JPS60102194A - フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

フエニルアラニンの製造法

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JPS60102194A JP59160164A JP16016484A JPS60102194A JP S60102194 A JPS60102194 A JP S60102194A JP 59160164 A JP59160164 A JP 59160164A JP 16016484 A JP16016484 A JP 16016484A JP S60102194 A JPS60102194 A JP S60102194A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景と要約 本発明はフェニルアラニンをその前駆物質、特にフェニ
ルピルビン酸塩またはフェニルピルビン酸からトランス
アミナーゼによって製造する方法に主として関するもの
である。本発明の一具体例はフェニルアラニンをフェニ
ルピルビン酸塩力もつ（り出すトランスアミナーゼ活性
を有する固定全細胞を利用する。しかし、本発明の更に
一つの具体例によれは、破裂させるかあるいは透過性を
与えた細胞をそのま＼あるいはその精製画分として、遊
離または固定された状態で使用することによりフェニル
アラニンタ得るための望みの酵素活性を得ることができ
る。
本発明はまたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性
を有する固定全細胞を用いてケイ皮酸かもフェニルアラ
ニンをつくる可能性をも企図している。
フェニルピルビン酸塩からのフェニルアラニンの製造は
多（の研究者達によって試みられて来た。
この変換をなし遂げるには二つの可能な経路がある。一
つは適当なアミン供与体とのアミン交換反応によるもの
であり、他はＮＡＤまたはＮＡＤＰといった生物学的エ
ネルヤー源を使用する直接の還元的ア・ミノ化である。
ザクライ（５ａｋｕｒａｉ　）　（Ｊ＋Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　４３Ｓ８５１．１９５６）はアミノ交換反
応による光学活性アミノ酸の製造を試みた。ザクライは
粗製豚心臓ｌ・ランスアミナーゼ（新しく得たもの）を
用い、アスパラギン酸を少量のグルタミン酸と共に用い
たとき、２０時間後にフェニルアラニンの収量が最高の
５８％（対照値を差引いた後）に達することを見出した
。アスパラギン酸を単独で用いたときの収量は僅か５０
％（対照値を差引いた後）に過ぎなかった。ザクライは
最旨収晴を得るには両方のアミノ酸が存在しなげればな
らないと結論した。彼はこの結果を、グルタミン酸がフ
ェニルアラニンに対するアミン供与体でありそしてアス
パラギン酸はグルタミン酸を再生する働きをするという
共同系と解釈した。
オーイシ（０ｉｓｈｉ　）　［「Ｔｈｅ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍ１ｎｏ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｊ　、ジョン　ヮイリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ
　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　）、ケイ・ヤマダ（Ｋ、
　Ｙａｍａｄａ　）筒編、１９７２．１６章〕は前駆物
質であるケト酸からのフェニルアラニンの製造を調査し
た。彼は乾燥した多数の微生物のスクリーニングにおい
てアサイ（Ａｅａｉ　）によりフェニルアラニンが最高
収量６６．５％で得られることれた。調査したＥ、コ＋
）　−（ｃａｄｉ　）の二つの株は用いた反応条件下で
６８．５％および５６％の収量を示した。アサイはアミ
ン供与体かＬ−アスパラギン酸塩、Ｌ−グルタミン酸塩
およびＬ−ロイシンの組み合わせであるとき７０．７Ｓ
　％といった高い収１’６二を得た。アスパラギン酸塩
を２倍過剰に用いた収量は僅か５４．５％に過ぎなかっ
た。
以前の指示された手順に関して上に記′した収量は経済
的な工業法に適さないことは明白であろう。
商業的に実行可能な方法にとっては９０％を超す収１６
：か一般に絶対必要であると考えられる。
オーイシはまた対にした酵素系を用いることにより、キ
タイ（Ｋｉｔａｉ　）が７６．８　％の収量に到達でき
たことも報告した。この対にした系は酵母アルコールデ
ヒドロデナーゼと牛肝臓グルタミン酸りエニルアラニン
アミノトランスファラーゼであった。この反応はセミカ
ルバジドによりアセトアルデヒドを除去することにより
推進される。更に、キタイはＮＡＤＰを供給するために
Ｅ、コリーを使用する還元的アミン化のために対にした
系を用いることによって反応なＬ−フェニルアラニンの
期待された収率１０Ｃ［にまで進めろことかできた。
アミン供与体として役立つ〃゛ルタミン酸塩限定試薬で
あった。
ワンドレイ（Ｗａｎｄｒｅｙ　）等（米国特許第４，３
０４，８５８号明細書）は、外部に由来するＮＡＩ’ま
たはＮＡＤＨを供給しながらフェニルピルビン酸塩から
のフェニルアラニンの製造に対して対にした系（ホルメ
ートデヒドロケ９ナーゼと共に）を記載している。この
系はまた米国特許第４．３２６．０３１号明細舛に説明
されているように、前駆物質としてアルファーヒｒロギ
シカルポン酸を使用した場合にも応用でとる。しかし、
これら系の両方とも、試薬ＮＡＤまたはＮＡＤＨを使用
すること、およびこの高価かつ不安定な物質を再生させ
るために連結系を使用することか必要である。
上で調査した利用できる文献は対の系を用いた場合にの
みフェニルアラニンがフェニルピルビン酸塩から高収量
で得られることを示している。非対系を用いたときには
、６種の異なるアミン供与体を用いてせいぜい７１チの
収にが得られている。
これは種々な給源からのトランスアミナーゼについて利
用できる文献に基づき期待される。例えば、ブロス（Ｂ
ｕ１０８　）およびノ１ンドラー、（Ｈａｎｄｌｅｒ　
）（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ７　ｓ　２４０巻、８号、６２
８６〜６２９４頁、１９６５年８月）は、失心１臓グル
タミン酸−アラニントランスアミナーゼが次の反応： アラニン＋α−ケトグルタル酸塩 グルタミン酸塩＋ピルビン酸塩 を触媒し、その平衡定数は２．２であることを見出した
。ｏ、ｉ　ｍアラニンと０．１５１７＝α−ケトグルタ
ル酸塩の系においては、グルタミン酸塩の生成は７０％
に制限される筈である。ヘンソン（Ｈθｎ５ｏｎ）およ
びフレランド（Ｃ１ｅｌａｎｄ　）　（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ６．３６８〜６４５．１９６４）は豚心臓グ
ルメミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼが次の反
応： α−ケトゲルタン酸塩　＋　Ｌ−アスパラギン酸塩％ オキサロ酢酸塩　十　グルタミン酸塩 を触媒し１その平衡定数は０．１６〜０．１７であるこ
とを決定した。このよう圧して、０．１　ｍα−ケトグ
ルタル酸塩と０．１５ｍＬ−アスパラギン酸塩の系は、
α−ケトグルタル酸塩からグルタミン酸塩への６２％変
換で平衡に達するであろう。
カネラキス（Ｃａｎθ１ｌａｋｉθ）およびコーヘン（
Ｃｏｈｅｎ　）　（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　ａｈθｍ、　
２２２．５３〜６２．１９５６）は犬肝臓チロシンーα
−ケトグルタル酸トランスアミナーゼが次の反応： → Ｌ−チロシン　＋　α−ケトクルタル酸を触媒すること
を調べ、６時間後に平衡状態に達しないこと、およびそ
の平衡はグルタミン酸とｐ−ヒドロキシフェニルピルビ
ン酸の生成に有利であることを発見した。
本発明の一つの重要な目的はフェニルアラニンヲ７　工
＝　／’　”！’ルピン酸マたはフェニルピルビン酸塩
からトランスアミナーゼによって高収量で製造する方法
を提供することにある。更に特別な一つの目的は単一ア
ミン供与体を用いて単一段階を含むこのような方法によ
り、対の系もあるいはＮＡＤＰまたはＮＡＤといった高
価な補足因子試薬の添加も必要とせずにフェニルアラニ
ンを製造することにある。他の目的は以下の説明で明ら
かになるであろう。
本発明によれば、固定した全細胞を用いてトランスアミ
ナーゼによりフェニルアラニンをフェニルピルビン酸ま
たはフェニルピルビン酸塩から製造する。本発明のもう
一つの具体例によれば、細胞のトランスアミナーゼ活性
を解放させるように破裂させるか透過性を与えた細胞を
使用する。これらの破裂細胞または透過性にした細胞は
遊離状態にあってもあるいは固定状態にあってもよい＠
本発明者等の上記の特許願において、本発明者等は、ポ
リアゼチジンゾレポリマー、カルボキシメチルセルロー
ス、ポリウレタンヒドロｒルプレポリマーまたはポリメ
チレンイソシアネートを硬化させることにより得た不済
性橋かけ結合重合体を用いて細胞を固定した酵素活性ン
イ１する全細胞からなる組成物の製造および使用を記述
した。固定用重合体はなるべり４？リアゼチジン爪合体
かよいが、他の記載の正合体を用いてもよい。固定した
細胞をビーズまたは他の粒状材料の上に被覆するのが有
利である。
本発明は以前の上記特許願に記載のような固定された細
胞組成物ならびに固定細胞の他の形の使用を企図してい
るが、ただし、固定細胞がトランスアミナーゼ活性を有
することを条件とする。本発明によれば、フェニルアラ
ニン前駆物質、詳しくはフェニルピルビン酸塩才たはフ
ェニルピルビン酸を、アミン供与体存在下にトランスア
ミナーゼ活性を有する固定細胞組成物と接触させて前駆
物質をフェニルアラニンに変換することによりフェニル
アラニンを製造する。補足因子として少量のピリドキサ
ール−５−ホスフェート（Ｐ５Ｐ）かトランスアミナー
ゼに要求されることが文献に示されている。この物質（
Ｐ５Ｐ）はまた本発明方法においても通常の補足因子量
で使用される。
前駆物質は遊離酸またはその塩、例えばアンモニウム塩
またはアルカリ金属塩として使用される。
種々様々なアミン供与体が使用できるが、ただしそれら
がトランスアミナーゼに関して活性である限りにおいて
である。供与体はＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスパライン
酸またはその混合物であるのかよい。しかし、他のアミ
ン供与体、例えばＬ−ロイシンまたはＬ−イソロイシン
も極めて有用な結果を与える。なるべくは供与体を過剰
に使用するのがよく、過剰を例えば６０〜５０％過剰ま
で、またはもつと多（まで増加させるとより高い収量が
得られるようである。
トランスアミナーゼ活性を示すどの微生物もこの目的に
使用できる。これらのうち多種多様なものか知られてい
る（前記のオーイシ発行物の表１６−３．４４１頁参照
）。これらには次のものが含まれる二 本発明に従いトランスアミナーゼ反応を実施するために
用いる反応条件は、この分野で理解されるように、広（
変化できる。例えばトランスアミナーピ活性およびアミ
ン供与体を含む固定細胞を含むカラムに前駆物質の水溶
液を通過させることがで六る。＠駆物質対供与体および
対細胞の最適比、および他の操作条件は過度の実験をし
な（ても、どんな特別な状況に対しても容易に決定でき
る。しかし、典型的には、アミン供与体対前駆物質の比
は少な（とも１：１、そしてなるべくは１．１：１また
はそれ以上、例えば６：１であろう。
特に適当な比は前駆物質１部当り供与体１．５〜２部で
ある、（部数は等価な重量に基ツ（）。
酸またはアルカリ性ＰＨを使用できるが、一般に個々の
条件の組に対して容易に決定される最適−があろう。通
常は、４以上のＰＨ、そして一般に５〜１０の範囲内の
ｐＨを用いるのが望ましいが、これら範囲の外側の−も
用いられる。普通には６０゜から４０℃の温度が用いら
れるが、トランスアミナーゼの不活性化温度より低いど
の温度も使用できる。
本発明を下記の例により説明する。
例　１ サツカロミセス　カレビシアエ、Ｅ、コリー、第４６５
．５５１号明細書に記載のように（例えば、その例８参
照）、ポリアゼチジンを用いて別々のバッチで、細胞ペ
ーストおよびポリアゼチジン水溶液（ヘルクレス　ポリ
カップ　１７２）の等部数を混合し１木製の棒を用いて
手で混合することにより２５°Ｃにおいて均一になるま
でかきまぜる。
この混合物を風乾したアノ・パーライトイオン交換ビー
ズ上に分散する。ビーズ上のペースト／７″レポリマー
混合物の薄膜を２５°Ｃで風乾する。次に、ビーズ１　
ｒｎｌ当り０．２グラムの微生物細胞を含むビーズの各
群１　ａｔｅを、ピルビン酸ナトリウムの０．１Ｍ水溶
液２５罰、およびアミン供与体としてＬ−グルタミン酸
、Ｌ−アスパラギン酸またはそのン昆合物のいずれか、
およびＰ５Ｐ０．１ｍＭを含む５０ｄエルレンマイヤー
フラスコ中に入れる。次にこれらを他の点では同様な条
件下で比較する。生じたフェニルアラニン（ＰＨＦｉ　
）についての結果を、１７時間の振盪後の上澄のＨＰＬ
Ｃ分析により決定し下記表Ｉに示す。
表　１ ７ｘニルアラニン（ＰＩＦ）を生スルフェニルヒアスパ
ラギン酸およびＬ−グルタミン酸を表わす）上記例は、
トランスアミナーゼ活性を有する上記のように固定され
た全細胞が、適当なアミン供与体を使用する場合、フェ
ニルピルビン酸塩前駆物質からフェニルアラニンを製造
するために効果的に使用できることを実証している。
Ｐ、ダクンハエおよびＡ、ファエカリスを新鮮な水分を
含まない状態（未破裂かつ透過性を与えず）で使用する
対照では、無視しつる程度のトランスアミナーゼ活性が
認められたに過ぎない。しかし、細胞を破裂させるか、
またはそれらに透過性を与えることにより、活性は実質
的に増加する。このことは、普通には溶解したか透過性
になったと考えられる乾燥細胞が商業的に受け入れられ
る変換を与えないことを文献が示しているので意外なこ
とである。
従って、破裂細胞または透過性にした細胞をフェニルア
ラニン製造に使用することは固定されていようが遊離の
状態であろうか、本発明のも５　一つの而を構成する。
本発明に従って使用するため細胞を破裂または透過性に
するのに各種の技術を使用できる。例えば、この分野で
知られているように音波を当てるかすり砕くことにより
細胞を破裂させることができる。別法として、細胞を化
学処理により、例えばトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）Ｘ
　ｉＱＱといった透過性を付与する界面活性剤で処理す
ることにより透過性にすることができる。これらの処理
は明らかにフェニルピルビン酸塩またはフェニルピルビ
ン酸を酵素と一層容易に接触できるようにし、従って、
微生物が固定されていようといまいと活性を改善する。
破裂細胞の使用、結果に及ぼすｐＨおよびアミン供与体
濃度の効果を下記の例で述べる。
例　２ 遊離はコリー細胞２グラムを細胞を破裂させるために１
０分間音波処理し、その後、これらを種柚なｌ“のＡＳ
Ｆ　（，１０Ｍ、　、’１５Ｍおよび、２Ｍ）、Ｐ５Ｐ
ｏ、ｉ　ｍＭおよびｐＰＡ　Ｏ，Ｉ　Ｍを含む水溶液２
５ｍ１と共にダブノフ（Ｄｕｂｎｏｆｆ　）　Ｈ２０振
盪機上３７℃において２６時間インキュベーションする
。ＰＨ調節のためＨ３ＰＯ４を用いる。
得られた結果を表■に示す。
表　■ ＡＬＦ濃度：　、１０Ｍ　、１５Ｍ　、２Ｍ転換チ（Ｐ
ＰＡがらＰＲＥ　） ｐＨ７８７ ８，４７７，６９０９６，７ 示したように、遊離細胞は、破裂させたとき、高いＡＳ
Ｐ濃度において最良のそして穀も有用な転換を与える。
表Ｈに示したデータは、商業上容認できる収量レベル罠
対し、ＡＳＰの量をモル当°ｉｉｔ　４準で基質の鼠を
超えるべきであることを示している。
本発明の種々な面を（に下記の例により説明する。
例　６ 表■は例１におけるように、ビーズ形で固定されたＥ、
コリー全細胞を用いたトランスアミナーゼ活性に対１−
るＰＨの効果を示している。１５ｍ６のＰＰＡ　、ｉＭ
、　Ｐ５Ｐ　Ｑ、１　ｍＭおよびＡＳＰ　、１５Ｍ中６
７６Ｃで２４時間インキュベーションしたビーズ２　ｍ
、ｌを用いる三回の実験を行なう。ＰＨをＩ　Ｎ　Ｎａ
ＯＨまたはＩ　Ｎ　ＨＣｌで調節する。
表　■ 実験１　実験２　実験３ 固定細胞　固定細胞　遊離細胞 ５．０　９５．９　５　′５２　３　７８５．５　９６
．５　４　９９　４　９４６．０　９５．０　５　２１
９　５　１２３６．５　９５．９　６　２１２　６　６
０１７．０　９５．１　７　２１７　７　５９８８．０
　９４．７　８　２０７　８　５７１９　２０９　８．
４　５８６ １０　１５６　９　６３７ １０　１１５ ＊１単位は湿潤細胞１グラム当り１マイクロモル／時で
ある。
表置中のデータは破裂遊離刊ｌ胞を用いて得られる収量
と同様のＰＨｇの高収ｌか固定二コリー！用いて得られ
ろことを示して′いる。
例　４ 下記の表１ｖハ、Ｉ］、ＩＭＰＰＡ　、　０．１５Ｍ　
ＡＳＰ　オヨヒＰ５Ｐ　Ｏ，ｌ１１１Ｍによる連続カラ
ム操作（３００ｍｇ。
３．５　Ｘ　７０ｃ／ＩＬ）で固定Ｅ、コリーを用℃・
てイ’４たＰＨＥの収量に関する結果を示す。
表　■ 日　１　９５．１　１００ ８　９１．２ ９　８７．９＊ １０　９２．１ １１　９２．１−　９２ １２　９４．２ １３　９５、’１ １４　９６．１ １５　９４．８ １６９６．８ １７　９５．８　８５” １８　９５−３ ５９１ ２９６ ６９７ ４５　１００ ＊時折の流速の変動はそのような場合の活性および収量
減少を示し５ることに注目すべきである。
しかし重要な因子は示されている最高収量であり、それ
が例示した方法の最大限の可能性を指示するからである
。
例　５ ポリアゼチジン重合体は本発明に使用する微生物の固定
に特に適当であるか、本発明は他の適当な固定用基質の
使用の可能性も企図している０このような他の材料の代
表例としてポリアクリルアミド、カツパーカラジーナン
（ＫａｐＩｌａ　−ｃａｒｒａｇθｅ−ｎａｎ　）、中
空繊維考案物、／％イボール（Ｈｙｐｏｌ　）またばＸ
ＡＤ被覆ビーズといった材料をあけることができる。こ
れら材料は勝れた収量を与えることが示されているが、
固定された細胞の活性は固定用基質ごとに変化しうる。
固定されたＥ、コリーを含む種々な系を使用して収量お
よび活性に関して得た結果を表■に示す。用いた方法は
、記載された固定細胞のカラムに、ＰＰＡ　Ｏ，ＩＭ、
　ＡＳＰ　Ｏ，１５ＭおよびＰ５Ｐ　Ｑ、ｉｍＭの水浴
液を６７℃において−８．６〜８；５　（ＮＨ４ＯＨで
調節）で連続して流すものである。流れはカラム活性度
と占める空間に従って変化する。読みをとる前に最適の
流れで平衡に達せしめる。
表Ｖに引用した材料のうち、ＸＡＤは巨大網状組織のス
チレン−ジビニルベンゼン樹脂であり、ＩＲ八へ３８は
第三級アミン置換基を含むスチレン−ジビニルベンゼン
からなるイオン交換ビーズ樹脂であり、ハイボールはポ
リウレタンホームである。カツパーカラジーナンガムは
使用前に粒子に切る。中空繊維考案物は商業的に入手で
きる品目である。
上記手順の別法として、フェニルアラニン　アンモニア
−リアーゼ活性が高い固定全細胞を用いることによりケ
イ皮酸からフェニルアラニンをつ（ることかできる。本
発明のこの面はヤマダ（Ｙａｍａｄａ　）等、　Ａｐｐ
ｘｉｅａ　ａｎｄ　ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｎｏｖ、　１９８１．７７３〜７
７８頁（参考文献としてここに取り入れた）により記述
された方法の改良に相当する。
ヤマｆｉ”　等ハＬ−フェニルアラニン　アンモニア（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｇｌｕｔｉｎｉｓ　）を使用
する酵素法によりトランス−ケイ皮酸からのＬ−フェニ
ルアラニンの製造を記述している。本発明によれば、ロ
ドトルラ　グルチニスＡＴＣＣ１０７８８”ｆヤマダら
の記述のようにして発育させ、収穫した細胞なポリアゼ
チジンプレ７Ｊｅリマーで固定する。細胞１４．９グラ
ムをポリアゼチジンプレポリマー１４．９グラムと混合
し、１３．８グラムのＩＲＡ　９３　Ｂイオン交換樹脂
上に被覆し、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性
な検定する。上記のようにしてつ（つたビーズ１ｍｌを
、トランスケイ皮酸７４０ｍ９．２８％水酸化７ｙモー
＝ウム４５ｍｌ　（ｐＨ１０，８０ｍ１に希釈）を含む
検定混合物５１ｎｌと混合することによりケイ皮酸をビ
ーでに加える。２４時間後上澄ヲセルロースＴＩ、Ｃ’
板上にスポットし、ブタノール、酢酸、水（４：１：１
）の混合物で展開し、板を、２％ニンヒドリンおよびエ
タノールで噴霧する。比較のためフェニルアラニンの標
準を使用し、スポットの強度と寸法に基づいた見積りは
０．５１ｎ９／ｄのフェニルアラニンが生じたことを示
した＠ 本発明の更にもう一つの特徴によれば、フエニルビルピ
ン酸（ＰＰＡ　）　（そのものまたはその塩、例工ばフ
ェニルピルビン酸ナトリウムとして）かう（７）　フェ
ニルアラニン（ＰＨｇ　）の収量は、出発物質を芳香族
トランスアミナーゼ、なるべ（はアスパラギン酸塩トラ
ンスアミナー−ビ（これは反応に対し５より大、なるべ
（は１０より大の平衡定数（Ｋｅｇ　）を与える）と接
触させることにより著しく増加させうろことが判った。
この酵素はそれ自体で使用してもよいし、あるいはこれ
を含有する固定または遊離の細胞の形で使用してもよい
。
芳香族アミン交換反応に関する文献の調査によれば、Ｅ
、コリー中に３種の主要なアミノ交換反応ケする酵素が
存在することが示されている。これらはトランスアミナ
ーゼＡとトランスアミナーゼＢであって、トランスアミ
ナーゼＡは実際は二つの酵素で、その一つはアスパラギ
ン酸塩トランスアミナーゼであり、そして他はチロシン
で抑制される芳香族トランスアミナーゼである。これら
トランスアミナーゼＡ酵素の両者ともトリシトファン、
フェニルアラニン、およびチロシンの生成を触媒する。
トランスアミナーゼＢはインロイシン、バリン、ノルロ
イシンおよびノルバリンの生成を触媒する＠ アスパラギン酸塩トランスアミナーゼ、即ちトランスア
ミナーゼＡに見出される二つの酵素のうちの一つは２０
分でＥ、コリー染色体上にあるのがわかり、セしてａｓ
ｐＣ突然変異と称される。チロシンで抑制されるアミノ
転移酵素は８０分でＥ、コリー染色体地図上にあり、ｔ
ｙｒＢと称されるＯ本発明の一部として、あるＥ、　：
Ｉ　ＩＪ−（例えば、Ｅ、コリーＡＴＣＣ１１３０３）
中のアスパライン酸塩トランスアミナーゼは増強される
こと、そしてこの酵素の平衡定数は〉１０であり、従っ
て反応：フェニルビルビン酸塩＋アスパラギン酸塩；フ
ェニルアラニン＋オキサロ酢酸塩 に使用したときフェニルアラニンの９５％より大きい収
量を可能に１−ることか決定された。
エール収集から得たＥ、コリー突然変異体を用いる検定
において、異なるトランスアミナーゼに対するＫｅｇに
差か見出される。このようにして、５４時間でｉｌｖ　
Ｅ突然変異体は２０％そしてｔｒｙＢ突然変異体は３６
チのフェニルピルビン酸からフェニルアラニンへの変換
を示すが、アミン供与体とし゛Ｃグルタミン酸塩を用い
る遊離細胞検定においてａｓｐ　Ｃは６２％、Ｅ、コリ
ー１　’［０３は６６％の変換を示した。
遊離細胞検定をアスパラギン酸７０チおよびグルタミン
酸３０チを用いて行なった場合、５４時間におけるフェ
ニルピルビン酸からフェニルアラニンへの変換はｉｌｖ
　Ｅ突然変異体に対し２０％、ｔｒｙ　Ｂ突然変異体に
対し５７％、Ｅ、コリー１１５０５に対し８９％そし゛
Ｃａ５ｐ’ｃ突然変異体に対して９１％であった〇 アミン供与体として７０％アスパラギン酸／６０％グル
タミン酸に対する結果はＬ−アスパラギン酸だけがアミ
ン供与体である場合に得られた結果と殆ど同じである。
ｉｌｖ　Ｅ突然変異体は５４時間で１９％変換を与え、
ｔｙｒ　Ｂは５７％、ａｓｐＣは１００％そしてＥ、コ
リー１１５０５は１０２チを与えた。このようにアスパ
ラギン酸塩トランスアミナーゼは文献に基づいて期待し
たよりもはるかに高収量を与えうろこと、ならびにこれ
ら収量は以前に報告された収量よりも有意に大きいこと
が判る。従って、本発明の四にもう一つの％徴として、
フェニルピルビン酸またはその同等物からこれを〉５、
なるべ（は＞１００平ｉＡｉ定数を有するアスパライン
酸塩トランスアミナーゼと接触させることによりフェニ
ルアラニンを製造することか提唱される。この目的に対
しては居、コリー１１３０３を使用するのが有利である
が、他の型の細胞（遊離または固定）も使用できる。
ある場合には、例えば〉１０という望みの平衡定数を満
足するため反応にカルボキシラーゼを含めることも便利
であるかもしれない。本来備わって高いアスパラギン酸
塩トランスアミナーゼ活性をもつＥ、コ！Ｊ−１１３０
３の使用はそれ自体で平衡定数に関して指定された制限
を満足１”るのに十分である。他方、トランスアミナー
ゼかそれ自身で必要なに０ｇ限界を満せない状況もあり
うる。
この場合には、反応な〉１【〕の平衡値にまで進めるだ
めにカルボキシラーゼも使用できる。
式： （式中、ＯＸはオキサロ酢酸塩であり、ＰＨＥ、　Ａ８
ＰおよびＰＰＡは前記の通りである）により決まる、関
醇する反応に対するに０ｇの調査から、この反応は反応
体の一つを除去することにより完結点に向かって推進し
うろことが判る。オキサロ酢酸塩ジカルボキシラーゼは
反応ニ オキサロ酢酸塩→ピルビン酸塩十ＣＯ２を触媒する。
アミノ交換反応と結合したこの反応はオキサロ酢酸塩を
平衡から効果的に除去できる。
例４に示したもののようにカラム内に固定された細胞か
らの流出液流の分析はそれか典型的にオキサロ酢酸塩３
５　ｍＭ　ｓ　ピルビン酸塩６５　ｍＭ　、アスパラギ
ン酸塩５ｍＭ、フェニルアラニン９５ｍＭおよびフェニ
ルピルビン酸塩５ｍＭを含むことを示す。このデータか
ら計算された平衡定数は、アスパラギン酸およびフェニ
ルピルビン酸塩からのフェニルアラニンの製造に対して
１６．６である。
ここに記載された本発明において種々な変更をなしうろ
ことが明白であろう。
従って、本発明の範囲は特許請求の範囲に定義されてい
る。
代理人　浅　村　皓 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ　、’　識別記号Ｊ ｒ内整理番号

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）　フェニルアラニンの製造法において、フェニル
    ピルビン酸またはフェニルピルビン酸塩をアミン供与体
    の存在下トランスアミナーゼ活性を有する固定化細胞と
    接触させることを特徴とする、上記方法。 （２）細胞をポリアゼチジン重合体により固定する、特
    許請求の範囲第１項記載の方法。 （３）　固定化細胞なビープまたは他の粒状材料上に被
    覆する、特許請求の範囲第２項記載の方法。 （４）過剰のアミン供与体を用い、−を特徴とする特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 （５）　アミン供与体の過剰分が少な（とも５０％であ
    り、−１が５−１０である、特許請求の範囲第４項記載
    の方法。 （６）　フェニルアラニンの製造法において、フェニル
    ピルビン酸またはフェニルピルビン酸塩をアミン供与体
    の存在下トランスアミナーゼ活性を有する細胞と接触さ
    せることからなり、前記細胞が酵素とフェニルピルビン
    酸またはフェニルピルビン酸塩との間の接触を増加させ
    るため破壊させるか透過性としたものであることを特徴
    とする、上記方法。 （７）細胞を音波処理により破壊させる、特許請求の範
    囲第６項記載の方法。 （８）細胞を界面活性剤で処理することにより透過性に
    する、特許請求の範囲第６項記載の方法。 （９）破壊細胞または透過性にした細胞か遊ＩＩＧ状態
    にある、特許請求の範囲第６項記載の方法。 叫　酵素を特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方法
    。 ａυ　供与体がＬ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸
    、またはその混合物である、特許請求の範囲第１項また
    は第６項記載の方法。 ０　単一アミン供与体だけを使用する、特ａ＋　請求の
    範囲第８項記載の方法。 （１３１供与体がＬ−アスパラギン酸である、特許請求
    の範囲第１２項記載の方法。 ＋＋４）　添加されたピリドキサール−５−ホスフェー
    トを含む、４許請求の範囲第１項記載の方法〇（１５１
    細胞が大腸菌の細胞である、特許請求の範囲第１項また
    は第６項記載の方法。 ００　細胞が シュードモナス　エルギノーザ　ＭＴ （Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＭＴ）アエロバクｐ　
    −エロテネス （Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）からな
    る群から選ばれる、特許請求のＭ＋ｉΣ囲第１項第１項
    第６項記載の方法。 （ＩＤトランスアミナーゼ活性を有する固定化細胞、ア
    ミン供与体およびフェニルピルビン酸またはフェニルピ
    ルビン酸塩からなることを特徴とする組成物。 （［樟　細胞をポリアゼチジンで固定する、特許請求の
    範囲第１７項記載の組成物。 （１１トランスアミナーゼ活性を有する固定化酵素を含
    みフェニルピルビン酸またはフェニルピルビン酸塩から
    フェニルアラニンへの変換に使用するのに適した組成物
    。 （至）酵素が全細胞の形で存在する、特許請求の範囲第
    １９項記載の組成物。 Ｃ！υ　酵素が破壊させるか透過性を与えた細胞の形で
    存在する、特許請求の範囲＠１９項記載の組成物。 （２榎　細胞をポリアゼチジン重合体によって固定する
    、特許請求の範囲第１９項記載の組成物。 （ハ）　フェニルピルビン酸またはフェニルピルビン酸
    塩からフェニルアラニンへの変換に用いるのに適した組
    成物において、トランスアミナーゼ活性を有する遊離細
    胞を含み、前記細胞を化学処理により透過性にするか破
    壊させることを特徴とする、上記組成物。 （２４１フェニルアラニンの製造法において、フェニル
    アラニンアンモニアリアーゼ活性を有す固定化細胞とケ
    イ皮酸を接触させることを特徴とする、上記方法。 シω　固定化細胞が粒状支持体上に被覆されたポリアゼ
    チジン重合体によって固定されたロドトルラグルチニス
    細胞である、特許請求の範囲第１０項記載の方法。 （４）　フェニルアラニンの製造法において、フェニル
    ピルビン酸またはフェニルピルビン酸塩をアルパラヤン
    酸塩トランスアミナーゼ活性と５より犬のに０ｇにおい
    て接触させることを特徴とする、上記方法。 ＠　Ｋｅｇか１０より犬である、特許請求の範囲第２６
    項記載の方法。 四　指定されたトランスアミナーゼを含むＥ、コート二
    １１３０３を特徴する特許請求の範囲第２７項記載の方
    法。 （ハ）　望むＫｅｇを与えるためカルボキシラーゼか存
    在する、特許請求の範囲第２６項記載の方法。
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