JPH059065B2

JPH059065B2 -

Info

Publication number: JPH059065B2
Application number: JP19016082A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Nakatsuka; Kazumori Yamamoto
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1982-10-29
Filing date: 1982-10-29
Publication date: 1993-02-03
Also published as: JPS5982091A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は６−(R)−Ｌ−エリスロ−５，６，７，
８−テトラヒドロバイオプテリン（以下、６−(R)
−Ｌ−BPH₄と略す）の製造に関する。さらに詳しくは酵素法による６−(R)−Ｌ−
BPH₄の製造の改良方法に関する。バイオプテリンには、例えば、その６位の炭素
原子の側鎖の相対配置により、Ｄ−系列とＬ−系
列があり、また、そのテトラヒドロ体には、６位
の炭素原子における絶対配置によつて(R)−または
(S)−という２つのジアステレオマーが存在するこ
とが知られている〔Furrer，H.J.S.Helu.Chim.
Acta，62，2577（1979）〕。すなわち一般式（）で示されるテトラヒドロプテリン誘導体において
R₁が

【式】であるものが６−(R)−Ｌ −BPH₄である。６−(R)−Ｌ−BPH₄は生体内に存在し、フエニ
ルアラニンン水酸化酵素の補酵素であると同時
に、他の芳香族アミノ酸水酸化酵素の補酵素とし
ても働いている。そのために、６−(R)−Ｌ−
BPH₄の欠乏は、神経伝達物質であるセロトニ
ン、ドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリ
ンなどの欠乏をもたらし、重篶な神経症状をもた
らす。例えば悪性フエニルケトン尿症などが知ら
れており、事実、６−（Ｒ、Ｓ）−テトラヒドロバ
イオプテリン投与による先駆的な治療成果も報告
されている〔Niederwieser.A.らLancet １
550（1979）；Curtius，Ｈ−CH.5Clin.Chim.Acta
93，251〜262（1979）〕。テトラヒドロバイオプテリンを化学的に合成す
る試みは多くされており、例えばＬ−バイオプテ
リンをトリフルオル酢酸中、Pt.Pd等を用い接触
還元してテトラヒドロ体を得る方法がある。しか
しながら得られるテトラヒドロ体は１組のジアス
テレオマーの混合物であり、分割して６−(R)−Ｌ
−BPH₄を単離する試みは高速液体クロマトグラ
フイーにより分割した例があるのみである。またＬ−バイオプテリンを無水酢酸によりアセ
チル化し、トリアセチル体としたのち、接触還元
し、さらにアセチル化し、分別結晶による分割も
報告されている〔Viscontini，M.らHelu.Chim.
Acta，62 2577（1979）〕が、実験操作の煩雑さ、
収率の悪さなど、多量の混合物の分割には適当で
ない。このことは、生成物が非常に酸素に対して不安
定なことによる。一方、一般式（）（R₁が）で示されるジヒドロ葉酸は、生体内における葉
酸の重要な代謝中間物質であり、このものは生体
内でジヒドロ葉酸環元酵素（以下DHFRと略す）
によつて一般式（）においてR₁がであるテトラジヒドロ葉酸に還元される。又、Ｌ−バイオプテリンを水酸化ナトリウムと
亜鉛粉末を用いて化学的に還元すると、収率よ
く、７，８−ジヒドロ−Ｌ−バイオプテリン（以
下、Ｌ−BPH₂と略す）に還元される。ジヒドロ
葉酸と同様にＬ−BPH₂にDHFRを用いて６−(R)
−Ｌ−BPH₄を得る試み報告されている〔渡辺
ら、生化学、第53巻、第８号 p1008（1980）〕
が、多量の６−(R)−Ｌ−BPH₄を得るには、以下
の理由により実際的でない。すなわち、亜鉛粉末を用いＬ−バイオプテリン
を還元する反応液中にDHFRを阻害する微量の
副生物を生じること。またＬ−BPH₂を単離して
酵素反応に用いようとすると結晶Ｌ−BPH₄は水
に難溶であるために以後の反応液量が多くなるこ
と。さらに、６−(R)−Ｌ−BPH₄が不安定なた
め、反応終了液より脱塩操作が困難なことなど多
くの問題があり、特に脱塩操作の困難性は大量合
成を不可能としている。本発明者らは、この酵素法によるＬ−BPH₄の
製造の改良を増意研究した結果、反応終了後安定
化剤として、Ｌ−アスコルビン酸およびＬ−シス
テイン塩酸塩を反応液中に添加することにより安
定的かつ精製の容易な製造法を見出し、本発明を
完成した。すなわち本発明はＬ−バイオプテリンをアルカ
リ存在下：亜鉛粉末等の還元剤で還元し、必要に
応じて、DHFRの阻害物質を除去し、Ｌ−BPH₂
を得、これを単離せず、反応液にさらに還元型ニ
コチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸
（NADPH）、グルコース−６リン酸（G6P）、グ
リコース６リン酸還元酵素（G6PDH）およびジ
ヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を加え酵素還元
反応を遂行せしめ、反応終了後、安定化剤として
Ｌ−アスコルビン酸およびＬ−システインを加え
安定的に精製することを骨子とする。安定化剤の添加の割合は重量比でＬ−アスコル
ビン酸：Ｌ−システイン＝２：１〜３：１でよ
く、Ｌ−BPH₄に対してＬ−アスコルビン酸が
１／10以上であれば良い。安定化剤の添加後、活性炭カラム、CM−セフ
アデツクスカラム等の通常用いられる精製法によ
つて精製し、安定化剤を含む６−(R)−Ｌ−BPH₄
を得、次いでCMセフアデツクスに吸着せしめ、
蒸留水（必要に応じて上述の安定化剤を含む）で
カラムを水洗し、NADPH、G6P、G6PDH、
DHFRおよび未反応のＬ−BP、Ｌ−BPH₂を除
去し、安定化剤を含む塩酸で溶出せしめ、安定化
剤を含む６−(R)）−Ｌ−BPH₄の２塩酸塩を得る。安定化剤を除去するには、嫌気下、例えばアル
ゴン気流下に、CM−セフアデツクス等のカラム
処理を行う。これにより精製された６−(R)−Ｌ−
BPH₄・２塩酸塩が得られる。つぎに本発明を実施例をあげて詳しく説明す
る。実施例１６(R)−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラ
ヒドロバイオプテリン（Ｌ−6R−BPH₄）の製
造法バイオプテリン15gを255mlの2N水酸化ナトリ
ウムに溶解し、蒸留水255mlを加え亜鉛粉末
16.35gを加え、窒素気流下２時間撹拌する。反応
後、セフアデツクスＧ−25（直径3.5cm、長さ15
cm）のカラムを通過せしめたのち、カラムを蒸留
水150mlで洗う。通過液と洗液とは合せて、氷浴
中、50％酢酸78mlでPH5.8に調整し、Ｌ−ジヒド
ロバイオプテリン水溶液を得る。２容三頚フラ
スコに移しグルコース６リン酸57gを蒸留水300
mlに溶解したもの、β−ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸還元型1gを５％酢酸ナト
リウム100mlに溶解したもの、グルコース６リン
酸還元酵素10000Uを蒸留水30mlに溶解したもの
を加え、更に蒸留水100mlを加え、全量を約1.5
とする。反応液を真空ポンプを用いてアルゴン置
換し、ジヒドロ葉酸還元酵素2000Uを10mMリン
酸緩衝液PH5.6 20mlに溶解したものを加え、酵素
反応を開始する。 37℃の温水浴上、アルゴン通気下で14時間撹拌
したのち、Ｌ−アスコルビン酸15g、Ｌ−システ
イン塩酸塩7.5gを加え減圧過し、液は活性炭
のカラム（武田薬品の白鷲）（直径６cm長さ30cm）
を通過させて、Ｌ−6R−BPH₄を吸着させる。カ
ラムを、0.1％Ｌ−アスコルビン酸および0.05％
のＬ−システイン塩酸塩を含む蒸留水（以下VC
液とする）15で洗つたのち、アセトン：VC液
＝４：１に混合した溶出液20で溶出する。溶出液を減圧下、１に濃縮してアセトンを留
去し、減圧過すると、粗精製Ｌ−6R−BPH₄溶
液が得られる。この溶液を0.025％Ｌ−アスコルビン酸、
0.0125％Ｌ−システイン塩酸塩を含む蒸留水（以
下0.25VC液とする）で平衡化した、CM−セフア
デツススＣ−25（H⁺型、直径６cm長さ30cm）のカ
ラムを通過させ、Ｌ−6R−BPH₄を吸着させる。
カラムを無酸素0.25VC液20で洗つた後、
50mMの塩酸を含む無酸素0.25VC液３で溶出
する。溶出液を減圧乾固し、６規定塩酸２mlを含むメ
タノール20mlに溶解し、エーテル250mlを加え沈
殿させる。更にエーテル500mlで沈殿を洗い、減
圧乾燥すると４％Ｌ−アスコルビン酸、２％Ｌ−
システイン塩酸塩を含む６(R)−Ｌ−BPH₄の２塩
酸塩が、白色粉末として、14.5g得られた。（収量
68％）得られた安定剤を含むＬ−6R−BPH₄2塩酸塩
200mgを、0.25VC液６mlに溶解し、0.25VC液で
予め平衡化したCM−セフアデツクスＣ−25（H⁺
型、直径１cm長さ10cm）のカラムを通過させ４
℃、アルゴン気流下で、アルゴン置換蒸留水100
mlで洗つたのち、アルゴン置換30mM塩酸で溶出
する。凍結乾燥を行なうと、白色粉末150mgが得
られる。0.1N HCl中で〔α〕_Dを測定すると、〔α〕²⁵゜_D＝−6.8゜（Ｃ＝1.7；0.1NHCl）の値を示し、ビスコンチニ（Viscontini、前出）
の報告している値と一致した。また、0.1NHCl
中でのUV吸収は、 λ_nax265ε＝1.52±0.07×10⁴mole^-1cm^-1の値を示
した。この生成物の0.1NDCl／D₂O中のp.m.r.スペク
トルは第１図に示すとおりである。 PMR（360MHz）、1.31（ｄ，3H）、3.62（ｄ，ｄ，
1H）、3.77〜3.93（ｍ，4H）

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた６(R)−Ｌ−
BPH₄・２塩酸塩の0.1NDCl／D₂O中のp.m.r.ス
ペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】１Ｌ−７，８−ジヒドロバイオプテリン（Ｌ−
BPH₂）をジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）によ
つて還元し、次いでＬ−アスコルビン酸及びＬ−
システイン塩酸塩を添加し精製することを特徴と
する６−(R)−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テ
トラヒドロバイオプテリンの製造法。２Ｌ−バイオプテリンをアルカリ存在下、亜鉛
粉末で還元し、得られたＬ−７，８−ジヒドロバ
イオプテリンを分子篩で処理してジヒドロ葉酸還
元酵素（DHFR）の阻害物質を除去し、Ｌ−７，
８−ジヒドロバイオプテリン（Ｌ−BPH₂）をジ
ヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）によつて還元し、
次いでＬ−アスコルビン酸及びＬ−システイン塩
酸塩を添加し精製することを特徴とする６−(R)−
Ｌ−エリスロ−５，６，７，８−テトラヒドロバ
イオプテリンの製造法。