JPS60115529A - ヘルペスウイルス１型および２型の糖タンパク質ｂの免疫学的に反応性を持つ非グリコシル化アミノ酸鎖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は単純ヘルペスウィルス１壓および２型（一般的
にＨ８Ｖ−１、Ｈ８Ｖ−２と略記される）に対する予防
および治療のためのワクチンに関するものである。更に
詳しくは、Ｈ８Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２の糖タンパン質
Ｂの中に見い出されるアミノ酸鎖と一致する配列を全要
素として構成されているアミノ酸鎖を発現するために必
要な遺伝子以外を除外したヌクレオチドを含むプラスミ
ドの生成のだめの、組、換えＤＮＡ技術の応用に関する
ものであシ、さらに、そのＤＮＡによって発現されるア
ミノ酸鎖、Ｈ８Ｖ−１またはＨ８Ｖ−２に対して効果的
免疫応答を生ずるそれらの誘導体、そのＤＮＡによって
生成したアミノ酸鎖生成物に基ずくワクチンにそれぞれ
関するものである。 本発明は生存原核細胞、生存真核細胞（これらは組換え
ＤＮＡを挿入されたり、取シ出される能力を持ち、且つ
そのＤＮＡ分子を発現することができる。）において、
糖タンパク質Ｂ中の、タンパク質部分の合成を誘導する
のに用いられるＤＮＡ分子を、与える。本発明組換えＤ
ＮＡ技術を使用することは、コスト的に効率がよく、生
成されたアミノ酸鎖は、生ウィルスによる汚染の危険の
ない、合成、予防、治療薬である。 単純ヘルペスウィルス１型および２型のＤＮＡは、１５
０　ｋｂ　を含有し、１０〇−２００のタンパク質を暗
号化するために十分な情報を持つ。約３０のタンパク質
は、ウィルス粒子中に存在し、その残存暗号化タンパク
質は、宿主細胞中のウィルスの複製や集合に関係してい
る。タンパク質膜に囲まれたＤＮＡ核に加えて、ウィル
スは、外膜構造を持つ。その膜は、脂質およびウィルス
暗号化糖タンパク質から構成されている。これらの糖タ
ンパク質は、特有なアミノ酸残基で始する１つまたはそ
れよシ多くの糖鎖を持つタンパク質である。４つのＨ８
Ｖ　糖タンパク質ｇＡ／ｇＢ（ｇＡはｇＢの先駆体）、
ｇＣ，ｇＤ、およびｇＥ　が存在する。 Ｈ８Ｖは、おそらくウィルス膜および細胞膜の融合によ
シ宿主細胞中に侵入し、この溶解にはｇＢ　が介在する
。ウィルスは、核において複製する。複製の間に、糖タ
ンパク質は合成され、感染細胞の原形質膜外表面まで達
する糖タンパク質の多くと共に、細胞表面に移送される
。ウィルス糖タンパク質はウィルス表面および細胞表面
から外部に出るので、Ｈ８Ｖ特異抗体と結合する最初の
ウィルス分子である。 一般的にワクチンは、総ての要素を持つウィルス粒子（
生ウィルス、弱毒ウィルス、化ウィルス〕または、ウィ
ルスの構造タンパク質（サブユニットワクチン〕から成
シ立っている。生Ｈ８Ｖワクチンについて、有効性を認
める報告があるけれども、多くの専門家は、その方法を
勧めない。なぜ欧らば、Ｈ８Ｖは、発癌活性および発癌
補助活性を持つ可能性があり、さらに一般的に言って、
人の生存を脅かすタイプのウィルスでないからである。 これに対して、サブユニットワクチンは、１つまたはそ
れよシ多くの糖タンパク質あるいはそれらの非グリコジ
ル化ｉ　ｎｏｎ　−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）アミノ
酸鎖で構成されておシ、どちらの免疫活性部位をとって
もよシ望ましい。生ワクチンは、生成が安価であるため
魅力的であフ、予防接種の後、増殖するので大変少量で
すむ。 しかし、危険性を秘めている。サブユニットワクチンは
、タンパク質の多量生成が必要とされるし、コストも高
額となるのであるが、安全性がある。 本発明による組換えＤＮＡ技術による大腸菌中で合成さ
れたウィルス糖タンパク質およびタンパク質成分は、ウ
ィルスＤＮＡに完全に制約されない。総ての要素を持つ
ＤＮＡでなく、唯一単独のウィルス糖タンパク質遺伝子
が存在する。組換えＤＮＡ技術は、ワクチン生成にかか
る生ウイルス汚染に関する危−艙を除くものである。 主なウィルスタンパク質の内の唯一のｇＢは、すでに生
物学的機能が知られておシ、ウィルス生長のだめの基本
要素であることが明らかにされている。以下の例に続く
表に、Ｈ８Ｖ−１およびＨ８Ｖ−２のそれぞれｇＢ　の
Ｄ’ＮＡ暗号化配列を示す。本発明は、糖タンパク質Ｂ
のアミノ酸鎖を発現する能力を持つヌクレオチド配列を
示す。微生物へ遺伝子を挿入することにより、Ｈ８Ｖ糖
タンパク質に対応するタンパク質を合成することができ
る。 ｇＢ　の糖部分でなく、タンパク質部分のみが、細菌中
で合成されるが、そのタンパク質は、免疫決定基の主要
な根源物質である。発現のため、微生物、つまシ大腸菌
の様な典型的な細菌は、要求されるアミノ酸鎖を発現す
る能力を持つプラスミドを含む普通増殖培地で増殖され
る。本発明において、細菌の膜断片から抽出された、本
発明の精製Ｈ８Ｖタンパク質は、タンパク質に対する抗
体を作るために、動物（例えば、ウサギ）へ接種されう
る。細菌中で作られたｇＢ　タンパク質に対する応答で
、動物体内で生成されたこれらの抗体は、ウィルスを不
活化（中和）する能力について試験されうる。 細菌中で、Ｈ８Ｖ−ｇＢ　発現が、極限まで増加した後
、およびｇＢ　に対して生成された抗体による適切なウ
ィルス中和の実証の後、ｇＢタンパク質ワクチンは、動
物で試験され、最後に臨床試験において評価されうる。 ウサギに対する約３μｇ　タンパク質／に９の一回接種
で、抗体応答を生じさせる。 ｇＢ　の完全に暗号化された配列が、細菌において発現
され得たが、免疫学的に活性を持つｇＢ　の一部のみを
発現することが、なぜ望ましいかには、実践的な理由が
ある。もし大腸菌の細胞質において発現されたｇＢ　の
３次元構造を変えうるならば、２つの広範囲におよぶ疎
水性部位、つま）信号部位と、膜への橋渡し部位が存在
する。（後に記す、配列に関する要約参照。）完成した
タンパク質が、感染細胞膜中に存在する時、信号配列は
、酵素的に除却され、膜への橋渡し残基は、膜中に存在
する。膜の細胞質側における残存Ｃ末端残基は、抗体に
近すきえない。従って、９０３全体の内の７５ＯＮ末端
アミノ酸残基までが、ワクチンに関して、抗原的に活性
を持つと思われる。 親水性残基は、タンパク質表面上に存在すると思われる
。β−螺旋の領域中のこれらの残基は、抗原決定因子の
候補者である。しかし、１次構造と、３次構造が、１次
元的に関連しないゆえに、抗原部位を形成する親水残基
は、必しも近接していると言えない。それにもかかわら
ず、長い鎖の内の適切に選択された、長さが１０−２０
のアミノ酸の近接残基は、たいてい抗原性を持ち、その
残基を持つ本来のタンパク質と結合する抗体の生成を導
きえる。従って、最も単純なワクチンは、高抗原活性を
持つ、ショートペプチドであシ、そのペプチドの配列は
、ｇＢ　遺伝子のヌクレオチド配列の知識から導びかれ
る。 Ｈ８Ｖ−１プラスミド ｐＫＢＸＸと呼ばれるクローンにより例示される、本発
明における単純ヘルペスウィルス１型の代表的な組換え
ＤＮＡクローンは、以下に示す方法によシ作成される。 ＫＯ８系統から精製されたＤＮＡは、制限酵素の供給者
によって決められた反応条件を用い、制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍ　ＨＩ　を使って切断される。同時に、ベ
クターＤＮＡｐＢＲ３２２（参照Ｂｏｌｊｖａｒ　ｅｔ
　ａｌ、ｅ　Ｇｅｎｅ　２．９５−１１３．１９７７］
はｇａｍ　ＨＩを使って切断される。仁の酵素は、有機
溶媒による抽出によシ除去させることができ、不活化さ
れうる。つまｆｉ、ＤＮＡを低温でエタノールを使って
沈降させ、吸引による、乾燥によシ、残存溶媒は、取シ
除かれる。 ＢａｍＨＩ　切断Ｈ８Ｖ−ＩＤＮＡは、Ｂａｍ　ＨＩ　
切断ｐＢＲ３２２ベクター（このベクターは、テトラサ
イクリン耐性遺伝子　（ｒｅｒｌにおいて独特なＪＬＬ
ＩＩＩＨＩ部位を持つ）の、類似した粘性末端と結紮さ
れる。結紮は、メーカーから提供された条件によシ、約
４℃で、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼを使って便宜に行なわ
れる。切断反応も結合反応も、どちらも密閉されたプラ
スチック容器中で行なわれる。 反応の同様な継続は、再びＫＯ８系統を用いて同酵素単
位数の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを用いての切
断および旦ｃ　ｏＲＩを用いて、ベクターＤＮＡｐＢＲ
３２５（Ｂｏｌｉｖａｒ　、　Ｇｅｎｅ　４　。 １２１−１３６　：１９７８）を切断することで行なわ
れる。酵素は再び除かれ、ＥｅＯＲＩ切断Ｈ８Ｖ−１は
、共通した結紮条件を使って、ｐＢＲ３２５（クロラム
フェニコール耐性ｆｃｍｒｌ遺伝子において独特なＥｃ
ｏＲＩ部位を持つＪの類似した末端と結紮された。 プラスミドｐＢＲ３２５は、アンピシリン（Ａｐｒ）、
テトラサイクリン、クロラムフェニコールに対して薬剤
耐性を明確に示す遺伝子を含み、ｐＢＲ３２２は、アン
ピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性遺伝子を持つ
。 大腸菌中への結紮混合物の導入の結果、Ｈ８Ｖ−１断片
を含むことが推測されるベクターは、ｐＢＲ３２５につ
いては、クロラムフェニコール、ｐＢＲ３２２について
はテトラサイクリン（これらの物質の存在において生長
能力を失なう）に対する感受性としてでなく、アンピシ
リンに対する抵抗性によシ同定される。薬剤耐性遺伝子
および他の遺伝子は、異種断片または無関係ＤＮＡによ
シ、はとんどいつも不活化される。 旦ｅｏＲＩ−Ｆ断片またはμｔｍＨＩ−Ｇ断片を含む組
換えプラスミドは、これらの酵素について、Ｈ８Ｖ−１
の既知の制限地図と、Ｈ８Ｖ−１挿入物の電気泳動的移
動性を比較することによシ同定される。制限断片は、ヌ
クレオチドの長さの減少と一致している、アガロースゲ
ル上の移動性の増加の順に、アルファベットＡ−Ｚの内
の大文字で示される。Ｈ８Ｖ−１の同系統１すなわちＫ
Ｏ８は、どれかひとつの制限エンドヌクレアーゼについ
て、唯一ひとつの制限地図を現わすであろう。しかし、
異なる系統のＨ８Ｖ−１は、ＫＯ８と全く無関係に増殖
していくので、必ずしも全てではないが、同じ制限部位
の大部分を共有する。 サブクローン（５ｕｂｃｌｏｎｅ　ｌ　同定のために、
（特にＫＯ８系統およびｔｓ１３５系統から得られたＥ
ｃｏｌＲＩ−Ｆ断片］ Ｋ　ＯＳ　（７）　ＥｃｏＲＩ−Ｆ断片についての座標
（ｃｏｏｄｊｎａｔｅ　］が利用される。 Ｈ８Ｖ−１ｈＫＯ８系統のＥｃｏＩＲＩ−Ｆ断片のサブ
クローンについての制限地図に次の制限酵素を記した制
限部位を以下に示す。 ￥　ω　ω　山　ｋＸＥ （１’）　Ｖ３　ｃＱ　Ｏ（’−１００４Ｃ’Ｊ（ｖ′
）寸０ト〇− 山　ａ：ｌｋｌ＋ｋＡ−＋？ ＣＳ３寸−■ωトの への−ｅＰ寸［Ｆ］■− の　ｍ　ｃｔ’ｚ　ＣＱ　ｌ−Ｑ　ｃｎ　寸０　０　０
　（）　ＯＯＯ ｌ：！：ｌ　ω　ｏｏＨ＜　山　山　×　に）０　０　
（）　ｕ　００　０）　（Ｔｈ　Ｃ’Ｊへ　ω　寸　寸
　Ｑ　■　Ｏへ 閣　山　ト　ｍ　ω　リ　−× ■０■００トのＯ Ｉ＋　ω　ω　寸　Ｏω　Ｏへ ％ｆＥＥＬ“９２“ ＫＯ８系統および温度感受性ｔｓＢ５系統についての制
限エンドヌクレアーゼ切断部位の地図の比較は０．３１
８に：０．３４４Ｐ；０．３５５Ｔ；および０．４１３
　Ｔの部位でＫＯ８についての特異性を示し、０．３３
１）Ｉ、０．３５５Ｐ、および０．３８９Ｘ。 の部位でｔｓＢ５についての特異性を示す。 ＥｃｏＲＩ−Ｆ　断片についての制限地図とｔＢＢ５系
統のそれとの間の比較は、２つの系統が、ゲノム座標０
．３１５から０．４２２に囲まれるＥｃｏＲＩ−Ｆ断片
における７部位以外のすべての部位を共有することを示
す。 Ｈ８Ｖ−１のゲノムは、１５０ｋｂ　の直線二本鎖ＤＮ
Ａ分子である。従って、０．０１地図単位は約１．５　
ｋｂに相当する。 Ｈ８Ｖ−１ｇＢのｐｋＢＸＸ　ト呼ハレるプラスミドは
、０．３４５　ＢａｍＨＩから０．３７２Ｘｈｏｒまで
のＨ８Ｖ−１配列を含む構造で構成される。０．３４５
部位から０．３９９部位までの座標を持つジッＨ１−Ｇ
　断片は、前述の結紮法によりまず作られ、それから５
ａｌＩを使っての部分消化を受け、Ｓａｌ　Ｉ断片を除
くために再び結紮される。これは０３４５シ児Ｈ１部位
から０．３８７８ａｌ１部位までの座標を持つフラグメ
ントｐＫＢＧ　−ＢＳ３を生ずる。これは２つのＸｈｏ
ｌｌｏ、３６８およびＱ、３７２）部位を含む。 ｐＫＢＸＸにおいて、要求された配列を得るために、ｐ
ＫＢＧ−ＢＳ３はとＨＩを使った完全消化およびＸｈｏ
ｌを使った部分消化を受けさせる。アガロース電気泳動
の結果、０．３４５から０．３７２までの１３ａｍＨＩ
　−Ｘｈｏ　Ｉ断片と対応する４、Ｏｋｂ結合結合層認
され、ゲルから電気溶離され、ｇａｍ旧、互配Ｉ切断ｐ
Ｕ　Ｃ９と結紮される。ｐＵＣ９は、アンピシリン耐性
遺伝子および多重クローニング部位を持つ、２．７ｋｂ
プラスミドである。（参照、　Ｖｉｅｉｒａ　＆Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅｌ　９　：２５９−２６８゜１９８
２　；　Ｍｅｓｓｉｎｇ　＆　Ｖｉｅｉｒａ　＊同書：
　２６９１゜このプラスミドはベセスダ調査研究所 ｌ　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、
　）から入手できる。プラスミドおよびアンピシリン耐
性遺伝子の複製の起源はｐＢＲ３２２（およそヌクレオ
チドの２０６７から４３６２１から導びかれ゛る。ｐＵ
Ｃ９の残存配列（約４００ヌクレオチド）は、大腸菌の
坦遺伝子の初期段階から導ひかれる。特に、その配列は
、ＲＮ　Ａ合成のための促進物、タンパク質合成のため
のリポソーム結合部位、第一遺伝子生成物（β−ガラク
トシダーゼ］のＮ末端断片を含む。 ＲＮＡおよびタンパク質合成の方向は、左から右へであ
る。多重クローニング部位は、大腸菌β−ガラクトシダ
ーゼの特徴的な配列のアミノ酸４と５の間に挿入される
制限部位Ｈ４ｎｄＩＩＩ　−ＰｓｔＩ　−５ａｌＩ　−
ＢａｍＨＩ　−ＳｍａＩ　＝ＥｃｏＲＩ　Ｉ左から右へ
）を含む。（表３参照）β−カラクトシダーゼタンパク
質合成がそのＮ末端に近いアミノ酸配列に影響を受けな
い（正確な読み枠が維持されている限シ〕ことが示され
ている。従って、活性β−ガラクトシダーゼはｐＵＣ９
プラスミドＤＮＡを含有する細胞において合成される。 Ｈ８Ｖ−１クローン化配列（但しＨ８Ｖ−１配列におい
ては存在しない〕に密着した独特な制限部位を持つベク
ターは、Ｈ８Ｖ−１クローンを同じ制限部位ヲ持つ他の
いくつかのベクター中で再クローン化させ得る。ｐＫＢ
ＸＸを作る目的で、ｐＵＣ９ＤＮＡは、ＢａｍＨＩおよ
び５ａｌＩを処理され、Ｈ８Ｖ−１配列（ＢａｍＨＩか
らＸｈｏＩまでｆ　０．３４５から０．３７２まで）は
、これら処理された部位と結紮される。その適当なりロ
ーン（形質転換分析の後の）は制限地図によシ同定され
た。 ｐＫＢＸＸ内に含まれるＨ８Ｖ−１配列は、上述の制限
地図を得るための制限部位の記載中のそれであることが
示された。 ５ａｌＩ　［Ｇ　ＴＣＧＡ　Ｃ）およびＸｈｏＩ　ｆｃ
　ＴＣＧＡ　Ｃ１の認識部位が末端ヌクレオチド部位の
状態によって異なるゆえに、それらは異なる配列部位で
ＤＮＡを切断するが、粘性の強い末端部位＋ＴＣＧＡ１
つまシ同じ４つの塩基を生ずることに注意すべきである
。従ってＸｈｏ１部位は３ａｌ　Ｉ部位へクローン化さ
れうろことであシ己れはｐＫＢＸＸ中でなされる。Ｈ８
Ｖ−ＩＸｈｏＩ　−ｐＢＲ３２２Ｓａｌ　Ｉ接合点での
塩基配列は交雑部位ＣＴＣＧＡＣになる。この部位は、
組み換えプラスミドの生産に使用した、どちらの酵素に
よっても切断されない。ヌクレオチドはｐＫＢＸＸにお
いて、右から左の方向に（ＸｈｏＩからＢａｍＨＩまで
）１から３９９７まで番号ずけされる。ｐＫＢＸＸにお
けるすべてのヌクレオチドは、Ｍ１３クローニングベク
ター［ジデオキシ鎖−末部法ｔ　ｄｉｃｌｅｏｘｙｃｈ
ａｉｎ　−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｌ
　］を使用して配列された。ヌクレオチドナンバーによ
る配列の要約を以下に示す。 配列要約 １からおよそ３７５まで ０．３７２　Ｘｈｏ　Ｉ部位で初まる５′余分配列（５
’　ｅｘｔｒａ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　１およそ３７５
から４９９まで ヌクレオチド４０６および４４３で始まる２つのＣＡＡ
Ｔボックスと、４７６でのＴＡＴＡボックスを含む５’
ｍＲＮＡ調節配列。 ４９９から７８９まで ヌクレオチド≠７９０で始まる最初の暗号化ヌクレオチ
ドへ達するｍ　ＲＮ　Ａ開始配列（初めのＡが≠５０１
である ＣａＣＣａＣＡＣのＡで開始り ７９０から３４９８まで Ｎ末端疎水性リーダー、膜への橋渡し配列、Ｃ末端イオ
ン配列、糖類付加 るアミノ酸暗号化配列。 細胞表面の外側に存在するであろう糖タンパク質の領域
は、７５ｏアミノ酸の辺シである。 ３４９９から３５４６まで ３５１８　ｐｏｌｙＡ付加信号開始部位および現存性の
ある３　５４９　ｐｏｌｙＡ付加部位を含有する３′非
暗号化配列。 ３５４９から３９９７まで ３９９２　ＢａｍＨＩ部位（座標ｔｅｏｏｒｄｉｎａｔ
ｅ）０．３４５）への３′非必須配列。 表１に、ｐＫＢＸＸの完全なヌクレオナト配列、表２に
、完全な翻訳生成物を示す。重要なペプチド構成は、Ｎ
末端（広範な疎水性膜挿入配列または、同疎水性信号配
列］、９つの現実にあシうるＮ−環状糖類付加部位、高
荷電固定配列（１０９アミノ酸）を含有する。 Ｎ末端信号配列は、完全なペプチドを生成するための糖
タンパク質合成の間に特異的信号ペプチダーゼによシ除
外される。 Ｈ８Ｖ−２プラスミド Ｈ８Ｖ−２は、Ｈ８Ｖ−１のｇＢ　遺伝子と遺伝子相同
性を示す。９５２　ＢＸＸと呼ばれるクローンによって
例挙される。本発明における単純ヘルペスウィルス２型
の典型的な組換えＤＮＡクローンは、以下に示す方法に
よシ作成される。ＨＧ５２系統から精製されたＤＮＡは
、制限酵素の共給者によって決められた反応条件を用い
、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを使って切断され
る。同時に、ベクター　ＤＮＡｐＢＲ３２５は、Ｅｃｏ
ＲＩを使って切断される。この酵素は、有機溶媒による
抽出によシ除却することができ、失活させうる。つ捷り
、ＤＮＡを低温でエタノールを使って沈降させ、吸引に
よる乾燥によシ、残存溶媒は取シ除かれる。勝ＲＩ切断
Ｈ８Ｖ−２ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ切断ｐＢＲ３２５ベク
ター（このベクターは、クロラムフェニコール耐性遺伝
子において独特なＥｃｏＲ１部位を持つ）の、同じ粘性
末端と結紮される。結紮は、メーカーから提供された条
件によシ、約４℃て、Ｔ４ＤＮＡリカーゼを使って効率
よく行なわれる。 プラスミドｐＢＲ３２５は、アンピシリン、クロラムフ
ェニコール、テトラサイクリンに対する、薬剤耐性を示
す遺伝子を含む。大腸菌への結紮混合物の挿入の後、Ｈ
８Ｖ−２断片を含むことが推測されるベクターを含む細
胞は、アンピシリン（または、テトラサイクリン）に対
する耐性、およびクロラムフェニコールに対する感受性
（クロラムフェニコールの存在で成長することができな
い。）により、同定される。薬面１性遺伝子および他の
ｉｌ’ｒ　（ｔ−＜了−は大異種ＤＮＡ断片の挿入によ
りほとんどいつも不活化される。クロラムフェニコール
感受性クローンのグループ（コロニー）は、Ｈ８Ｖ−２
ｇＢ配列を含むクローンを決定するだめに、選択される
。それをするために、分離細菌コロニーは、固形増殖培
地を入れた皿の上におおわれた、特別な口紙」二で再増
殖された。かぐして得られたコロニーは、所々に固定さ
れ、さらにＮａＯＨの処理により、外から加えられたＤ
ＮＡを浸透するようになる。この処理はまた、二本鎖Ｄ
ＮＡを一本鎖に分離する。Ｈ３Ｖ−１ｇＢの暗号化配列
から誘導された、放射活性−不備ＤＮＡの溶液は、口紙
上に注がれる、その口紙は、培養され、適切なバッファ
ーで、隔隔まで洗われた。特別なコロニーにおいてプラ
スミドＤＮＡを含有するＨ３Ｖ−２が、Ｈ３Ｖ−１、！
：相同な（基本的に同一）ヌクレオチド配列を持つなら
ば、ＨＳ　Ｖ　−１のヌクレオチド配列は、唯一固定さ
れ、口紙上に保持されるであろう。この過程は、ハイフ
リット形成と呼ばれ、これは、口紙」二に保持された二
本鎖ＤＮＡが、ひとつのＨＳ　Ｖ　−１放射活性鎖と、
Ｈ８Ｖ−２非放射活性鎖を含むことを意味する。口紙は
、エックス線フィルムに写され、ハイブリッド形成は、
目的とされるコロ−ニーがその位置で暗い斑点を作るこ
とで検出される。この方法により、コロー二は、ｐ５２
ＥＧと呼ばれる、１１　Ｓ　Ｖ　−２Ｅｃ　ｏ　ＲＩ断
片を持つベクターを含有することが確認された。２つの
コロニーは、極度のハイブリッド形成を見せ、挿入物を
含んだ。その挿入物の移動性は、ＥｃｏＲＩ−Ｇの移動
性と区別がつかなかった。（同じ座標を共有すると思わ
れるＨ　Ｓ　Ｖ　−Ｉ　ＥｃｏＲＩ　−Ｆ断片との比較
によシ測定）挿入物は、また、ＥｃｏＲＩ−Ｇ断片の特
徴を示す独特なＨｉｎｄｌ１１部位を含む。最初のクロ
ーンｆ　ｐ５２ＥＧ　）は、＋３　ａ　ｍ　Ｈ１やＨｉ
ｎｄｌｌｌを使って切断さｔ、その断Ｊ）のケル溶出ノ
後、ｐＵＣ９の同部位にクローン化された。 それをｐ５２ＥＧ　−ＢＨと呼ぶ。細菌におい−ｃ１タ
ンパク質へのＤＮＡ発現について特に適するベクターｐ
ＵＣ９へ、ｐ５２ＥＧから誘導されたクローンを町クロ
ーン化することがイ」利であることが発見された。より
小さいプラスミドは、完全ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌ
ｌｌ消化、次いでＮ肋Ｉ＋０．３５４および０．３７２
Δ駐１部位がある）を用いた部分消化により、ｐ５２Ｅ
Ｃ−ＤＨから作られた。適切なゲル溶出断片（ＢａｍＨ
Ｉ−ＸｈｏＩ−ＸｈｏＩｔたはＢＸＸ）は、そのすぐ後
に、０．３７２　Ｓａｌ　Ｉ−ＸｈｏＩ交雑部位を作シ
出す第二ｐＵＣ９ベクターの上胴および５ａｌＩ部位へ
クローン化された。 挿入物の座標は、制限地図により、ｏ３４５−０．３７
２が示されており、ＤＮＡ配列分析により、０．３６８
−０．３４８の領域が結局示された。３つの制限部位の
内大体１つは、Ｈ８Ｖ−２とＨ８Ｖ−１の間で共通であ
る。それらの部位は、Ｈ８Ｖ−Ｉ　ＫＯ８系統の同様の
部位に対して、ＨＧ５２の座標を標準化するために使わ
れる。たとえば、０．３６０　Ｓａｌ　Ｉ部位と、０．
３４８　ＢｓｔＥ１１部位は、２つの系統において同一
である。 Ｈ８Ｖ−１プラスミドｐＫＢＸＸ　（７）　Ｈ８Ｖ　−
２相同物である。ＨＳ　Ｖ　−２由来プラスミド９５２
　ＢＸＸは、５′末端および３′末端の外にｇＢｍＲＮ
Ａの約４５０のヌクレオチドを伴ない、約４０００塩基
対を含有する。これは、０．３４５近接ＢａｍＨＩ部位
からＨ８”１７−１における、０．３７２　Ｘｈｏ　Ｉ
部位の１０　ｂｐ以内である０、３７２　Ｘｈｏ　Ｉ部
位まで広がる。その部位は、たぶん２つのゲノムにおけ
る同一のヌクレオチドでの部位である。Ｈ８Ｖ−２にお
けるＢａｍＨＩ部位は、Ｈ８Ｖ−１におけるＢａｍＨＩ
部位の右へ５０ヌクレオチドあたシである。 以下に示す表に、制限部位の相対位置を示す。 ０．３４５と０．３７２地図単位の間の、Ｈ８Ｖ−Ｈ８
Ｖ−１ｔＫｏｓ　ｌ　Ｈ８Ｖ−２［ＨＧ−５２］Ｂａｍ
ＨＩ　Ｏ，３４５０，３４５３ Ｂ＋ｑｔＥＩＩ　Ｏ，３４９，０，３５５０，３４９Ｘ
ｍａ　Ｉ　Ｏ，３４７，０，３５４０，３５０，０，３
５９７，０，３５７，０，３５９７０，３７１ ＮｒｕＩ　Ｏ，３６９０，３６９ ＰｓｔＩ　Ｏ，３５０，０，３５６３０，３５６，０，
３５６３，０，３６８０，３６７，０，３６８ ＸｈｏＩ　Ｏ，３６８２，０，３７１６０，３５４，０
，３７１６ＳａｌＩ　Ｏ，３６００，３５８，０，３６
０Ｂａｌ　Ｉ　Ｏ，３５７５，０，３６７５０，３５７
５，０，３６７５表２にはまた、Ｈ８Ｖ−２ｇＢとＨ８
Ｖ−１ｇＢについて、ＤＮＡ塩基とアミノ酸配列の比較
を示す。Ｈ８Ｖ−１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
が示され、Ｈ８Ｖ−２配列におけるいくつかの変異（Ｈ
８Ｖ−１に相対して］を示す。 Ｈ８Ｖ−１ｇＢは、９つのＮＪＪ状糖類付加部位おける
残基７６−７８での存続部位におけるａｓｎ　−ｐｒｏ
　−ｔｈｒ−はＨ８Ｖ−２においては、ｇｌｙ　−ｐｒ
ｏ　−ａｒｇに変わる。最後に、Ｈ８Ｖ−１には存在し
ないが、Ｈ８Ｖ−２において存在する５つのコドンを発
見した。これは、Ｈ８Ｖ−１についての配列中の空間に
よシ示され、Ｈ８Ｖ−２についての挿入配列は、その空
白部の上に書かれている。Ｈ８Ｖ−２ｇＢ遺伝子は、Ｈ
８Ｖ−１のそれと、大変相同性を示す。 ｐＫＢＸＸから、ｇＢを発現するために、プラスミドは
、たとえば、ヌクレオチド４８２でのＮｒｕＩ特異部位
で、切断され、さらにその発現のために、５′非暗号化
ヌクレオチドおよび５′疎水性信号指定ヌクレオチドの
大部分または、ヌクレオチド１から９１１ま工のあちこ
ちを、除くために、Ｂａ１３１１５’から３′、３′か
ら５′のどちらについてもエキソヌクレアーゼ活性成分
を含む、酵素調製剤）を処理される。再結紮および大腸
菌の形質転換の後、ｇＢを沈降させる抗体を使ったｇＢ
　の生成能力を、細菌クローンについて試験することが
できる。ｐＫＢＸＸにおいて、Ｈ８Ｖ−１配列は、βガ
ラクトシダーゼのアミノ酸６から８と一致する（表３参
照）多重暗号化部位中の位置で挿入されたことに注意さ
れたい。従ってｇＢ　遺伝子は、この位置でβガラクト
シダーゼ遺伝子へ融合される。しかしｇＢ　は、ヌクレ
オチド３４９８で、ｇＢ　の鎖末端コドンが存在（表２
］するために、βガラクトシダーゼのカルボキシル末端
でβガラクトシダーゼへ融合されない。 ｐＫＢＸＸは、完成したｇＢペプチドのすべてを本質的
に発現するのに使うことが出来るけれども、抗原的に活
性を持つｇＢ　の一部のみを発現することがなぜ望まし
いのか、いくつかの理由がある。第一に、疎水性配列を
含む大膜タンパク質は、しばしば細菌における発現の時
、不安定である。第二に、全ペプチドの内のおよそ７５
ＯＮ末端アミノ酸のみが、抗原的活性を持つ。なぜなら
ば、残シの残基は＼膜中にあシ、それゆえに抗体に近す
きがたいからである。第三は、３次元構造と、抗原活性
との関係が、いずれのタンパク質についても知られてい
ない。そのため、最も高い抗原活性を持つと非常に思わ
れる配列の単一セットを予言できない。それゆえに、細
菌中での抗原的活性ｇＢ　の生成のためのｇＢ　を信号
領域をこえて初まる）のＮ末端部の一部分をおのおの含
有するＤＮＡプラスミドの一群のセットが選択された。 プラスミドの一群は、ｐＫＢＸＸおよびｐ５２ＢＸＸの
どちらにおりても６３７から２１１４まで広がるヌクレ
オチドの１４７７−　ｂｐμす１制限部片の使用を含む
。精製断片は、その断片のおのおのの末端から、っまシ
０から約３０”Ｏｂｐまでを取シ除くために、異なる時
間、Ｂａ１３１と共に培養される。５′末端から２７５
ヌクレオチドを除去することによシ、ヌクレオチド９１
１で、または、ちょうど疎水性信号配列の木部で、新し
Ｖ　Ｓ　／末端を生ずる。Ｂａｌ　３１消化の後、約８
００から１４７７　ｂｐ　までのヌクレオチドの長さは
、ｇＢ　のＮ末端アミノ酸の２６７から４９２との対応
を得る。断片の一群はプールされ、プラント末端は、Ｈ
ａｎｄ　１１消化ｐＵＣ９１プラント末端化されたノと
結紮された。細菌の形質転換の結果、個々の細菌の子孫
は、ラジオイムノアッセイを用い、抗原活性ｇＢの生成
について試験される。（実施例７参照）大量の抗原活性
ｇＢ生成へ導び〈プラスミドは、同定され、その配列は
、プラスミドの木部でのヌクレオチド座標を確立するた
めに決定される。 そのいった断片と、ｇＢ　遺伝子のまっすぐ伸びた部分
からの断片は、ワクチン作成のために使用される。ｇＢ
　ペプチドに対する抗体は、ウィルス中和度決定のため
に使用しうる。 ｇＢ　ワクチンが、十分な抗原的活性を持たない場合、
発現には、真核ベクターを必要とするであろう。 それには、いわゆる往復（シャトル］ベクターを使用で
き、そのベクターは、細菌中がまたは、真核細胞中でＤ
ＮＡを複製する。ｇＢＢ４Ｏための内生的プロモーター
配列は、その起源が真核である。しかし、それは、能率
的発現のために相加ウィルス因子の存在を要求するであ
ろう。従って、違ったプロモーターの使用は望ましい。 ｐＫＢＸＸのＨ８Ｖ−１配列は、Ｈ８Ｖ−１挿入物の二
つの部位における制限部位（例えばＨｉｎｄｌｌｌやＥ
ｃｏＲＩ　）を利用することによシ、真核発現ベクター
上で容易に再りロシ化されうる。 Ｂ、　ｐ！５２ＢＸＸからの発現 ｐ　５２　ＢＸＸからｇＢを発現するために、そのプラ
スミドは、たとえば、ヌクレオチド４８２でのＮｒｕＩ
特異部位で切断され、さらにその発現のために、５′非
暗号化ヌクレオチドおよび疎水性信号指定ヌクレオチド
（ヌクレオチド９１１に至るまで、または、９１１以後
］を除くために坦３１（５’から３′、３′から５′の
どちらにりいても、エキソヌクレアーゼ活性成分を含む
酵素調製剤］を使って処理される。膜への橋渡し疎水性
配列（およそ３０４０で始まる）を除くために、ＤＮＡ
はＸｈｏＩを使って切断される。＋２６７２で存在する
ＸｈｏＩ特異部位。１でのＸｈｏＩ部位は、ｐ　５２８
ＸＸの構造物において、５ａｌＩ−Ｘｈｏｌ交雑部位に
変えられた。）　Ｂａｌ　３１、ＸｈｏＩ断片（プラン
ト末端化された）は、アガロース電気泳動により同定さ
れ、ゲル溶離され＼ＳｍａＩ、５ａｌＩ切断ｐＵＣ８Ｄ
ＮＡと結紮された。 ｐＵｃ８における、多重クローニング部位、言い換える
と、Ｅｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｓｍａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　−
８ａ］Ｉ　−ｐｓｔ　ｌ−ＨｌｎｄｌｌＩは、ｐＵＣ９
におけるのと、正反対の方向である（表３）。他の点は
、全く同じである。β−ガラ、クトシダーゼＲＮＡおよ
びタンパク質合成の方向は、左から右である。Ｈ８Ｖ−
２配列の挿入は、Ｂａｌ　３１からＸｈｏＩへである。 その合成の方向もまた左から右である。特に注目する点
は、Ｓｍａ　Ｉがプラント末端を残すことである。Ｓｍ
ａ　Ｉ　−Ｂａｌ　３１結合点で、３つのすべての解読
相が、Ｂａ１３］エキソヌクレアーゼ開裂が同時に起こ
らないゆえに予期される。ｐＵＣ８の多重クローニング
部位ニオける５ａｌＩ　（ＧＴＣＧＡＣ）とＨ８Ｖ−２
の巴ユＩ　（ＣＴＣＧＡＧＩはどちらも、コドンの最初
のヌクレオチドのあとを切断するゆえに、正確な解読相
は、３′結合点で保持される。５′βガラクトシダーゼ
／Ｈ８Ｖ−２結合点（全体の約−）でβガラクトシダー
ゼ解読相を保護するそれらのコドンは、最初の６つのβ
ガラクトシダーゼアミノ酸へ融合されるｇＢ　ペプチド
を正確に発現するであろう。 ３　’　Ｈ３Ｖ−２／βガラクトシダーゼ境界での解読
相が保持されるのでｇＢ配列が、このときアミノ酸残基
ｌＯで融合される結果、保持される。本質において、β
ガラクトシダーゼの４つのアミノ酸残基は、ｇＢ　の約
５００と入れ代わる。融合タンパク質は、ｇＢ　のＣ末
端側へ約１００のアミノ酸残基を加えたベクター中に存
在する内生的βガラクトシダーゼターミネータ−を使う
。 結紮ＤＮＡは、大腸菌（系統ＲＤＰ２１１）を形質転換
するために使われ、アンピシリン耐性コロニーが得られ
る。これらのクローンにおけるＨ８Ｖ−２挿入物の大き
さと方向性は、制限地図により決定される。平均の挿入
物の大きさは、約１．５　ｋｂ　であることが発見され
、すべての挿入物は、正しい方向性を持った。 βガラクトシダーゼは、ラクトース（三糖類）を、細胞
生長のためのエネルギー源となるグルコースとカラクト
ースに切断する。その合成は、ラクトース（または、た
とえばイソプロピル−β−Ｄチオガラクトシド ｆＩＰＴＧ］のような、代謝されない、化学的同類不必
要誘導物】の、あるなしによシ、ＲＮＡ合成の段階で調
節される。調節ヌクレオチド配列は、ｌａｃプロモータ
ー

【前記）からさかのぼって（５′へ向って〕存在して
いる。相内のｇＢ　／βガラクトシダーゼ融合生成物を
持つクローンを同定するために、培養は、ＩＰＴＧの存
在下で行なわれ、位相顕微鏡（全培率４００倍］を使っ
て、含有物体ｆ　１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ　
）の存在について試験された。いくつかの異種タンパク
質（特に疎水性タンパク質であシ、大腸菌により大量に
作られた）は、細菌中の小脇のような容易に検出可能な
含有物体中に集められるであろう。 は、含有物体を含んだ。これらのクローンにおいて、細
胞分裂または抑制され、円筒状に形造られた細胞は、繊
維にそって、大体規則正しい間隔をとった空間に存在す
る含有物体を共なう状態で、繊維状になる。培養物は、
誘導物のない状態で生長する時、正常に見えた。 ＩＰＴＧの存在下、および不在下で生長した培養物から
のサンプルは、ドデシル硫酸ナトリウムｌ５Ｄｓ）−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を用いるタンパク質分析
のために準備される。細胞は、遠心によシ、ペレット化
（ｐｅｌｌｅｔ　Ｉ　され、次に溶解される。その溶解
混合物は、上清に細胞質タンパク質〔可溶性）および、
ペレットにおいて膜タンパク質（不溶性）に分離するた
めに、沈殿された上清のタンパク質は、次に酸処理によ
シ沈殿され、ペレット化にされる。細胞質分画および膜
分画から得られたペレットは、電気泳動サンプル溶液の
同量中に再浮遊され、分別物は、ＳＤＳ電気泳動にかけ
られる。主な結合物は、誘導培養物の膜分画における５
　５　ｋｄ　と一致する移動度が観察される。これは、
ｇＢ／／　ガラクトシダーゼ融合生成物として予期され
た大きさである。結合物は、誘導培養物から得られた細
胞質分画寸たは、非誘導培養物の膜分画か細胞質分画か
ら検出されない。ＩＰＴＧの存在下て生長した含有物体
を含む。１７の独立クローンからの膜分画は、約６５　
ｋｄ　の移動度で、主な結合物を与えた。標準マーカー
タンパク質の使用により、１５−５０μｇ融合生成タン
パク質が、約５×１０８細胞個相当を含む培養地のそれ
ぞれのｍｅから得られることが判断される。 ６５−　ｋｄ　融合タンパク質の免疫的反応性は、駆動
力として、再び電気泳動を用い、ニトロセルロースのシ
ート上に、電気泳動的に分離されたタンパク質を移すこ
とにより試験される。電気フロンティング（ｅｌｅｃｔ
ｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇｌは、プロッティング（ｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ　ｌ装置のメーカによって決められたようにな
される。タンパ’）質ヲ含むニトロセルロースシートは
、ＩＩ　Ｓ　Ｖ　−２またはＨＳＶ−１に対する、市販
されている抗体の調製液中につけられる。これらの抗体
調製液は、ウサギから得られた血清のＩｇＧ分画を含む
。抗体は、＋）５ｋｄ　タンパク質と優先的Ｇ′こ結合
することが〕勺υ」され酵素反応により検出される。第
二の抗体、つ寸りヤキー抗つサキＩｇＧ　（そのＩｇＧ
と共不結合した、西洋わさびペルオキシダーゼを失う）
は、加えられ、前もって結合したウサギＩｇＧと結合す
るであろう。最後に、その酵素についての基質が加えら
れ、酵素反応の位置で青色に着色された沈殿の形成させ
た。沈殿の青色の結合物は、ニトロセルロースフロット
（ｂｌｏｔ　１における６　５　ｋｄ　と一致する移動
率で観察される。その存在は、ＩＰＴＧの存在下で生長
した細胞の膜分画においてのみ検出される。 ６５　ｋｄ　タンパク質は、ＨＳ　Ｖ　−２抗体と同じ
位強く反応しないけれども、ＨＳ　Ｖ　−Ｊ抗体と交差
反応をする。 ｐ５２ΔＮＸ−６０と呼ばれるプラスミドを含むクロー
ンの一つは、さらに研究を進めるために選ばれる。ＨＳ
Ｖ−２挿入物の５′末部および３′末部は、Ｍ１３クロ
ーニングへフタ−およびＭＩ３配列決定ヘクター中へ再
クローン化され、ＤＮＡ配列は、ｐ５２△ＮＸ−６０に
おける５′および３′結合点で、決定された。ＨＳ　Ｖ
　−２挿入物は、ＨＳＶ−１ｇＢの１３５から６２９１
でに対応するアミノ酸残基に基すいた配列を含む（表２
〕。これは、制限エンドヌクレアーゼ分析（１，５ｋｂ
＋から決定された挿入物の大きさと一致し、融合ペプチ
ド＋　６５　ｋｄ　ｌ　の大きさと一致する。この挿入
物は、５′および３′結合点でのβカラクトシターセが
特徴ずけたコドンを持つ相中に存在することが示される
。 ｐ５２△ＮＸ−ＧＯからの６５　ｋｄ　ペプチド生成物
の動物試験のために、大量のタンパク質が必要とされる
。膜分画についての分離手順は、一定率でスケールを上
げ、ｍ２量の６５ｋｄペプチドが、調製電気泳動装置に
置かれる。 この装置は、ゲルの底部からのタンパク質をＰａ　Ｎｇ
し、電極緩衝液（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｂｕｆｆｅｒ　］
に分画を集めることができる。フラクションは、分析的
ＳＤＳ電気泳動により分（）１さ／Ｌ、融合タンパク質
を含むピーク分画Ｑ−１、プールされ、そのブール 対して透析される。ａ縮しない状，軒では、イ１１製６
　５　ｋｄ　タンパク質儂度は、１００から２００μｇ
／ｄ　である。この濃度は、フロインドアジュバントで
１：１で希釈した後動物への導入に適している。 ６　５　ｋｄ　タンパク質は、ヌクレオチド１１９２へ
向いて５′方向へ広がる。（表２）この木部でより多い
ヌクレオチド配列を含む伺加ＤＮＡクローンを分離する
ことも望ましい。このために、より小さい１３ａｌ　３
　］生成削除部分を持つクローンが作られる。Ｈ　Ｓ　
Ｖ　−　］のｐ　Ｋ　Ｂ　Ｘ　Ｘから誘導された発現ク
ローンは、同様な手順で作成されうる。４　８　２　Ｎ
ｒｕ１部位は、ＨＳＶ−１とＨ　Ｓ　Ｖ　−　２で共通
である。 実施例Ｉ ＢａｍＨＩ−Ｇを作るだめの、ｐＢＲ３２２へのＨ８Ｖ
ｌ　（ＫＯＳ系統）ＢａｍＨＩ断片のクローニング Ａ、制限エンドヌクレアーゼ処理 エツペンドルフバイアル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｖｉａ
ｌ　）（プラスチック製で、スナップキャップを持つ）
内で、ｐＢＲ３２２（ベセスダ調査研究所）１μｔ　（
約０．５μ２）、ＫＯ３３６μｔ（約５μ２）、Ｂａｍ
ＨＩ３μｔ（８ユニツト／μｔ）は、制限緩衝液１の１
１０μを中で、消化される。制限緩衝液１は、ｐＨ７，
４の１０　ｍ　Ｍ　トリス緩衝液、５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム、１０ｍＭ塩化マグネシュウム、１０μＭメルカプ
トエタノール、１００μ’　／　ｍｔヌクレアーゼフリ
ー牛血清アルブミンを含む。消化は、３７℃、３時間で
行なわれる。（ここで注意すべき点は、過剰量のアミノ
酸を用い、余分に消化時間をとったことである。ＤＮＡ
を切断することを理解しなければならない。酵素１単位
は、３７℃１時間で完全に１μ２　大腸菌ラムダファー
ジＤＮＡを切断するであろう）。 消化後、反応混合物は、Ｔ　Ｅ　（１ｍ　ＭＦＪＤＴＡ
、１０ｍＭトリス、ｐＨ８，ｏ）を使って、４００μｔ
に希釈される。この溶液は、制限エンドヌクレアーゼを
不活化させるために１５分間６５℃で熱せられ、それか
ら室温に冷される。溶液は、それから、いくらかの残存
酵素を不活化し取り除くために、クロロホルム２４：３
−メチルブタノール１を等量で２回抽出される。（加熱
による制限エンドヌクレアーゼの不活化以外の方法は、
最終濃度的１％までドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
を加えることである。ＳＤＳも不活化酵素も、小型セフ
ァデックスカラムを通過することによってＤＮＡから分
離される） 他のプラスチックバイアルへ、残存溶液２４０μｔ　を
移した後、そこに５Ｍ塩化ナトリウム６０μｔ　と冷却
エタノール５００μｔ（約２倍量）が加えられる。その
混合物は、−７５℃３０分間保持され、遠心される。次
にその上清は除かれ、ＤＮＡペレット（ｐ６１１ｓｔ）
は、エタノールを除去するだめに、吸引乾燥される。 Ｂ、結紮 その乾燥ペレットは、ｌｙ＋ｔＭアデノシン三リン酸１
７μｔおよびＴ４ＤＮＡリカーゼ１００単位といっしょ
に、２０μｔのリガーゼ緩衝液（ｐＨ７，８の５０　ｍ
　Ｍ　トリス緩衝液、１０ｍＭ塩化マグネシュウム、２
０ｍＭジチオトレイトール、５０μ２／μｔヌクレアー
ゼフリー牛血清アルブミンを含む）に再浮遊される。こ
の混合物は、１５時間培養され、大腸菌ＲＲ１を形質転
換するために使用される。 Ｃ１形質転換 大腸菌の２０　ｍｔ培養物は、０３の最適密度（６２０
ｎｍ　）　になるように、■メジューム中で、炭酸ガス
を飽和の状態にして、３７℃で増殖される。（Ｖメジュ
ームは、トリプトン１０１’ｍ、イースト抽出物５５’
ｍ、ＮａＣＪ７２ｍ、にＣ１，５ｙｍ、Ｍｙ　Ｓ　ｏ４
．　Ｈ２Ｏ０，５９ｆｆ！、水１ｔを含む）その培養物
は、ｌＯから３０分間氷上で冷やされ、細胞は、遠心（
４℃で、６００（Ｍ／Ｘ５分）でペレット化される。そ
のペレットは、４℃に冷却した２　０　ｍｌのＳ　Ｔ　
（ｐＨ７，５の２５　ｍ　Ｍ　トリス−Ｈα、　１０　
ｍＭＮａｃｌ）　中に、ゆるやかに再浮遊される。細胞
は、上と同様にペレット化され、１０　ｍｌ、ｃ　Ａ　
Ｓ　Ｔ　（ｐＨ７、０の２５ｍＭトリス−Ｈα、１０　
ｍＭＮａ　Ｃ１＋　５０　ｍＭＣａα２−２Ｈ２０）　
中にゆるやかに再浮遊され、氷上で２０分から３０分間
保持される。 細胞は、再びペレット化され、エツペンドルフハイアル
（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｖｉａｌ　）　内の１．３５ｍ
Ａ　冷却（４℃）ＣＡＳＴ中に、非常にゆるやかに再浮
遊され、形質転換のために使われるまで（０から６０分
以内）冷却保存される。 ＣＡＳＴにおける細胞浮遊液０．２　ｍ７へ、ＣＡＳＴ
におけるプラスミド（０，０１から１０　ｔｔ’ｉ　Ｄ
ＮＡ　）　０．１　ｍＡが加えられ、これらの浮遊液は
、ゆるやかに混ぜられ、６０分間氷上に保持される。こ
の混合物は、２分間３７℃へ暖められ、同じ時間間隔で
冷やされる。バイアルの内容物は、培養管内のＶメジュ
ーム２．７　ｍＡへ加えられ、細胞内に挿入するだめの
機会をプラスミドＤＮＡに与えるため、および発現のた
め（このプラスミドにより特徴ずけられたアンピシリン
耐性遺伝子からのタンパク質合成のだめ）に、２から３
時間炭酸ガス飽和状態で、培養される。この時、細胞は
、５倍、５０倍、５００倍に、■メジュームで希釈され
、それらの分別液０．２　ｍｌは、Ｖ−ａｍｐベトリブ
レート表面に延ばされる（アンピシリン２５　ｍｙ／　
Ｌ　を含み寒天１５９ｍ　／　ｔ　で強化されたＶメジ
ューム）。そのプレートは、３７℃で一晩培養され、生
長したコロニーは、プラスミドＤＮＡを調製するために
使われる。 実施例２ プラスミドｐＫＢＧ−ＢＳ３ 先の実施例で得られたＢ　ａ　ｍ　Ｈニー　Ｇクローン
は、先の実施例の方法によシ制限酵素処理を受ける。下
に示す５ａｔＩを使った代表的な反応において、使用さ
れた制限緩衝液は、以下を含むＲＢ−８である。 トリス緩衝液　６□ＭｐＨ７，４ 塩化ナトリウム　１５０　ｍＭ 塩化マグネシウム　１０刷 βメルカプトエタール　１０ｍＭ こうして、１０μＰＢａｍＨＩ−Ｇは、ＲＢ制限緩衝ｔ
ｉ、２５μを中において、室温で１５分間、約１単位の
５ａｔＩ酵素で部分消化される。実施例２の中での成果
は、０．３４５８ａｍＨ１部位から０．３８７ＳａｔＩ
部位までの座標で、断片ｐＫＢＧ−ＢＳ３を生産する。 実施例３ ｐＫＢＸＸを得るために、１０μノのｐＫＢＧ＝　Ｂ　
Ｓ　−３は、２時間、８単位のＢａｍＨＩを使って完全
に消化した後、ＲＢ−１中で１単位Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉを用
いて部分消化される。 どちらの場合も、制限緩衝液１が使われる。 ここに用いられた様な部分消化において、１単位の酵素
は、１０μ７　のＤＮＡについて使用され、反応時間は
、１５分に減する。 アガロース電気泳動において、０．３４５から０．３７
２のＢａｍＨＩ−Ｘｈ　ｏ　Ｉ断片に対応する４、　Ｏ
Ｋ　ｂ結合物が、得られる。この断片は、ゲルから電気
溶離され、２４°ｌのクロロホルム対３メチルブタノー
ルの混合液の等量を使って抽出され、エタノール沈殿さ
れる。この断片は、それから、ＢａｍＨＩ−８ａＡＩ切
断ｐＵＣ９と結紮される。かくして、ｐＵＣ９は、初め
に前述の方法により、ＢａｍＨＩおよび５ａｔＩの作用
を受け、それから、対応する部位に対して、Ｈ８Ｖ−１
配列（上記電気溶離された断片、ｏ３４５ＢａｍＨ１か
ら０．３７２　Ｘ　ｈ　ｏＩ）と、実施例ＩＢの全力法
によって結紮される。 実施例４ ｐＢＲ３２５のＥｃｏＲＩ部位への、Ｈ８，Ｖ−２（Ｈ
Ｇ５２系統）のＥｃｏＲ１断片のクローニング Ａ、制限エンドヌクレアーゼ処理 エツペンドルフバイアル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｖｉａ
ｌ　）（プラスチック製で、スナップキャップを持つ）
内で、ｐＢＲ３２５［ベセスタ調査研究所〕２μｔ　（
０４μ５１）、ＨＧ５２　３６μｔ（４μ９）、Ｅｃｏ
Ｒ）５μｔ（４０単位）は制限緩衝液２の１１０μを中
で消化される。 制限緩衝７＆　２は、ｐＨ７，４の１００　ｍ　Ｍ　ト
リス緩衝液、５０　ｎｔ　Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化マグネシウム、１０ｍＭメルカプトエタノール１０
０μｙ／ｍｔヌクレアーゼフリー牛血清アルブミンを含
む。消化は、３７℃で３時間行なわれる。 消化の後、反応混合物は、ＴＥ（１ｍＭＥＤＴＡ１ｐ１
１８の１０　ｍ　Ｍ　トリス）を使って４００μｔに希
釈される。この溶液は、制′限エンドヌクレアーゼを不
活化するために、１５分間６５℃へ加熱し、それから、
室温に冷却される。この溶液は、それから、いくらかの
残存酵素を不活化し、取シ除くために、２４：１のクロ
ロホルム対３メチルフタノールとの混合液の等量を使っ
て２回抽出される。 他のプラスチックバイアルへ、残余溶液２４０μｔ　を
移した後、ここに、５Ｍ塩化ナトリウム６０μｔおよび
、冷却エタノール５００　ｔｔｌ（約２倍量）が加えら
れる。混合物は、３０分間−７５℃で保持され、後、上
清は、除かれ、ＤＮＡペレットは、エタノールを除去す
るために吸引乾燥される。 Ｂ、　’）ロー：／　ｐ　５２　ＫＧ作ｔＬ−のための
結紮乾燥ペレット（ｐｅｌｌｅｔ　）　は、リカーゼ緩
衝液２５μを中に再浮遊される。（リカーゼ緩衝液は、
ｐｌ＋　７．８の５０　ｍ　Ｍ　トリス緩衝液。 １０　ｍ　Ｍ塩化マグネシウム、２０ｍＭジチオトレイ
トール２５０μ７／μｔヌクレアーゼフリー牛血清アル
フミンを宮む）Ｈ８Ｖ−２サン　プル２０μｔは、ｐ　
ＢＨ３２５ＤＮＡ２μ４１０ｍＭアデノシン三リン酸１
．５μｔ、Ｔ４ＤＡリガーゼ（ベセスタ調査研死所廿２
０２）５０単位と、混合さ往る。この混合物は、１６時
間培養され、大腸菌ＲＤＰ　１４５を形質転換するため
に使用される。 実施例５ ｐ　５２　Ｅ’Ｇ−Ｂ　Ｈ＆影形成るために、ｐＵｃ９
　への、ｐ５２ＥＧからの且ａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｌ［断
片のクローニング 最初のバイアルにおいて、ｐ５２ＥＧ２０１１Ａ　−（
約５μ２）は、３７℃で９０分間２Ｘ制限緩衝液１２２
μを中で、Ｊ（ａｍＨＩ、Ｈｉ　ｎ　ｄ、ｕｔ、　Ｅｃ
。 ＲＩの１μｌを使って消化される。それからｉ量の１Ｍ
トリスが加えられ、培養は更に９０分継続する。 第二のバイアルにおいて、１ｏμｔのｐＵＣ９は、制限
緩衝液］　４５μｌと共に、Ｂ　ａ　ｍＨＩ　、Ｈ３ｎ
ｄＩｌｌの１μｔｆ使って、３７℃で３時間培養される
。 制限緩衝液］、　（Ｒｅ５ｔｉｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅ
ｒ　１　）は、ｐｌ＋７．４の］０ｍＭトリスを含み、
その緩衝液は、他の点では制限緩衝液２と同様である。 消化後、切断ＤＮＡは、０．７５％アガロースゲルにお
ける電気泳動により分離される。目的結合物は、アガロ
ースから電気溶離され、それから実施例４のように抽出
きれ、結紮され、大腸菌を形質転換するために便われる
。 実施例６ ｐ５２ＥＧ−ＢＨからのｐ５２ＢＸＸの単離最初のバイ
アルにおいて、ｐ５２ｇＧ−ＢＨＩＯμｔ（約５μり　
）は、制限緩衝液１　４０μ、／、＋：ＩＱこ、Ｂ　ａ
　ｍ　Ｊ（］、　＋Ｈｉ　ｎｄ用の１μｌと共に加えら
れ、３７℃で２時間３０分培養される。それから、、Ｘ
ｈｏ１１単位が加えられ、培養は、ｐ５２ＥＧ−ＢＨの
多くの分子における２つのＸｈ。 ■部位の内の１つのみを切断するために１５分間継続さ
れる。 第２のバイアルにおいて、１０μｔのｐＵＣ９は、制限
緩衝液ＲＢ−８４０１１を中で、３７℃で２時間３０分
、ｆ３ａｍＨＩの１μｔおよび　５ａｊＩの２μｔを使
って消化される。 使用された制限緩衝液はＲＢ−８であり、以下を含む。 トリス緩衝液　６城ｐＨ７，４ 塩化ナトリウム　１５０　ｍＭ Ｍ塩化マグネシウム　１０　ｍＭ ヌクレアーゼ゛フリー 十血清アルブミン　１００μり／ｍＬ βメルカプトエタノール　１０ｍＭ ＤＮＡは、アガロース電気泳動によシ分離され、電気溶
離され、抽出され、結紮され、先の実施例に示すように
、大腸菌ＲＤ　Ｐ　１４５を形質転換するために使用さ
れる。電気溶離されたｐ５２ＢＧ−ＢＨの断片は、０．
３４５ＢａｍＨＩ部位から、０．３５３　Ｘ　ｈ　ｏ　
Ｉ部位を経て、０．３７２ＸｈｏＩまで広がる４、６Ｋ
ｂ断片である。ここでまた注意しなければならない点は
、Ｘｈｏ■部位がＳ’　ａ　Ｌ　Ｉで同じ粘性末端を持
つがゆえに、ＨＳ　Ｖ−２０，３７２Ｘ　ｈ　ｏ　１部
位は、ｐＵ０９の５ａｔ１部位へクローン化されること
である。 実施例７ 細菌における、ｐＫＢＸＸからの１Ｂ断片の発現 Ａ、ｒＢ断片の生成 １０μｔのｐ　Ｋ　Ｂ　ＸＸ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（約１０μ
ｇ）および、１０μｔのｎａｚＩ制限エンドヌクレアー
ゼは、等量の２ＸＢ　ａ　ｔＩ緩衝液（Ｎａαを含まな
い制限緩衝液ＲＢ　−］、　）へ加えられ、ＤＮＡは、
エツペンドルフ・スナップキャップ・バイアル中で、３
７℃で１６時間消化される。０．７％アカロースゲルを
用いた′電気泳動による、２つのＤＮＡ断片（１，４８
Ｋｂ、５．２０Ｋｂ）の分離の後、要求される１、４８
Ｋｂは、ゲルから電気溶離される。 ＤＮＡは、残存ＢａｔＩ酵素を不活化し除却するために
、フェノール、クロロホルム、３メチルブタノールのそ
れぞれ２４：２４：１の混合物の等量を使って２回抽出
される。 ＤＮＡを含む水層は、酢酸ナトリウム（３Ｍ保存溶液）
へ、入れ、−７５℃で、３０分の保管期間冷却エタノー
ルの２倍量を加えることにより沈殿される。エタノール
をゆるやかに注ぎ、ＤＮＡを吸引乾燥し、これを５００
μｙ／μｔの牛血清アルブミン２５μｔに、等量の２　
Ｘ　Ｂ　ａ　Ｌ　３１緩衝液（ｐＩＩｓ、　ｏの４０ｍ
Ｍトリス、２４　ｍＭｃａＣ１！２．　２４　ｍＭＭ９
α２゜４００　ｍＭＮａＣｌ、、２　ｍＭ　ＥＤ　ＴＡ
　）および２　ｌｉｔ　のＢａｔ３１（２，５単位）を
加えた溶液に再浮遊される。酵素およびＤＮＡのこれら
の濃縮は、ＤＮＡの各末端から、約１００ヌクレオチド
／　ｍｉｎの加水分解を起こさせる。 Ｂａｔ３１調製物は、５′　から３′　も３′から５′
　もどちらについても、エキソヌクレアーゼ分解活性（
ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　）
を含み、ゆえに、ＤＮＡのどちらの鎖も、加水分解され
る。５μｌのサンプルがＯから３分の間に２０秒間隔で
取シ出され、５０μｔのフェノール−クロロホルム−３
メチルブタノールヲ含有するエツペンドルフスナップキ
ャツプバイアルへ加えられる。（前の段落参照） ためられたＤＮＡ断片は、前に示したように抽出され沈
殿され、５０μｔのＴＥ中に再浮遊される。さらに、サ
ンプル量中の小変化部を持つ残存モノヌクレオチドを除
却するために、回転透析によってでファデックス小型カ
ラム中を通過される。 これに、ＨｉｎｃｌＩを使った培養によりプラント末端
化されたｐＵＣ９ベクターＤＮＡ１μ（約０．１μ９）
が加えられる。通常、１０μＭＡＴＰを共なう５μｔの
ＩＯＸリカーゼ゛緩衝液［］、Ｘリガーゼ緩衝液につい
てのセクション４（実施例４）を参照〕は、３μｔのＴ
４ＤＮＡリカーゼ（４ｘ１０ｓユニット／ｍｔ　）　と
共に加えられる。得られた溶液は、室温で１６時間培養
され実施例ＩＣにおけるように大腸菌を形質転換するた
めに、ただちに使われる。 Ｂ、抗原的に活性なＩＢ断片 上記の形質転換実験から得られた、独特なコロニーから
の細菌は、１０ｍ１の培養液に入れられることに使用さ
れ、０５の光学密度（ＯＤ）に生長される。おのおのの
培地からのｊＴ−［１１１１は、ペレット化され、１０
％トリクロロ酢酸（ＴＣＡｊ中に再浮遊され、沈殿物は
、同量の１０％ＴＣＡを使って、エラペンドルススナツ
プキャップバイアル中で洗浄される。 最後にペレットは、■００μｔのＴＥ中で洗浄され、ｐ
Ｈ８，０２Ｍトリス−ベース（Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ　）
　２μｔを加えることにより中和される。 １０μｌのサンプルは、ニトロセルロースフィルターへ
庄かれ、３７℃で３０分間、風乾される。細菌のタンパ
ク質やＤＮＡは、フィルターへ拘束され残るであろう。 ニトロセルロースの細片（１４５Ｘ１９０喘）は、緩衝
液Ａ（１）１１７．５の１０ｍＭトリス。 １７（１ｍＭＮａα、０．１ｍＭフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド、さらに加えて、０．０１％ＳＤＳおよ
び１０ｍＭ塩化マグネシウムも含む）　５　ｍＡ　中に
浸される。ＤＮＡは、２　ｔｔｑ／　ｍＡ　のデオキシ
リボヌクレアーゼｌ（ＤＮａ５ｅｌ）溶液■０μｔを加
えることにより、１０分間消化される。ニトロセルロー
スのすべての処理は、］、８Ｘ１５０＋ｍｎスクリュー
キャップ（ｓｃｒｅｗ−ｃａｐ　）型試験管中において
行なわれる。ニトロセルロース自体は、試験管の内側に
巻きつけられる。細片は、約１０ｒｐｍで回転するドラ
ム上で試験管を回転させることにより、すべて連続培養
基中に浸すことにより保持される。 ＤＮａ　ｓ　ｅ　■およびヌクレオチドは、ＯＤ】％Ｓ
ＤＳを含む緩衝液Ａ　５　ｍｌ　で２回、５分間づつ洗
浄することによシ除かれる。Ｈ８Ｖ−１抗体の非特異的
結合は、０，０１％ＳＤＳおよび１０％馬血清を含む緩
衝ｏ、Ａ　３　ｍｌ　を使って、ニトロセルロースを処
理することによりブロックされる。処理は３時間行なわ
れる。細片は、００１％ＳＤＳを含む緩衝液Ａ５ｍｔで
２同各１０分づつ洗浄される。 Ｈ８Ｖ−１抗血清（精密な科学原理に基すいて典型的に
得られた）は、細菌溶解物（Ｌｙｓｉｔｅ　）　中に存
在する、抗原的活性を持ついくつかのｆＩＢ断片へ、血
清中のｆＢ抗体を結合させるために加えられる。１０μ
ｔの抗血清は、５００μｔの溶液Ｂ（１？ＭＭＥＤＴＡ
、０．１％ＳＤＳ、０．１％トリトンＸ−１００，およ
び４％馬血清を含む緩衝ＭＡ）へ加えられ、室温で１６
時間結合させられる。 溶液８３　ｍｌ　で２回、１０分間づつ洗浄の後、２μ
Ｃｉの１２５１タンパク質Ａ〔ニューイングランド核（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）　：］を
含む溶ｉＢ　５００μｌが加えられる。タンパク質Ａは
、黄色ブドウ球菌からのものであり、■２Ｇ抗体の一定
領域と結合する。タンパク質Ａは、室温で３時間で、こ
れらの部位と結合させられる。最後に、フィルターは、
馬血清をｉｔない溶液８５　ｍＡ　で５回、１５分づつ
洗浄され、乾燥され、２４から７２時間Ｘ−ＯｍａｔＸ
線フィルムにさらされる。 細菌において合成されたｆＢ生成物を試験するために、
Ｂａｔ３１清化ＤＮＡから合成された１Ｂペプチド（実
施例７）および、後述されている最後のクローンの調製
物（実施例８参照）は、ＳＤＳ電気電気的動的離された
ペプチドのラジオイムノ反応により試験され得る。１Ｂ
生成物が、ｔａＣプロモーターの制御のもとに存在する
ゆえに、その生産は、ｔａｃタンパク質（ＩＰＴＧのよ
うな）の合成を誘導する化学物質によって誘導されなけ
ればならない。 細菌の１０　ｍｔ　培養は、）ＰＴＧの存在のあるなし
において、０Ｄ０５まで生長され、細胞はペレット（ｐ
ｅｌｌｅｔ　）　化され、１０％の冷却されたＴ　ＣＡ
　ｌ　ｍｌ　中に再浮遊され、３０分間冷却される。２
回目の遠心の後、細胞は、１０％ＴＣＡで洗浄きれ、最
後のペレット（ｐｅｌｌｅｔ　）　は、ｐＨ８，Ｏの２
Ｍトリス−ベース（ｂａｓｅ　）　２μｔで中性にされ
、電気泳動サンプル溶液（ｐＨ７，０の５ｍＭトリス、
２％ＳＤＳ、５％βメルカプトエタノール。 ０．００５％ブロムフェノールブルー）の１００μを中
に再浮遊される。１０μｔのサンプルは、９．５％ゲル
へ与えられ、ペプチドは、１００ボルトで６時間、分離
される。 このペプチドは、ニトロセルロースシート上に電気的フ
ロント（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔ　）　化され、その
シートは、風乾される。２Ｂペプチドは、ラジオイムノ
アッセイによｐ、１ｉ’Ｂの存在について検定するため
に、実施例７に示しだようにニトロセルロースシートを
処理することに視覚化される。予想された犬きさのペプ
チドが視敵化されるはずである。 ウサキヘ接棟されるだめの抗原として使用するｙＢ断片
を調料するために、誘導細菌培養物は、ＴＣＡで処理さ
れ、第１段落で述べたように、電気泳動サンプル溶液中
に再浮遊される。ただし、総容量は、約１００μ２　の
２Ｂペプチドを得るために１０倍に増加される。ゲルの
適当な領域からのｆＢは、フロイントのアジュバント中
で、つぶされどろどろにされ、抗体生成のためにウサギ
に接種される。２５μ２　のペプチドは、最初および引
き続く２回目の注射において１更用され得る。次に、ウ
サギからの抗血清は、１Ｂ沈降能および、ウィルス中和
能について試験され、それによって、望ましい分画が確
認される。 実施例８ 細餉中のｐ　５２　ＢＸＸからの２Ｂ断片の発現Ａ、１
Ｂ分画の生成 エツペンドルフスナップキャツプバイアル（Ｅｐｐｅｎ
ｄｏｒｆ　５ｎａｐ　ｃａｐ　ｖｉａｌ　）中のｐ５２
ＢＸＸ　ＤＮＡ（２５μ２ｍ）はエタノール沈殿され、
ペレット（ｐｅｌｌｅｔ　）　は、７０％エタノールで
洗浄され、吸引乾燥されそうして４５μｔのＲＢ　６　
（１００ｍ　Ｍ　Ｎａα、ｐＨ７，４の６ｍＭトリスＨ
α、６　ｍ　Ｍ　ＭＦα２．５ｍＭ２メルカプトエタノ
ール、１００μ’　／　ｍｔ−ＢＳＡ）中に再浮遊され
る。制限エンドヌクレアーゼＮｒｕｌ（４ｕｎｉｔ／μ
ｔのものを４μｔ）が加えられ、その混合物は、３７℃
で一晩、牛血清アルブミンの存在下で培養される。反応
停止溶液（５μｔ）が加えられ、その反応混合物は、反
応停止溶液中の、不活化酵素、洗浄物、染色物を除去す
るだめに、ＴＥ緩衝液中で、バイオゲル（Ｂｉｏ　Ｇｅ
ｌ　）　Ｐ　−１００を使用する回転透析を２回サイク
ル受ける。ＤＮＡはエタノール沈殿され、洗浄され、乾
燥される。ＤＮＡは、２５　／Ｉｔ（ＤＢ　Ｓ　Ａ（５
００μｙ　／ｍｔ　）中に再浮遊され、それに等量（７
）　２　Ｘ　Ｂ　ａ　ｌ　３１緩衝液（ｐＨｓ、　ｏ　
）４０ｍ　Ｍ　トリス、２４ｍＭＣａα２１２４　ｍ　
Ｍ　Ｍ７Ｃ３゜４００　ｍＭＮａ　Ｑ！、　２−ｍＭ　
ＥＤＴＡ　）に３μｔのＢａ／Ｌ３１（３，５単位）が
加えられる。これらの酵素濃度およびＤＮＡ９度は、Ｄ
ＮＡの両末端から約１５０ヌクレオチド／ミニムを加水
分解する原因となる。Ｂａ７３１調製物は、５′　から
３′　についても３′から５′についてもエキソヌクレ
アーゼ的活性を含んでいるので、ＤＮＡのどちらの鎖・
も加水分解される。７μｔサンプルがそれぞれ、１分３
０秒から４分３０秒まで、３０秒間隔で取シ出され、Ｔ
Ｅ４３μｔおよび反応停止溶液５μｔ６含むバイアルへ
加えられる。Ｂａ１３１切断の範囲は、アガロースゲル
（０，７５％ゲル）でサンプルを１０μを処理すること
によシ決定される。 Ｂａ１３１切断使った消化によシ約ＩＫｂだけ短かくさ
れたと思われるＤＮＡサンプルは、回転透析を２サイク
ル受ける。ｌ０ＸＲＢ１の最終量の０およびＸ　ｈ　ｏ
　ｌ　（１５ｕｎｉｔ　／１ｉ７）１μｔが加えられ、
その混合物は、３７℃で８時間培養される。Ｘｈｏｉは
、ヌクレオチド２６７２でＤＮＡを切断し、２つの断片
を生ずる。反応停止溶液５μｔが加えられ、おのおのの
時間点からＤＮＡの１が、０．７５％アガロースゲル上
の２つの近接するくほみのおのおのへ加えられる。電気
泳動け、５４ボルトで一晩行なわれる。ＤＮＡは、臭化
エチジウム染色により視覚化され、１．７Ｋｂ連結物は
、ゲルから切り離され、電気溶離（０，ＩＸ電極緩衝液
中で、１０８ボルトで３時間）される。臭化エチジウム
は、ＴＥで飽和されたｎブタノールの等量（約３　ｍｌ
　）　で３回抽出することにより除去される。クロロホ
ルム：３メヂルブタノール（２４：１）の等量を使って
２回、抽出が行なわれ、ＤＮＡは、エタノール沈殿され
、エタノールを使って洗浄され、乾燥される。 ＤＮＡは、ＴＥ５０μを中に再浮遊され、４μ９　のｐ
ｔｒｃｓベクターＤＮＡ　（予め、王ｍａｉと５ａｉｌ
とを使った連続消化にさらされた）と同じように、回転
透析を２サイクル受ける。ベクターＤＮＡｄ、エタノー
ル沈殿され、洗浄され、４８μｔのＳｍａｌ緩衝液（ト
リス、Ｈα（ｐＨ８，０）　、６　ｍＭ　：　Ｋα。 ２０　ｍ　Ｍ　：　Ｍりα２，２メルカプトエタノール
。 ６ｍＭ；　ＢＳＡ、１００μ９ｍ　／　ｍｌ　）　への
再浮遊に先だって、吸引乾燥される。２μｔのＳ　ｍ　
ａ　ｌ　（１０ｕｎｉｔｓ　／μｔ）が加えられ、消化
後、ＤＮＡは、回転透析を２サイクル受け〔いくつかの
場合において、’Ｓ　ｍ　ａ　ｌは、ＤＮＡのエタノー
ル沈殿および乾燥の前の、クロロホルム−３メチルブタ
ノール（２４：１）抽出によシ、不活化され、除去され
る。〕どちらの場合にも、ＤＮＡは、４６μｔのＲＢＳ
へ運ばれ、４１１ｔ　のＳ　ａ　Ｌ　Ｉ　（］０ｕｎｉ
ｔｓ／μｍ）　が加えられ、培養は、３７℃で２時間行
なわれる。 おのおのの時間点から得られるＨ８Ｖ−２ＤＮＡ断片（
約２ｔｔｙ）　は、０．２，１（７）ｐｌＪＣ８，、Ｄ
ＮＡと混ぜられる。１０Ｘリカーゼ緩衝液の１ん量、１
μｔのＡ　Ｔ　Ｐ　（１１ＭＥ／／　ｍｔ）。 および３μＡのＴ４ＤＮＡリガーセ（４×１ｏ５ｕｎｉ
ｔｓ　／　ｍｌ　）　が加えられ、全反応液量が、５０
μｔになる結紮は、室温で一晩行なわれる。反応混合物
は、実施例１ｃの技術にょ９、Ｅ、ｃｏＡｉ　ＲＤＰ２
１１を形質転換するだめに、直ちに使用される。 ｆＢ−βガラクトシダーゼ融合タンパク質の同定および
免疫的活性 各個′））細菌コロニーは、適当なＨ８Ｖ−２挿入物を
伴なうプラスミド（ｐ５２ΔＮＸとと呼ばれる部類の）
を挿入することにより、およびｌ　ＰＴＧ　（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオカラクトシト）の存在において生長
する含有゛′吻体を挿入すると々によシ得られる。これ
らコロニーからの培養物（１０ｍｌ　）　は、約１のＯ
Ｄへ、誘導状態（５０％エタノール中に５６　ｍｆ　／
　ｍｌ　の１．　Ｐ　Ｔ　Ｇ　４μｔ）または、非誘導
状態（２０％（Ｖ／Ｖ　）グルコース浴液１５０μｔ）
において、■メジューム中で生長される。細胞は、ペレ
ット化され、（６０００７×５分）、］　Ｏｍｙ／　ｍ
ｔ　のリソチーム、４μ９　／　ｍｔの膵臓デオキシリ
ボヌクレアーゼ■（ＤＮａｓｅｌ）を含む溶解緩衝液（
５ｍ　Ｍグルコース、１０ｍ、Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８
，０の２５　ｍ、　Ｍ　トリス−Ｈ（り１００μを中に
再浮遊される。氷上で３０分培養後、反応混合物は、渦
動され、氷結物は、２度暖められて解かされ、５ｍｔの
ＴＥが加えられ、その混合【１勿は、渦動される。サン
プルは、溶液中の細胞質タンパク質または可溶タンパク
質（リポソーム含有）を残して、膜タンパク質重たは不
溶タンパク質をペレット化するだめに、沈殿される（６
０００ｒＸ１０分）。等量の冷却トリクロロ酢酸（１０
％Ｗ　／　Ｖ　）は、細胞質タンパク質を沈殿させるた
めに、氷上で３０分間、上清へ加えられる。これらのタ
ンパク質は、沈殿され（６０００ｉｉｉ’　Ｘ　Ｊ、　
０分）、電気泳動サンプル溶液（ｐｉｌ　７．　Ｑの０
．０５Ｍトリス−Ｈα、　２　％ＳＤＳ、５％βメルカ
プトエタノール、ｏ、６ｏ５％フロモフェノールフルー
、５Ｍ尿素）の１００μを中に再浮遊される。５μｔか
ら１０μｔの２Ｍトリス−ベース（’ｂａｓｅ　）　は
、ペレット中の残存トリクロロ酢酸を中２１１するだめ
に加えられる。最初のペレット中に存在する膜タンパク
質もまだ、電気泳動サンプル溶液１００μを中に可溶化
される。 １２％アクリルアミドゲル（分析用ゲル）は、ゲル緩衝
液（ｐｌ＋　８．８の０．３７５Ｍトリス。 ＨＣｌ、０．１％５ＤＳ）の１００　ｍｌ　中にアクリ
ルアミド（１２ｙｍ　）　とＮ、Ｎ’−ジアリル酒石酸
ジアミド（０，５６℃ｍ）　を溶かすことによシ作られ
る。０．６　ｍＡ　の過硫酸アンモニウム溶液（水９　
ｍＡに対して１７ｍ）および３０μｔのＮ、　Ｎ、　Ｎ
’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンは、重合過程を
触媒するために、９０ｍ１　に対して加えられる。溶液
は、吸引のもとで、ガスを除かれ、４Ｅ、ｍｔ　が、お
のおのの分離ゲルを形成するために使用される。２枚の
ガラス板（＋　５．９　Ｘ　ｉ　９ｃｍ）は、そのおの
おのの側面において１．２　ｍｍスペーサーにより、お
よび、板の底部で節３のスペーサーにより間隔をあけら
れ、その２枚のガラス板の間に、溶液は注がれる。完全
な集合物は、クランプ（ｃｌａｍｐ　）によりきさえら
れたプラスチックゲルスタンドへ同時に保持され、緑は
、アカロース（水１００　ｍｔに対して１．６２ｍ）で
密閉される。プラスチック・ブランク（ｂｌａｎｋ　）
　（幅１Ｂｃｍ、長さ’；！、、　５　ｃｍ　＋厚さ１
、２　ｉｎ　）は、ゲルの上表面でなめらかな表面を作
るために挿入される。ゲルが重合（］時間）された後、
ブランクは、取シ除かれ、１５ｍＬ　の堆積ゲル（５％
アクリルアミドのみを宮め、ｐｉｌ　７．０００１２Ｍ
トリス、Ｈα、０．１％ＳＤＳにおける同じ方法で使ら
れた）は、分離ゲルの上表面に注がれる。１０の歯を持
つコウム（ｃｏｍｂ　）　（おのおの幅８５胴、×長さ
１５．２　ｒａｍ　）が、堆積ゲルへ添えられる。 堆積ゲルの重合（１時間）の後、電気泳動１ナンプル溶
液甲のタンパク質サンプル（５μＬから１０μｔ）は、
コウムの歯によって作られたおのおのくほみへ加えられ
る。ゲルは、トリス−グリシン電極緩衝液（００２５Ｍ
トリス。 ０．１９２Ｍグリシン、０１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　、　ｐＨは
８．５）中で４時間３０分、１０８ボルトで電気泳動さ
れる。電気泳動の後、ゲル板は分離され、ゲル中のタン
パク質は、染色されるが、収い収られる。 タンパク質を視覚化するために、コマイセブリリアント
ブルー（Ｃｏｏｍａｒｓｓｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔＢｌ
ｕｅ　）　染色液（０，２５％染色液１　（１，２＋Ｘ
氷酢酸、４５．４ｘｙｔタノ−／Ｌ）ｕ、３０分間ゲル
へ加えられ、それから、メタノール−酢ば一水（５−７
，５−８７，５）中で一晩脱色される。 抗体反応に使用されるタンパク質は、染色されず、１２
タイポリアクリルアミド−８ＤＳゲルにおける電気泳動
を使用し−で分離した後ニトロセルロース紙上に吸い取
られる。電気吸い取り器が使われ、吸い敗りは、メーカ
ーより提供された指示により行なわれる。収い取シは、
２０Ｘ（Ｖ／Ｖ）メタノールを含む電極緩衝液（１９２
ｍＭグリシン、２５ｍＭトリス−ＨＣ／！、Ｉ　ＸＳ　
Ｄ　Ｓ　、　ｐＨ８，３ＫＡ製すれた）中で、６ｏボル
ト１時間３０分行なわれる。 タンパク質がニトロセルロースへ移動すれた後、抗体結
合測定のだめに直径１００ｍｍのプラスチックペトリ皿
へ、合致する帯状片へそれは切り離される。帯状片は５
　ｍＡ　のリン酸緩衝液比された塩類溶液＜ｐｓｓ）（
ｘ、１４９ｍＣａＣｌ２．２Ｈ２０，０，２ＦｍＫα、
　１．０２　ＦｍＮａ　ＨＰ　０４＋　１．０２９ｍＫ
Ｈ２Ｐ　０４．０．２９ｔｎＫＨ２Ｐ　ｏ、、＋　０．
１９ｍＭりＣ１２，６Ｈ２０、８９ｍＮａα、　ｐｉｆ
　７．４に調製）で、おのおのの洗浄時間５分間で、２
回洗い落とされる。非特異結ばは、１時間半、馬血清５
００μｔ　全含むＰＢＳ５ｍＬ　ｆ帯状フィルター片を
処理することによシ最少限度におさえられる。５　ｍＡ
のＰＢＳで２回洗浄の後、帯状片は、馬血清１００μｔ
を含むＰ　Ｂ　Ｓ　５　ｍｌ　中で、市販の抗Ｈ８Ｖ−
２（２０μｔ）寸たは抗Ｈ３Ｖ−１（５０μｌ）ウサギ
血清に一晩さもされる。 抗血清は、ＰＢ３５ｍＡ　で３回洗浄により取り除かれ
、ｇ２２抗は、Ｐ　Ｂ　８５　ｍｌ　および馬血清１０
０μＬ中に加えられる。第２抗体ハ、西洋わさびペルオ
キシダーゼを含むヤギ抗ウサギｌｒＧである。　第２抗
体は、第１抗体において存在するＩ　’Ｐ　Ｇと結合す
るであろう（Ｈ８Ｖ−２タンパク質の部位で）。 ニトロセルロース帯状片は、３時間第２抗体にさらされ
る。ＰＢＳで５回洗浄された後、５　ｍｌ　の基質溶液
（、ｌＯｍｐの４−クロロ−１−ナフトール、１ｍｌ　
のエタノール、１０μｔの３０％Ｈ２０、１，００ｍＡ
の水）は、指示酵素（西洋わさひペルオキシダーゼ）の
部位でＷ邑が発色するまで加えられる。すべての培養は
、７５ＲＰＭで、回転式シェーカーで行なわれる。 Ｃ０７Ｂ断片 動物試鹸のために、大量の６５ＫｂｆＢ−β−ガラクト
シターゼ融合タンパク質を得るために、上に述べられた
膜分画は、誘導された培養物の１リツターから調製され
る。Ｐ５２ΔＮＸ−６０と呼ばれるプラスミドを宮むク
ローンが、使用される。６５Ｋｂ融合タンパり質を営む
膜分画を１０　ｍｌ　（Ｉ　Ｌの培養物の同量物からの
）まで、１０％ポリアクリルアミド−８ＤＳ調製ゲル上
に、ピペットで移され１．電気泳動される（１５０ボル
ト）。タンパク質は、ゲルから取シ去られ、分画（２＝
２）　は、６から８時間にわたって集められる。融合タ
ンパク質を含む分画け、調製ゲルからの分画のポリアク
リルアミド−８ＤＳゲル亀気泳動により同定される。５
０μ乙　のサンプルは、分析ゲルの上を移動し、その移
動は、非分画サンプルのそれらと比較される。 タンパク質は、上に述べられたように染色および脱色さ
れ視覚化される。相対的に純粋な６５Ｋｂ融解タンパク
質が、得られる。タンパク質は、ＰＢＳに対して透析さ
れ、フロイントのアジュバントと１：１で希釈される。 ６５Ｋｂタンパク質は、その時、約ｌｏＯμ２／ｍｔｔ
ｖ＃Ｗである。１　ｍｌ　のアルコツトは、抗体生成の
ために、ヤギおよびウサギの臀部および背部上の多くの
部位に接種するために使われる。用いられた方法は、７
週間後に始まる血清採取をしながら、１週おきに５回の
接種を行なう。マウスにおける防護効果を実証するため
に、１０μｔから１００μｔが、マウスの同部位中に接
種される。異なる時間間隔接種の後、致死量のＨＳ　Ｖ
−２（５Ｘ１０５プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）が、マウ
スの合致する部位中に接種される。防湿マウスは、コン
トロールをこえて、生存率の注目に値する上昇を示す。 表　１ Ｈ８Ｖ−１ｒＨのヌクレオチド配列および、それをとシ
囲む領域 Ｈ８Ｖ−１（ＫＯ８）のヌクレオチド配列および、地図
単位０．３７２と０．３４５の間が示される。配列は、
０．３７２Ｘｈ　ｏ　１部位で始まシ、０３４５地図率
位ＢａｍＨＩ部位で終わる。配列は、５′　から３′　
まで書かれている。推定上のＣＣＡＡＴ″’（、、、、
）および“Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　”　（−）信号部位は、下
線を引かれる。３つの可能なｍ　ＲＮ　Ａ開始部位は、
（）で示される。最初の可能なＡＵＧ翻訳開始コドンは
、四角のわくおよび矢印を使って示される。ＡＵＧコド
ンから翻訳の終点は、ＥＮＤの文字で示される。推定上
のポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡ　（黒の四角い点）
が示され、ｐｏｌｙＡ付加の推定点のすぐ後に、（△）
の印が示される。 明細書の浄＝（内′ごに宸更なし） 表　２ Ｈ８Ｖ−１４８とＨ８Ｖ−２ｒＢ（７）アミノ酸列比較 一査下の列に記入されたものは、）ＩＳＶ−１ｆＢのア
ミノ酸配列である。その上の列は、Ｈ８Ｖ−１９Ｂに適
合するヌクレオチド配列を表わす。そのすぐ上の列は、
Ｈ８Ｖ−２ｒＢに適合するヌクレオチドを示し、それは
、Ｈ８Ｖ−１のだめのヌクレオチドと異なる部分のみを
示す。Ｘの印は、決定されなかったＨ８Ｖ−２のヌクレ
オチド配列を示す。（Ｈ８Ｖｔ１４Ｂの残基］、　７−
４１と一致）下から４番目の列は、Ｈ８Ｖ−１１Ｂのヌ
クレオチドと異なる部位でのＨ８Ｖ−２ｆｉ’Ｈの相応
するアミノ酸配列を示す。一番上の数字は、Ｈ８Ｖ−１
ＦＢのアミノ酸残基の数である。 ５つの余分なアミノ酸残基が、Ｈ８Ｖ−１配列において
示された空白部で、Ｈ８Ｖ−２ｒＢについて存在するこ
とが注目きれるであろう。 口ｋｕ＞ｅ１ＭＬ＋−ロ０υ−ロＬｌ　＜　Ｏロ　ｕク
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−ｃ＋＋　＋　！　＜　ｕ−υＱ（―クー　←−ｔ−４
−＜　ｌｊ　ｌ−Ｌｌ　ｌ−表　３ ｐＵＣ９およびｐ　ＵＣ８における多重クローニング部
位、 示された制限部位を富む多重クローニング部位は、図に
示される。クローニング部位は、β−カラクトシダーゼ
遺伝子のＮ末端と関係が深く、それは、１１のアミノ酸
が、ｐＵＣ９に適合するタンパク質のアミノ酸４と５の
間、およびｐＵＣ８に適合するアミノ酸６と７の間に挿
入される原因となる。新しいアミノ酸は、正常β−ガラ
クトシダーゼアミノ酸から分れ出たものである。ＲＮＡ
およびタンパク質合成の方向は、左から右である。 １２３４５ １　２　３　’　４　ＰＲＯＳＥＲＬ［ｉｌｌ　ＡＬＡ
　＾ＬＡＴＩＲＭＥＴ　ＩＬＥ　ＴＩＩＲ ＡＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＣＣＡ　ＡＧ
ＣＴＴＧ　ＧＣＴ　ＧＣＡ’　Ｈａｎｄ　ＩＩＩ　’　
Ｐｓｌ１ １２３４５６１２３ ＴＨＲＭＥＴ　ＩＬε　ＴＩＩＲＡＳＮ　ＳＥＲａ＋４
　ｇＩｙ　５ｅｒＡＴＧ　ＡＣＣＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣ
Ｇ　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＣＧＧ　ＧＧＡ　ＴＣＣＥｃｏ　
Ｒ１［ｌａｍ　ＩＩ ｅａ　１ ｓｓ　１ 注：ＴＴＣは矢印の上のアミノｖ６−セリン６７８９１
０１１ ＧＬＹ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　）ＬＥ　ＰＲＯＧＬＹ　５　
６　７　８ＡＳＮ　ＳＵＲＬＥＵ　ＡＬＡ ＧＧＴ　ＯＧＡ　ＣＧＧ　ＡＴＣＣＣＣＧＧＧ　ＡＡＴ
　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＣ’　Ｂｏｓｌｌｌ　”　ＥＣ
０ＲＩ　’ＳａＬ　Ｉ　Ｓｓｏ＋ ＬＣＣＩ　Ｘ＋ｅｏ！ Ｈｉｎｄ　ＩＩ ４　５　６　７’　８　９　１０　１１　７　Ｉｔｖａ
ｔ　ａｓｐ　Ｉｅｕ　ｇｌｎ　ｐｒｏ　ｓｅｒ　Ｉｅｕ
　ａｌａ　ＬＥＤ　ＡＬＡ。 ＧＴＣＧＡＣ’ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＡＧＣＴＴＧ
　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＣＰｓｉ　ｌ　１ｌｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ を暗号化する。 手　続　補　正　書（方式） ％式％ ｌ事件の表示昭和５９年　特許願第１２９９１５号３、
補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏　名　スタンレー　パーソン （名相 ４、代理人 （１１別紙の如く明細書（第７８頁、第７９頁）１通を
提出致します〇

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　１（Ｓ　Ｖ　−１またはＨ８ｖ−２ウイルスの糖
   タンパク質Ｂ中に見い出されるアミノ酸鎖に対応する配
   列を含む、Ｈ８Ｖ−１またはＨ８Ｖ−２に対応して抗原
   性である非グリコジル化アミノ酸鎖。 ２　ウィルスがＨ３Ｖ−２である特許請求の範囲第１項
   のアミノ酸鎖。 ３、　ウィルスがＨＳ　Ｖ　−１である特許請求の範囲
   第１項のアミノ酸鎖。 ４．７５０より多くないアミノ酸残基を含む特許請求の
   範囲第２項のアミノ酸鎖。 ５、Ｎ末端疎水性リーダー、膜への橋渡し配列、Ｃ末端
   イオン配列、糖類付加のだめの８つの部位を含む特許請
   求の範囲第４項のアミノ酸鎖。 ６５より少なくないアミノ酸残Ｊ、（：　／、含む！１
   ）許請求の範囲第４項のアミノ酸鎖３゜ ７、　表２に参照されるアミノ酸残基１３５−６２９を
   含有し、分子量約６５，０００ダＪしトンを持つ特許請
   求の範囲第６項のアミノ酸鎖。 ８．７５０より多くないアミノ酸残基をａむ特許請求の
   範囲第３項のアミノ酸鎖。 ９、Ｎ末端疎水性リーダー、膜への橋渡し配列、Ｃ末端
   イオン配列、糖類付加のだめの９つの部位を含む特許請
   求の範囲第８項のアミノ酸鎖。 １０５つよシ少なくないアミノ酸残基を含む特許請求の
   範囲第８項のアミノ酸鎖。 １１、表２に参照されるアミノ酸残基１６５−６２９を
   含有し、分子量約６５．０００ダＪＬトンを持つ特許請
   求の範囲第１０頃のアミノ酸鎖。 １２、　）ＩＳＶ−１または）［５Ｖ−２ウイルスの糖
   りンパク質Ｂ中に見い出されるアミノ酸鎖に対応する配
   列を含有し、１（ＳＶ−１またはＨ８Ｖ−２に対応して
   抗原性である、非グリコジル化アミノ酸鎖を暗号化する
   デオキシヌクレオチドを包含するＤＮＡ運搬へフタ＋　
   ０ １３、Ｈ８Ｖ−１またはＨ８Ｖ−２ウイルスノ糖タンパ
   ク質Ｂ中に見い出されるアミノ酸鎖に対応する配列を含
   有し、Ｈ８Ｖ−１またはＨ８Ｖ−２に対応して抗原性で
   ある非グリコジル化アミノ酸鎖を暗号化するＤＮＡ　配
   列から本質的に成るＤＮＡ　の部分。