JPH0426837B2

JPH0426837B2 -

Info

Publication number: JPH0426837B2
Application number: JP21620782A
Authority: JP
Inventors: Kazutomo Imahori; Hitoshi Kondo; Hiroshi Nakajima; Tatsuo Iwasaki
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 1982-12-09
Filing date: 1982-12-09
Publication date: 1992-05-08
Also published as: JPS59106296A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、アデノシン−5′−三リン酸（以下
ATPという。）を補助因子とする酵素反応による
生理活性物質の製造法に関するものである。

近年、現行の化学工業の見直しから、生体内の
化学反応が注目されるようになり、生体内の化学
反応を工場内の反応器で再現しようとする試みが
盛んに行なわれるようになつてきている。元々、
生体内では生命を維持するために、数多くの生合
成反応が酵素を触媒として営なまれており、これ
らは、化学合成反応では合成困難な化合物を容易
に与えるだけでなく、省エネルギー性、無公害性
など社会の要請に応える要素も有しているので、
化学工業界における必須の技術になろうとしてい
る。これらの中でも、加水分解反応、異性化反応
などの技術分野においては、既に実用化のレベル
に達しているものもある。

しかし、生合成反応の中でも、特に重要な反応
である結合反応を行なうに当つては、ATPがエ
ネルギー源または補助因子として必要である。こ
の際、ATPはエネルギー源または補助因子とし
て働いた後、アデノシン−5′−二リン酸（以下
ADPという。）またはアデノシン−5′−一リン酸
（以下AMPという。）に分解され、消費されてし
まうことになる。従つて、結合反応を工業的な再
現するためには、ATPが安価に供給されること
が必要であるが、現実にはATPは極めて高価な
物質である。それ故に、ATPの消費後の姿であ
るADP、AMP、特に最低のエネルギーレベルに
消費されつくしたAMPをATPに再生変換するこ
とが、この問題点を打開する重要な技術となるの
である。

ところが、このような結合反応による物質の製
造を、ATPを再生しながら行なうという例はあ
まり知られていない。たとえば、特開昭54−
122793号公報などが知られている程度である。こ
れは、グルタミン酸、システイン、グリシンにγ
−グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチ
オン合成酵素を作用させてグルタチオンを合成す
る際に消費されるATPを酢酸キナーゼの作用で
消費された後の姿であるADPから再生再利用す
るというものであるが、そのレベルに止まつてお
り、先に述べた最低のエネルギーレベルに消費さ
れつくしたAMPをATPに再生変換することにつ
いての知識を与えるものでない。一方、消費され
たATPを微生物の解糖系を利用して再生または
補給しようという考えもあり、ここでATPの原
料としてAMPを使用するという例がある（たと
えば、栃倉辰六郎ら、有機合成化学、第39巻、第
６号、487頁、1981年）。しかし、このAMPは、
ATPの消費後の姿ではなく、ATP源として別に
加えるものであり、しかも、この試みの結果は、
AMPのATPへの変換効率は極めて悪いというも
のであつた（同上文献）。すなわち、微生物の解
糖系を利用する場合も、ATPをその消費後の姿
であるAMPから再生するということについては
否定的な推測しか得られていなかつたのである。

従来、このような観点からATPをAMPに連続
的に消費して有用物質を合成するための反応器
（バイオリアクター）の概念が考えられ、このシ
ステムの完成が強く要望されていた。

本発明者らは、これらの実状に鑑み、特に最低
のエネルギーレベルに分解した産物であるAMP
をATPに変換再生することにつき鋭意研究した
結果、最適生育温度が50℃ないし85℃である微生
物の産生する変換酵素を使用すると、短時間で、
高収率でAMPをATPに変換できることを見い出
し、また、AMPとATPとの混合比を特定の条件
に制御してAMPをATPに再生すると、安価で、
かつ操作性良く長期間安定してAMPを実質上ほ
とんど100％ATPに変換できることを見い出し、
さらに引続き検討を重ねた結果、この知見に基い
て(a)AMPからATPに再生する反応系と、(b)
ATPを用いて生理活性物質を合成する酵素反応
系とを連結することにより、最低のエネルギーレ
ベルに分解した産物であるAMPを原料として生
理活性物質が合成されることを見い出し、本発明
を完成した。

すなわち、本発明は、(a)アデノシン−5′−一リ
ン酸をアデノシン−5′−二リン酸に変換する酵素
と、アデノシン−5′−二リン酸をアデノシン−
5′−三リン酸に変換する酵素とを組み合わせてア
デノシン−5′−一リン酸からアデノシン−5′−三
リン酸を生成させ、(b)生成させたアデノシン−
5′−三リン酸を用いて酵素反応により生理活性物
質を合成し、次いで(b)の反応によつて生じたアデ
ノシン−5′−一リン酸を(a)の反応によつてアデノ
シン−5′−三リン酸に再生し、再生したアデノシ
ン−5′−三リン酸を(b)の酵素反応による生理活性
物質の合成にくり返し利用することを特徴とする
複合酵素法による生理活性物質の製造法である。

本発明において、ATPを用いて生理活性物質
を合成せしめる酵素反応（以下生理活性物質反応
系という。）としては、先に述べた結合反応とい
われるものが主たるものであつて、たとえば、ア
ミノ酸からアミノアシルｔ−RNA合成酵素によ
りペプチドおよびペプチド誘導体を合成する反
応、酢酸または脂肪酸とCoAからアセチルCoA
合成酵素またはアシルCoA合成酵素によりアセ
チルCoAまたはアシルCoAを合成する反応、パ
ントイン酸とβ−アラニンからパントテン酸合成
酵素によりＬ−パントテン酸を合成する反応、キ
サンチル酸とアンモニアあるいはグルタミンから
グアニル酸合成酵素によりグアニル酸を合成する
反応、アスパラギン酸とアンモニアからアスパラ
ギン合成酵素によりアスパラギンを合成する反
応、カルボン酸とCoAからブチリルCoA合成酵
素によりアシルCoAを合成する反応、Ｄ−アラ
ニンとポリ（リビトールリン酸）からＤ−アラニ
ル−ポリ（リビトールリン酸）合成酵素により、
Ｏ−Ｄ−アラニル−ポリ（リビトールリン酸）を
合成する反応、デアミドNAD⁺とＬ−グルタミン
からNAD⁺合成酵素によりNAD⁺を合成する反応
などがあげられる。

本発明において、上記生理活性物質反応系で、
ATPは、消費され、AMPになるわけであるが、
このAMPを、ADPに変換する酵素とATPに変
換する酵素とを組み合わせてATPに変換する
（以下ATP再生反応系という。）。このAMPを
ADPに変換する酵素としては、例えば、アデニ
ル酸キナーゼが使用され、この際、AMPへのリ
ン酸供与体としては、ATPが使用される。また、
ADPをATPに変換する酵素としては、酢酸キナ
ーゼ、カルバミン酸キナーゼ、クレアチンキナー
ゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン
酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼなど多くのもの
が使用できるが、リン酸供与体の価格、ATPへ
の変換活性、酵素の入手の容易さなどを勘案する
と、酢酸キナーゼを使用するのが最も有利であ
り、この際、リン酸供与体としてはアセチルリン
酸が使用される。このように、アデニル酸キナー
ゼと酢酸キナーゼを使用するに際して各酵素のリ
ン酸供与体としてはATPとアセルチリン酸を使
用することになるが、リン酸供与体としての
ATPは最終変換物であるATPを循環使用するこ
とができるので、結局、リン酸供与体としてはア
セチルリン酸だけを供給すればよいことになる。
このような組み合わせにより効率的な設計がはか
れるのはこれら両酵素の利点である。

このように、二種類の変換酵素を使用すること
により生成AMPをATPに再生することが可能に
なるが、これら両酵素は最適生育温度が50℃ない
し85℃である微生物の産生する酵素であることが
望ましい。このような微生物としては、バチル
ス・ステアロサーモフイルス、バチルス・ブレビ
ス、バチルス・コアギユランス、バチルス・サー
モプロテオリテイクス、バチルス・アシドカルダ
リウスなどのバチルス属の微生物、クロストリジ
ウム属の微生物、サーモアクチノマイセス属の微
生物、アクロモバクター属の微生物、ストレプト
マイセス属の微生物、ミクロポリスポル属の微生
物、サーマス・アクアテイクス、サーマス・サー
モフイルス、サーマス・フラブスなどのサーマス
属の微生物、サーモミクロビウム属の微生物、カ
ルデリア属の微生物などがあげられる。また、こ
れら微生物の遺伝子を導入した常温生育微生物も
含まれる。これら微生物の中でもアデニル酸キナ
ーゼ、酢酸キナーゼの両酵素の産生に特に適した
ものはバチルス・ステアロサーモフイルスであ
る。この微生物から得られる両酵素は精製が容易
であり、比活性が高い。研究当初においては、最
適生育温度が50℃ないし85℃である微生物の産生
する変換酵素を使用することは常温でのATP再
生産には適しないと考えられていたが驚くべきこ
とに常温で短時間、高収率で長期間安定して
AMPをATPに変換でき、これらの効果はむしろ
常温生物が産生する酵素をはるかにしのぐものな
のである。

本発明でAMPを原料として前記した生理活性
物質反応系で生理活性物質を合成するには、ま
ず、反応器を構築すればよいが、そのような反応
器としては、例えば、膜型反応器、カラム型反応
器を使用することができる。膜型反応器は、生理
活性物質が低分子物質の場合に特に有効に使用で
きる。この際、酵素は高分子物質であるので、各
酵素はそのまま反応器の中にとどまつた状態で使
用することができる。生成したAMPは、低分子
物質であるので、反応器から流出するが、イオン
交換クロマトグラフイーなどの操作により簡単に
生理活性物質と分離したのち、反応器へ戻すこと
により、ATPに再生することが可能である。ま
た、あらかじめATPに適当なスペーサーを導入
し、水溶性高分子物質と結合せしめた、いわゆる
水溶性高分子化ATPを使用すれば、このような
分離操作も不要になる。この場合の水溶性高分子
物質としては、例えば、可溶性デキストランのよ
うな多糖類、ポリアクリルアミド誘導体やポリア
クリル酸誘導体のようなビニルポリマー誘導体、
ポリエチレングリコール誘導体のようなポリエー
テル誘導体など各種のものを使用することができ
る。

次にカラム型反応器は、生理活性物質の如何を
問わず使用できる。この場合には、使用する各酵
素を適当な担体、たとえば、セルロース、デキス
トラン、アガロースなどのような多糖類の誘導
体、ポリスチレン、エチレン−マレイン酸共重合
体、架橋ポリアクリルアミドなどのようなビニル
ポリマーの誘導体、Ｌ−アラニンＬ−グルタミン
酸共重合体、ポリアスパラギン酸などのようなポ
リアミノ酸またはポリアミドの誘導体、ガラス、
アルミナ、ヒドロキシアパタイトなどのような無
機物の誘導体、などに結合、包括あるいは吸着せ
しめて、ちわゆる固定化酵素としてカラムに充填
して使用すればよい。この反応器では、生成した
AMPは高分子化、非高分子化を問わず、反応器
外へ流出するが、前述と同様にして生理活性物質
と分離し、反応器へもどすことができる。また、
水溶性高分子化ATPは、膜分離が可能であるの
で、分離操作を簡単にすることができる。

上述の反応器は、連続的に操作することを前提
として説明したものであるが、このような思想に
基いて他の反応器を考案することもできるし、場
合によつてはバツチ式の反応器を使用してバツチ
式に操作してもよい。

本発明において、生理活性物質反応系とATP
再生反応系とを上記した反応器を別々に使用し
て、これらを連結して操作することもできるし、
また生理活性物質反応系とATP再生反応系とを
上記した同一の反応器の中に共存せしめて操作す
ることもできるが、生理活性物質を効率良く合成
するには、両者とも生理活性物質反応系で生成し
たAMPをATPとともにATP再生反応系に供す
ることが望まれる。このとき、AMPとATPとの
量比は、次式に示す範囲にあることが望ましい。

0.15×５×γ²／γ²×AMP≧ATP≧0.04 ×５＋γ²／γ²×AMP (a) 但し、AMPはAMPの濃度（mM）、ATPは
ATPの濃度（mM）を表し、γはADPをATPに
変換する酵素の固定化酵素活性とAMPをADPに
変換する酵素の固定化酵素活性との比で、１以上
の正数を表わす。

上記のATP再生反応系を実施するための装置
としては、基質供給部、上記２種類の変換酵素を
含む反応槽、自動サンプリング部、分析装置およ
び制御部から構成された装置を具備したものを用
いるのが望ましい。その基質供給部としては、例
えば、AMP槽、ATP槽、アセチルリン酸槽から
構成され、定量ポンプ等の可変量送液装置と自動
調節弁の作動により一定流量、一定濃度で酵素反
応槽に各基質を送液することができる。自動サン
プリング部は酵素反応槽からの反応液をあらかじ
め設定した時間間隔で自動的に一定量採取し、分
析装置に送ることができる。分析装置はAMP、
ADP、ATPの各濃度を計算し、この値をもとに
制御部は可変量送液装置と自動調節弁の作動を制
御し、ATP再生反応系に供給するAMP、ATP
及びアセチルリン酸の量を調節することができ
る。

次に生理活性物質反応系とATP再生反応系と
を別々の反応器を使用して、これらを連結して操
作するには、たとえば次のような方法を用いるこ
とができる。まず、ATP再生反応系の反応器に、
AMPを0.1μM〜4M、好ましくは1μM〜2M、さ
らに好ましくは10μM〜500mM、アセチルリン酸
を0.1μM〜500mM、好ましくは1μM〜400mM、
さらに好ましくは10μM〜300mM、および(a)式に
示したようにATPをAMPに対し、ATP再生反
応系の量比によつて異なるが、好ましくは４％以
上を反応器の一端からAMPと共に供給し、反応
器内でAMP→ADP→ATPの変換を行なわしめ
ることができる。反応器から溶出した反応液を適
当な分析システムで分析し、AMP、ADP、
ATPの各濃度およびATPへの変換率を求めるこ
とができる。この時、流速としては、反応器の大
きさにより異なるが、たとえば0.3μ／時間から
１×10⁶／時間の間の適当な流速を選定できる。
この反応液の一部（ATP濃度はAMP濃度の４％
以上が望ましい。）を反応器入口に循環して戻し、
初期に供給していたATP液の供給を停止する。
残りの大部分の反応液は、反応液中のATP以外
の物質、たとえば酢酸が生理活性物質反応系を阻
害しない場合は、濃度を調節してそのまま生理活
性物質反応系の反応器へ生理活性物質反応系の基
質と混合して供給し、また、阻害する場合には、
イオン交換樹脂等の適当な分離手段を用いて阻害
物質を除いた後、生理活性物質反応系の反応器の
一端に、生理活性物質反応系の基質を溶かした溶
液と混合した供給すればよい。この時、流速とし
ては反応器の大きさにより異なるが、たとえば、
0.3μ／時間から１×10⁶／時間の間の適当な
流速を選定すればよい。この基質濃度は、生理活
性物質によつて異なるが、基質の溶解度がATP
再生反応系から供給されるATP濃度より低い場
合は、その基質濃度の溶解度が上限となり、ま
た、基質の溶解度が供給されるATP濃度よりも
高い場合には、ATP濃度と同等の濃度がその基
質の最も濃い濃度となる。また、後者の場合、供
給されるATPを濃縮すれば、より高濃度で合成
反応を行なうことができるが、この場合には、濃
縮操作が入るため不連続的方法となる。反応器中
の溶出液から適当な分離手段、たとえばイオン交
換樹脂で反応生成物（生理活性物質）とAMPと
を分離し、AMPは、ATP再生反応系の反応器の
一端に戻し、再びATPに再生すればよい。

また、生理活性物質反応系とATP再生反応系
とを一つの反応器の中に共存せしめて操作する場
合は、両者の酵素系の基質が互いに酵素反応系を
阻害しない場合のみ適用できる。両酵素反応系の
基質濃度としては、ATP再生反応系で生成する
ATP濃度と生理活性物質反応系の基質の溶解度
との関係で選定することが望まれる。たとせば
ATP濃度より生理活性物質反応系の基質の溶解
度が低い場合には、ATP再生反応系で生成する
ATP濃度を基質濃度に合わせるように、AMP、
ATP、アセチルリン酸濃度を選定すればよい。
また、逆に、ATP濃度より生理活性物質反応系
の基質の溶解度が高い場合には、ATP再生反応
系で生成するATP濃度に基質濃度を合わすこと
が望まれる。ATP再生反応系に、AMPと共に供
給するATP量は、前記の別々の反応器を使用し
て、これらを連結して用いる場合よりも、２倍、
より好ましくは４倍、さらに好ましくは５倍以上
加える方が望ましい。流速としては、前記別々の
反応器の場合と同じく、反応器の大きさによつて
異なるが、たとえば0.3μ／時間から１×10⁶
／時間の間の適当な流速を選定できる。また、
反応器から流出した反応液は、前述した如く、適
当な分離手段、たとえばイオン交換樹脂などを用
いてAMPと生理活性物質とを分離し、AMPは反
応器の入口に再び基質として戻して再利用するこ
とができる。

本発明の実施に当つて、PHとしては、使用する
酵素によつて異なるが、おおむね中性付近、すな
わち６〜11、好ましくは6.5〜9.0の範囲が使用さ
れる。緩衝液としてはこれらのPHに適した通常の
ものを使用することができる。たとえば、７付近
ではリン酸塩、イミダゾール塩、トリエタノール
アミン塩などをあげることができる。

本発明の実施に当つての温度としては室温ない
し50℃の範囲で選択することができる。ATP再
生反応系に最適生育温度が50℃乃至85℃である微
生物の産生する酵素を使用する場合はATP再生
反応系をより高温で行なうことができるが、最適
生育温度の５℃以下であることが望まれる。

本発明によれば、前記のような反応器を用いて
ATPを補助因子とする酵素反応を連続的に極め
て効率よくかつ経済的に行なうことが可能になつ
た。したがつて、最初に述べたような生体内で行
なわれている結合反応を生体外の化学工業的な反
応として行なう、いわゆるバイオリアクターの稼
動の実現が可能になつたものである。特に生体内
の最も重要な反応であるアミノ酸活性化酵素によ
るタンパク合成反応やペプチド合成反応などの実
用化が可能となつたことは、工業上測り知れない
価値がある。

次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１アデニル酸キナーゼと酢酸キナーゼは、市販バ
チルス・ステアロサーモフイルス由来の標品（生
化学工業販売）を使用し、アセチルCoA合成酵
素は市販酵母由来の標品（ベーリンガー・マンハ
イム社製）を使用した。

これら３種酵素を次のようにしてセフアロース
4Bに固定化した。すなわち、活性化CH−セフア
ロース4B（フアルマシア社製）5gを洗浄膨潤後、
酢酸キナーゼ2000ユニツトを加えて反応させ、固
定化酢酸キナーゼ1000ユニツトを得た。同様にし
て250ユニツトのアデニル酸キナーゼから100ユニ
ツトの固定化アデニル酸キナーゼを、100ユニツ
トのアセチルCoA合成酵素から10ユニツトの固
定化アセチルCoA合成酵素を得た。固定化酢酸
キナーゼと固定化アデニル酸キナーゼをATP再
生産用カラム（内径1.6cmで長さが10cm）に充填
し、10mM塩化マグネシウムを含む25mAイミダ
ゾール塩酸緩衝液PH7.5に溶解した6mMAMP、
0.3mMATP、25mMアセチルリン酸を25ml／時
間の流速でカラムに供給した。カラム内の反応温
度を30℃に保つた。ここで生成したATPをAMP
濃度に対し５％（0.3mM）だけ、再生産カラム
入口に戻した。

又、固定化アセチルCoA合成酵素を別のカラ
ム（内径1.0cm、長さ９cm）に充填した。基質と
して、100mMイミダゾール塩酸緩衝液、PH7.5に
溶解した4mM酢酸カリウム、4mM還元型CoA、
リチウム塩、4mMMgCl₂を25ml／時間の流速で
流し、これをATP再生産システムから溶出した
ATP溶液とを１：１に混合し、固定化アセチル
CoA合成酵素カラムに供給した（流速50ml／時
間、反応温度37℃）。更に、カラムからの溶出液
から陰イオン交換樹脂ダウエツクス１−X8（ザ・
ダウ・ケミカル社製）により、AMPを分取し、
PH、濃度を所定の値にした後、ポンプでATP再
生産カラムに供給した。生成したアセチルCoA
の量をカラムからの溶出液を0.05ml採取し、
1mM5，5′−ジチオビス−（２−ニトロベンゾイ
ル酸）（DTNB）（PH6.65、リン酸緩衝液）３mlに
添加し、室温で20分後の412mmの吸光度変化によ
り未反応SH基を定量して算出した。

その結果、反応開始30分後に1.5mMのアセチ
ルCoAが生成し、以後24時間にわたつて安定に
推移した。

実施例２実施例１と同様にして得た固定化酢酸キナーゼ
2000ユニツト、固定化アデニル酸キナーゼ200ユ
ニツト、及び固定化アセチルCoA合成酵素10ユ
ニツトを１つのカラム（内径1.8cm、長さ12cm）
に充填し、10mM塩化マグネシウムを含む
100mMイミダゾール塩酸緩衝液PH7.5に溶解した
4mM AMP、1.0mM ATP（AMP濃度に対し25
％）、25mMアセチルリン酸、2.5mM酢酸カリウ
ム、2.5mM還元型CoAリチウム塩を50ml／時間
の流速で供給した。このカラム内の反応温度を37
℃に保つた。これを実施例１と同様にカラムから
の溶出液からAMPを分離し、元の基質供給部に
戻した。

反応開始後40分後に、生成したアセチルCoA
は1.6mMになり、以後15時間にわたつて安定に
推移した。

実施例３市販エシエリシア・コリ由来の酢酸キナーゼ
（ベーリンガー・マンハイム社製）と市販酵母由
来アデニル酸キナーゼ（オリエンタル酵母社製）
を用い、実施例１と同様の条件で実験を行つた。

その結果、反応開始後40分後に生成したアセチ
ルCoAは、1.1mMに達したが、以後漸減し、15
時間後には半減する傾向にあつた。

実施例４アスパラギン合成酵素をラクトバチルス・アラ
ビノーサスATCC8014より、硫酸アンモニウム分
画、リン酸カルシウムゲル、ゲル濾過を経て精製
した。

実施例１と同じATP再生産システムを用い、
10mM塩化マンガンを含む25mMイミダゾール塩
酸緩衝液、PH7.5に溶解した4mMAMP、
0.3mMATP（AMP濃度に対し7.5％）、16mMア
セチルリン酸を供給し、ATPを再生した。

また、アスパラギン合成酵素を4mM塩化マン
ガンを含む100mMトリス塩酸緩衝液に100ユニツ
ト溶解して、分子量30000の限外濾過膜を使つた
内容量50mlの膜型反応器に封入した。

これに、4mM塩化マンガンを含む100mMトリ
ス塩酸緩衝液に溶解した4mM塩化アンモニウム、
4mML−アスパラギン酸とATP再生産システム
からのATP液を１：１に混合して、流速25ml／
時間で供給した。このときの反応温度を37℃に保
つた。溶出液から実施例１と同様にしてAMPを
分離し、ATP再生産システムに戻した。又、生
産したＬ−アスパラギンは溶出液をそのまま高速
液体クロマトグラフイ装置に供して定量した。

このときのクロマトグラフイ装置の条件として
カラムを島津ゾルバツクスODSを用い、溶出液
を0.01M酢酸ナトリウム（PH4.5）／アセトニト
リル（55／45）で、流速を１ml／minとし、検出
を210nmにおける吸光度で行なつた。

その結果、反応開始後30分でＬ−アスパラギン
が1.5mM生成し、以後15時間にわたつて安定に
推移した。

実施例５チロシルーtRNA合成酵素をバチルス・ステア
ロサーモフイルス微工研菌寄第5141号から、
DEAE−セルロース（ワツトマン社製）、ヒドロ
キシアパタタイト（生化学工業販売）、DEAE−
セフアデツクス（フアルマシア社製）の各クロマ
トグラフイー、硫酸アンモニウム分別、ヒドロキ
シアパタイト、DEAE−セフアデツクス及びセフ
アデツクスＧ−150（フアルマシア社製）の各クロ
マトグラフイーを経て単一に精製した。

次に実施例１と同様にして、AMPと触媒量
（AMP濃度に対し５％）ATP、及びアセチルリ
ン酸から、ATP（純度98％）を再生し、これを以
下の反応に用いた。

上記精製チロシル−tRNA合成酵素150mg、塩
化マグネシウム200mg、ATP51mg（純度98％）、
Ｌ−チロシン0.5mg、ピロフオスフアターゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）100ユニツト、ジ
チオスレイトール0.005mgを20mMへペス緩衝液
70ml（PH8.0）に溶解し、４℃で15分間反応させ
て反応混合物を得た。得られた反応混合物にＬ−
フエニルアラニンメチルエステル2gを加え、よ
く混合し、反応温度を30℃に保つて１日放置して
反応させた。

次いで得られた反応液にアセトン100mlを加え、
沈殿を遠心分離除去後、上清をエバポレーターに
て約10mlに濃縮し、高速液体クロマトグラフイ装
置に供し、生成物を分離した。このときのクロマ
トグラフイ装置の条件として、カラムをマイクロ
ボンタパツクC₁₈（ウオーターズ社製）を用い、展
開溶媒を50mMリン酸緩衝液（PH7.0）／アセト
ントリル（85／15）で行ない、検出を210nmの吸
光度で行なつた。

その結果、Ｌ−チロシル−Ｌ−フエニルアラニ
ンメチルエステルを0.22mgを得た。又、同時にボ
イド画分に溶出したAMPを更に実施例１と同様
にして分離し、ATP再生産システムに戻して
ATPを再生産した。

実施例６メチオニル−tRNA合成酵素を市販パン酵母
（オリエンタル酵母社製）からリン酸セルロース
（ワツトマン社製）カラムクロマトグラフイ操作
により粗酵素液（純度10％）として得た。

次に実施例１と同様にして、AMPと触媒量
（AMP濃度に対し５％）ATP、及びアセチルリ
ン酸からATP（純度98％）を再生し、これを以下
の反応に用いた。

上記粗メチオニル−tRNA合成酵素1g、塩化マ
グネシウム10mg、ATP21mg（純度98％）、Ｌ−メ
チオニン0.5mg、ピロホスフアクターゼ（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）５ユニツト及びメルカ
プトエタノール20mlを50mM2，５−ジメチルイ
ミダゾール緩衝液PH9.0、15mlに加え、実施例５
と同様に反応させた後、反応混合物をセフアデツ
クスＧ−75に供し、ヘペス緩衝液（PH8.0）にて
溶出し、ボイド容の画分を30mlを集め反応混合物
を単離した。単離した混合物にＬ−ロイシンエチ
ルエステル0.5gを固体のまま加えて、25℃で４時
間反応させた。得られた反応物にアセトン30mlを
加え、生じた沈殿を遠心分離除去した後、上清を
エバポレーターにて約10mlに濃縮後、実施例５と
同様に分離し、Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシンエ
チルエステルを0.92mg得た。

また、実施例５と同様にしてAMPとATPに再
生した。

Claims

【特許請求の範囲】１ (a)アデノシン−5′−一リン酸をアデノシン−
5′−二リン酸に変換する酵素と、アデノシン−
5′−二リン酸をアデノシン−5′−三リン酸に変換
する酵素とを組み合わせてアデノシン−5′−一リ
ン酸からアデノシン−5′−三リン酸を生成させ、
(b)生成させたアデノシン−5′−三リン酸を用いて
酵素反応により生理活性物質を合成し、次いで(b)
の反応によつて生じたアデノシン−5′−一リン酸
を(a)の反応によつてアデノシン−5′−三リン酸に
再生し、再生したアデノシン−5′−三リン酸を(b)
の酵素反応による生理活性物質の合成にくり返し
利用することを特徴とする複合酵素法による生理
活性物質の製造法。２ (b)の反応によつて生じたアデノシン−5′−一
リン酸をアデノシン−5′−三リン酸とともに(a)の
反応に供してアデノシン−5′−三リン酸に再生す
る特許請求の範囲第１項記載の製造法。