JPS5980614A - 血栓溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な血栓溶解剤に関する。

血栓症は、外利手術、分娩、外傷あるいは伝染性疾病等
において血管内に血液の結塊を形成されることによって
ひき起こされることが多く、この危険を取り除くべく種
々の試みがなされている。

ヘパリン、クマリン誘導体等の抗凝１（：１剤の検力は
その１例である。他の例は、血栓溶解剤の使用である。

血栓溶解剤は、血栓症において生成した商魂を溶解によ
って血管から移動させる機能を何するものである。

商魂ば、酵素トロンビンの作用によってフイブリノゲン
から形改されたフィブリンで構成されている。一方、正
常な血液はプラスミノーゲンを含有しており、このプラ
スミノーゲンがプラスミンに作用するとフィブリンを溶
解してそれを酵素作用によって分解するものである。循
環する血液は、血管内に而塊が生ずると直ちにこれを劣
化させて取除くために必要なすべての含有物を含んでは
いるが、実際には、身体の自己血栓溶解の潜在能力は、
このような目的を充分満足させることは雉しい。これは
、血中のプラスミノーゲン・アクチベータの濃度が不充
分であることに起因している。

したがって、体外から血栓溶解剤を股布することが血栓
症の有力な治療方法となる。

今日、尿又は培養腎細胞から分離されたプラスミノーゲ
ン・アクテベータであるウロキナーゼ、ストレプトコツ
キから採られるプラスミノーゲン・アクチベータである
ストレプトキナーゼが血栓溶解剤として用いられている
。しかしながら、ウロキナーゼもストレプトキナーゼも
血液から採った正常のプラスミノーゲン・アクチベータ
とは異なるものであり、とくに、これらはフィブリンに
対して特異的な親和性をもっていないので、血栓症の治
療におけるウロキナーゼ及びストレプトキナーゼの使用
結果は、すべての点で必ずしも十分満足できるものでは
ない。所望の効果を得るためには比較的多量の膜力を必
要とするが、大計投与は、フィブリノーゲン溶解あるい
は内出血等の危険な副作用を招く原因となる。したがっ
て、比較的大規模に製造でき、がっ、副作用の少ない高
い血栓溶解活性を有する薬剤の開発が強く要望されてい
る。

本発明者等は、血液から採った正常のプラスミノーゲン
・アクナベータと強い関係をもち、がっ、血栓症の治療
において効果の大きい血栓溶解活性を有するプラスミノ
ーゲン・アクチベータを探索した結果、ヒトの腎臓又は
血管等の組織から新規なプラスミノーゲン・アクチベー
タを分離精製することに成功し、この物質及びその製造
方法についてすでに提案した。先の提案に係る新規なプ
ラスミノーゲン・アクチベータは、ヒト腎臓あるいはヒ
ト血管等から分離精製される組織プラスミノーゲン・ア
クチベータである。Ｋｗ　ａ　ａ　ｎら（Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、２４．３８７（１９６５）　）　もヒト腎臓
組織プラスミノーゲン・アクチベータの研究を行なって
いるが、１（ＬＩＣ１ｎｓｋ　ｉら、Ｂｃｒｎｉｋら、
Ｂａ　ｒ　Ｉ　ｏｗら、ｋｓｌｅｄらあるいはＬｅｗ　
ｉ　ｓのその後の研究により、このようなヒト腎臓組織
の培養により得られるプラスミノーゲン・アクチベータ
はウロキナーゼと免疫学的及び物理化学的に同一である
ことが明らかにされており、ウロキナーゼの副作用が知
られつつある今日、ヒト腎臓等の組織からプラスミノー
ゲン・アクチベータを分離精製し、これを血栓溶解剤と
する勇気を喪失させた。しかるに、本発明者等は、驚く
べきことに、ヒト腎臓やヒト血管から、ウロキナーゼと
全く性質を異にする組織プラスミノーゲン・アクチベー
タの分離精製に成功するとともに、この新規なアクチベ
ータについてあらゆる観点から検討を進める中で、強力
な面栓溶１「Ｈ効力を見い出し、本発明を完成するに至
ったものである。

本発明に係る血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・
アクチベータは、次の特徴を有する。

（１）ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法により、１本のタン白質バンドを
示し、みかけの分子酸が約７０．０００ヒ５．０００で
あること。

（２）等電点電気泳動法による主バンドのｐｉが７〜９
の範囲にあること。

（３）抗つロキナーゼ１ｇＧ−セファロース親和性クロ
マトグラフィーにより吸着されない免疫学的性質を有す
ること。

（４）次のグループＡの物質に加水分解活性を示し、グ
ループＢの物質に活性を示さない物質を有すること。

グループＡ：１−Ｉ−Ｄ−バリルーＩノーロイシル−Ｉ
、　　ＩＪシン−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロライ
ド及びＨ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリルーＬ−アル
ギン−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロライド。

グループ１３　：　１ｌｏｃ　−Ｌ−バリル−Ｌ−プロ
リル−］」−］アルギニンー４−メチルクマリル７−ア
ミド、カルボベンゾギシーＬ−フェニルアラニル−１，
、−フルヤニ／−４−メチルクマリル−７−アミド、Ｌ
−プロリル−Ｌ−７エニルアラニルーＬ−アルギニン−
４−メチルクマリル−７〜アミド、グルタリルグリシル
−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド。

本発明に係る＋ｒ＋を栓溶解剤の成分たるプラスミノー
ゲン・アクチベータは、以上のような特徴的性質を有］
−１当該アクチベータは、フィブリン−セファロースカ
ラムに実質的に全て吸着され、がっ２ＭのＮｉＩ、ＳＣ
Ｎにより溶出され、また組織あるいは血管から１　乃至
２　Ｍ　ノＮＩ％Ｓ　ＣＮ　（＋）Ｉ−１７，４）テｔ
ｉｌｌ出あるいは潅流され、０．１係のトリトンＸ　−
１，００等の存在下でＪＮ製されるものであって、ｐＨ
７，４の緩衝液中４°Ｃで２週間後も安定なものである
。

本発明に係る血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・
アクチベータは、例えば、次のようにして製造される。

ヒト腎臓又はヒト血管から常法によりアンモニウムチオ
シアネートの存在下で抽出し、次いで該抽出液をイオン
交換体を保持するカラム、Ｌ−アルギニンあるいはアル
ギニン誘導体を４ｄ体に結合したカラム、血球凝集素を
担体に結合したカラム、分子篩能な有する担体を保持す
るカラムから選ばれるカラム又はこれらを組み合せた複
数のカラムに通じて精製することにより得ることができ
る。

本発明に係る血栓溶解剤は、以下に示す実施例により自
ずと明らかであるが、成分たるプラスミノ−ケン・アク
チペータは正常細胞由来であることが特記されなければ
ならない。悪性腫瘍細胞由来のプラスミノーゲン・アク
チベータも血栓溶解活性があることが知られているカ瓢
ヒトに投与する医薬としての性格上、長期にあるいは大
酸に投与する場合のあらゆる危険性を考慮するならば、
本発明に係る血栓溶解剤の安全性がその由来においてす
でに確保されている。

更に、ウロキナーゼとは異なり、本発明に係る血栓溶解
剤の１１見分たるプラスミノーゲン・アクチベータは、
１（ＩＬ液から採った正常のプラスミノーゲン・アクチ
ベータと同様な、フィブリンに対する特異な親和性を有
しているので、血栓症の治療に十分４４足しつる結果を
与える。加えて内用（（ＩＬあるいはアナフィラキシ−
・ショック等副作用もなく、本発明に係る血栓溶解剤は
、極めて有効な治療薬である。

本発明に係る血栓溶解剤は、適当な用喰で患者に投与し
てよく、そして副作用が少ないか又はない潜在力及び有
効［（１１栓溶解力をもつ。したがって、本発明の血栓
溶解剤は、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋価基、動脈
閉塞、体外循環及び動脈静脈閉鎖の場合に遭遇するよう
な異なった血管床の急性及び滑性の血栓閉塞を治療する
のに用いられる。

以下本発明の血栓溶解剤を実施例により具体的に説明す
る。

実施例１ 本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・アク
チベータの分離精製 ヒト腎臓のアセトンによる脱脂粉末１００りに、ｐｌ（
、７，４の０．０２Ｍ）リスｔＩｃ＋で緩衝させた２Ｍ
のチオシアン酸アンモニウム５ＱＱ　ｒｎｌを加え、４
°Ｃにて１０時間攪拌した。遠心分離（Ｘ　１３，００
０り、３０分間）により抽出液と沈澱′吻とに分けた。

抽出液を１．ＮＩ−（ＣＩにてｐＨ３，０に調整し、沈
澱物を遠心分離（Ｘ　１．３，０００　’７　、３０分
）により回収した。この沈１殿物なさらに５００　ｍｌ
の１ｍＭのＩＪＤｉ’Ａ　、　０．３　ＭのＮａＣｌ　
、　１０　Ｋ］、Ｕ／７ｎ４アプロチニン、　５　＋ｎ
Ｍイプシロンアミノカプロン’］．’ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　
３Ｑ　を含むｐＬＩ　７．４の０．０１　　モルリン酸
ナトリウム緩衝液（緩衝液Ａ）に溶解した。次にこの緩
衝液にｉｏｏｈｚのフィブリンセライトを加え、４°Ｃ
にて３・０分間攪拌後、遠心分離（　ｘ　３，０００　
９　。

１０分）を行なった。沈澱物を１．００　ｍｌの緩衝液
Ａに再懸濁し、４×１９（ＭＬのカラムに充てん後、５
０（１ｄの緩衝液Ａで洗浄した。次いで、０．４Ｍのア
ルギニンを含んだ緩衝液Ａでプラスミノーゲン・アクチ
ベータを溶出した。溶出液は１０ｉずつフラクノヨンし
た。その結果を第１図及び第１表に示す。この精製法は
約８５係以上の高い回収率を示し、本発明の血栓溶解剤
の成分たるプラスミノーゲン・アクチベータのもつ強力
なフィブリンとの親和性を利用したものである。

第　　１　　表 実施例２ 本発明の血栓溶解剤とウロキナーゼとの血栓溶解作用の
比較 本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・アク
チベータとウロキナーゼとの血栓溶解作用をチャンドラ
・ループ法によって比較した。健康なボランティアの男
子より得た人血液を用いて実験を行なった。正確に５ｍ
／の血液を採取し、３．１係のクエン酸ソーダをＱ、５
ｒｎｌ加えて凝血を防ぎ、さらに１当でラベルしたフィ
ブリノーゲン５０ｚｔｌを加えた。よく混合した後、］
、５ｙ＋／！ずつ分取し、長さ２８ＣＴＬ内径ｏ、３６
ホのタイゴンチュープに入れ、２０ｍＭの塩化カルシウ
ムを加えた後、チューブ′の両端を連結して環状とした
。この環状光１里チューブを］、　７　ｒｐ＋ｎで回転
する２３度の勾配をもつターン・テーブルに固定した。

室温（２４−２５℃）で１時間あるいは２４時間血栓形
成を行なった後チューブを開き１０／ｚｌのザンプルを
１千り、ラジオアイソトープを測定した。その後プラス
ミノーゲン・アクチベータを加え、チューブの両端を閉
じてターン・テーブルで再び回転した。

所定時間後に１０μｍの血液ザンプルを採り、アイソト
ープを測定した。アクチベータの活性は、血１λり 栓より溶解してくる　　■の血液中の量で表わした。

加えた　　■−フィブリノーゲンは、約９５〜９８係の
効率で血栓のポリマーに取り込まれていたが、１時間後
と２４時間後では、クロスリンクの程度に差があり、部
分的にクロスリンクした（　Ｐａｒｔｉａｌ　ｃｒｏｓ
ｓ　ｌ　１ｎｋｅ（１＝ＰＸＬ　）ものと、はぼ完全に
（Ｔｏｔａｌｌｙ　ｃｒｏｓｓ　１ｉｎｋｅｃｌ＝ＴＸ
ＬＪ）クロスリンクしたものが得られた。第２図はｌ”
ＸＬに対する本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノ
ーゲン・アクチベータとウロキナーゼのドースＩ１１に
よる溶解の状態を示したものである。第２図において、
（ａ）はアクチベータの場合を示し、（１））はウロキ
ナーゼの場合を示しており、本発明に係る血栓高解剤の
プラスミノーゲン・アクチベータがウロキナーゼに比較
して非常に効率のよい溶解を起こすことを示している。

反応１０時間憐に（１））の系に（２１）と同歌の本発
明に係る血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・アク
チベータを加えると、はぼ完全な溶１ｒ１イが誘発され
た（第２図（Ｃ））。

第２図において各点は３つの実験値の平均値を示９ しており、アクチベータの濃度を１×１０　Ｍとした場
合、本発明の成分たるアクチベータはＩＩ）ＸＬを２０
時間後にはほぼ完全に溶解しているが、ウロキナーゼは
、その約４０チを溶出しているにすぎない。そこでこの
系に１０時間後にさらに本発明のアクチベータを追加す
るとほぼ完全な　Ｉの放出が起っており当該アクチベー
タが強い血栓溶解作用を有することを示している。また
完全にクロスリンクした血栓を使用した実験ではウロキ
ナーゼは３５係の溶解を２０時間後に示したにずぎない
が、本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲン・
アクチベータでは９０チの溶解を示した。

一方、コントロールとして全くアクチベータを注入しな
い場合は　■の放出は全く検出されず血栓の溶解がアク
チベータに依存していることを示している。

実施例３ 各種動物血栓に対する本発明に係る＋（＋１枠溶解剤の
作用 実施例２と同様な方法で各押動物より採血な行ない１時
間後にクロスリンクした血栓（１）ＸＬ）をその動物の
血漿中で本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノーゲ
ン・アクチベータを働かせその溶解作用を調べた。各々
の実験でアクチベータの濃度を２０ＩＵ／ｄとし反応開
始後１０時間までその溶解状態を１２５１のクロットか
もの放出によって測定した。この系でもバックグランド
はほとんどアクチベータを住人しない時と同様で１０時
間後もわずか２〜３係が検出されるにすぎなかった。

これとは対照的にヒトの系では、はぼ９６係が溶解され
た。ヒト及び各種動物について溶解度を測定した結果を
第３図に示す。第３図において、（ａ）はヒト、（１）
）はザル、（Ｃ）はラビット、（（１）はイヌ、（ｅ）
はラットの場合をそれぞれ示している。

第３図に示されるように、動物によって溶解の程度は鴇
なっているが、ザルの場合はヒトと同様によく働いてい
るが、ラットの場合は溶解作用はよくない。本発明に係
る血栓溶解剤はヒトあるいはザルに特異的な酵素である
ことがこれによって示される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の血栓溶解剤の成分たるプラスミノー
ゲン・アクチベータを実施例１に示す方法によって溶出
したときの溶出曲線である。 第２図は、本発明の血栓溶解剤とウロキナーゼとの血栓
溶解作用を比較した図であって、（ａ）は本発明の血栓
溶解剤、（ｂ）はウロキナーゼ、（Ｃ）はウロキナーゼ
に１０時間後本発明の血栓溶解剤を加えた場合をそれぞ
れ示す。 第３図はヒト及び各種動物の血栓に対する本発明の血栓
溶解剤の血栓溶解効果を示す図である。 第３図において、（ａ）はヒト、（ｂ）はサル、（Ｃ）
はラビット、（ｄ）はイヌ、（ｅ）はラットの場合をそ
れぞれ示す。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 第　　　１　　　　図 １’ｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｏ、（フラクション）第　　２
　　図 ５　１０　１５　２０ 時　　間 第　　　３　　　図 ２．５５７．５１０ 時　　　間 手　　続　　補　　正　　書 昭和５８年７月７日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１８９０６５号 ２、発明の名称 血栓溶解剤 ３、補正をする者 明細書の「特許請求の範囲」および［４色り］の詳細な
説明］の欄 ５、補正の内容 （１）明５細書の「ｌ特許請求の範囲」を別紙のとおり
訂１１丁する。 （２）　　四〇頁７〜８行の「により、１本のタン白質
バンドを示し、」とあるな「による主要なタン白質バン
ドの１と訂正する。 に（）　　同１１頁２行の［８５チリ、ｌｊとあるを「
３０チ」と訂正ず−る。 （４）　　同１１頁第１表のタン内情の１ｌｆｌの「８
４１とあるを「２１」と訂正する。 （５）　　同１１貞第１表の総活性の欄の「９５」とあ
るを「６２」と訂正する。 （６）　　同１１頁第１表の総活性の］閘の「８０」と
あるな「２９」と訂正する。 特許出）頓人　三井東）モ化学株式会社別紙 特許請求の範囲 １８次の特徴を有するプラスミノーゲン・アクチベータ
を成分とする血栓溶解剤。 （１）　　ナトリウムドデシルサルフェート−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法による主咲なタン白質バンド
のみかけの分子喰が約７０，０００上５．０００である
こと。 （２）等電点電気泳動法による主バンドのｐｌ　が７〜
９の範囲にあること。 （３）　　眸つロキナーゼＩｇＧ−セファロース親和性
クロマトグラフィーにより吸着されない免疫学的性質を
有すること。 （４）次のグループへの物質に加水分）質店性を示し、
グループＩ３の物質に活性を示さない性質を有すること
。 グループＡ：１（−１）−バリル−Ｌ−ロインルーＬ−
ｌＪ／ンー１）−二トロアニリトシヒドロクロライド及
びＩ−１−Ｄ−イソロイシル−Ｌ　、−プロリル−Ｌ−
アルギニン−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロライド。 グループＤ　：　Ｂｏｃ　−Ｉノーバリル−Ｌ−プロワ
／Ｌ／　−Ｌ　　７　ルキーンー４−メチルクマリル−
７−アミド、カルボベンゾキン−Ｌ−フェニルアラニル
−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド、
Ｉノープロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−フルキニ
ン−４−メチルクマリル−７−アミド、グルタリルグリ
シル−１ノーアルギニン−４−メチルクマリル−７−ア
ミド。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 】６次の特徴を有するプラスミノーゲン・アクチベータ
   を成分とする血栓溶解剤。 （１）ナトリウムドデシルザルフェ−１・−ポリアクリ
   ルアミドゲル電気泳動法により、１本のタン白質バンド
   を示し、みがけの分子量が約７０．０００上５，０００
   　であること。 （２）等電点電気泳動法による主バンドのｐＩが７−９
   の範囲にあること。 （３）　抗つロギナーゼＩｇＧ−セファロース親和性ク
   ロマトグラフィーにより吸着されない免疫学的性質を有
   すること。 （４）次のグループＡの物質に加水分ＩＱイ活性を示し
   、グループＩ３の物質に活性を示さない性質を有するこ
   と。 グループＡ：ＩＩ−ｆ）−バリル−１ノーロイシル−Ｌ
   　−Ｉ＋ンンーｐ−ニトロアニリドジヒドロクロライド
   及びｌ−１−Ｄ−イノロイシル−］］Ｊ−プロリルーＬ
   −フルギニコン１〕二トロアニリドジヒドロクロライド
   。 グループ１３　：１３ｏｃ　　Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ
   ル−し−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド
   、カルボベンゾキノ−■ノーフェニルアラニルー■Ｊ−
   アルギニン−４−メチルクマＩ）ルア　　７ミｌ’、１
   ．Ｊ−フロリルー　１−、−フェニルアラニル−Ｌ−ア
   ルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド、グルタリ
   ルグリシル−Ｌ−アルギニン−４−メチルクマリル−７
   −アミド。