JPS5982091A - バイオプテリンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は６−（Ｒ）−Ｌ−エリスロー５　、６　、７゜
８−テトラヒドロバイオプテリン（以下、６−（Ｒ）−
Ｌ　−１）ＦＨ４と略す）の製造に関する。

さらに詳しくは酸素法による８−ＣＲ）−Ｌ−ＢＰＨ，
の製造の改良方法に関する。

バイオプテリンには、例えば、その６位の炭素原子の側
鎖の相対配置により、Ｄ−系列とＬ−系列があシ、また
、そのテトラヒドロ体には、６位の炭素原子における絶
佳配置によって（Ｒ）−またはＣ３）−という２つのジ
アステレオマーが存在することが知られている（　Ｆｕ
ｒｒｅｒ、Ｈ，Ｊ、Ｓ、Ｈｅ１ｖ。

Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、　６２　、２５７７　（１９７９
）　）。すなわち一般式（Ｉ） で示されろテトラヒドロプテリン誘導体において（２） −Ｌ　−Ｂ　Ｐ　Ｈ＜である。

６−　（Ｒ）　−Ｌ　−ＢＰＨａは生体内に存在し、フ
ェニルアラニン水酸化酵素の補酵素であると同時例、他
の芳香族アミノ酸水酸化酵素の補酵素としても働いてい
る。そのために、６−　（７ｉ’）　−Ｌ　−Ｂ　Ｐｌ
ｈの欠乏は、神経伝達物質であるセロトニン、ドーパミ
ン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどの欠乏をもた
らし、重篤な神経症状をもたらす。例えば脂性フェニル
ケトン尿症などが知られておシ、事実、６−　ＣＲ）　
−Ｃ８）−テトラヒドロバイオプテリン投与による先駆
的な治療成果も報告されている〔Ｎｉｅｄｅｒｗｉｅｓ
ｅｒ、Ａ、らＬａｎｃｅｔ　１　５５０（１９７９）；
　Ｃｗｒｔｉｕｓ、Ｈ−Ｃ１ｌ　、らＣ１１ｎ、Ｃｈｉ
ｍ。

Ａｃｔａ　９Ｂ　、　２５１〜２６２　（１９７９）　
〕。

テトラヒドロバイオプテリンを化学的に合成する試みは
多くなされてお勺、例えばＬ−バイオプテリンをトリフ
ルオル酢酸中、Ｐｔ、Ｐｄ等を用い接触還元してテトラ
ヒドロ体を得る方法がある。しかしながら得られるテト
ラヒドロ体は１ｍのジアステレオマーの混合物であシ、
分割して６−（Ｒ）（３） −Ｌ　−ＢＰＨ＜を単離する試みは高速液体クロマトグ
ラフィーによシ分割した例があるのみである。

またＬ−バイオプテリンを無水酢酸によりアセチル化し
、トリアセチル体としたのち、接触還元し、さらにアセ
チル化し、分別結晶による分割も報告されているＣＶｉ
ｓｃｏｎｔｉｎｉ、Ｍ、らＨｅ１ｖ、Ｃｈｉｍ。

Ａｃｔａ、６２　２５７７（１９７９）、）が、実験操
作の煩雑さ、収率の悪さなど、多情の混合物の分割には
適当でない。

このことは、生成物が非常例酸素に対して不安定なこと
による。

一方、一般式（Ｉｆ） で示されるジヒドロ葉酸は、生体内例おける葉酸の重要
な代謝中間物質であシ、このものは生体内でジヒドロ葉
酸還元酵素（以下ＤＨＦＲと略す）（４） 葉酸に還元される。

又、Ｌ−バイオプテリンを水酸化ナトリウムと亜鉛粉末
を用いて化学的に還元すると、収率よく、７．８−ジヒ
ドロ−Ｌ−バイオプテリン（以下、Ｌ　−ＢＰＨ，と略
す）Ｋ還元される。ジヒドロ葉酸と同様にＬ　−ＢＰＩ
ｉ、にＤＨＦＲを用いて６−（Ｒ）−Ｌ　−ＢＰＩｈを
得る試みは報告されている〔渡辺ら、生化学、第５８巻
、第８号　ｐ１００８（１９８０）］が、多量の６−　
（Ｒ）　−Ｌ　−Ｂ　ＰＨ＜を得るには、以下の理由に
より実際的でない。

すなわち、亜鉛粉末を用いＬ−バイオプテリンを還元す
る反応液中にＤＨＦＢを阻害する微量の副生物を生じる
こと。またＬ　−ＥＰＨ，を単離して酸素反応に用いよ
うとすると結晶Ｌ　−Ｂ　Ｐ　Ｈ＜は水に難溶であるた
めに以後の反応液量が多くなること。さらに、６−　（
７？）　−Ｌ　−ＢＰＩｈが不安定なため、反応終了液
よシ脱塩操作が困難なことなど多（５） くの問題があり、特に脱塩操作の困難性は大量合成を不
可能としている。

本発明者らは、この酸素法によるＬ　−ＢＰＨ＜の製造
の改良を鋭意研究した結果、反応終了後安定化剤として
、Ｌ−アスコルビン酸およびＬ−システィン１霊酸塩を
反応液中に添加することによシ安定的かつ精製の容易な
製造法を見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明はＬ−バイオプテリンをアルカリ存在下
：亜鉛粉末等の還元剤で還元し、必要に応じて、ＤＨＦ
Ｒの阻害物質を除去し、Ｌ　−Ｂ　ＰＩｌｔを得、これ
を単離せず、反応液にさらに還元型ニコチンアミドアデ
ニンヌクレオチドリン酸ＣＮＡＤＰＨ）、グルコース−
６リン酸（ＧＡＰ）、グルコース６リン酸還元酵素（０
６ＰＤＨ）およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＩＩＦＲ）
を加え酵素還元反応を遂行せしめ、反応終了後、安定化
剤としてＬ−アスコルビン酸およびＬ−システィンｔＪ
ｎＬ安定的に精製することを骨子とする。

安定化剤の添加の割合は重量比でＬ−アスコル（６） ピン酸：Ｌ−システィン−１：２〜１：３でよく、Ｌ−
ＢＰＩＩ４に対してＬ−アスコルビン酸が添以上であれ
ば良い。

安定化剤の添加後、活性炭カラム、ＣＭ−セファデック
スカラム等の通常用いられる精製法によって精製し、安
定化剤を含む６−　（Ｒ）　−Ｌ　−ＢＰＨ４を得、次
いでＣＡ／Ｉセファデックスに吸着せしめ、蒸留水（必
要に応じて上述の安定化剤を含む）でカラムを水洗し、
ＮＡＤＰＨ，Ｇ６Ｐ、Ｇ６ＰＤＪ−１゜Ｄ　Ｉｉ’　Ｆ
　Ｒおよび未反応のＬ−ＢＰ、Ｌ−ＢＰＩＩ２を除去し
、安定化剤を含むＪ穐酸で溶出せしめ、安定化剤を含む
６−　（Ｉｒ）−ＢｐＨ４の２塩酸塩を得ろ。

安定化剤を除去するには、嫌気下、例えばアルゴン気流
下に、Ｃ、Ｍ−セファデックス等のカラム処理を行う。

これによシ精製された６　−（Ｒ）　−Ｌ−ＢＰＪＩ４
・２塩酸塩が得られる。

つぎに本発明を実施例をあげて詳しく説明する。

実施例１ ６　（Ｒ）　−Ｌ−エリスロー５，６，７．８−テトラ
ヒトロバ゛イオ７°テシ′ン（Ｌ−６Ｒ−ＢＰＩｈ）の
製造（７） バイオプテリン１５２を２５５１の２Ｎ水酸化ナトリウ
ムに溶解し、蒸留水２５５ｄを加え亜鉛粉末１６．３５
９を加え、窒素気流下２時間攪拌する。反応後、セファ
デックスＧ−２５（直径８．５閏、長さ１５ＣＩｎ）の
カラムを通過せしめたのち、カラムを蒸留水１５０１で
洗う。通過液と洗液とは合せて、水浴中、５０チ酢酸７
８−でｐＨ５，８に調整し、Ｌ−ジヒド゛ρバイオプテ
リン水溶液を得る。２に容三頚フラスコに移しグルコー
ス６リン酸５７１を蒸留水３００ｄに溶解したもの、β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型
１ｆを５チ酢酸ナトリウム１００酩に溶解したもの、グ
ルコース６リン酸還元酵素１０．００　ｃｉＵを蒸留水
８０ＦｄＫ溶解したものを加え、更に蒸留水１００ａを
加え、全社を約］６５１とする。反応液を真空ポンプを
用いてアルゴン置換し、ジヒドロ葉酸還元酵素２０００
Ｕを１０ｍｕ　’Ｊン酸緩衝液ｐＨ５，６２０ｍに溶解
したものを加え、酵素反応を開始する。

（８） ８７℃の温水浴上、アルゴン通気下で１４時間ｍ拌した
のち、Ｌ−アスコルビン酸１５ｆ、Ｌ−システィン塩酸
塩７．５９を加え減圧濾過し、涙液は活性炭のカラム（
武田製薬製の白鷺）（直径６σ長さ８０ｃｆｎ）を通過
させて、Ｊ、　−６Ｒ−ＢＰＩｈを吸着させる。カラム
を、０．１％Ｌ−アスコルビン酸および０．０５％のＬ
−システィン塩酸塩を含む蒸留水（以下ＶＣ液とする）
１５２で洗ったのち、アセトン：ＶＣ液−４：１に混合
した溶出液２ＣＭ？で溶出する。

溶出液を減圧下、ＩＥに濃縮してアセトンを留去し、減
圧濾過すると、粗精製Ｌ　−６Ｒ−Ｂ　Ｐ　Ｈ＜溶液が
得られる。

この溶液を０．０２５４　Ｌ−アスコルビン酸、０．０
１２５％Ｌ−システィン塩酸塩を含む蒸留水（以下０．
２５ＶＣ液とする）で平衡化した、ＣＭ−セファデック
スｃｍｚ５ｕｊ＋型、直径６（ｍ長さ８０ｃｒｎ）のカ
ラムを通過させ、Ｌ　−６Ｒ−ＢＰＢＩを吸着させろ。

カラムを０．２５無酸素ＶＣ液２０ｐで洗った後、５０
　ｍＭの塩酸を含む無酸素０．２５（９） ＶＣ液３ｐで溶出する。

溶出液を減圧乾固し、６規定塩酸２ｍｌを含むメタノー
ル２０ｍＡに溶解し、エーテル２５０ｍ／を加え沈殿さ
せる。更にエーテル５００−で沈殿を洗い、減圧乾燥す
ると４％Ｌ−アスコルビン酸、２％Ｌ−システィン塩酸
塩を含む６　（Ｒ）　−Ｌ−ＢＰＨ４の２塩酸塩が、白
色粉末として、１４，５ｆ得られた。（収量６８％） 得られた安定剤を含むＬ　−６Ｒ−ＢＰＨ＜２塩酸塩２
００ｍｇを、０．２５ＶＣ液６ｄに溶解し、０．２５Ｖ
Ｃ液で予め平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−２５Ｃ
ｆＩ＋型、直径１Ｃ１ｎ長さ１０　ｃｍ　）のカラムを
通過させ４℃、アルゴン気流下で、アルゴン置換蒸留水
１００＋ｎＡで洗ったのち、アルゴン置換８０　ｍＭ塩
酸で溶出する。凍結乾燥を行なうと、白色粉末１５０Ｉ
ｎ９が得られる。０−Ｉ　Ｎ　ＩＥＩ中で〔α〕、を測
定すると、 〔α）２５’＝　　６．Ｂｏ（Ｃ＝１，７　；　０ＩＮ
ＩＩＣＩ）の値を示し、ビスコンチ、＝−（Ｖｉ　ｓ　
ｃ　ｏｎｔ　ｉｎｉ　、前出）の報告している値と一致
した。また、０．１　ＮＩＩＣＩ（１０） 中でのＵＶ吸収は、 λｍｚ２６５　ｅ　−１，５２±０．０’７Ｘ１吋Ｍ−
’ａｍ−’の値を示した。

この生成物の０．　ｌ　ＮＤＣｌ　／Ｄ２０中のｐ、ｍ
、ｒ、スペクトルは第１図に示すとおりである。

ＰＭＲＣ８６０ＭＨｚ）、ＩＪＩ　Ｃａ、８Ｈ）、３．
６２　（α、α、ｌＨ）、３．７７〜３．９３（ｍ、４
Ｈ）

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた６　（Ｒ）　−Ｌ−ＢＰＨ
４−２塩酸塩の０．　Ｉ　ＮＤＣＩ　／Ｄ２０　中のｐ
、ｍ、ｒ、ス（クトルである。 特許出願人　サン）　ＩＪ−株式会社 （外４名） 手　　続　　補　　正　　書 昭和５８年７０月６日 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１９０１６０　号 ２、発明の名称 バイオプテリンの製法 ６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄 ＼ 乙補、正の内容 明細書を次のように訂正する。 頁　　　　行　　　　訂正前　　　　　　訂正後２　　
　１０　　　給体　　　　　　　絶対６　　　９　　面
性　　　　　　　悪性３　　　　’１０　　６−（Ｒ）
−６−（Ｒ，５）（Ｓ） ７　　　　１　１：２〜１：３　　２：１〜６：１９　
　　４　　製薬　　　　　　　薬品９　　　１９　　０
．２５無酸素　　　無酸素０，２５１１　　　２　　　
Ｍ　　　　　　　　　ｍｏｌｌｅｌｌ　　　６　　α　
　　　　　　　ｄｌｌ　　　７　　α、α　　　　　　
ｄ４以　　　　上 〜５０３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　Ｚ、−７，８−ジヒドロバイオプテリン（Ｚ、
   −ＢＰＨ，）をジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＰＲ）によ
   って還元し、次いでＬ−アスコルビン酸及びＬ−システ
   ィン塩酸塩を添加し精製することを特徴とする６　−（
   Ｒ）　−Ｌ−エリスロー５，６．？、８−テトラヒドロ
   バイオプテリンの製造法。 （２）Ｌ−バイオプテリンをアルカリ存在下、亜鉛粉末
   で還元し、得られたＺ、−７，８−ジヒドロバイオプテ
   リンを分子篩で処理してジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ
   Ｒ）の阻害物質を除去し、Ｌ−７゜８−ジヒドロバイオ
   プテリン（Ｌ−ＢＰＨ２）をジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ
   ＨＦＲ）によって還元し、次いでＬ−アスコルビン酸及
   びＬ−システィン塩酸塩を添加し精製することを特徴と
   する６　−（Ｒ）　−Ｌ−エリスロー５，６，７．８−
   テトラヒドロバイオプテリンの製造法。 （１）