃か１したつ６、工程２の
水洗浄を数回繰返した。

４、活性炭をガラスのカラム（２，６Ｘ　７０ｃｍ　）
、　　　　　　　　に移し１流出物がｐ　Ｈ１５に達す
るまで水を床中に流しだ。

５、　次いで活性炭をカラムから取り出し、輩渇で水中
に貯えた。

次の方法によりグルコシダ−ゼ・を室部で固定化した： １．２５０ｍ５の丸底フラスコ中において、ＰＦ！Ｉ−
６００（Ｄｏｗ製、分子尾範囲４　ｏ、　ｏ　ｏ　ｏ〜
６０．０００のポリエチレンイミン）の４％ン各４芝１
００　ｍｅを酸わ旨４’　した粒状炭１０ｍｇに添加い
ゆっくりと数時間（祉（３４’　した−２、　次いで、
Ｉ？　リアミンを傾斜し、活性炭を多量の水で洗浄した
。

６　活性炭上に吸着された（、−１定化アミノ基を、ｐ
　ｆｌ　９．０に調節シた１係グルタルアルテ゛ヒト°
〆台液２００ｄＫよりグルタルアルデヒド 化した，３ｐＥｉを９．０にａ持しながら反応を１８時
間帖ｆｉ’ｉ口〜だ、 ４、グルクルアルデヒド溶液を６１斜し１活性炭を水洗
して未反応のグルクルアルデヒド紮篩去したう ５、４ＮａυＨ（２Ｎ）でｐ　Ｈ　７．　０に調節した
グルｒーｆミ’ｊ−ゼ（ＡＧ，Ｄｉａｚｙｍｅ　　Ｌ−
１００２、５ｒＨｅ，Ｍｚｌｏｓ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｌｅｓ，　　工ｎＣ＋）溶液をＦＡＮＱ体化炭に添加
した。徳やかに数時間撹拌しなから１反応器合物のｐＨ
をＺＯに保った。

６、　この酵素溶油を傾斜し１固定化酵素を水洗したつ 固定化ｍ素の活性及び安定性を、Ｆｏｒｄら、Ｅｎｚｙ
ｍｅ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｗｌｎｇａｒｄ，Ｊ
ｒ＋。

Ｌ．Ｂ，編、２６７頁，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ　＆
Ｅｌｏｎａ，　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　　（　１　９　７
　２　）に記述されているように、循環式微分型反応器
において数回評価することによって決定した．評価は基
質としてＭａｌｔｒｉｎ−１５　［Ｇｒａｉｎ　Ｐｒｏ
ｃｅｓｓｉｎｇｏｏ、、Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ，ＩＯＷａ
，　　から入手した低ＤＪ！！（１５〜１８）のトウモ
ロコシ殿杉Ｊ〕をＸ３　ｆ（　４．　２の００２Ｍ酉ｉ
：１１１．きｔ清棗叱！：ｔｒンｊ！σ１コで月ｊいる
ことにより５０℃下に行なつブｃ．Ｈ白１１１１を行な
うグζめに一物ｌ綾を受器中に入れ、生成するグルコー
スの量をＧｌｕｃｏｓｔｒａｔｅ　ｇｚ　（−＋Ｆａｌ
ｌＪな方法）で１１価し１回帰分析からグルコースの分
画りに生成する初期速厩を決定した。活性の単位は’；
％ｋ　栄↑ト下において１分間にグルコース１μモルを
生成する酵素のふ（を表わす。

新しい基質を用い且つ活性の安定１１１１を決定する、
　　たメＫ　？＆　＃’ｆ　１面出Ｊ　Ｋ　ｇ　ｌＩｉ
７　ｉ夜（”　０２”　ｒ’ｌ’ｌＣｊ’＆ＪＩＪ、ｐ
　Ｈ４、２）で洗浄することによｆ）ｒ庁素を連わ′Ｃ
的に３回評価し／Ｌ，次の結果は、ＡＧＭＪｊ導体化炭
上にト１ｗ化され且つ活性のあることを示ず− 活性炭上に固定化されたＡＧの活性 １回　　　　１４８　　　　　５４４ ２回　　　　１４５　　　　　　３！＋８５回　　　　
１３８　　　　　　３２２実施例　■ 炭への固定化 実施例Ｉにおける如（ＰＥニーグルタルアルデヒドで誘
導体化しだネ’３１状炭５　＋ｎｉ　、ｆＦＥを、バク
テリヤのα−アミラーゼ（Ｔａｋａ−Ｔｈｅｒｍ■、Ｍ
ｉｌｅｓｂａｂｏｒａｔｏｒｔｅｅ、　　工ｎｃ、）を
Ｌｉ：ｉｌ固定化るために使用した。誘導体化炭を処理
するために用いる酵素溶液は水で５０ｍｅに７：布釈し
た１〃ノｅのＴ　ａ　ｋ　ａ　−Ｔｈθｒｍ■からなっ
た。固定化を実施例１に記述したように行なった。得ら
れた固定化調ＮＶ物を、緩衝液（１ＱｍＭの０ａＯ１，
を含有する０、　０２　Ｍ酢酸Ｉｎｓ　ｐ　Ｈ６−０）
で洗浄後、１０　ｍＭ　０ａＣ１゜を含有するｐ　Ｈ６
，０のＱ、　Ｑ　２　Ｍｆ４’ｆ醒塩緩衝液中４％町浴
性絨粉を基質として用い、微分型反応器で評価した。殿
粉の加水分解の程り川を、Ｕｈｕｙｓｅｎら、Ｍｅｔｈ
Ｏｄ８　　ｉｎ　　ＥｎＺｙｍ０１０ｇ７　、ｇ１Ｍｌ
１巻、６８５頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９６６年に記述されているフェリシアニド法により生
成する還元基の量を（１４す定することによって決定し
た。この鳩舎グルコースを参照物質として防用した。固
定したα−アミラーゼの活性は・連続評価において、固
定化１オ素１　ｍＩ！当りそれぞれ１１．７及び９５単
位であったつ 実施例　■］ 菌のα−アミラーゼの、ＰＥ工り巻導体什粒状炭への固
定化 実施例１１に記述したように、Ｗ４のα−アミラーゼを
誘導体化炭上に固定化した。　ｐ　ＨＩ　ＺＯに６１．
■節Ｌ　ノ７二ｓｕｍｉＺ７ｍｅ　　ＬＰ−８の菌−の
α−アミラーゼ（ｑ　０８ＭＭＵ／η）α１ｆを含有す
る酵素溶液を用いてＰＥニーグルタルアルデヒドでｈ誘
導体化した活性炭５ｍｌを処理した。同定化％、ｌ製物
の活性を、１％Ｍａｒｔｒｉｎ−１０を基質として用い
る以外実施例１１に記述したように測定した。連続評価
において同定化醇木１　ｍｌ尚り５，２及び５．５単位
の活性がイＩＪられた。活性の単位は、フェリシアニド
法によりグルコースμモル／分として測定される如き還
元基の生成量を表わす。

実施例　■ 実施例■に記述した方法を用いてダイズのβ−アミラー
ゼを固定化した。ｐ　Ｈ７，０に６’・υ１１シた５　
０　ｍｌの酵素溶液（凍結転作した試料ｃＬ１ｆ。

１８２単位／ｆ）を用いてｐｇ工誘導体化炭５　ｍｌを
処理した。この固定化酵素；＋’１３製物を１実施例Ｈ
の評価条件を用いて微分型反応器で評価した。固定化酵
素１　ｍｌ当り２．６及び２４の）ｉ；続訂価結果が得
られた。

実施例　Ｖ ｐ　Ｈ７，０のモルト・アミラーゼ（０２２、Ｍｙｌａ
ｓｅ−ＷａｕＦＪｒｆ！ｔｏｊ−ｎ　　Ｔ、＋ａｂ）の
１００ｍ１！の浴液を用いて１実施例■に記１１６シた
方法により１ＰＥ工誘導体化粒状炭１０ｍｅを処３７＋
！　した、この固定化酵素調製物を１実施例１０９（シ
述したようにＮ４％可溶性殿粉を基質として用いるとと
により、微分型反応器で口・１′価しブ輸固定化酵素１
グｅ当り１．８坪位の活性が得られた。粒状炭を用いる
ｔＦ価の多くでは、ＣｈＯら、Ｂ１０ｔｅｃｈｎｏｌ。

Ｂｉｏｅｎｇ、、　　ヱ旦、１６５１（１９７Ｂ）に記
述されるように基質及び生成物の吸λ１が実除の速度に
影響しうろことを記述しなければならない。

実施例　■ Ｄ工水（１）　ｆ（７，０）　１００　ｍｌ、中のコム
ギのμ−アミラーゼ（凍結乾燥した粉末１４０　ＭＭ　
Ｕ／ｍｙ）［１２ｍｇ、Ｈｌを用いｔ実施Ｎｉｌに記述
した方法に＋ｒｒつてＰＥエーグルタルアルデヒ）″誘
導体化Ｐ　ｉ　ｏ　ｍｅを処理した。この調製物の活性
は、微分＆反応器中においてｐｆ（ａｏの４チ可酊性殿
粉を基質として用いることにより、固定化酵素１　ｍｌ
当り１，６竿イＶとし′て訂１曲できた。

実施例　■ プルラナーゼの、ＰＥニーグルタルアルデヒド誘実施雄
側に記述した方法と同様に、誘導体化炭１０ｍｇを、プ
ルラナー−１１’　（Ａ　、Ｅ　、　　Ｍ　、　　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌＬｔａ、、試料に１０００）０．２ｆをＤ
工水１０〇−に浴８’Ｆすることによって調製したプル
ラナーゼのｐ　Ｈ７，０の溶液１００ｒｎｅで処理する
ことによりプルラナーゼを固定した。この酵素調製物の
活性を、循環式微分型反応器中において、ｐｆ（５，５
の０、０２　Ｍ　ｉ！ｉ７酸塩緩衝液中（１２％グルラ
ンを基質を用いて５０℃下に評価した。プルランの消化
の程度を、還元基の出現によって決定した。、Ｍ元基を
、フェリシアニド法により、グルコースを参照物として
好個した。還元基の生成を時間の関数としてプロットし
、このプロットから、反応１５分においてプルランの１
５チが消化されたことが評価された、 実施例　Ｗ ストレプトマイシン・オリパセウム（８ｔｒｅｐｔＯ−
ｍｙｃｅｏ　　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）の洗浄した細胞を
稀釈洗剤（Ｑ、１％Ｌｕｂｒｏｌ　ＷＸ）　　で処理り
及び遠心分Ｆｒ’ｌｋ　して細胞かすを除去することに
よって可溶性のグルコース・インメラーゼ（Ｇ工）を得
た。を占性２単位／　ｍｅ　（単位＝フルクトースμモ
ル／分）を有するｐＨ７，０の可ｍ性Ｇ工ｔｙ）　１ｏ
　Ｏｎｌｅ量ヲＦＩ４いて、実施例１１に記述したよう
に誘導体化粒状炭１０ｍｅヶ処理した。活性は微分型反
応器中において、２Ｍグルコース、４．１　ｍＭ　Ｍｇ
ＳＯ４−７Ｈ，０。

２．４　ｍＭ　ＮａＨ３Ｏ，及び２０ｍＭ１．リス−マ
レエート緩衝液ｐＨａＯを含む基質を用いることにょシ
１５０℃で固定化酵素１−当り２．２　ＪＰ位と評価さ
れた。フルクトースの生成量をシスティン−Ｈ，Ｓｏ。

法で決定した。

実施例　■ １％グルタルアルデヒド浴欣をα０５Ｍホウ酸塩でｐ　
Ｈ９，０に緩衝させ且つｎ：素溶液を００５Ｍ燐１・夜
ナトリウノ・でｐ　Ｈ７，０に緩衝させる以外実施例■
に記述した方法により、閂のラクターゼをｌｉｊ′Ｆ体
化粒状炭に固定化した。ラクターゼｆｒｒＷＬ（０，１
ｆの５　Ｑｒｎｌ、　Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ。

Ｉｎｃ、、ｐｐの２クターゼ、１．４．２８０　ＦＣＯ
Ｌυ／１）を用いてＰｉｎ工誘漕１体化炭１０ｒｎＩを
処理した。

この酵素調製物の活性を、微分型反応器において１００
５Ｍ酢酸塩緩衝液ｐ　Ｈ４，５中α１５Ｍラクトースを
基質として用いることにより５５℃で測定した。ラクト
ースノ分解を、ＧｌｕｃｏＢｔｒａｔｅ法により決定さ
れる如きグルコースの生成量によつて監視した。活性は
同定化酵素１　ｍｌ当り６８単位として評価された、 実施例　Ｘ 先の実施例においてはｔ　１神ｙｉ１＋だけのポリアミ
７（ＤＯＷ　ＰＥＩ　−６００、分子ｌｊ、範囲４０．
０００〜６　ｏ、　ｏ　ｏ　ｏ　）を粒状炭に誘導体化
させた。本実施例では１他の分子量のｐｇ工を用いてｃ
′ニド累の結合に及はす影響を決定した。この実験のた
めに、１％Ｐ　Ｅｉ　Ｉ　−１８（Ｍ　Ｗ　１．８００
　）　ｓ　２　％　Ｐ　Ｅニー　２０．０　（ＭＷ２０
，０００−３０．０００　）％及び１％ＰＥエーロ０”
ｌ（ＭＷ４０，０００〜６０，０００）の溶液５０ｍ１
を用いて酸洗浄した粒状炭１０Ｆｎｌを処理した。活性
炭の肪導体化法は、グルタルアルデヒド溶液を０．０５
　Ｍホウ酸塩でｐ　Ｈ９，ｏ　Ｋ緩衝させる以外実施例
夏に記述したものと同様でありた。またＡＧｇ液（５０
ｍｌに希釈したＭｉｌｅｓＤｉａｚｙｍｅ　Ｌ−１００
の２　ｍｌ　）も０．０５　ｎ燐ａ塩てｐＨ７，０に緩
衝させた。

この調製物の酵素活性を１実施例■に記述したように循
環式微分型反応器で決定した。次の表は活性を要約する
。

ｐＥ■−ＩＢ　　　　　　　　　２５２ＰＥニー２００
　　　　　　　２５２ １）Ｅエーロ００　　　　　　　　１７９これらの結果
は、広い分子量範囲のＰＥｌが同定化酵素に便用できる
が、ポリアミン分子の大きさが固定化された酵素の足に
影響するということを示す、＃素が結合するＰＥ工分子
の大きさは、立体障害又は物質移動の現象により１液化
炒粉の消化から得られる生成物の様子にも影響する。

実施例　Ｘ 本実施例では、ＡＧを固定化するために他の釉類の承り
アミンをポリエチレンイミンの代りに用いた。この実験
に対してはＢｅｔＺ１１８０をポリアミンとじで使用し
た。このＢθｔｚ　　Ｌａｂｏｒａ−ｔＯｒｉｅＢ、　
　工ｎｃ、、Ｔｒｅｖｏｓｅ、Ｐｅｎｎ５ｙｌ−ｖａｎ
ｌａ、から商品名Ｂｅｔｚ　　１１８０として市販され
ている重合体は・エピハロヒドリンのアルキレンポリア
ミンとの組合によってｆＪＩられる水浴性のカチオン重
合体である。これは１００万以下の分子Ｊｔをイ］シ、
溶液１ｖ当り約α２８８ミリモルのアミノ基にンヒドリ
ン分析による）を含み１全石液重ＭＫ基づいてｓｏｂ＜
量チの固体を含イｆする浴液として市販されている。こ
の重合体及びその製造に関する更に詳細な記述は米国特
許第３゜９１５．９０４号及び第へ９５３．５３０号に
見出すことができる。Ｉポリアミンの吸着、アミン基の
活性化及び酵素の固定化の工程は芙飾例１に記述したも
のと同様でめった。調製物の活性は実施例Ｉにおける如
く２５６単位／同定化酵素ｍｅとして評価された０本実
施例は、ペンダントのアミン基を有するポリエチレンイ
ミン以外の４′リアミンも本発明で使用するのに適当で
あることを示す。

実施例　Ｘｌｌ 固定化＃ｔＬ’；／こ酵素及び担体間の距離及びＪ−（
１体に関する固定化酵素の柔軟性は、自ン素の代りにポ
リアミンをＳ吸着された誘導体化ポリアミンに反１１ｗ
。

させ、次いでこの新規なポリアミンをｆ’ｉ？ｓ＜の固
定化のだめにグルタルアルデビドで誘、ｖｉ体イヒする
ことによって笈えることができる。この技術？’；１ｓ
５１にポリアミン（ＦＥＺ又Ｌｊ：Ｅｅｔｚｌｌｓ　ｏ
　）を酸洗浄した粒状炭に吸着させ；庄２にアミノ九を
グルタルアルデヒドと反応させ；第３にポリアミンをグ
ルタルアルデヒドのアルデヒド基に共有的に結合させ；
柁４にアミノ基をグルタルアルデヒドで粘性化させ、最
後に酵素を固定化するということによって試みられた。

実験条件ｔま一；ＪＹリアミンをｐ　Ｈ９，０ノ０．０
５　Ｍホウ酸塩緩衝液中で作るという第２のポリアミン
での処理を除き、ポリアミン及びグルタルアルデヒド工
程に関しては実施例ＸにｉＬ述したものと同様であった
。ｐｇエーロ００及びＢｅｔＺ　　１１８０の組合ぜに
より４つの試料を調製した。固定化に用いた酵素は実施
例■に記述したＧＩであった。

製造した試料の活性を１実施例■ｌｌにｆ５ｅ述した評
価法を用いて下表に示す。

活性（μモル／フルクト １、ＰＥニーＧＡ−ＰＨＩ　　　　　　４．４２、　　
ＰＨＩ−ＧＡ−Ｂｅｔｚ　　　　　　４．３Ｓ、　　Ｕ
ｅｔｚ−ＧＡ−ＦＢＩ　　　　　　　４．５４、　　Ｂ
ｅｔｚ−ＧＡ−Ｐｅｔｚ　　　　　　　４．５すべての
ル：４製物の粘性は実力ｉｉｔ　Ｉｓ！ｌ　■ｌｉでｂ
Ｌ］定化したＧＩよりも活性があった。この１６］定仕
法は、実施例■で用いたｐＢ工誘導体化炭素に対する同
定化酵素の２．２単位／　ｍｅと比較して、炭素粒子へ
の酵素負荷量を増加させうるお 実施例　ＸＵＩ の製造技術 ｅ床固定化に関するすべての上述の実施ｆ７！ｌはパッ
チ式で行なったものであっブζ。本実施例はカラム法を
用いるＡＧの担体３００ｍｐへのＬ６１定化に関する結
果を示す。

方法（すべての工程は室ｆｉり １、　　Ｄａｒｃｏ　の２０／４０メツシュ粒状活性炭
３００ばを娘）１０１に数時間性した。

２、過剰のＨＯ１′ｆ：１ＬＪｉ料し１活性炭を多ト１
；、のＤＩ水で洗１ｓｔＬ　７’Ｃｎ ＆　活性炭を２．６Ｘ７０ｔ１ｎのガラス製カラムに移
し、流出物のｐＨが６９に姪するまでノ］、を床に通じ
ることにより洗浄しｈ＋（’、け７゛こ。

４、　次いでポリアミンの溶液２ｔ（Ｂθｔｚｉｔ６゜
の４０２をＤＩ水で希釈）を床に通じた。すべての溶液
を床へ通しだ後）浴液を４時間に亘り上方ｒｚｉｃとし
て床へイＩ、ｑ　Ｊ、ｌ；ｉした。

５、　次いで水４１（上方流）でｆｆ’ｃ浄することに
より過剰のポリアミンを活性炭がら洗沖し７ヒ。

６、０．０２Ｍホウ酸塩緩衝液（１）　Ｈｑ’、　ｏ　
）中１％グルタルアルデヒド１．５ｔを床へ通じ１次い
で約１６時間上方流で循環した。

１　次いで過帽ｊのグルタルアルデヒドを工程５と同様
の方法によシ活性炭から水で洗浄した。

８．１０２Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）中酵素溶％
ｙ　（Ｄｉａｚｙｍｅ　　ｂ　Ｏｍｅ　）　１．５１．
を床へ通じ１次いで約５時間に貝って上刃υ：ｔでｑｆ
４Ｈ環させた、９　次いで過］・１］の川床を工程５に
記述したように洗浄した。

１α　００２Ｍクエン酸塩緩’＋１ｉｒＪｉｌｔ　（ｐ
Ｈ４，２）　約７ｔを約１８時間に亘って床へ通じた。

この時流出物のｐＨは４．２であった、 １１、　　固疋化酵素の調製物をカラムから取り出し、
０、０２　Ｍクエン酸塩緩衝液中にｐ　Ｈ４，２で貯蔵
した。

実施例１）て記述したように微分型反応器で評価した固
定化ＡＧ調製物の活性は、固定化＃素１ゴ当り２３６単
位であったつこの実ノッミで示されるように１多量への
スケ−ルアツブは固定化に対し何ら固有の問題を呈さな
かつだ。

実施例　ＸＩＶ この比較例では１アルミナとイ古性炭をｉ″？素の同定
化に対する担体として比較する史なる実ｊ？ξを記述す
る６１ノ」体の物理性を下表１１を約する。いくつかの
異なる因子を比較しグこ。

１つの実五陰において、同一の条１°１下し仁ＰＫＩ／
グルタルアルデヒドを用いることにより１アミログルコ
シダーゼ（ＡＧ）を２つの担体物質（アルミナ及び活性
炭）へ固定した。）渭性仄のＢ【要な性質の１つは塩メ
ζ−酸洗浄で７与生できるということであるから、両担
体を、ｒコｆ累の固定化に先立って穏やかなル−塩基処
理に供した、これらの実ｊ、！７Ｑに対し〜担体物質を
約２時間に亘シ振とう揚でｈり又は塩基と混合し、次い
で夜通し放置し７′ｃ、次いで試剤を傾斜し１担体を固
定化工程で処理する前に１ａに、要約する。

第１表：　アルミナ及び粒状炭の性責 粒径（メツシュ）　　　　２４／４８　　３０／４０細
孔容Ｍｌ　（ｍｅ　／　ｙ　）　　　住５０　　　　　
ｏ、　９５平均細孔直径■　　　　４５　　　　２００
表面Ｍ（ｎｚ／ｙ）　　　２１０　　　　　ｂｏ。

ｔ　　Ａｌｃｏａ社、Ｐｌｔｔｓｂｕｒｇｈ、　　ＦＡ
、からの活性アルミナＡ１級 ２、　　Ｄａｒｃｏ社、Ｖ／ｌ１ｍ１ｎｇｔｏｎ、、　
　ＤＥ、からの粒状活性炭 ａ、２０ｍＭクエン１：ばてｐ　Ｈ４，２に紋１！ＩＩ
Ｊさせた１０％Ｍａｌｔｒｉｎ−１５をノｄｉ乃として
用いることにより５ＤＣに６Ｄ分間保υ１１することに
よって評価された活性、活性の単位はクルコース１μモ
ル／分を生成するＮｙ　素ノ夙を表わす。

ｂ、固定化酵素の活性は、ｒ＋―素を］穢とう機水浴中
へ１１１いたフラスコ内で培狐することにより上述と同
イｇ！の条件で謡ｌ抽し／Ｃ０活性の単位ｔよ（ａ）と
同一の定壱で４〉る。

第１ａ表に要約した結果は、４（１体の予備処理で１活
性炭がすべての酵素を結合するのにより効果的であるこ
とを示す、アルミナは酵素の約５０％を結合していない
で残こすという結合に１３リシ、見かけ上より特異的で
ある。アルミナのｍ゛処理、この担体の結合能力が結合
しない寸＼残る多量の活性により且つ低い固定化活性Ｃ
単位／　ｍｅ　）により示されるように減少するという
具合にアルミナの楢造を見かけ上変えてしまう、しかし
ながらアルミナの塩基での処理は殆んど影響を示さない
。活性炭の醒又は塩基の処理は、活性炭の結合特性に本
質的に全熱影響しないように見ることができるうこれら
の結果ｉ穏やかな酸又は塩基処理に対する相対結合性及
び担体の不活性に関し、基本的な差異を示している。

固定化ＡＧ作用特性及びその両組体上での安定性を液化
したトウモロコシ殿粉の消化について評価するために、
他の一連の実５〜を行なった。ＡＧは畝又は塩基の予備
処理を行なわずに両組体上へ固定化した。

第２表は固定化工程におけるｆ’ｌ？素の分布を友釣す
る。カラム反応器（１００Ｘ１．５ｍのガラス製のソヤ
ケットつきカラム）を用いて、各固定化酵素を同量でａ
イＪするカラムを準備し／ζ−０この実験に対して、カ
ラムは活性炭に結合したＡＧ床１〇−及びアルミナに結
合したＡＧ床５０ｍ１からなった０両カラムに・２３％
ＤＢにＳ’４　卸され且つ５ｍＭクエン酸塩でｐ　Ｈ４
，２に調盲ｊされた２５ＤＥＣデキストロ一ス同等〕の
未１＃製のα−アミラーゼで液化したトウモロコシ粉を
供給した。、基ｆ１を約１０ｍｅ／時の一定流速で床に
通じ／こうカラムのノヤケットに５０℃の水を循］；Ｅ
Ｊ　してカラムを一定温度に維持した。消化の程度を決
定するために・カラム流出物をＨＰＬＯ分離へ周期的に
供して炭水化物特性を決定した。アルミナ及び活性炭に
結合するＡＧによる消化物の戻水化りｌ特性をそれぞれ
第３及び４表に要約する。またこれらの表には、公称の
反応時間及びＤＦｉ値も示す、この公称の反応時間はそ
の大きい比容量が故にアルミナに結合しプこＡＧに対し
て長かった。屍化水紫％性は例え両醇累が同一の活性単
位（初井Ｊ１占住に基づいて）を有したとしても著しく
異なった。

／″ ７／ ／ ／ 公を１１の １　　　　　　　　　　　　．８１　　　　　　　　　
　　１７．７５　　　　　　９０．ノド２　　　　　　
　　　　　　・９う　　　　　　　　　　　４１，７５
　　　　　　　つ０．８′２）１．００　　　　　６５
．５　　　９］、１句　　　　　　　　　　　　　−９
８，８９，５９０，６５，４６，１１５，２５つ０．１ ６　　　　　　．９７　　　　　１３７゜２５　　　９
０．３７　　　　　　　　　　　　］　、０５　　　　
　　　　　　１６２．２５　　　　　　　つ０．８８　
　　　　］。、ｏ７　　　　　１８６．０　　　　’）
１．６９１・０７　　　　　２０９．７５　　　８８．
０１０　　　　　　．９６　　　　　２３３．７５　　
　８５．３１１　　　　　　　・９６２５５−７５　’
　　　Ｂｌｈ、２１２　　　　　　．９３　　　　　２
８８．２５　　　８５．１１３　　　　　１．０２　　
　　　　うｏ６．ｏ　　　　８５．３１４　　　　　　
．８８　　　　　３２９．．５　　　８３．Ｏ１５］、
０２　　　　　３３５．２５　　　８３．８１６　　　
　　　．８９　　　　　３５６．２５　　　８２．０１
７１、ｌＯ６７８，５Ｂ７．４ １８　　　　　　．９７　　　　　４０２．０　　　８
６゜４基質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
５．１ａ、第３表に示した条件の１１−’ＯＬから得た
話り、７％３表に示した方法で計算したＤＦｉ８７．２
　　２Ａ１．１　　　　（Ｊ　　　　ＯＯ９，３８７゜
９　　２．０　　　　１．０　　　０　　　０　　　　
０　　　　９．１８８．５　　１，５　　　　１．Ｇｏ
　　　ＯＯＯ９，０８７，７：１．．９　　　　　．９
　　　０　　　０　　　　０　　　９．５８Ｇ、９　　
　２．２　　　　１．０　　　０　　　　０　　　　０
　　　１０，０８７．２　　　、’、１　　　　　．９
　　　０　　　０　　　　０　　　　９．７８８．１　
　１．６　　　　１．０　　　０　　　０　　　　０　
　　９．３８９、’３　　１−．１　　　　　．９　　
　０　　　０　　　　０　　　　８，７ａｎ、２．　　
２．７　　　　　、．８　　　０　　　０　　　　０　
　　１２．５８０．６　　３．７　　　　　．８　　　
０　　　０　　　　０　　　１４．９７９、う　　３．
７　　　　　．８　　　　Ｑ　　　　　Ｏ○　　　１６
．５８０．６　　３．１　　　　　．７　　　０　　　
００１５゜６８０．９　　　　）７．１　　　　　．８
　　　０　　　　０　　　　０　　　１５，２７７．４
　　　　　４゜６　　　　　　　　　．９　　　　　　
０　　　　　　　０　　　　　　　　０　　　　　　１
７．１７８、ノＩ　　　　　ノ１．６　　　　　　　　
　　．７　　　　　　０　　　　　　　０　　　　　　
　　０　　　　　　１６，４７６．３　　１１．、ｌｈ
　　　　　　、８．　　０　　　　０　　　　０　　　
１８゜５８１−．２　　　　　１．６　　　　　　　　
　　．７　　　　　　０　　　　　　　　０　　　　　
　　　　０　　　　　　　１３．６８３．２　　１．１
　　　　　．７　　　０　　　　０　　　　　（’ｌ　
　　　１４．９３．７　　９．３　　　　１５．８　　
５．４　　２４．１　　１４．λ　　　２７．６１水化
物特（ｅＥ　。

第３及び４表からは１活性炭に固定化したＡＧがＤＰい
低ＤＰ、及びＤＰｓオリゴサツカライドの高割合及びＤ
Ｐ、、ＤＰ、及びＤＰ、オリゴサツカライドの完全な消
化によって示されるように液化殿粉をより完全に消化し
たことが決定できるーまた〉ＤＰ６画分はアルミナに固
定化したＡＧに比べて活性炭に同定化したＡＧに対して
笑質的に低かった。３ＡＧ−アルミナカラムからの流出
ｌレフ中の、ソザツカライド（ＤＰ、）及び中間オリゴ
ザツカライド（ＤＰ、〜ＤＰ６）の高量及びグルコース
の低量はｔ活性の見かけの損失或いは酵素活性の見かけ
の損失を引き起こすある種の物質移動す♂、数の存在を
示す。

アルミナに結合したＡＧの１活性の見かけの伯失或いは
活性炭に結合したＡＧと同程度に効果的に紋粉を消化し
えないことを定量化するために、活性は第３及び４表に
示す結果から計算した１生成グルコースのμモル／分／
ｍ素ｍｌとして表わすことができる。この時、カラム消
化物から観察される活性を、Ｍａｌｔｒｉｎ　　１５を
基質として用いる珈とう浴中で固定化ｃＡ￥累をｔｌ’
　１曲することによって得られる初期速度活性で割るこ
とにより、活性の結果を無名数に規格化もし７ｉγ占性
炭に結合したＡＧの無名数での活性は〜アルミナ結合し
たＡＧの無名数での活性の殆んど２倍である。

／′ 両方のＡＧの固定化形の結果から１縁られる無名数での
活性の比較は１両カラムの転化率が同様でないから、比
較耐荒い１′価となる。しかしながら、９１．１１名１
ｊＪ１．−Ｃ（’）　？’ｉ’ｉ性の広イｙｚ化は１五
４　ａ　’Ｌ　ｔ　ｒ　ｌ　ｎ　１５（１５ＤＥ）を？
［１化する原の及び液化トウモロコシ殿粉（２５，ＤＩ
Ｊを転化する時のＡＧの固定化１しの基本的な差異を示
している。これらの結果から引き出すことのできる結６
而は〜活性炭に結合したＡＧがアルミナに結合したＡＧ
よりも短釦のオリゴザツカライドをグルコースへ迅速に
消化することができるということである。これは炭んに
結合したＡＧがアルミナに結合したＡＧよりも比較的拘
束されていないことを示す。

固定化ＡＧの画形は第１表に示すように全く安定である
かに見える。最初、炭素に結合したＡＧは運転の約５０
時間まていくらか見かりの活性を失い、次いで運転４０
０時間を経て定常状態に達するということは興味深；記
述できる。アルミナに結合したＡＧは運転の初期の５０
時間に亘って見かけの活性の増大をもたらう物へある神
の物ｙ（移ｊＪの抵抗を示１度している６　ｔ１’ｒ　
１７’、のデータは１見かけの定常状態後に、アルミナ
ｔｉ−結自したＡＧｔユ炭素に結合しだＡＧでνく現し
たものの約２０％でちることを示す。

これらの実験から、同一の糸外において活性炭はアルミ
ナ（２５，７単位／　ｍｅ　）よりもＡＧを結合する（
７１３単位／　ｍｅ　）ことが示される。活性炭に結合
したＡＧは、アルミナに結合したＡＧよりも１夜化トウ
モロコシ殿粉を完全に消化するから、アルミナに結合し
たＡＧよりも物質移動抵抗の影響を受けにくいようであ
る。活性炭が酸及び塩基の処理に対して安定でおり、一
方アルミナは塩基の処理に安定であるが、酸の処理に不
安定であるということも示される。担体の酸及び塩基の
双方に対する安定性は、ｔη、素固定化にＮ使用するた
めに担体をｒＪ生する際に必要である。総合してこれら
の結果は、ＰＥ工・−グルタルアルデヒド法による酵素
の固定化における担体として用いたとき１活性炭及びア
ルミナが全く異なることを明白に示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）有孔性の粒状活性炭を〜ペンダントのアミン基
   を有するポリアミン化合物の溶液と接触させて、ポリア
   ミンを表面への吸看及びＨ１＋札内への捕捉の双方によ
   り活性炭にイマ４ノ凸さゼ；ｂ）活性炭との接触による
   水及びそれに分Ｂした付Ｎしてないポリアミンを除去し
   翫及びこれを多官能性有機ハライド、多官能性無水物、
   多官能性アゾ化合物、多官能１１イソチオシアネート又
   は多官能性インシアネートであるアミンと専反応する物
   質の水性分１ｆ’１．　ＶＷ−と接触させてこの反応性
   基の１つをペンダントのアミン基と反応させ且つ更なる
   反応のだめに存在するアミンと反応する残基を残し；及
   びＣ）活性炭との接触による水及びそれに分散した未反
   応のアミンと反応する物質を除去し１そしてこの活性炭
   を固定化すべき酵素の水溶液と接触させて〜１“１．累
   のアミン基を共有結合の形成によって未反応のアミンと
   反応する残基と反応させ、これによって１１１゛水をｌ
   う１定化する〜 工程を含んでなる同定化酵素配合体の製造法う２、活１
   ４１：　Ｗが米国ふるい系で１２〜４０メツシユの粒径
   、直径で６５〜１００ＯＸの細孔寸法及び２００〜ｂｏ
   ａｉ／ｙの表面積を有する特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 五　ポリアミンがポリエチレンジアミン、ポリエチレン
   イミン、ポリへキザメチレンージアミン・ポリメチレン
   ジシクロヘキシルアミン、ポリメチレンツアニリン、ポ
   リテトラエチレンペンタミン１及びポリエチレンイミン
   の徂：から選択される特許請求のｊｊｉα囲第１項第１
   項記載４．　ポリエチレンイミンがボリソエチレントリ
   アミン、ボリトリエチレンテト２ミン、ポリペンタエチ
   レ／へキサミ／又はポリへキサメチレンツアミンである
   特許請求の範囲第３項記載の方法う５、　ポリアミンが
   エビハロヒドリン及びアルキレンポリアミンの共重合体
   である’％ｉｉ’ｆ請求の範囲第１項記載の方法。 ６、　ポリアミンが５００〜１００．　ＯＯＯの分子量
   馳囲を有する特許請求の範囲第１坦記載の方法。 Ｚ　アミン反応性物質がビスーソアゾベンヅノン−２，
   ２１−ジスルホンｈセｉ　４　、４’−ジフルオル−＝
   　　　−３，３’−ジニトロジフェニルスルホン；ジフ
   ェニル−４，４′−ソチオシアネートー２．２′−ソス
   ルホン師；６−メドキシソフエニルメタンー４，４′−
   ジイソシアネート；トルエン−２−インシアネート−４
   −インチオシアネート；トルエン−２，４−ジイソチオ
   シアネート；ソアゾペンソジン；ソアゾペンジノン−３
   ，３１−ソアニシシン；Ｎ、Ｎ／−へキサメチレンビス
   ヨードアセトアミド；ヘキザメチレンジイソシアネート
   ；シアヌル自グクロライド又は１．５−ノフルオルー２
   ．４−ジニトロベンゼンである特許請求の範囲第１８１
   記載の方法。 ８　アミン反応性物質がグルクルアルデｂドである特許
   請求の範囲第１又は３項記載の方法〜９、　酵素がグル
   コアミラーゼである特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、　　有孔性の粒状活性炭を４Ｉ体として有し、こ
   れにペンダントのアミンｂｌｉ　’ｋ　’１ｊ’するポ
   リアミン化合物の、多官能性アルデヒド、多′自能性有
   槻ハライド、多官能性アゾ化合物、多官能・詑イソチオ
   シアネート又は多官能性・インシアネートとの反応生成
   物を付着して有し、この反応性生成物の未反応のアミン
   反応性基がそれに結合させるべき酵素の遊離のアミン基
   と反応している固定化酵素配合体。 １１、　　活性炭が米国ふるい系で１２〜４ｏメツシユ
   の粒径、直径で３５〜１ｏｏｏＸの細孔寸法及び２００
   〜６００ｍ’／ｆの表面積を有する特許請求の範囲第１
   ０ＪＡＨｔ載の配合体、１２、　　ポリアミンがポリエ
   チレンイミン、ポリエチレンイミン、ポリへキサメチレ
   ン−ジアミン、ポリメチレンジクロヘキシルアミン、ポ
   リメチレンツ゛アニリン、ポリテトラエチレンペンタミ
   ン箋及びポリエチレンイミンの群から選択される特ｒ目
   ｉＮ求の範囲第１０項記載の配合体つ１３、　　ポリエ
   チレンイミンがボリソエチレントリブミン１ポリトリエ
   チレンテトラミンへポリペンタエチレンへキサミン又は
   ポリへキサメチレンジアミンである特許請求の範囲第１
   ２項記載の配合体。 １４、　　ポリアミンがエビハロヒドリン及びアルキレ
   ンポリアミンの共重合体である％Ｆｆ請求の範囲第１０
   項Ｇじ載の配合体、 １５、　　ポリアミンが５００〜１００．００００分・
   子對範囲を有する特許請求の範囲第１０項記載の配合体
   、 １６、　　アミン反応性物ｌ！Ｊがビスーソアゾペンジ
   ノン−２，２′−ノスルホン酪；　４　、４／−ノフル
   オルー６．６′−ジニトロソフェニルスルポン；ジフェ
   ニル−４，４Ｉ−フチオシアネート−２，２′−ソスル
   ｙＪｚ　７　Ｎ　ｉ　６−メドキシジフエニルメタンー
   ４．４′−ジイソシアネート；トルエン−２−インシア
   ネート−４−インチオシアネ−１・；トルエン−２，４
   −ヅインチオシアネート；ヅアゾペンソジン；ソアゾペ
   ンソジンー６，３′−ジアニシソン；Ｎ　、　ＮＺ−へ
   キサメチレンビスヨードアセｌアミド；ヘキサメチレン
   ツイソシアネート；シアヌル戯クロライド又は１．５−
   ノフルオルー２．４−ソ二トロベンゼンである特許請求
   の範囲泥１０項記載の配合体つ １Ｚ　アミン反応性物質がグルタルアルデヒドである特
   許請求の範囲第１０又は１２項記載の配合体。 １ａ　酵素がグルコアミラーゼである特許Ｍｌ（求の範
   囲第１０項記載の配合体。