JPS6012986A - 成熟ヒトｉｌ−２をコ−ドする２本鎖ポリデオキシリボヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのインターロイキン−２（工Ｌ−２）は、淋巴球の
反応性を調節しうる可溶性蛋白質で抗原特異的エフェク
ターであるＴ−淋巴球の長期間インビトロ−培養を促進
しくマイトジェネーシス】、そして過去においては、マ
ウス、ラット、またはヒトの淋巴球細胞をマイトジェン
で刺激することで生産されて来た。

マウス、ラットおよびヒトの正常Ｔ−淋巴球より精製さ
れたＩＬ−２１″を種々の型の生物活性を示すことが分
った。そして、Ｔ−細胞の消失の場合やまたある種の形
状の癌において細胞毒性のあるＴ−細胞の形成を刺激す
るのに有用である（ＪｏｕｒｎａｌＯｆ　’ｒｈｅ　７
Ｂｎｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＡＢＢＯＣｉａｔ
ｉＯｎ、　ＶＱｌ。

２４９．１６６−１７１頁（１９８３年１月１４日〕。

誘導されたヒト悪性腫瘍細胞に由来するヒト工Ｌ−２は
、最近、複数の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＯ
）段階を用いて均質にまでＮＭされた。（Ｓ、　Ｓｔθ
ｒｎ、蛋白質、ペプチド、およびポリヌクレオチＶのＨ
ＰＬＯについての第３回シンポジウム、１９８６年１１
月り１ａ−１＜５日、モンテカルロ、モナコ。標題：ポ
リペプチド分離のための逆相担体：ヒ）Ｔ−細胞白血球
よりの工Ｌ−２の精製均質化）。精製されたヒトエＬ−
２は、抗原特異的エフェクターチー淋巴球の長期インビ
トロ−培養を促進しそして淋巴球の活性を調節する強い
活性を示す。最終的には５００．０００倍に精製され、
約１０’［Ｊ／■の比活性を有し、アミノ酸組成はりぎ
の工うである。

ＡｓＸ　１２．４　Ａｈａ　５．９　Ｔｙｒ　３．０Ｔ
ｂｒ　１１．６　ｃ７ｓ　３．６　Ｐｈｅ　５Ｊ３Ｓｅ
ｒ　７．４　Ｖａｌ　４Ｑ　Ｈｌｓ　３．８ａｌｅ　１
６．５　Ｍθｔ　４．０　Ｌｙｅ　１０．＋ｌ５Ｐｒｏ
、　７．４　工１ｅ　８．５’　ｐ、ｒｇ４．９ａ’ｌ
ｙ　２．４　Ｌｅｕ　２０．８Ｔｒｐ　Ｎ、Ｄ。

日本、東京、癌研究所の呑口博士は、ペンシルバニア、
フィラデルフィアの第６回組換えＤＮＡ　会議都会で、
ＩＬ−２遺伝子のクローン化および配列決定およびヒト
インターロイキン−２の未成熟型の発現について報じた
（１９８３年２月９日）。

工Ｌ−２蛋白質アミノ酸配列が由来するＣＤＮＡは、（
！Ｏｎ　Ａを用いて誘導されたＪｕｒｋａｔ細胞より得
られたｍＲＮＡより得られた。ＣＤＮＡクローンの全長
は８００塩基対長で１５３個のアミノ酸をコードする。

呑口博士は成熟工Ｌ−２蛋白質のアミノ酸配列および先
行するシグナルペプチドの配列を提出したが、成熟した
形の蛋白質を直接九発現しうる遺伝子に天然遺伝子を変
換することについてなんら示唆していない。さらに、ア
ミノ末端近くでのＤＮＡ配列上の便宜な制限サイトにつ
いてなんら留意されていないことは注目すべきである。

１９８３年６月２４日、呑口等は、Ｎａｔｕｒｅ　３　
Ｑ　２．３０５−’−３１０１Ｃ、ヒトＩＬ−２のクロ
ーン化ＣＤＮＡの構造および発現について報じた。

本発明の要約 本発明はヒトインターロイキン−２およびそれの製造方
法に関する。より具体的には、本発明は、−成熟ＩＬ−
２をコードする構造遺伝子、−それぞれにエンドヌクレ
アーゼ認識サイトの部分を表わす、付着末端を有する、
成熟ヒトエＬ−２をコーｒする２本鎖ポリデオキシリボ
ヌクレオチｒ１ 一形質転換微生物中で、成熟ヒトエＬ−２を発現しうる
、複製しうる微生物用発現ビヒクル−これらの発現ビヒ
クルで形質転換された微生物 −配列の第１のアミノ酸としてメチオニンを有する成熟
ヒトエＬ−２（Ｍｅｔ−工Ｌ−２）および−成熟ヒトエ
Ｌ−２をコーＶする構造遺伝子および発現ビヒクルを調
製し、形質転換された微生物中でそれを直接に発現さす
ための方法を提供する。

成熟ヒトエＬ−２をコードする構造遺伝子を調製する方
法は、 ａ）　適正の配列で結合された時に、成熟ヒトエＬ−２
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ鎖を与える、第１の
１連のオリゴデオキシリボヌクレオチーフラグメントを
調製する； ｂ）　適正の配列で結合された時に、上記のコード鎖に
対して相補的なりＮＡ鎖を与える、第２の１連のオリゴ
デオキシリボヌクレオチーフラグメントを調製する； ０）第１と第２の１連のフラグメントσ〕相互に相補的
な部分のあいだに水素納会を形成させ、２本鎖構造とし
、そして ｄ）　ＩＪビデ−ョンによりそれぞれの鎖を完成させこ
とを包含する。

最後に、本発明は、発酵プロスより、組換え法による望
む成熟ヒ）　ＩＬ−２を分離し精製し、細菌蛋白質を本
質的に不含でそれ故治療剤として適当なヒトエＬ−２を
提供することを包含する。

図面についての記載 第１図は、バクテリオファージラムダＰ、Ｌ７″口モー
ターにより、遺伝子の発現がプロモートされる、有利な
、クローン化し発現するためのベクターをみちびくプロ
セスを記載した模式図である。

ｐＲｃ　２３　ト同ボされる（ｍのベクターは、”　ｃ
　ｏｎｅｅｎｅｕｓ”（コンピューターで算出）リボゾ
ーム結合サイト含有合成オリゴヌクレオチド（５ｃｈｅ
ｒｅｒ　等、ＮｕＱｌｅｉｏ　Ａｃ１ａｓ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　８　、３８９５（１９８０））をＰＬプロモー
ターを含有する２　５０　ｂｐ　Ｂｇｌ　ｕ　−Ｈａｅ
　ｉｌｌフラグメントに連結させ、連結生成物をプラス
ミドｐＲａ　２に挿入することで構築される。発現ベク
ターｐＲ０２５の構築についてのさらに詳細はヨーロッ
パ公開特許願９９０８４をみられたい。

第２図は両方の端に制限二ンＶヌクレアーゼ末端を有す
る、成熟ヒトエＬ−２をコーＰする２本鎖遺伝子を示す
。この遺伝子は発現ベクターにじかに挿入するのに適当
である。

第６図は、成熟ヒトエＬ−２のアミノ酸配列を、それを
コードするＤＮＡ−配列とあわせて示す。

第４図は、工Ｌ−２に対する合成構造遺伝子の制限地図
を示す。合成遺伝子を形成するコＶンを適当に選択する
ことにより、構造遺伝子全体を通して、天然遺伝子とは
区別しうる実質数の制限サイトが実現される。

第５図は、制限サイト末端を有する、成熟ヒトエＬ−２
のための合成遺伝子の構築に用いられる、１連の４０オ
リゴデオキシリボヌクレオチドフラグメントを示す。奇
数を１ジしたフラグメントはコーー鎖で、偶数を付した
のは相補鎖である。

第６図は、成熟ヒトエＬ−２の合成遺伝子のアミノ末端
の構築を示す。この部分はフラグメント１−２４の段階
的連結で得られる。

第７図は、成熟ヒトエＬ−２の合成遺伝子のカルボキシ
末端の構築を示す。この部分はフラグメント２５−４０
を用いて構築する。

第８図は、成熟ヒトエＬ−２の合成遺伝子のアミノ末端
およびカルボキシ末端フラグメントの連結を示す。６塩
基の突出部分を用いて連結させる。

第９図は、親プラスミｙ　ｐＲｃ２３より始めて、成熟
ヒトエＬ−２を発現しうる組換えプラスミＰ構築のため
の流れ図を示す。第８図に得られるヒトＩＬ−２の遺伝
子ｔよプラスミドに挿入する。Ａｍｐｒはアンピシリン
抵抗性の遺伝子を示す。種々のエンドヌクレアーゼ制限
サイトの相対的位置を示す。

１）ＲＯ２３にふつうに見出だされるテトラサイクリン
抵抗性遺伝子（Ｔｅｔｒ）は、Ｓａｌエサイトにおいて
制限切断するときに除かれる。それで、スクリーニング
のためＫは、組換えプラスミｒはアンピシリン抵抗性の
みを示す。

第１０図は、オリゴヌクレオチド合成に用いる固体担体
ホスファイト法に用いるがラス担体への負荷を模式的に
示す。操作は、ＭａｔｔθｕＣＣ１および０ａｒｕｔｈ
ｅｒｓ、　Ｊ＋　Ａｍ、　Ｏｈｅｍ、　ｓｏｃ、　１０
３　＃　３１８５（１９８１）の応用である。

第１１図は、固体担体ホスファイト法を用いるオリゴヌ
クレオチげ合成を模式的に示す。

第１２図ｒｊ１固体担体よりオリゴヌクレオチｐを除保
護しそして放出さすことを模式的に示す。

第１６図は、オリゴヌクレオチｒ製造のための固体担体
トリエステル法で用いる官能基中間体の名称を示す。操
作は、Ｄθｍｔ）ｅｋ等、Ｊ、　Ａｍ、　Ｏｈｅｍ。

ｓａｃ、　１０３　、７０６　（１９８１）の応用であ
る。

第１４図は、固体担体トリエステル法によるオリゴヌク
レオチド構築で用いる反応スキームの模式図を示す。

本発明の詳しい記載 成熟ヒ）　ＩＬ−２をコードする遺伝子の調製遺伝コー
ドに従いコドンを選び成熟ヒトインターロイキン−２を
コードする合成するＤＮＡを選択しうる。調製および精
製が容易のように、たとへば約１８から約２４ヌクレオ
チドのオリゴデオキシヌクレオチドをそれぞれ別々に調
製し、組上げて望む配列とする。第１の系列は、適正な
配列に結合すると、成熟ヒトインターロイキン−２の発
現のためのＤＮＡコード鎖を与える。（第５−７図のフ
ラグメント１．３，５．７．９．１１，１３゜１５．１
７，１９．２１，２３，２５．２７゜２９．３１．３３
，３５．３７および６９をみょ）。

第２の系列は、やはり適正に結合する時に、コード鎖に
相補的な鎖を与える。（第５−７図のフラグメント２．
４．６．８，１０，１２．１４゜１６．１８．２［１，
２２，２４，２６，２８゜３０．３２．３４．３＜Ｓ、
３８および４０をみｊ４それぞれの鎖のフラグメントハ
、フラグメントブロックの付着末端の水素結合で、相補
性が組上げを促進するようになるべくは重ね合わせる。

なるべくは２段階で組上げたあと（第６および７図をみ
よ）、第８図に示すような従来法で連結させて構造遺伝
子を完成する。

遺伝コードは縮重しているので、同じ化合物をコーＶす
るのＩｃ異なる合成構造遺伝子を構築しうる。しかし、
さしあたりの目的では、微生物ケ９ツムの発現において
有利なことの知られているコドンを大部分用いる。たと
へは、Ｅ、　（！Ｏ１ｉに有利なコドンを酵母での発現
に有利なコドンと１Ｃ深く組合わせれば、遺伝子は細菌
と酵母の両方のベクターでの発現に適当となろう。遺伝
配列の選択により、また、その後の分析を容易にする便
宜な制限サイトが提供される。さらに、成熟ヒトインタ
ーロイキン２に対する選択した配列は、組上げの際に、
オリゴヌクレオチドの適正な連結を妨害するかもしれぬ
、自己相補性および繰返しの配列のないように、コンピ
ュータースキャンニングして確かめておく。

、）Ｃ０ｃｏｌｉ中での発現のためには、インターロイ
キン−２ボリペゾチドのコーー配列の前方にＡＴＧ開始
コドンなおき、あとに、ひとつだけのＴＧＡ翻訳停止コ
Ｖンをおく。発現ベクター中への挿入に便宜のように、
遺伝子の始めと終りにＢａｏ１’を工末端をおく。発現
ベクターへの挿入のための別のサイトとして、そして１
度クローンされたあとの遺伝子の迅速Ｍａｘａｍ−Ｇ１
１．ｂθｒ配列決定を容易にするために、コーＰ配列に
つづいてＢａ１エサイトも含ませた。

発現ベクターの調製 宿主細胞中で複製できそしてそれを形質転換］−うるシ
ラスミｒ１ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列は、本
明細書中では発現ベクターと称［７うる。

これらのベクターは、ＤＮＡの本質的な生物学的機能だ
とへば複製、コート蛋白質の産生またはプロモーターま
たはりボデーム結合サイトの欠失を伴なわないで、あら
かじめ定められた様式でＤＮＡ配列が切断されるエンド
ヌクレアーゼ認識サイトまたは制限サイトのひとつまた
は少数の存在を特徴とし、そして、形質転換された細胞
の同定に用いるのに適当なマーカーだとべばアンピシリ
ン抵抗性を含有する。

本発明の実施に用いて有利な発現ベクターは、ハイプリ
ｒリボゾーム結合サイトを合Ｍ１−る。それよりハイプ
リＦ　ＲＢＳの白米するリボ・ｌ−ム結合サイト（ＲＢ
Ｓ　）は、ＤＮＡによりコードされるＲＮＡ配列を含有
する。ＲＢＢ　Ｖｉ宿主細胞中での翻訳の開始に必要で
、そして、本質的に、（１）アミノ酸メチオニンのため
のＡＴＧ　ＷＡ訳開始コーン（既知のＥ。

Ｃ０１１遺伝子生成物はすべて、アミノ酸メチオニンで
始まり、これは、あとから除去してもよいしく２なくて
もよい）；（２１シャイン−ダルガノ配列（Ｓ−Ｄ配列
）として知られろ、１６ＳリボゾームＲＮＡの３′末端
の塩基に相補性の３から９個の塩基配列（Ｎａｔｕｒｅ
２５４．３４（１９７５）１７およびリンカ−領域とし
て知られるこれら２つのあいだに存在する塩基配列より
本質的に成立つ。

本発明の有利な具体例を形成する発現ベクターは、バク
テリオファージラムダ−ＤＮＡより分離されｔｅｔＲと
ａｍｐＲの遺伝子のあいだに挿入されたＰＬプロモータ
ーを官有するシラスミｙ　ｐＢｕ　３２２の誘導物であ
る。ＰＬは、ラムグーＣＩレプレッサーで、効率的にそ
して具合よく調節されうる非常に強いプロモーターであ
るので選択された。このレプレッサーをコーｐする遺伝
子は、変異Ｃ工ｔ６２またはＣ工ｔｓ８５７を＠有し、
これがレプレッサーを温度感受性とする。３０°Ｇでレ
プレッサーは正常に機能し、そして約６７°０から約４
２℃までで不活化される。それでＰＬ７１″ロモーター
は、３００Ｃでレゾレス（ターン−オフ）され、４２℃
で脱レゾレス（ターン−オン）される。ＰＬ７″′ロモ
ーターを調節しつる能力から、遺伝子生成物の発現なし
に約５０℃から約６６°Ｃで培養物を発育させ、至適の
時点で温度を約３７から４２℃に移して、望む成熟ヒト
エ’Ｌ−２を生産させうる。

本発明で用いる有利なベクターは、ＳＤ配列に対して末
端の方向に（６′一方向に向けて下流に）ＨｃｏＲｘ制
限サイトも含有する。それで押々のハイプリｙ　ＲＢＳ
を構築する手段を与える。ＩＬ−２コーＶ遺伝子のＡＴ
Ｇコーー配列ＫＳＤ配列を結合するのに、Ｅ（！ＯＲエ
サイトを用いてハイデリドＲＢＳをひとたび構築した時
、それは、ＥＣ０ＲＩ処理、Ｋ１θｎｏｗポリメラーゼ
エで末端をみたし、生ずる２つの端をＴ、ＤＮＡ　ＩＪ
ガーゼで平滑末端連結することにエリ、さらに変型しう
る。

本発明により提供される成熟ヒトエＬ−２に対する新規
構造遺伝子と組合わせた別の発現ベクターを用いるため
に、他のコントロール要素を用いることも、この方面の
技術で可能である。必要なシラスミｙ中への遺伝子の挿
入を可能とするＩｃは、明らかに、末端にある粘度の変
型が必要となりうる。本発明のもつとも広義の特徴に従
す細菌中に用いるに適当なシステムには、１ａＣプロモ
ータ−オペレーターシステム、アラビノースオペロン（
ファイ３　Ｑ　ｄａｒａ　）またはコリシンＥｌ、ガラ
クトース、アルカリホスファターゼまたはトリプトファ
ンオペロンがある。さらに酵母にお込て発現さすの［Ａ
ＤＨシステムを用いうる。

微生物 形質転換に適当なものとして、この方面の技術で、多数
の単細胞微生物が知られている。特に、細閑、かびおよ
び藻類がある。形質転換ＫＮ利な生物には、Ｅ、Ｃ０１
ｉＯ株、バチルス、たとへばＢａａｉ’１ｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｉｌｉｅおよび類似のものがある。形質転換に有利
な微生物にさらに酵母がある。

本発明の有利な具体例において、形質転換を受けるに用
いる微生物として、英国特許公報Ａ２０５５３８２　ｈ
ｖＬｙ己載）ｘうなに、　ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株２９
４がある。この微生物の株はｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　
’ｒ７ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔ土０ｎＫ
１９７８年１０月２８日に寄託されＡＴＣｃＡｃｃｅｓ
ｓｉｏｎ　Ｎｏｓ　。

３１４４＜Ｓおよび３１　、ｉ４８を受けている。

Ｂ、ｃｏｌｔ　ＭＡ　２１０またはＲＲ工のような他の
適当なＬ　ｃｏｌｉ株も用いつる。

本発明をさらに実施例により説明する。

列１ １コンセンサス”ＲＢＳ（Ｓｃｈｅｒｅｒ等、Ｎｕｃ：
ｔｅｉａＡａｓｄｅ　ｎｅｓｅａｒｃｈ、　ｆ３　、３
８９５　（１９８０）　ｌ）をｆ有する会成オリゴヌク
レオテｒを、ラムダＰＬフロモーターを含有する２　５
０　ｂｐのＢｇｌ　ｕ−Ｈａｅ　■フラグメントに連結
させ、連結生成物をシラスミ）Ｆ　ｐＲＯ２Ｋ挿入する
ことにより、第１図に示すよう罠、シラスミ’ｆ　Ｔ）
ＲＣ２３を構築した。この構築の詳細を下記する。

ラムダＰＬ７″′ロモーターを含有する２５０塩基対（
ｂｐ）　ＤＮＡフラグメントを分離するために、４ｂ　
ＯｂＰ　Ｅｇｇ　１１−　Ｈｐａ　ｌのＤＮＡフラグメ
ント（ラムダ−ＤＮＡ配列の１９８１年１１月パージョ
ンの１）Ｉ）Ａ３５２６０から３５７１０まで）の１μ
ｇをＨａｅ　ＩＩＩで消化し、生成物を５チポリアクリ
ルアミド中調製用ゲル電気泳動で分離した。約２００ｎ
ｇの２５Ｑ　ｂｐ９）Ｂｇｌ　■−ｎａｅｌｌＩフラク
メ７　トｕｓ第１図に示した合成オリゴヌクレオチＰの
それぞれの６０　ｐｍｏｌｅに連結させた。これらの合
成オリゴヌクレオチＶは、５Ｏｈｅｒθｒ等（上記引用
）のコンピューター分析で得られた“コンセンサス”リ
ボゾーム結合サイト配列の大部分を含有する。連結され
た分子は（オリゴマー除去のためＩｃ　）ＢｇｌＩＩお
よびＥＣＯＲ工で消化し、ｒルミ気泳動で精製した。

連結された生成物は、ついで、ＢｇｌｌｌおよびＢ２ａ
ｏＲ工でやはり消化されたｐＲｏ　２中に連結させた。

］）ＲＣ２は、ＢｃｏＲエサイトに隣接してＢｇｌｌｌ
の位置するｐＢＲ５２２の誘導体である（第１図をみよ
）。

標準方法を用いて菌株ＲＲＩ　（ｐＲＫ　２４３　ＣＩ
ｔｓ）を形質転換し、′５０°Ｃで、アンピシリン（５
０μｇ／ｍｌ）！！培地中で選択した。５０個の形質転
換物を得、これらのうちの８個よｐ　ＤＮＡを分離し、
Ｈｌｎａ　■で消化して分析した。８個のうち６個が予
期された制限パターンを示し、これらのうちのひとつの
Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔヌクレオチド配列分析で、
予期された構成（Ｉ）ＲＣ！　２３と称する）が確かめ
られた。

ＷＪ６図に示すように、オリゴヌクレオチドは２段階で
組上げた。オリゴヌクレオチ）’１−２４を、第６図に
示したスキームで連結させ、■Ｌ−２遺伝子のアミン末
端部分であるフラグメントエＬ−２Ｎとした。同様に、
第７図に示すように１遺伝子のカルボキシ末端部分であ
る工Ｌ−２０を生成さすのにオリゴヌクレオチー２４−
４０を連結させた。

上記の連結のための具体的操作を下記する。

５０　ｍＭのＴｒｉｅ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５、）、１０
　ｍＭのＭｇＣｌ２．０．１１ｎＭのＥＤＴＡ　、　５
　ｍＭのＤＴＴ　、　０．１　ｍＭのスペルミゾｙ　−
ＨＣＩ、１２．５　ｍ（１）ＡＴＰオヨ（Ａ３７．５μ
Ｃ〔γ−５２ｐ　：ｌ　ＡＴＰ　（担体不含）を含有す
る１０μｌの反応混合物中で６７℃で３０分、５単位の
ポリヌクレオチドキナーゼで処理し合成フラグメン）１
−４０のそれぞれの２０　ｐｍｏｌｅをリン酸化する。

６５℃に５分加熱し、ついで５μｍの０．５　Ｍ　＋７
）　ＫＤＴＡ　、　５　、ｕｌの１０＋ｖ／ｍｌのｔＲ
ＮＡおよび１９０μｍ０５Ｍの酢酸アンモニウムを加え
て反応を止める。核酸はエタノール沈殿させ、２００μ
ｍ００．６Ｍ酢酸ナトリウノ・に再懸濁させ、エタノー
ルで再沈殿させ、減圧テ乾燥し、１ｍＭのＴｒｔｓ　（
ｐＨ７，４）　、０．１ｍＭのＥＤＴＡ　（０，Ｉ　Ｘ
ＴＥ）の１０μＩＩＣ再懸濁させる。

工Ｌ−２遺伝子の２つの部分（工Ｌ−２Ｎおよび工Ｌ−
２０）を、第６および７図に示したスキームで別ｋｔｆ
−組上げろ。５　Ｑ　ｍＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ７，４）
、１１０ｌＴｌのＭｇＣｌ２．１３　ｍＭのＡＴＰを含
有する反応混合物中４単位のＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガー
ゼを用いて１５０Ｃで６０から６０分かけて、各８ｐｍ
０１θのリン酸化オリゴヌクレオチＶを連結させる。配
列を連結させたあと、追加して２００単位のりガーゼを
加え、４°Ｃで２日インキュベーションを続ける。連結
反応は６５℃で５分加熱して止め、氷上で冷却する。連
結分子はＢｃｏＲ工で消化し、エタノール沈殿させ、８
％ポリアクリルアミｒｒル上で電気泳動して分ける。Ｉ
Ｌ−２遺伝子のＮ−末端部分を含有する２５０ｂｐ生成
物およびＣ−末端部分な含有する１７０ｂｐ生成物を、
ダルより採取し、２度エタノール沈殿させ、乾燥し、Ｑ
、ｉ　ＸＴＦ！の１０μｍにＦ［濁させ、オートラジオ
グラフィーで同定する。

Ｅ、　０Ｏ１１中の工Ｌ−２遺伝子生成物の直接的発現
のために、工Ｌ−２遺伝子を含有するＢｃｏＨニー１３
ａｌエフラグメントを、ＥＩＣＯＲ工およびＢａｌ工で
消化した発現ベクター中に挿入する。ｐＲｅ　２３はＥ
ＣＯＲエサイトに隣接してバクテリオファージラムダ−
ＰＬプロモーターおよび合成ＳＤ配列を含有するｐＢＲ
３２２の誘導体である（第１図をみよ）。このＢｃｏＨ
エサイトにおいて工Ｌ−２配列を結合さすと、効率のよ
い翻訳開始のための非常に有利なりボデームー結合サイ
トを生成する。強力なＰＬグフローターよりの転写開始
は、低コピー数シラスミド１）ＲＫ２４Ｂ　ｏ■ｔｓに
よりコードされる温度感受性ＣＩレプレツザーで具合よ
くそして効率的にコントロールされろ。

上記の組換えプラスミドを構築するための具体的操作を
下記する。

精製された工Ｌ−２ＮおよびｘＬ−２ａフラグメントの
２μｍを、２００単位のＴ　４　ＤＮＡリガーゼを用い
、１０μｍの反応混合物中で１５°Ｇで１５時間かけて
連結させる。混合物を６５℃で５分加熱し反応を止め、
ついで氷冷する。連結分子は１ａｏＲ工および８ａｌ工
で消化し、ついで上記のように、ベクター１）Ｒｅ　２
３　（やはりＥ（！ＯＲ工および５ａｌＩで消化しであ
る）の２００　ｎｇに連結させる。連結混合物を用いて
、標準操作に従い株ＲＲ工（ｐＲＫ２４８Ｃ工ｔｓ）を
形質転換する。アンピシリンを含有する培地上（５０μ
ｇ／ｍｌ）上で転換物を選択する。期待されたように、
ベクター中に挿入された工Ｌ−２配列を官有する形質転
換物は、分離されたプラスミドＤＮＡの制限分析で決定
する。発現ベクター中にクローン化された金工Ｌ−２コ
ード配列は、ついでＭａｘａｍ−Ｇｉｌｔ）θｒｔヌク
レオチド配列分析でたしかめる。

クローン化された合成ＩＬ−２遺伝子の発現を試験する
ために、２つのアプローチをとる。

１）Ｉ）ＲＯ２３／工Ｌ−２でコードされた翻訳生成物
（細胞不含）を分析する、そして、 ｚ）ｐＲａ２３／工Ｌ−２を含有する誘導細胞をＩＬ−
２生物活性を分析する。これらの実験の詳細を下記する
。

１）精製ｐＲａ　２５　／工ＩＪ−２　ＤＨＡ　Ｃ対照
ＤＮＡも平行して）を、５５Ｓ−メチオニンを含有する
カップルさせたインビトロ−転写−翻訳システム［Ｋｕ
ｎｇ等、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｊ、０ｐｈ
７１Ｌ　１９５　ｓ　３９６（１９７９））に加え、生
成物を５ＤＢ−ポリアクリルアミｒゲル電気泳動で分析
しついでフルオログラフィーに処する。

２）株ＲＲ工（：Ｉ）ＥＬＫ　２４８　ｃ工ｔｓ　、　
１）Ｒｅ　２３／工Ｌ−２）をＭ９−グルコース培地中
で発育させ（６０℃）、約２×１０８細胞／　ｍｌ　ト
Ｌ、”）イテ４２°（、Ｃ２時間訪誘導る。ｌ　ｍｌ試
料を取り細胞を遠心して集める。細胞は、５０　ｍＭの
Ｔｒｉｓ　（ｐ８７．４　）、１０チスクロースの５０
μｍ中に再懸濁させ、ドライアイス／エタノール浴中に
急に凍らす。細胞は融解させ０から４°ＣＫ保つ。浴解
混会物（１谷鼠の５ｍのｇｃｌ、　１容皺の０．５Ｍの
ｚ：ｏＴＡ、１容敏の１Ｍのスペルミジン−ＨＣｌおよ
び２容量の５１ｎｇ／ｍ１リゾチーム）の５μｍを加え
、氷上に３０分おいてから、６７℃で２分インキュベー
トする。凍結−融解をもう１度おこない溶解を完了する
。細胞のかすを遠心除去し、溶解物はドライアイス／エ
タノール浴中ですみやかに凍らす。Ｇ１１ｌｉｓ　ｆｌ
、Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．１２０　、２０２７　（１９７
８）の方法によりＩＬ−２生物活性を分析する。

溶解物よりの成熟ヒトエＬ−２の精製は、この方面でよ
く知られているクロマトグラフィー操作で行ないうる。

このような操作には、工ＩＪ−２ポリクロナルまたは七
ノクロナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフ
ィー、カラムクロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＯ−
操作（上記のＡ、　５ｔｅｒｎの文献）がある。このよ
うなりロフトグラフィー法の組合わせも用いうる。この
ようにして、治療のための投与形態に用いるＶＣ４当な
均質な形状の組迦え成熟ヒトエＬ−２をうろことができ
る。

発現された組換え法による蛋白質は、アミン末端アミノ
酸としてメチオニンを有しうる。しかし、宿主微生物中
に酵素が存在すると生成物より、メチオニンが部分的に
または完全にさえも除かれつる。

列２ ６′−〇−スクシニルヌクレオチＶ製造の標準方法５′
−〇−ジメトキシトリチルお上びＮ−保膿デオキシヌク
レオシ）−”（２，５ｍ・ｍｏｌｅ　）を乾燥ピリジン
（５ｍｌ　）お上びＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（
０，３，！￥）に溶解する。無水コハク酸（２，Ｏｍ・
ｍｏｌｅ　＋　０．２１１　）を加え、溶ｔｉ、は室温
で２４時間かくはんする。反応を完了したら浴媒を減圧
で蒸発させ、乾燥ゴム状物にトルエンを加え（１３ｍｌ
各回］蒸発さすことを２度反復する。残買物は塩化メチ
レン（３０ｍｌ）に溶解し、浴液はくえん酸（水冷）で
抽出する。有機相は各１５ｍ１の水で２度洗う、そして
無水硫酸ナトリウムで乾燥する。生成物の脱トリチル化
を避けるには、上記の塩化メチレン浴液に約Ｑ、３ｍｌ
のピリジンを加える。塩化メチレン溶液は約１０ｍ１に
濃縮し、ヘキサン／エーテル（１：Ｉ　Ｖ／Ｖ　；　２
５０ｍ１）で沈殿させてスクシニル化ヌクレオシドを分
離する。

沈殿を濾取し減圧乾燥する。

例３ スクシニル化ヌクレオシＶのｐ−ニトロフェニルエステ
ル製造のための標準法 第１０図に示すように、スクシニル化ヌクレオシド（１
ｍ・ｍｏｌｅ　）をピリジｙ（０，３ｍ１）を含有する
乾燥ジオキサン（３ｍｌ　）に溶解する。上記溶液にジ
シクロへキシルカルボジイミｐ（ＤＯＯ。

約５ｍ１ｒｎＯ］、ｅ　＃　９００　＃　）およびｐ−
ニトロフェノ−ｋ　（０，２２Ｊｉ’　、　１ｍ、ｍｏ
ｌｅ　）を加える。溶液は２時間かくはんし、ジシクロ
ヘキシル尿素の沈殿は遠心して除く、上清はそのままつ
ぎの例に記載するように樹脂へのカップリングに用いる
。

例４ 固体担体ホスファイト法のだめのスクシニル化ヌクレオ
シＰの樹脂への縮合 ｐｌｅｒｃｅ　ａｐＧ／ｂｏｎｇ　ａｈａｔｎアルキル
アミンの孔の大きさの調節されたガラス担体（孔の直径
５００Ｘ　）ｃｏ　２５　ｍｌ（約１０９）を２５ｍ１
の乾燥ジメチルホルムアミドに懸濁させる。スクシニレ
ート化ヌクレオシＶのｐ−ニトロフェニルエステルを含
有する浴液な上記懸濁液に加える。混合物は２４時間ふ
る。誘導体化した樹脂を分け、乾燥ＤＭＦ　（５０ｍｌ
宛６回）、ジオキサ７　（５Ｑ　＋ｎｘ宛５回）、メタ
ノール（３０ｍｌ宛６回）で洗い、最後に無水エーテル
（３０ｍｌ宛６回）で洗う。

未反応のアミノ官能基があれば、それは、乾燥ピリジン
（２５ｍｌ　）、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（２
５０■）および無水酢酸（５ｍｌ　）の溶液と担体とを
２時間室温で反応させてふさぐ。

固体担体を濾取し、メタノール（３０ｍｌ宛５回）、お
よび無水エーテル（５０ｍｌ宛２回）で順次に洗う。

担体上のヌクレオシＰ負荷の測定 ヌクレオシｒ負荷樹脂の約１〜試料を、アセトニトリル
（１ｍｌ　）中０＋Ｉ　Ｍのトルエンスルホン酸で処理
する。赤オレンジ色の樹脂より遊離するトリチルカルボ
ニウムイオンを集めアセトニトリルで適当に希釈する。

このような測定を平均４回して担体上の負荷の程度をめ
る。いくつかの異なる樹脂負荷実験で得られる負荷の範
囲は、２２−２５μｍｏｌｅヌクレオシ？ヌクレオシ？
／＆固。

例５ ヌクレオシドの５′−〇−ジメトキシトリチルー６′−
〇−ホスホロアミダイトの標準的調製第１１図に示すよ
うに、Ｂｅａｕｃａｇｅおよびｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２　、１
８５９（１９８１）の操作に従い、５′−〇−ジメトキ
シトリチルヌクレオシＹ　（５ｍｍｏｌｅ　）の試料を
、乾燥、酸不含クロロホルムに溶解する。この溶液にジ
インプロピルエチルアミン（２，７４ｍｌ、　１５．７
４ｍｍｏ］−ｅ　）を加え、ついで、１−２分をかけて
ジメチルアミノーメチルホスホノモノクロリダイト（Ｏ
Ｈ３０Ｐ（Ｃ１）　Ｎ（（！Ｈ３）２’）を序々に加え
てゆく。混合物は１７５　ｍ１０計叡エチルを用いて分
液口斗に移す。有機混合物は飽和食塩水（７５ｍ１＃　
４回）で抽出する。酢酸エチル相は硫酸ナトリウムで乾
燥する。溶液は根細して油状とし、無水酢酸エチルに再
溶解し、５０　ｍｌの溶液とする。この溶液は、あらか
じめ冷却（氷−アセトン温度）したｎ４種類のヌクレオ
シｒ誘導体のすべてについて約８０−の収率が得られた
。ジメチルアミノホスホロアミダイトの試料はマイナス
１４°Ｃでアルゴン中に保存した。

例６ ホスファイト法によるフラグメントＡａ１０５′−ＡＡ
ＴＴＯＴＡＴＧ（）ＯＴＯＯＧＡＯＴＴ　−３’の固体
担体合成段階１　：５’−ｏ−ジメトキシトリチルチミ
ジン負荷ガラス担体（４３５ｑ、２０μｍ０１ｅノジメ
トキシトリチルチミジン７１９の担体）を０．２Ｍのジ
クロル酢酸（２ｍ１ジクロメタン中）で、懸濁液を１．
５分振る方法で脱トリチル化する。担体はジクロルメタ
ン（５ｍｌ　、　２回）で洗う。ジクロルメタン処理を
数秒反復し、脱トリチル化を確実に完結さす。

担体はつぎのように順次に洗う。

ａ）ジクロルメタン中１ｑｂトリエチルアミン（５ｍｌ
　ｍ　２回） ｂ）　無水アセトニトリル（９ｍｌ−、３回）。

段階２ニジメトキシトリチルチミジンのジメチルアミノ
ホスホルアミダイト誘導体の溶液（２ｍｌの無水アセト
ニトリル中１００μｍｏｌｅ　）を担体に加えついでテ
トラゾール溶液（２ｍｌ中２５０μｍｏｌｅ）を加える
。懸濁液は２分振り、減圧濾過し、無水アセトニトリル
で洗う（４Ｘ５ｍｌ）。

段階３：約１０ｍｇのＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン
を含有するピリジン中無水酢酸（０，４ｍｍ１の２ｍｌ
溶液を担体と２分間振り、未反応のヒｒロキシル官能基
をふさぎ、ふさいだ担体はアセトニトリル（４回、　５
　ｍｌ　）で洗う。

段階４：ヨー素（０，２Ｍ　）のテトラヒドロフラン／
水／２．６−ルチジン（２：　１　：　１　ｖ／ｖ）中
浴液をふさいだ担体と０．５分振り、無水アセ）ニトリ
ル（６回、　５　ｍｌ　）で洗い、そしてジクロルメタ
ンで洗う（２回、　５　ｍｌ　）。

段階４の生成物を用いて段階１を反復する。ついで、５
′−〇−ジメトキシトリチルデオキシシテジンのホスホ
ロアミダイト誘導体を用いて反復する。段階６および４
をついで反復する。

それぞれ順次にヌクレオシド誘導体を加えて、段階１か
ら４までのサイクルをくり返してゆく。

デオキシアデノシン（（ｉＡ）　＃デオキシグアノシン
（ｄＧ）　＃デオキシシチジン（（１（３）　、　（ｔ
ｏ　、チミジン（Ｔ）　、　ａＱ、ａ（Ｂ、ａＧ、’ｒ
、　ｄＡ、Ｔ、（１０、Ｔ、Ｔ、　ｄＡおよびｄＡの相
当するホスホルアミｒｎ導体をそれぞれに加えてゆき、
５′一方向に鎖を延ばしてゆく。

そして膳むフラグメントとする。

例７ 担体よりのオリがヌクレオチＶの脱保護および遊離 例６で得られたオリゴヌクレオチｒ結合担体の試料（１
５０■）を、１．４−ジオキサン（０，２５ｍ１）０．
２５　ｍ’ｌの無水トリエチルアミンおよび０．１２５
ｍ１チオフエノールの混合物で室温で６０分処理する。

樹脂を濾取し、メタノールで洗い（４Ｘ　２　ｍｌ　）
、５０℃で１７時間濃水酸化アンモニウムで水解する。

樹脂はペレットとし、上清は減圧濃縮し、水（１ｍｌ　
）　ＶＣ再溶解する。オリゴヌクレオテＶの溶液を０．
４５ミクロンのフィルターに通シ、ｃ１８逆相Ｍｉｃｒ
ｏｂｏｎｄａｐａｋを用いるＨＰＬＯシステム（Ｗａｔ
ｅｒｓ　Ａｅｅｏｃ、）で分画する。ｐ）（７，０，５
０℃、０．０５　Ｍのトリエチルアンモニウムアセテー
ト中１０−３０％アセトニトリルのグラジェントを用い
る。よく分離したジメトキシトリチル含有生成物を集め
、濃縮し、室温で０．５時間、８０％水性酢酸で処理す
る。酢酸を蒸発させたあと、試料を水に溶解し、エーテ
ル抽出しトリチルアルコールを除く。望むオリイヌクレ
オチｒをｆＷする水層な分け、ＨＰＬＯで純度を調べる
。均質な生成物をうるためＫは、この段階で第２の精製
が必要でありうる。純度の最終的基準として、変性条件
でアクリルアミ−ゲル電気泳動で５’、−３２ｐ−ラベ
ルオリゴヌクレオチＶを分析する。フラグメントのヌク
レオチＶ配列は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ　ｂｅｒｔ法、Ｐ
ｒ０Ｃ０Ｎａｔ１．　Ａｃａａ、　ｓｅｔ、　［ＩＳＡ
　７４　、５６０　（１９７７）でたしかめうる。

上記と同じアゾローチで、工Ｅｌ−２遺伝子のフラグメ
ント１３，１４．１５．１６．１７，１８゜１９．２０
，２１．２２．２３および２４の合成をする。

しｕ８ 工Ｌ−２遺伝子のノナデヵヌクレ芽チド（Ｌ（ＯＡＡＧ
ＴＴＯＴＡＣ！０ＡＡＧＡＡＧＡＯ）　７　ラグメント
３のホスホトリエステル固体和合成のための標準法この
的で化合物の番号はすべて第１６図および１４図に示す
ようである。この方法はっぎの段階を包含する。

ａ）−膜構造式（１＋および（２）の適当にブロックさ
れたモノ−およびジヌクレオチｒをそれぞれに合成する
。

ｂ）アミノメチルポリスチレン樹脂（５）を調製する。

Ｃ）　アミノメチルポリスチレン樹脂にスクシネート（
７）を負荷させ、未反応のアミン基は無水酢酸−ビリジ
ンでマスクする。

ｄ）京合体に担われたヌクレオシド（８）より、０Ｈ２
Ｃ１２中０．２Ｍジクロル酢酸（ＤＮＡ）で５′−ジメ
トキシトリチル基を除き、カッｆリング反応のための５
′−ヒｒロキシ官能基を有する樹脂（９）とする。

’３）　２ｆｔ体のトリエチルアンモニウム塩（１１ヲ
（９１、！：縮合させて重合体に担われたトリヌクレオ
チＶ圓とする。（９）よりの未反応５’−ＯＨ基はピリ
ジン中１０チ無水酢酸でマスクする。

ｆ）　（Ｉｌｌを０．２ＭのＤＯＡで脱トリチルし新し
く５′−ＯＨ基を生成させつぎのカップリングに用いる
。

上記の適当に保護された七ノー／ジヌクレオチドを、既
知の方法でほんのわづか改変するだけで合成する。５′
−ジメトキシトリチル−デオキシシチジン（６）の６′
−スクシネートは、Ｍｊｙ（Ｍｌｈｉ等、Ｈｕｃｌｅｌ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　８ｍ　５４９１　
（１９８０）により合成する。

アミノメチルポリスチレン樹脂（５） 市販品として入手しうるクロルメチルポリスチレン（１
％架橋、０，３２　ｍｍｏｌ／ｇＣ１ｍ　３０１　ｍ９
　ｍｍｏｌ　）およびカリウムフタルイミド（２，７７
／／　、　１５　ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　（２５Ｑ　ｍｌ
　）中に含有するスラリーな１２０℃に２０時間加熱す
る。樹脂は熱時濾過し熱ＤＭＦ　（２００ｍｌ）　、水
（４Ｘ５０ｍ１）、ジオキサン（３Ｘ８０ｍｌ）、エタ
ノール（３Ｘ８０１ｎｌ）そしてエーテル（３Ｘ　５０
　ｍｌ　）で順次に洗い、フタルイミＰ誘導体（４）と
し、これをエタノール（３５０ｍｌ）に懸濁させ、ヒＶ
ラジン（５ｍｌ）と５時間還流させる。反応混合物Ｉｒ
１ｍ取Ｌ、熱エタノ−ｋ　（Ａ　Ｘ　７　Ｑ　ｍｌ　）
　、熱ＤＭＦ（２Ｘ７０ｍｌ）、水（３Ｘ　７０　ｍｌ
　）、エタノール（３×７０ｍ１）およびエーテル（３
Ｘ８０ｍｌ）で洗う。ついで樹脂を乾燥しく　２８ｇ　
）アミノメチルポリスチレン（５）とする。ピクリン酸
滴定でアミノ基濃度０．２１　ｍｍｏ’ｌ／ｇである。

５′−ジメトキシ−６′−〇−スクシニルーデオキシシ
チジン（７）のアミノメチル樹脂（５）への負荷５ｇの
アミノメチル樹脂（５）を乾燥０Ｈ２Ｃ１２（３０ｍｌ
　）に含有するスラリーに、モノスクシネート（７）（
０，９７ｇ、　１．５ＩｎｌｎＯ１）、ＤＯＯ（０，９
２７、？　）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ
）　（５０ｍｇ）を加え、反応混合物は室温で４時間混
合する。樹脂（８）を濾取し、０Ｈ２Ｃ１２（４ｘ　１
５　ｍｌ）、ＭｅＯＨ（４Ｘ１５ｍｌ）、０Ｈ２Ｃ１２
（４Ｘ　１５　ｍｌ　）およびエーテル（３Ｘ１０ｍｌ
）で洗う。樹脂を減圧乾燥しく　Ｑ、１ｍｘＨｇ）　、
負荷されたヌクレオシｒの濃度ヲ、クロロホルム中１％
ＢＳＡ溶液中で担体から遊離するＤＭＴＯＨの吸収〔λ
ｍａｘ　４９８　ｍε９２１００〕を測定して定量する
。

樹脂（８）とあわせて存在する樹脂中の未反応アミノ基
をマスキングするには、混合物をＤＭＡＰ　（５０ｖＮ
ｉ）を含有する１０％無水酢酸−ピリジン（６０ｍｌ　
）と室温で３０分反応させる。ついで樹脂はＣＨ２Ｃ１
２、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２そしてエーテルで洗う。

負荷されたヌクレオシｒの濃度をふたたび上記のように
測定する。

ＣＨ２Ｃｌ２中０．２　Ｍジクロル酢酸を用いる樹脂（
８）の脱トリチル化 ジメトキシトリチル化されたヌクレオシドのそれぞれの
脱トリチル化に用いうる条件を表１に示す。代表的実験
はつき゛のようである一０小型カラム（１，３ｘｌＯｃ
ｒｒＬ）中で約６０秒、乾燥ｃｌ（２Ｃ１２（２ｍｌ　
）中で樹脂を膨潤させ、ついで１０ｍ１の０．２ＭのＤ
ＯＡと６０から４０秒振り、きわめて速く濾過し、そし
て０Ｈ２Ｃ１２（３−４Ｊｕｌ　）できわメチ速く洗う
。この操作を反復し、洗液がＤＭＴＯＨによる色を示さ
ぬ状態とする（表１をみよ）。洗液を集め、吸光値を測
定してＤＭＴＯＨの濃度を計る。これは、負荷されたモ
ノ−またはジヌクレオチｒの濃度を反映する。

脱トリチル化を完了したら、０Ｈ２Ｃ１ｚ中０．５Ｍの
Ｅ、３Ｎ溶液、ＯＨ，、Ｃｌ２（３Ｘ　１０　ｍｌ）お
よびピリジン（３Ｘ５ｍｌ）で樹脂を洗う。

表１ ＧＡ　２　ｉ体ｕｅと５′−ヒドロキシ−ポリスチレン
担体（９）とのカップリングによる重合体に担われたａ
ｈａ　３量体Ｕの生成 ピリジンで洗った５′−ビークキシ樹脂（９）　（５７
Ｗ　−０，０１ｍｍｏｌ）を高真空（０，００５ｍＨｇ
　）−ｃ。

カラム上に２分間ヒートガンより熱風を吹きつけること
により乾燥する。乾燥空気またはアルゴンを入れて真空
を注意して除く。ついで、ＧＡ２量体のトリエチルアン
モニウム塩ＧＯＩ　Ｃ０，０６ｍ　ｍｏｌ）のピリジン
溶液（０，７ｍｌ　）を樹脂に添加する。

ついでメシチレンスルホニル−６−ニトロ−トリアゾー
ル（ＭＥＩＮＴ）　（０，１８ｍｍｏｌ）を加える。カ
ラムは正しく栓をし５０分４０℃に加熱する。反応混合
物を濾過しピリジン（３ｘ３ｍｌ）で洗う。

樹脂とＤＭＡＰ　（１０ｍｙ　）含有１０％Ａｃ２ｏ／
ｐｙとを、室温で３分間反応させて未反応５’−ＯＨ基
をマスクする。樹脂を濾取し、ピリジン（２Ｘ　２　ｍ
ｌ　）、ｃ）ｔ２Ｃ１２（２ｘ　５　ｍｌ　）、Ｍ１３
０Ｈ（２Ｘ　５　ｍｌ　）そしてふたたび０Ｈ２Ｃ１２
（’；！　ｘ　５　ｍｌ　）で順次に洗いポリスチレン
重合体に担われたＧＡＯ３量体住υとする。

樹−脂に結合された６量体（Ｉｌｌの５′−ジメトキシ
トリチル基は上記（表１）のように０．２ＭのＤＯＡで
除去する。それより生ずる５′−説保換された、樹脂に
結合した６重体（１２１は、選択した２址体または単量
体を用いて各サイクルを反復し望む１９景体まで延ばす
。

脱ブロックおよび精製 最後のカップリング反応のあとで、Ｒｅｅ日θ等、Ｔｅ
ｔ、　ｂｅｔｔｅｒｓ　ｊ　９　、２７２７　（１９７
８）の操作に従い、室温で１５時間、８０％ジオキサン
−Ｈ２０中Ｎｌ、　Ｎ１．　Ｎ３．　Ｎ３−テトラメチ
ルグアニジウムピリジン−２−カルポキサルｒキシメー
ト（１ｍｌ　）の０．５モル溶液で処理する。溶媒を蒸
発させ、残留物は６０℃で８時間濃アンモニヤ（２８％
、　４　ｍｌ　）で処理する。遠心してから、上溝を約
Ｑ、５ｍｌの容置に濃縮し、これを０．０５Ｍ　（１）
　ＴＥＡＢ　（１，５ｍｌ）　ＶＣ溶解し、０．０５Ｍ
のＴＦｉＡＢを流動相に用いてＢｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　
−５０カラＡを通す。６ｍｌ宛の分画を集めＢθｃｋｍ
ａｎ　ＵＶ分光光度計モデル３４で吸光値を測定する。

生成物を廿Ｗｆｉ［１３０−４３を集メ１００．８０Ｄ
分をうる。この生成物の５００Ｄ分を、１２分をかけ、
７．５から３７．５％アセトニトリル（ＦＪ（７，８）
の直線状グラジェントを用い、ミクロボンダバク”１８
カラム上のＨＰＬＯで精製する。５１％　０Ｈ３ＯＮで
溶出されるビーク２はジメトキシトリチル生成物を含有
するので、これを集めて３０．２０Ｄ分をうる。

溶媒を蒸発させ、残留物は８０チ酢酸（２０分、室温）
で脱トリチルする。酢酸を蒸発させ、残留物ヲトルエン
（３Ｘ１ｍｌ）と共蒸発させ、残存酢酸を除く。残留物
は水（２ｍｌ　）　［溶解し、エーテル抽出しく　３　
ｘ　３　ｍｌ）　、Ｎ機不純物を除く。

水溶液は注意して濃縮して４００μｍとし、濾過し、７
．５−５７．５％アセトニトリルの直線状グラジェント
を用いるミクロボンダバク０１ＢＨＰＬｃカラムで精製
する。２０．６％アセトニトリルで溶出されるピークを
集め、７Ｍ尿素の存在するアクリルアミｖｒル上の電気
泳動でさらに精製する。もっとも移動の遅いバンドを緩
衝液で溶出し、５′−ヒＶロキシル基をγ（”Ｐ）　−
ＡＴＰでラベルしてから、得られた１９ヌクレオチーフ
ラグメントの配列をＭａｘａｍ−Ｇｉ１ｂｅｒｔ配列分
析で確かめた。

上記と同じ操作を用いて、工Ｌ−２遺伝子のフラグメン
ト２．４，５．６，７，８，９．１０゜１１　．１２，
２５．２６．２７．２８．２９゜３０．３１，３２，３
３，３４，３５．３６゜３７．５８．３９および４０を
合成した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バクテリオファージラムダＰＬ７１″ロモー
ターにより、遺伝子の発現がプロモートされる、有利な
、クローン化し発現するためのベクターをみちびくプロ
セスを記載した模式図である。 第２図は、両方の端に制限エンＶヌクレアーゼ末端を有
する、成熟ヒトエＬ−２をコー−する２本鎖遺伝子を示
す。 第３図は成熟ヒトエｒ、−２のアミノ酸配列を、それを
コーＶするＤＮＡ−配列とあわせて示す。 第４図は工ｒＪ−２に対する合成構造遺伝子の制限地図
を示す。 第５図は、成熟ヒトエＬ−２に対する合成遺伝子の構築
に用いられる１連４０個のオリゴデオキシリボヌレオテ
ドフラグメントな、制限サイト木端もあわせて示す。 第６図は、成熟ヒトエＬ−２の合成遺伝子のアミノ末端
の構築を示す。 第７図は、成熟ヒトエＬ−２の合成遺伝子のカルがキシ
末端の構築を示す。 第８図に、成熟ヒトエＬ−２の合成遺伝子のアミノ末端
およびカルボキシ末端フラグメントの連結を示す。 第９図は、親プラスミＩｓ　ｐＲｏ　２３より始めて、
成熟ヒトエＩＪ−２を発現しうる組換えシラスミｒ構築
のための流れ図を示す。 第１０図は、オリゴヌクレオチド合成に用いる固体担体
ホスファイト法に用いるガラス担体の負荷を模式的に示
す。 第１１図は、固体担体ホスファイト法に用いるオリゴヌ
クレオチド合成を模式的に示す。 第１２図は、固体担体よりのオリイヌクレオチドの除保
護および放出を模式的に示す。 第１３図は、オリゴヌクレオチ）−”［造のための固体
担体トリエステル法で用いる官能基中間体の名称を示す
。 第１４図に、固体担体トリエステル法によるオリゴヌク
レオチー構築で用いる反応スキームの模式図を示す。 代理人　浅　村　晧 第２図 ５゜ ５０ ００ ＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡ　ＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴ　ＴＡＡ
第３図 ５ ００ ９０ ３５ ８０ ２５ ７０ １５ 鬼５図 ５１　３１ ３、　ＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＨ，Ｇ
ＡＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＧＴＡＴ１２、　Ｇ
ＴＣＡＡＣＡＴＡＣＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴＴ１９、　Ｇ
ＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＡＣＣＧＴＴＡＧＡＡ２５、　Ａ
ＣＧＴＣＣＡＣＧＡＧＡＴＣＴＴＡＴ３６、　ＧＴＡＡ
ＴＣＣＡＴＣＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴ４０、　ＡＡＩＩ
ＣＧＩＣＧＡＣＩＣＡＡＧＴＴＡＡＧ＋９−ｍｅｒ １−ｍｅｒ ＋９−ｍｅｒ ９−ｍｅｒ ３−ｍｅｒ ２　＋　−ｍｅｒ ２＋−ｍｅｒ ２−ｍｅｒ ２−ｍａｒ ２−ｍａｒ ２−ｍｅｒ ０−ｍａｒ ８−ｍａｒ ８−ｍａｒ Ｂ−ｍａｒ ２＋−ｍａｒ ２＋　−ｍｅｒ ２１−ｍｅｒ ２１−ｍｅｒ ９−ｍｅｒ １−ｍｅｒ ２　＋　−ｍｅｒ −すトリトル・フォールス・パダ ーリン・アベニュー２４６ 一州ウェスト・カルドウエル・ ノール・プレース１６ 手続補正書（自発） 昭和５９年４月２を日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５９年特許願第　５４１５１　号 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和　年　月　日 明細書の浄ＩＦＣ内容に変更なし） 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和ｌア年特許願第、シー（１−／Ｆ７　号３、補正を
する者 事件との関係　特ｚ′ｌ出願人 住　所 溝数、　エフ、ホフマンーラ　ロシュウントコンパニー
アクチェノゲゼル／ヤノト ５、補正命令の日イ」 昭和Ｖ／年ｚ月２を日 ６、補正により増加する発明の数

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）成熟ヒト１Ｌ−２をコーＶし、そして、それぞれ
   にエンドヌクレアーゼ認識サイトの部分を表わす付着末
   端を有してｂる二本鎖ポリデオキシリボヌクレオチド。
2. （２）末端が、異なるエンドヌクレアーゼの認識サイト
   の部分を表わしている、上記（１）項記載のポリデオキ
   シリボヌクレオチド。
3. （３）　該成熟ヒト１Ｌ−２のアミノ末端をコー−する
   末端がＥＣＯＲ工認識サイトに属しそして工Ｌ−２のカ
   ルボキシ末端をコードする末端が５ａｌｌ：認識サイト
   に属する上記（２）項記載のポリデオキシリボヌクレオ
   チド。
4. （４）第２図に示すＤＮＡ配列の、上記（１）項記載の
   ポリデオキシリボヌクレオチド。
5. （５）　該成熟ヒト１Ｌ−２の微生物的発現を行ないう
   るＤＮＡ配列と操作して連結させた、成熟ヒト１Ｌ−２
   をコーＰするＤＮＡ配列。
6. （６）　第３図に示すＤＮＡ配列の、成熟ヒト１Ｌ−２
   をコードする構造遺伝子。
7. （７）　形質転換された微生物中において、成熟ヒト１
   Ｌ−２を発現しつる、複製しうる、微生物性発現ビヒク
   ル。
8. （８）　バクテリオファージラムダに由来するプロモー
   ターおよびオペレーター、ハイプリーリボゾーム結合サ
   イト、および成熟ヒト１Ｌ−２をコーげするＤＮＡ配列
   を言方することを特徴とする、上記（７）項記載の発現
   ビヒクル。 ＋９１　７″ロモーターおよびオペレーターがＰＬおよ
   びＯＬである、上記（８）項記載の発現ビヒクル。 （１０１成熟ヒト１Ｌ−２をコードする構造遺伝子の挿
   入されたｐＲＯ２３／　Ｋ　ｃｏＢニーＢａ１工である
   上記（９）項記載の発現ビヒクル。 Ｕ　上記（カー（１０）項記載の発現ビヒクルで形質転
   換された微生物。 住ｚ　形質転換されたＥ、　Ｃ０１１株である、上記Ｑ
   １１項記載の微生物。 〇四　ヒトＮｅｔ４Ｌ−２゜ ■　上記Ｏ１１または０項記載の微生物を発育させ、工
   Ｌ−２遺伝子の発現を誘導し、誘導期間が完了したら微
   生物な浴解させ、そして、該微生物の細胞構成成分より
   該成熟ヒトエＬ−２を分離することを包含する、組換え
   による成熟ヒトＩＬ−２の生産方法。 （１５＋　約６０から３６℃までの範囲の温度で微生物
   を発育させ温度を約４２°Ｏｆ上昇させて遺伝子発現を
   誘導する、上記（１４１項記載の方法。 四　該微生物がヒトＭｅｔ−工Ｌ−２を発現する、上記
   （＋４１またはＱ５）勇記載の方法。