JPS5982100A - 細胞物質検出方法とそれに用いる化学試験試薬系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は、生物学的流体のような液体中の細胞物質、例
えば、体細胞、微生物細胞もしくは細胞層を検出するた
めの方法及び手段に関し、更に詳しくは、液体試験試料
中の補酵素フラピンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ　
）の存在量を測定することによって、細胞物質を検出す
る方法及び手段に関する。

〔発明の技術的背景とその問題点〕

古典的な細胞検出方法は多大な時間と労力を費す培養法
を必要とする。この方法では、試験試料中のどの細胞も
、その細胞集落が目に見ることができ、計数できる点ま
で、さもなくば、更なる試験のために取扱うことができ
る点まで増殖せしめる。古典的な培養法には多くの欠点
があるが、これに代る簡単な方法が無かったので、この
方法は細胞（とりわけ、バクテリア細胞）の検出及び同
定の一般的方法として、今なお、用いられている。

これまで研究されてきた、細胞（とりわけ、バクテリア
細胞）を検出するための間接的方法の多くは、酵素アデ
ノシン三リン酸（ＡＴＰ　）を検出することを必要とす
る。この方法では、先ず、細胞を破壊して細胞のＡＴＰ
を放出せしめ、酵素的生物発光分析によってこれを測定
する。この分析は、ＡＴＰその他の臨界補因子の存在下
で、酵素ルシフェラーゼをその基質ルシフェリンに作用
させることからなる、螢の生物発光反応を利用するもの
である。この方法の代表的なものは、米国特許第３，７
４５，０９０　ｉ３．９７１，７０３及び４　、２８３
　、４９０号、並びに、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｍｏｌｏｇｙ、　５７　６５−７２　（１９７８）に教
示されている。しかしながら、ＡＴＰ生物発光法は、普
通、臨床実験室では見かけない生物発光検出装置を必要
とするという大きな欠点を有している。

ところで、ＡＴＰ以外にも、種々の細胞間酵素補因子、
例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ）とそのリン酸エステル誘導体（ＮＡＤＰ）、ピリド
キシルホスフェ−）　（ＰＬＰ　）、テトラヒドロ葉酸
、チアミンピロホスフェ−）　（ＴＰＰ　）、補酵素Ａ
（ＣＯＡ）、ビオチン、ヘム含有分子、（マグネシウム
、亜鉛及びマンガンのような）金属イオン及びフラビン
アデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）等が一般に知られて
いる（　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏ−１ｏｇｙ＋　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　ａｎｄ　Ｉｎｍ
ｕｎｉｔｙ、　ＷｉｌｓｏｎとＭｉｌｅｓの共著、Ｅｄ
ｗａｒｄ　Ａｒｎｏｌｄ　、Ｔ、ｔｄ、　（出版社）。

（ロンドン）第６版１９７５年〕。しかし、これら他の
補因子Ｃ主としてＮＡＤ）が試験液体中の細胞及び細胞
物質の検出に用いられるのけ極く限られた場合のみであ
った。

例えば、ＦＡＤとアポ（グルコースオキシダーゼ）との
相互作用はＳｗｏｂｏｄａによって研究されている（　
Ｂｉｏｃｈｉｍ、　１３ｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１
７５　：　３６５−３８７　（１９６９）、　）。

また、特異結合分析、例えば、均一系競合的結合免疫分
析における標識としてＦＡＤの利用が、本願出願人によ
る米国特許第４．．２３８，５６５号に記載されている
。

〔発明の目的〕

本発明は液体試験試料中の細胞物質を簡易かつ迅速に測
定することができる方法及び試験試薬を提供することを
目的とする。

〔発明の概要〕

本発明者は、フラピンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ
）を測定することによって、液体試料中の細胞物質を簡
便かつ有利に検出できることを見い出し、本発明を完成
するに至った。

当然、本発明は種々様々な分析に適用することができ、
例えば、生物学的流体中の微生物感染を、試験試料中の
ＰＡＤ−ｉと非感染試料中のＦＡＤ量とを比較して検出
するのに有用である。

本発明は次の２つの主要な段階から々る：即ち、 （１）液体試験試料中のＦＡＤ量を測定する段階と、 （２）　　その測定された量と照合試料中のＦＡＤ量に
相当する標準品とを比較する段階とから成る。

試験対象の液体が生物学的流体である場合には、照合試
料は幾らかの測定可能なＦＡＤバックグラウンド値を有
するものであってもよく、また、このようなＦＡＤバッ
クグラウンド値を有しないものであってもよい。生物学
的流体が正常状態で幾らかのＦＡＤを含有している場合
には、試験試料中のＦＡＤ含有量の対照となる正常状態
のＦＡＤ量の切捨て値を確認しておく。

そうすれば、この試験試料中の過剰のＦＡＤが試料中の
異常な細胞物質の存在を示すことになる。また、生物学
的流体が正常状態で検出可能なＦＡＤを有しない場合（
即ち、対照試料が有意な量の細胞物質を含有していない
場合）には、標準のＦＡＤ値は本質的に零となり、試験
試料中の検出可能なＦＡＤの測定値そのものが、この場
合、試験試料中の細胞感染の存在を示すことになる。

破壊された細胞からの組織片のみならず、体細胞又は微
生物細胞もこの方法によって検出可能である。生育性細
胞は、試験試料に特別な細胞崩壊処理を行い、又はこの
ような処理を行うことなく、検出することができること
が判った。

所望ならば、細胞を崩壊するには、超音波処理又は化学
的もしくけ酵素による崩壊処理（例えば洗剤処理）のよ
うな慣用的手段を用いることができる。一般に、試験試
料中における細胞の破壊によって更なる細胞内ＦＡＤが
遊離するので、より鋭敏な分析が可能となる。

本発明は、主として、液体（とりわけ、臨床上及び診断
上有意義な生物学的液体）中の微生物細胞又は微生物感
染の検出に適用される。微生物感染とは、全ての生育性
もしくは無生育性微生物細胞（原核生物、主としてバク
ｒ　ＩＪアから原生動物、菌類及び酵母等の真核生物に
至るまでの全ての微生物を含む。）及びこのような細胞
の崩壊によって生じた組織片を意味する。

試験試料中の全微生物細胞の存在、又は、実際に分析を
行う前の成る時点で試験試料中に全細胞が存在するかど
うか（この事は細胞屑及び遊離の細胞内ＦＡＤの存在に
よって立証される。）、又はこれら両者を検出すること
が重要となる場合がある。このように、本明細書におい
て、「感染」という用語は、全細胞のみならず、細胞屑
を含め、分析対象液体中に正常状態では見い出されない
細胞物質を指す。

本発明に従って分析可能な液体及び流体としては、産業
用流体、産業廃液及び商用排液等；地上水や井戸水のよ
うな環境上重要な液体；主として、ヒトや動物の体液の
ような生物学的流体である、科学上もしくは医学上重装
な流体が挙げられる。

本発明において、液体試験試料中のＦＡＤは、利用可能
ないかなる手段、例えば、螢光光度測定法（Ｂｕｒｃｈ
らの著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１７５　：４５
７（１９４８）　；　Ｋｏｚｉｏｌ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ３　（Ｐａｒｔ　Ｂ　）
　：　２５３（１９７１）　；及びＭａｙｈｅｗ　とＷ
ａｓｓｉｎｋの共著、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　５６（Ｐａｒｔ　Ｅ　）　：　２１７（
１９８０）参照。〕、ポーラログラフイー法（Ｋｎｏｂ
ｌｏｃｋ著、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｒｎｏｌｏ
ｇｙ３　（Ｐａｒｔ　Ｂ　）　：　３０５　（１９７１
）参照。〕、分光光度測定法（Ｆａｚｅｈｕｓと：［１
（ｏｌ＜ａｉの著、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　３　（Ｐａｒｔ　Ｂ　）　：　３８５（１
９７１））及び一般に当業者が利用可能な手段によって
測定することができる。

通常、本発明の方法は、ＦＡＤ濃度に対応した検知可能
な信号を発する化学試験試薬系に試験試料を接触するこ
とによって測定された該信号と、該化学試験試薬系と照
合用試料を接触させた時に該試薬系が発する信号である
照合用信号を比較することから成る。前述の通り、その
照合用試料はこの分析の目的のため正常であると考えら
れるＦＡＤの量を含有する。分析対象の液体が正常状態
で注目する細胞物質を有意な量含んでいない場合には、
照合用試料はそのような状態を反映することに々シ、照
合用信号は、もしあるとしても、本質的に化学試験試薬
系のバックグラウンド信号となる。

生ずる検知可能な信号は、ヒトの観察又は計器検出によ
って感知可能ないかなる物理的、化学的又は電気的現象
であってもよい。

例えば、電気化学的測定、熱量測定、圧力測定その他で
得られる信号であってもよい。好ましくは、光学的信号
、例えば、スペクトルの可視光線、紫外線又は赤外線領
域の光吸収変化に原因する螢光、リン光、化学ルミネッ
センス、色変化が選ばれる。

用いる化学試験試薬系としては、（ａ）　Ｆ　Ａ　Ｄと
結合してホロ酵素（触媒活性酵素）を形成するアポ酵素
と、（ｂ）ホロ酵素に対する基質と、（ｅ）基質の酵素
反応生成物の存在下で検知可能の信号を発する指示物質
から成るものが特に好ましい。

有用なアポ酵素としては、アポ（キサンチンオキシダー
ゼ）　（Ｓｕｇｉｕｒａらの著、Ｃｈｅｍ、　ｐｈａｒ
ｍ。

Ｂｕｌｌ　２９　：　１３６１　（１９８１）　）、ア
ポ（アミノ酸オキシダーゼ）　（ＷａｒｂｕｒｇとＣｈ
ｒｉｓｔｉａｎの共著、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｚ、　２９
８　：　１５０　（１９３８）　ｉ及びＢｉｏｃｈｅｍ
。

Ｊ、　３３：２００８　（１９３９）、　　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１３６　：１７７　（１９４０）
及びＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　３
　：９５０（１９５７）参照〕、アポ（グルタチオンレ
ダクターゼ）　Ｃ５ｃｏｔｔらの著、Ｊ、　１３ｉｏ１
．　Ｃｈｅｍ。

２３８　：　３９２８　（１９６３）及び米国特許第４
，２６８，６３１号参照〕が挙げられる。生じた信号が
光学的な特質を有する場合、特に、信号が測色計で測定
できるもの（例えば色変化）である場合、本発明は細胞
物質を検出するための極めて簡単かつ有用な手段を提供
することになる。更に最も好適ナアボ（グルコース　オ
キシダーゼ）Ｅ験試薬系は、酵素基質としてグルコース
と、指示物質として過酸化活性物質及び光学的信号を発
する発光源とから成る。

過酸化活性物質としては当業者に周知のものを用いるこ
とができ、種々の有機・無機資源から得る物質が利用で
きる。例えば、ホースラデイシュ（西洋ワサビ）ペルオ
キシダーゼ又はポテト（馬鈴薯）ペルオキシダーゼのよ
うな植物ペルオキシダーゼを用いることができる。ペル
オキシダーゼ活性を有する無機化合物としては沃化ナト
リウム、沃化アンモニウム等の沃化物及びモリブデン酸
塩が挙げられる。更に、族ヘミン及び過酸化活性を有す
る多くの他のポルフィリンを用いることができる。酵素
ではないが、過酸化活性を有する他の物質としては、チ
オシアン化鉄、タンニン酸鉄、フェロシアン化第−鉄、
クロミック硫酸カリウムその他の同様な化合物が挙げら
れる。

同様に、過酸化水素と過酸化活性物質の反応時、又は、
これら化合物の共存下で検知可能な光学的信号を発する
、多種多様の有用な発光源が当業者に公知である。その
ような発光源としては、色源体又は呈色指示薬染料、例
えば、０−トリジン、ベンジジン、シリンガルタシン（
ｓｙｒｉｎｇａｌｄａｚｉｎｅ　）　、　　ジアミノフ
ルオリン、及ヒテトラメチルベンジジン、及び関連する
誘導体が挙げられ、また、慣用的にトリンダー試薬と称
されるカップルド（ｃｏｕｐｌｅｄ　）染料系、例えば
フェノールと４−アミノアンチピリンが挙げられる。他
の有用な発光源としては、スコポレチン（６−メドキシ
ウンベリフエロン）、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等の
螢光発生素ペルオキシダーゼ物質及びジアセチルジクロ
ロフルオレセン（米国特許第４，２６９，９３８号）の
ような各種のフルオロセン誘導体がある。また、ルミノ
ール、イソルミノール、ピロガロール及びそれらの各種
誘導体及び類縁体も発光源として用いることができる。

この試験試薬系は緩衝剤、稀釈剤、安定剤その他の同様
な試薬等の他の成分を含有することもできる。また、分
析の遂行上、細胞の崩壊又は細胞層の分解が望まれる場
合には、試験試薬系に洗剤、蛋白質加水分解酵素その他
の同様の物質を含有せしめることができる。

ＦＡＤを感知する化学試験試薬系は、試薬キット、試薬
組成物の混合物又は試験具等のいかなる慣用的な形をと
ってもよい。試薬組成物の混合物又は試薬キット成分は
液体であってもよく、通常は水性溶液であり、また、乾
燥粉末、錠剤等又はゲル物質、フィルム等の形でアラて
もよい。好適な試験試薬系の形は試験試薬系が担体部材
又はマ）　ＩＪソックス組み込まれた試薬帯片試験具で
ある。担体は、水もしくは分析対象の他の流体に曝した
時に溶解せず、その構造上の一体性を維持するマ）　Ｉ
Ｊソックスあって、吸収性もしくは非吸収性又は多孔性
もしくは非多孔性のいずれの形であってもよい。用いる
ことができる好適な吸収性マトリックスとしては、吸収
紙２重合体フィルム、重合体ゲル、セルロース、木材２
合成樹脂２合成樹脂フリース（ｆｌ−ｅｅｃｅｓ　）　
ｒ織布、不織布その他の同類物を挙げることができる。

非吸収性マトリックスとしてはガラス繊維及びポリプロ
ピレン等のような有機プラスチック材が挙げられる。試
験具を作成するには、例えば先ず、担体マトリックスを
液体試薬組成物で浸透、浸漬、噴霧もしくは印刷した後
、大気中乾燥もしくは吹き付は空気乾燥等の適切な手段
によって乾燥して、マトリック上に乾燥された試薬／マ
）　ＩＪラックス合体を得る。

次に、このマトリックスを、例えば、取扱い易くするた
め、両面接着テープのような適切な手段によって、有機
プラスチック帯片（例えば、ポリスチレン帯片）等の不
溶性支持体部材に貼着すればよい。

アポ（グルコース　オキシダーゼ）試薬帯片具の形とし
た場合には、本発明の試験試薬系は、−細胞物質を検出
するための最も簡単かつ便利な手段を提供する。先行技
術の培養法及びＡＴＰ−化学発光法と比較して、本発明
の試薬帯片具は、これを試験試料中に浸漬し、取り出す
だけで分析結果が得られる。生じた光学的信号は簡単に
装置によって読み取られ、また、色の変化が生ずる場合
等の適当な場合には技術者によって観測される。照合用
信号は装置内に包蔵させることかでき、また、色片もし
くは色票等の観察可能な形にしておくことができる。試
験試料の信号と照合用信号との比較は装置内部又はヒト
の観察によって行われる。液体（特に、生物学的流体）
中の細胞物質（特に、微生物感染）を検出するための、
このよう々簡単で、単刀直入かつ迅速な方法は今までに
存在したことがない。

〔発明の効果〕

以上の説明から明らかな通り、本発明は液体試験試料中
の細胞物質を簡易かつ迅速に測定することができるとい
う効果を奏する。

〔発明の実施例〕

以下、本発明を実施例によって説明する。これら実施例
は本発明を限定するものと解釈するべきものではない。

実施例１ 生育性微生物（例えば、バクテリア）の培養体を適切な
媒体内に接種し、増殖速度を観察して、増殖特性曲線を
得た。増殖曲線のグラフを作るために、ミリリットル当
りの微生物の濃度を経時（時間）的にプロットした。

接種直後には、細胞を新しく・環境に順応させるため、
成る程度の時間を必要とした。この順応のための、遅れ
段階と呼ばれる期間中、細胞内にはかなりの変化が起っ
たが、細胞分裂はほとんど、もしくは全く生じなかった
。次の段階は対数的もしくは指数関数的に増大する段階
である。細胞分裂が微生物の性質と環境条件によって決
定される一定の速度で起った。微生物が。

与えられた養分を取り尽し、排泄物が累積すると、定常
的段階に達する。この期間中、細胞分裂と細胞死が同じ
速度で起って、生育性細胞の数は比較的一定に保持され
る。最後に、定常的段階は死亡段階に取って代わる。こ
の死亡段階では、細胞死が細胞分裂より大きな速度で起
きた。

大腸菌の流体培養基を６時間、増殖せしめ、その間、数
アリ　コツトを取り出し、集落を数えるため、試料を平
板上に植え付けた。各アリコツトの残りは冷凍し、その
後解凍し、ＦＡＤを測定した。

Ａ、材料 １　調製されたトリブチケース大豆寒天培地（ＴＳＡ）
平板（Ａｃｕ　Ｍｅｄｉａ、バルチモア。

メリーランド州、アメリカ合衆国） ２、トリプチケース大豆肉汁培地（ＴＳＢ）（Ａｃｕ　
Ｍｅｄｉａ）−１００ｍｌ／瓶（３５°士２ｒ。

１時間以上前培養） ３、　大腸菌、　ＡＴＣＣ８７３９−ＴＳＢ中１８時間
懸濁 ４、　無菌食塩水（０，８５％Ｎａ　ＣＱ　）　９．９
　ｍｌ！／　ｆ　ユーブｉ１９．ｏｍｌ／チューブ ５、　マイクロピペット□０．０１ｍＡ；０．１ｍ１（
校正流） ６、試験管−１０ｍｌ　（ｍｍ）　Ｘ　１００　ｔｔｒ
ｍ。

７、　無菌ピペット−ＩＴＬｌ、　２ｎｌ、　１０　ｍ
Ｊ。

８、　冷凍バイアル（１１） ９、　平板拡散用の曲がりガラス捧 １０、　　氷納−充満された冷凍バイアルを冷凍機に運
搬するためのもの。

Ｂ８手順 １、１８時間大腸菌懸濁液を：ＬＯＸ１０１８Ｃ肌−ノ
（集落形成単位／ｍｌ）に調整した。

２、　前培養された１００１ｎｌフラスコから容量１０
ｍ１の無菌ＴＳＢを取り出した。

（ａ）１ｍｌ容量に“前培養照合用”とラベルを付は冷
凍した。

（ｂ）３つの０．１　ｍｌアリコツトをＴＳＡ平板上に
拡散させ、３５°±２Ｃで４８時間培養した。

３．１０ｍ容量の標準培養を残存するｇＯｍｌＴＳＢ中
にピペッティングし、よく混合して、標準培養の１：１
０稀釈液とした。

４、総量２．５１ｍＡ’を培養されたＴＳＢから取り除
いた。

（ａ）　　１ｍｉ容量を冷凍バイアル中にピペッティン
グし、サンプリング・冷凍の時間をラベルした。

（ｂ）　　１．５１ｎｌ容量を１１０Ｘ１００の試験管
中にピペッティングした。波長６４０．ｎｍにおけるパ
ーセント透過率（＠を分光光度計から読み取り、記録し
た。

（ｅ）　　接種されｆ、ニー　Ｔ　Ｓ　Ｂから０．０；
１−容量を採取し、無菌食塩水で１０−３．１０−５及
び１ｏ−７まで稀釈した。集落形成単位（ＣＦＵ　）を
計数するために、３組のこれら稀釈液 ０、１耐容量を拡散平板上に接種した。

即ち、次の稀釈液を用いた。

１、　０．０１　ｍＪ培養液＋１０．１　ｍ７食塩水（
１０）ノ拡散平板０．１”Ｌ３組（１０−’）２、　０
．１１ｎｌ（１０”−３）＋９．９１ｎｌ！食塩水（１
Ｏ−５）の拡散平板０．１ｎｌ、３組（１０””’）３
、　０．１　ｍｌ　（１Ｏ−５）＋９．９　ｙｎ１食塩
水（１０−’）の拡散平板０．１ｄ、３組（１０−７）
（ｄ）　　全ての平板を３５°±２ｃで４８時間培養し
た。

５、第４段階を３０分間隔で、総計６時間繰り返した。

これらの結果を第１表にまとめて示す。

第　　１　　表 ０．０　　　　９８．５　　　　１．４　　Ｘ　　１０
７０．５　　　　９９．０　　　　９．ＯＸ　　１０６
１．０　　　　９７．０　　　　１．２　　Ｘ　　１０
’１．５　　　　９５．０　　　　３．ＯＸ　　１０’
２．０　　　　９４．５　　　　４．．４　　ｘ　　１
ｏ７２．５　　　　８６．０　　　　１．Ｉ　　Ｘ　　
１．０８３．０　　　　８２．０　　　　１．６　　Ｘ
　　１０８３．５　　　　７１．０　　　　３．６　　
Ｘ　　１０８４．０　　　　６６．０　　　　２．９　
　Ｘ　　１０８４．５　　　　６０．０　　　　１．２
　　Ｘ　　１０９５．０　５４０　１．ＯＸ　１０９ ５．５　　　　４９．５　　　　８．７　　Ｘ　　１０
８６．０　４９．５　１．ＯＸ　１０９ Ａ、試薬 （ａ）　　アポグリコースオキシダーゼ□２μＭのアポ
グルコースオキシダーゼ（ＦＡＤ−結合部位によって測
定−米国特許第４．′２６８．６３１号参照〕、４ｍＭ
の４−アミノアンチピリン３０　％　（Ｗ／Ｖ）グリセ
ロール、０、１　％　（Ｗ／Ｖ　）の仔牛血清アルブミ
ン、０．０２％（Ｗ／Ｖ　’）のアジ化す）　ＩＪウム
及び０、１．　Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７０゜（ｂ）
　　アポグルコースオキシダーゼ／抗（グルコースオキ
シダーゼ）抗血ｆｆ　溶液−抗（グルコースオキシダー
ゼ）抗血清０．４　ｍｌ　ト混合された前記アポグルコ
ースオキシダーゼ溶液５ｍｌ。

ｆｅ）　　グルコースオキシダーゼ分析溶液□２、１　
ｍＭの３．．５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンス
ルホン酸ナトリウム、０．１０５Ｍグルコース、６０μ
欽包のホースラディシュベルオキシダーゼ（シグマ型■
）、及び０．１Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７，０゜Ｂ、
試料の調製 増殖培地の冷凍アリコツトを解凍し、その０、１　ｍｌ
を０．１　％　（Ｗ／Ｖ）　　のアジ化ナトリウムを含
有する氷冷された０、　１　Ｍのリン酸塩緩衝液０．９
　ｍｌで稀釈した。この稀釈溶液を氷上保存した。

Ｃ０分析手順 稀釈された増殖培地試料０．１０ｒｒＬｌを一組の使い
捨て用プラスチック製キュベツトの各々に容れ、グルコ
ースオキシダーゼ分析溶液１．９０ｍ１と混合した。次
に、キュベツトを３Ｏｒの温度に保持された水浴中に混
背した。アポグルコースオキシダーゼ／抗（グルコース
オキシダーゼ）抗血清溶液（１００μａ）をキュベツト
・キャップ中に容れ、キュベツトの頂部にそのキャップ
を挿入し、混合のため数回反転させることによって分析
を開始した。次に分析溶液を各々３０分間３０ｉＣに装
置し、前記グルコースオキシダーゼ分析溶液からなるブ
ランクに対して波長５２０ｎｍで吸光度を記録した。０
．３の吸光度単位の増大は増殖培地中に約１１ＭのＦ’
ＡＤが生成したことを示す。

集落計数法とＦＡＤ分析との結果を図に示す。バクテリ
ア集落の数とＦＡＤ濃度との間にはある範囲で一定の相
関関係がみられた。

実施例２ 第２の試験は各種の試料処理がＦＡＤ分析とバクテリア
感染との相互関係にどのような影響を及ぼすかを調べる
ために行った。

Ａ、試薬 （ａ）　　試薬Ａ　−４μＭのアポグルコースオキシダ
ーゼ（ＦＡＤ結合部位によって測定した。）％８ｍＭの
４−アミノアンチピリン、５０　％　（Ｗ／Ｖ）　ノｆ
　’Ｊ　セｏ　−ル、及び０．１　Ｍのリン酸塩緩衝液
、ｐＨ７，０゜ ｆｂ）　　試薬Ｂ−試薬Ａの各１ｎｌ容量に加えられた
８μｅの抗（グルコースオキシダーゼ）抗血清。

（ｃ）　　試薬Ｃ２，１ｍＭの３．５−ジクロロ−２−
ヒドロキシベンゼンスルホン酸［，１，０５Ｍのグルコ
ース、　６０μり／１ｒＬｌのベルオキシダ−ゼ、及び
０．１　Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７，０゜Ｂ０分析手
順 キュベツト内で試料０．０５　ｍｌと試薬Ｃ１，９０Ｔ
Ｌｌを混合し、２５Ｃで平衡状態にさせて分析を行った
。反応は、試薬Ｂを０．０５８μａ加えることによって
開始した。２５Ｃで３０分間温潟置た後、波長５２０ｎ
ｍで吸光度を記録した。

Ｃ０校正曲線 ＦＡＤ試料を０．１　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液中で調製し
、分析に５０μαを用いた。５２０ｎｍでの吸光度とＦ
ＡＤ濃度との相関関係を第２表に示す。

第２表 ０　　　　　　　　　　　’０．０７１２．０５　　　
　　　　　０．２７９ ４．１０　　　　　　　　　Ｑ、４７７６．１５　　　
　　　　　０．６６８ ８．２０　　　　　　　　０．８５６ １０．２５　　　　　　　　　１．０５６１２．３０　
　　　　　　　　１．２３７Ｄ、処理試料及び未処理試
料中のＦＡＤ測定１、　未処理試料 実施例１で得られた大腸菌試料の解凍されたアリコート
を１．０　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝液で１０倍に稀釈した。

２、　超音波処理試薬 大腸菌試料をブランソン超音波処理機（Ｂｒａｎｓｏｎ
　５ｏｎｉｃａｔｏｒ　）　（Ｗ１４０Ｄ型、ヒート・
システムズ・ウルトラソニックス社、プレインビュー、
ニューヨーク、アメリカ合衆国）で超音波処理し、緩衝
液で１０倍に稀釈し、分析した。

３、　ペプシン処理試料 １０倍稀釈試料０．１　ｍｌ　ヲ、１０　ｍ９　／　ｍ
ｌ（Ｄペプシンを含む０．２　Ｍ　ｘｃＱ７ＨＣ！ａ溶
液０．２　ｒｎｌ（ｐＨ１，１，）と混合することによ
って、超音波処理された大腸菌試料を分解せしめた。

３７Ｃで２時間湯漬した後、試料をＦＡＤ分析に付した
。

これらの結果を第３表に示す。

第　　３　　表 ＦＡＤ含有量（ｐｍｏ　ｌ　ｅ　ｓ／ｍ１）０　　　１
．４Ｘ１０７　９　　　１１　　　　３４０．５　　９
．０Ｘ１０６　９　　　１２　　　　３６１．０　　１
．２Ｘ１０”　　　　　１２　　　　３６１．５　　３
．０ｘｌＯ７９１３３８ ２，０４，４，Ｘ１０７１０１５　　　　３９２．５　
１．］Ｘ１０１２　１６４２ ３．０　１．６Ｘ１０１７　２０　５２３．５　３．６
Ｘ１０３０　３３　７０４．０　２．９Ｘ１０３５　３
７　７７４．５　１．２Ｘ１０５６　５８　１１０５．
０　１．０Ｘ１０５６　５７　１０８５．５　８．７Ｘ
１０５３　５７　１０８６．０　１．０Ｘ１０５３　５
６　１１４これらのデータは、ＦＡＤ含有量が未処理及
び処理試料中のバクテリア増殖レベルと相関関係を有し
ていることを示している。試料を細胞破壊処理すると、
得られる分析値のＦＡＤ濃度は高くなる。

【図面の簡単な説明】

図は、大腸菌培養増殖中に採取された試料の経時分析に
おける、ＦＡＤ分析法と従来の集落計数法との間の相関
関係を説明するグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　液体試験試料中のフラビンアデニンジヌクレオチ
   ド量を測定する工程と、該測定量を照合用試料中のフラ
   ビンアデニンジヌクレオチド量と比較する工程とから成
   ることを特徴とする液体試験試料中の細胞物質検出方法
   。 ２、試験試料とフラビンアデニンジヌクレオチドの濃度
   に関連した検知可能な信号を与える化学試験試薬系を接
   触させ、該信号と該化学試験試薬系を照合用試料に接触
   させた時に該試薬系が与える信号である照合用信号を比
   較することから成る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　該照合用試料に有意な量の細胞物質が含有されて
   いない特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、該化学試験試薬組成が、 （ａ）　　フラビンアデニンジヌクレオチドと結合して
   ホロ酵素を形成するアポ酵素と、 （ｂ）　　ホロ酵素に対する基質と、 （ｃ）　　該基質の酵素反応生成物の存在下で検知可能
   の信号を与える指示物質から成る特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ５、　該アポ酵素がアポ（グルコースオキシダーゼ）で
   あり；該基質がグルコースであり；該指示物質が過酸化
   活性物質と、過酸化水累及び該過酸化活性物質の存在下
   で光学的信号を与える発光源からなる特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ６、　該試料を最初に処理して、その中に存在する細胞
   を崩壊せしめる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、　該試料中の細胞を崩壊せしめることが出来る洗剤
   に、該試料を接触せしめる特許請求の範囲第６項記載の
   方法。 ８　該液体試験試料が生物学的流体である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ９、　（ａ）　　フラピンアデニンジヌクレオチドと結
   合してホロ酵素を形成するアポ酵素と、 （ｂｌ　　ホロ酵素に対する基質と、 （ｅ）　　該基質の酵素反応生成物の存在下で検知可能
   の信号を与える指示物質から成ることを特徴とする液体
   試験試料中の細胞物質との総量が、試験試料中の細胞物
   質の存在下で、実質的に最適表信号を発生するような量
   で存在してなることを特徴とする液体試験試料中の細胞
   物質を測定するための化学試験試薬系。 １０、該アポ酵素がアポ（グルコースオキシダーゼ）で
   あり、該基質がグルコースであり、該指示物質が過酸化
   活性物質と、過酸化水素及び該過酸化活性物質の存在下
   で色変化する色原体である特許請求の範囲第９項記載の
   試験試薬系。 １１、　　試験試料中の細胞を崩壊せしめることが出来
   る化学的分解剤が添加されている特許請求の範囲第９項
   記載の試験試薬系。 １２、該化学的分解剤が洗剤である特許請求の範囲第１
   １項記載の試験試薬系。 １３、該過酸化活性物質がペルオキシダーゼである特許
   請求の範囲第１０項記載の試験試薬系。 １４、該色原体が３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベ
   ンゼンスルホン酸塩と４−アミノアンチピリンからなる
   特許請求の範囲第１０項記載の試験試薬系。