JPS5980609A - コレステロ−ル低下活性画分の製造方法及び当該活性画分含有抗動脈硬化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗動脈硬化剤及びその製造方法に関する
。今日、圧印典型的成人病の１種である動脈硬化性疾患
乃至高脂血症等の治療・予防薬としてはクロフィブレー
ト関連製剤を始めとして幾つかが提案されているが、薬
理効果及び副作用等の点でこれらは必らずしも充分満足
し得るものとは云い難くより効果的な薬剤への希求が一
段と高１っている。

本発明者らは新規抗動脈硬化剤につき鋭意研究の結果、
ストレプトコツカス属に属する各種微生物菌体かもの特
定抽出画分が血中コ、し、ステロール値を極めて効果的
に低下ぜしめ得るものであり且つその起源が所謂腸内、
Ｉ１１菌であるこれら菌体の抽出画分は経口では実質的
無毒性であること、更にはより高度の精製のための出発
材料として好適であることを知見し、本発明に到達した
ものである。

以下、本発明に於いて使用さね得る微生物の種類等、活
性画分の製法、薬理作用等につき詳細に分脱する。

微生物 ストレプトコツカス属に属する各種微生物が使用され得
、就中、ストレプトコッカス・フェシウム、ストレプト
コッカス・フエカーリス、ストレフトコツカス・ボービ
ス、ストレプトコッカスφエピウム、ストレプトコッカ
ス・デユランス、ストレプトコッカスｅザリヴアリウス
、ストレプトコッカス・ミテイス、ストレプトコッカス
・イクイヌス等を好適なものとして例示し得る。

更に、本発明に於いて最も有用な具体的菌株例を微工研
受託番号と共に表示すれば下記の通りである。

第１表 ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ　ＡＤＶ
１００９　　ＦＥＩｔＭ　Ｐ−６６２４ｘ　ｆａｅｃａ
ｌｉｓ　ＡＤＶ９（１０１ｗ　ｎ−６６２５＃　−ａｖ
ｉｕｍ　　ＡＤ２００３　　　＃　＃−６６２６ｙ　５
ａｌｉｖａｒｉｕｓＡＴ）ＶｌｏｏＯＩ　　＃　ｔｒ−
６６２７ｓ　ｃｌｕｒａｎｓ　　ＡＩ）Ｖ３００］　　
　＃　＃−６６２８ｔｔ　ｍ１ｔｉｓ　　ＡＩ）Ｖ６Ｏ
１３ｒｒ　ｐ−６６２９ｔ　ｅｑｕｉｎｕｓ　ＡＤＶ８
００１　　ｒｒ　ｒ・−６６３０菌学的性質 菌学的性質の点では、本発明で使用の微生物は同−分類
菌につき公知各文献の示すものと同一の諸性質を有する
。

すなわち、本発明微生物の菌学的性質及び培養条件等に
関しては下記諸文献が参照される。

］　）　ＢｅｒｇｅＶ’ｓ　Ｂ／Ｉａｎｕａｌ　ｏｆ　
Ｄｅｔ、ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　１３＋ｃｔ、ｅｒｊｏ
Ｌａｇｙ　Ｉ８　ｔｌｌｅｄ、、　４９０−５０９　（
１９７４）２）　Ｉｎｔ、　Ｊ、５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔ
、−１１１１４（１９６６）３）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、　Ｉｒｒｍｕｎｏｌ、　２５（３１，２５７−２６９
（１９８１）４）　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、　
３；　　５３−５７　（１９８０）５）　Ｊ、　Ｇｅｎ
ｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２８　７Ｊ　３
−７２０　（１９８２）６）　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、、　２４　ｆ６１１１３１−１１３９　
（１９７２）ここで、前出各種菌株につきその主な菌学
的性状を要約して表示すれば次の通りである。

以下余白 （ｌ１２，３．５−トリフェニルテトラゾリウムクロリ
ド）これらの微生物の培養は上記の通り常法によるもの
であるが、例えばロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）　Ｈ体培地（
註）にて好気的に静置培養し、得られた培養液を遠心分
離してその菌体が採集される。

（註） 蒸留水１１中に トリブチケース　　　　　　　１０９ 酵旬コニキス　　　　　　　　　　５７ト　　リ　フ″
　１・　−ス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　３２に２）ＩＰ０４　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３　　ｆｆＫＨ
２ｒイ）４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　３２クエン酸三アンモニウム　　　　２２ ツイーン８０　　　　　　　　１１ グルコース　　　　　　　　　２０ｆ システイン塩ｒＲ塩　　　　　　ｏ、２２※塩類溶液　
　　　　　　　　　５　ｍｌ（ｐＨ７，１２１℃　１５
分間加熱滅菌）※塩類溶液蒸留水１００／に 活性画分の製法 本発明活性両分の典型的製法の１例を各工程ごとに示せ
ば次の通りである。

１、　菌体採集工程 前記各微生物等の菌株を前述のロゴーリ゛液体培地５１
に接種ｌ〜、３７℃にて５時間好気的に静置培養して生
菌数６　Ｘ　１０”／−の培養液をつくり、得られた培
養液を１２．００　Ｏｒｐｍの連続遠心分離に付し菌体
を集め、生理食塩水で２〜３回洗浄して採集菌体とすく
）。

２、水抽出工程 ａ）前記採集菌体を生理食塩水（０，Ｆ！；　５　％Ｎ
ａＣ１水溶液）　１．５　ｙｎｌに懸濁して得られる菌
液（２Ｘ　１０”　／ｄ）を１１５℃で１０分間加熱（
オートクレーブ）し、菌体の破壊と熱水抽出とを併せ行
なう。

得らね、た抽出懸濁液を遠心分離処理（２，０００Ｇ×
２０分）するとその上清として目的抽出液が与えられる
。

ｂ）前項ａ）に示す菌液を超音波破壊処理（１５Ｋｃ、
６０分）し、イ４）られた抽出懸濁液を遠心分離処理（
２０，０００〜２５．０００Ｇ。

３０分）するとその上清として目的抽出液が得られる。

尚、抽出溶媒としては上記生理食塩水のみならず所定ｐ
Ｈ値に調整された各種緩衝液等も適宜使用され得る。

３、活性画分分取工程 前記各抽出液を分子量３，５００以下透過性透析膜（商
品名”セロチュ〜）”；牛丼化学薬品社製）等で３昼夜
、蒸留水で透析処理し、目的活性画分が得られる。

尚、他の透析データを勘案すれば、本発明活性画分は水
抽出物中、その分子量が３，５００〜５０．０００のは
ん凹円に分布するものと推定される。

薬理作用 １、薬理効果 後記各実験例に示す通り本発明活性画分よ　　＝り成る
抗動脈硬化剤は、血中コレステロール値を極めて効果的
に低下せしめるものであり。

したがって、この指標と密接な関連を有する動脈硬化症
を始めとし、高脂血症、高リポ蛋白血症、黄色）珀症、
胆石症、高血用症、糖尿病等の疾患に対しその治療乃至
予防薬として有用なものと云い得る。

本発明剤は又、経口、静注等の手段で適用され得、その
用量は通常数■〜数１Ｏｒ／Ｋｑ体重、より好１しくけ
経口投与で数１（〕■〜数９　／　Ｋｆ体道程度であり
、その剤型としては生理食塩水等への懸濁液剤、凍結乾
燥等による粉末剤１、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等々、
通常の剤型を適当なキャリヤ、増絹剤、希釈剤等と共に
適宜選択使用し得る。

２、急性毒性 後記実験例に示す通り、本発明剤のＬＤｓ。

値は３．７ｍｇ／マウス（腹腔的投与）以上であり、経
口投与の場合は実質的に無骨性である。

邸験例１ 七〇生菌数が２Ｘ１０”個／−の菌液（生理食塩水懸濁
）を用い、前記活性画分の製法に準じてストレプトコッ
カス・フェシウム　ＡＤＶ１００９から熱水抽出（前記
２．ａ）項）により活性画分を得た。

ここに於いて、菌液１０ｍ（生菌数２　Ｘ　Ｉ　Ｏ”個
）当りの菌体乾燥重量は２．ｏ２であり、これより得ら
れる活性画分の夫は４３５■であった。

次に、このようにして得られた活性画分２１７１ｒｑ（
乾燥型取換算）、これに相当量の各両分及びオートクレ
ーブ処理したのみの死菌体菌液０．５ｄを通常ラット（
雄６週令、平均体重２１９Ｆ。

各群５匹）に４週間、経口的に連日投与した。

次いでこれらラットの工大動脈より動脈血を採集、遠心
分離して血清標品を得、コレスキット（商品名；関東化
学社製、Ｚｕｒｋｏｗｓｌｃｉ法）により血清標品中コ
レステロール値を測定した。

結果を第３表に要約して示す。

尚、表中、対照は試料無投与ラット群であり、各数値は
対照群を１００％としたときの低下率（％）であり、又
、比活性は死菌体の夫を１とじたときの単位重量当りの
相対活性を示す。

又、ダイエツトすなわち飼料の組成（重電％）は下記第
４表の通りでありこれを自由摂取とした（以下、同様）
。

第３表 面　分　　　　低下率（％）　比活性 熱水抽出残渣−１，３− 第４表 カゼイン　　　　　　２０ 大豆油　　　　　　　１゜ 小麦でんぷん　　　　６１ ミネラル　　　　　　　４ ビタミン混合物　　　　２ ろ紙粉末　　　　　　　３ 実施例 実験例】と同様にしてストレプトコツカス属各種す生物
の加熱処理菌体及び活性画分を得、これを通常ラット（
雄１８週令、平均体重２４０１；各群５匹）、通常及び
無菌マウス（［１８週令、平均体重２０２；各群１０匹
）に４週間菌数にして１０１１　個／日相当量を経口的
に連日投与し、前記と同様にして血清中コレステロール
の各低下率を測定した。結果を第５表に示す尚、表中、
°′コレステロール負荷”又は″果糖負荷”は、前記飼
料に更に１％コレステロールを添加したもの或いは小麦
でんぷんを果糖にて全量置換した飼料を使用した場合を
示すものであり、数値は無投与群を対照とした加熱処理
菌体の低下率及び活性画分の比活性（括弧内数値）であ
る。

第５表 Ｓ・ Ｓ。

Ｓ。

（４，３） Ｓ。

Ｓ。

（４，２） Ｓ、イクイｙｚスＭ）Ｖ６Ｏ１３１８，７２４，４（３
，６） リコレステロール負荷タイエツト 璽り果糖負荷ダイエツト 実施例 Ｓ、エビラム　ＡＤ２００３菌株な用い、実験例１と同
様にして（但し、破壊抽出工程は８０℃の熱水による前
項２．ｂ）項の超音波処理に従った）、活性画分を得た
。

これを前記実験例１と同様に通常ラットに投与した結果
、比活性は６．２であった。

実施例 ＩＣＲ系マウス（雄６週令、平均体重３０．０±０．７
’ｌ）を使用し、前記活性画分の製法に従って得られた
活性画分をマウス当り９　Ｘ　Ｊ　Ｏ’、９Ｘ１０”、
９　Ｘ　Ｉ　Ｑ’個の３段階の出発菌数（各群１０匹）
に相当間でその生理食塩水０．５ｍ懸濁液を腹腔内投与
し、１４日間マウスの生死を観察した。

Ｂｅｈｒｅｎｓ−ＫＭｒｂｅｒ法に従って算出したＬＤ
ｓｏ値（■／マウス）を第６表に示す。

尚、連日経口投与では、いずれの場合でも実質的に無毒
性であった。

第６表 Ｓ、フェシウムＡＤＶ１０Ｕ９　　　　　　　４．７Ｓ
、フエカーリスＡＤＶ９００１　　　　　　３．８Ｓ、
エピラムＡＤ２００３　　　　　　４．２Ｓ、サリヴア
リウスＡＤＶ１０００１　　　　６．ＩＳ、デー’ｙｙ
ｘＡＤＶ３００１　　　　　　　５．５Ｓ、ミティスＡ
ＤＶ７００１　　　　　　　３．７Ｓ、　イク（ヌスＡ
ＤＶ８００１　　　　　　５．５製剤例 １゜前記実験例１に従って得られたＳ、フェシウムＡＤ
ＶＩ　Ｏ０９活性画分の凍結乾燥物４３〜（死菌体数１
．５Ｘ１０”個に相当）を精製でんぷん末９５０１ｎｇ
と均一に混合、打錠して経ロ捜方用錠剤とした。この錠
剤は体重５０に９の成人における死菌体数用［１３Ｘ］
０’個／Ｋｆ体重に相当する。

２、上記凍結乾燥物４３０　ｍＷを精製でんぷん末５０
０■と混合、打錠したものは、同様に用量３　Ｘ　１０
１０個／　Ｋｙに相当する。

このように、本発明剤は前記標準用量等に基づいて、活
性画分と薬学的に許容され得る担体とを混合して所定の
活性を有する所望の剤型とすることができる。

特許出願人　　株式会社アドバンス開発研究所千　Ｉタ
　浦　ｊに　書　（自発） 昭和５８年７　月２ｊ］」 １、γ訂庁長官　若　杉　和　人　　殿１、事イ′１の
表示 昭和５７年特５′「間第１８９２５３号２、発明の名称 コレステロール低下活ｆ１両分の製造方法及び当：：Ａ
活・１°１画分含有抗動脈硬化剤 ３．１！ＩＩ正をする者 事１′１との関係　　　１、ｒ算出に４人住所　　〒Ｉ
Ｏ：ｌ　　ｌｊ京都中火区１−１本橋小用町５番７号（
］”ｌ’：１、０３−ｆｉ＋’ｉ７　１５５１）氏名　
　株式会社アドバンス開発研究所４、ｌｌ１１正の対象 明細９Ｆの１発明の詳細な説明］の欄 ５、？ｌｌｌ正の内容 明細書第４真第】行目がら９行目第１表をＦ記の通りに
訂正する。

第　１　表 −菌−−４−一名　　　　　　　　　　　Ｉｔ思−５ｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　　ｆａｅｃｉｕ＊　　　＾
ＤＶ１００９　　　　　　　　　　ＦＥＩｔｌＩ　　ｆ
ｉｌ＋−２９０／／　　　　／／　　　ｆａｅｃａｌｉ
ｓ　　ＡＤＶ９００１　　　　　　ｔｔ　　　ｔｔ　−
２９７〃／／’　　ａｖｉｕｍ　　ＡＤ２００３　　　
　　　　　／／　　　ｔｔ　−２９８／／　　　　／／
　　　５Ａｌｉｖａｒｉ＋＋ｓ　　ＡＤＶｌｏｏＯＩ　
　　’　　／／　　　／／　−２９９ｐｉ　　　　／／
　　　ｄｕｒａｎｓ　　ＡＤＶ３００１　　　　　　　
／／　　　／／　−３００／／　　　　Ｉｔ　　　ｍ１
ｎｉｓ　　ＡＤＶ７００１　　　　　　　　／／　　　
＃　−３（）］”　　　　’／　　　ｃｑｕｉｎｕｓ　
　ＡＤＶ８００１　　　　　　　／／　　　Ｉｔ　−３
０２受ｎＬ席号変更届 １召（１１５８年”ｉ　　７１２−ｒ’ｒ−］１、＋を
許ｒコ゛艮官若杉和大　殿 １、事件の表示 昭和５７年特３γＭ第１８９２５３号 ２、発明の名称 コレステロール低ド活性画分の製’Ａｔ力法及び当該活
性両分含有抗ｊｌｌ、＋１脈硬化剤 ３、手続をし九−者 Ｉｔ　Ｉ’ｌとの関係　　　特許出願人住所　　〒１０
３　　東京都中央区日本豹小曲町５芥７′３（１’ＥＬ
　　０３　６６７　１５５１）４．１１１寄託磯関の名
称 通商ｐＩ業省−■、業技術院徽生物工業技術研究所５、
＋ｔ＋受託受託 後−Ｔ：　６Ｎ　１Ｘ’ｉ　’＋：ｌ’第６６２４号（
Ｆ’ｌζＴ＜ｈｌ　　１’−（’１０２４１依１−研菌
寄ギＳＧ　６２５号 （Ｉ・’ＥＲＭ　　＋’−０６２５） 微−１，研菌寄！ｉ’ｓ６１’ｉ２６号（ＦＩりＲＭ　
　Ｐ−６（３２Ｇ＞ 微工研菌寄第６６２７号 （ＦＥＲＭ　　１）−６６２７） １紗−■′、研菌寄第６６２８号 （ＩＦＩζＩＢＭ　　］〕−６６２８）微ｌ研菌寄第６
６２９号 （＋、’ＥＲＭ　　Ｉ？　　６６２９）微１．研ＩＷ寄
ｔｔＳＧ　Ｇ　３０号 （ＦＥｒ？Ｍ　　Ｐ−６６３０） ６、ｔｆ＋寄託機開の名称 通商産業省１業技術院微生物工業技術研究所７、新受託
番号 徴工研条寄第２９６号 （ＦＥＲＭ　　Ｂ■）−２９（３） 徴−１゜耕条寄箔２９７号 ｆＦＥＩ？Ｍ　　１３Ｐ−２９７） 徽土研条寄第２！］８号 （ＦＦＲＭ　　１３Ｐ−２９８） 微工研条寄第２９９号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２９９） 徴■−腓条１ｆｆ第３００号 （ＦＥｆい（１３Ｉ’　−３００） 全土研条寄第３０１号 （Ｆｌ’：ＲＭ　　旧）−３０１） τ孜土研条寄ｊ（’、　：’ｌ　ｌ＞　２号（ＦＥＲＭ
　　ＩＮ’−３０２） ８、添イ；Ｉ！１！類の１１０ （ｔ）　Ｍ受託番号をｆｌｉＦ明する書面　　　　　　
７通（受ハしｉｉ＋１の万）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ストレプトコツカス属に属する微生物を培養
   し、培養物から菌体を採集し、前記菌体を水抽出処理し
   次いで得られる抽出液から分子ｉ：３，５００以上の成
   分含有画分を分取することより成るコレステロール低下
   活性画分の製造方法。 （２１ｔ＃！ｆｉｌｉ′ｆ’　Ｍｉ’Ｊ求の範囲第（ｌ
   ｌ　項Ｋ　記ｅ　〕方法テ４４）　ラれる前記活性画分
   を有効成分として含有することを特徴とする抗動脈硬化
   剤。 （３）　　前記微生物がストレプトコッカス・フェシウ
   ム、ストレプトコッカス・フエカーリス、ストレフトコ
   ツカス・ボービス、ストレプトコシカスＯエビウム、ス
   トレプトコッカスのデユランス、ストレプトコッカス・
   サリヴアリウス、ストレプトコッ力スリミテイス及びス
   トレプトコッカス・イクイヌスより成る群から選択され
   る１ｓ又は２種以上の微生物であることを更に特徴とす
   る特許請求の範囲第（２）項に記載の抗動脈硬化剤。