JPS60145090A - Ｄνａ - Google Patents
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- JPS60145090A JPS60145090A JP59001204A JP120484A JPS60145090A JP S60145090 A JPS60145090 A JP S60145090A JP 59001204 A JP59001204 A JP 59001204A JP 120484 A JP120484 A JP 120484A JP S60145090 A JPS60145090 A JP S60145090A
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- neutral protease
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- plasmid
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＤＮＡに関する。
今日まで多くの組み換えＤＮＡ研究は大腸菌（Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ）を用いてなされておシ、すでに多くの異種遺
伝子が大腸菌内で発現されている。しかし、この方法で
Ｌ発現された遺伝子産物が菌体内に蓄積される。したが
って目的とする遺伝子産物を純粋な型で取得するまでの
過程で、目的物の菌体からの抽出およびその抽出液から
の精製に多大な時間と労力とを要するだけではなく、目
的とする物質を完全な形で純粋に得ること自体がきわめ
て困轢である。
ｏｌｉ ）を用いてなされておシ、すでに多くの異種遺
伝子が大腸菌内で発現されている。しかし、この方法で
Ｌ発現された遺伝子産物が菌体内に蓄積される。したが
って目的とする遺伝子産物を純粋な型で取得するまでの
過程で、目的物の菌体からの抽出およびその抽出液から
の精製に多大な時間と労力とを要するだけではなく、目
的とする物質を完全な形で純粋に得ること自体がきわめ
て困轢である。
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）属細菌は古くから種々
の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されておシ、
これら菌体外酵素の遺伝子のプロモーターおよびシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ領域をクローニングし、
その下流に目的とする蛋白質の構造遺伝子を連絵して、
これを枯草菌に導入すれば、目的とする蛋白質を遺伝子
産物として菌体外へ分泌させることが可能になる と考
えられる。
の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用されておシ、
これら菌体外酵素の遺伝子のプロモーターおよびシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ領域をクローニングし、
その下流に目的とする蛋白質の構造遺伝子を連絵して、
これを枯草菌に導入すれば、目的とする蛋白質を遺伝子
産物として菌体外へ分泌させることが可能になる と考
えられる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌においては、分泌される蛋白質
はアミノ末端側におよそ２０〜３ｏアミノ酸残基からな
るシグナルペプチドを持つ前駆体として合成サレタのち
、この部分がシグナルペプチターゼによって切断されて
、鴫し菰蛋白質になると考えられている。すでにＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ−ｅｎｓ
のａ−アミラーゼ遺伝子（１，’ Ｐａ１ｖａ ｅｔ
ａｌ： Ｇｏｎｅ、 ２２．２２９（１９８３） 、）
、 Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
のベニンリナーゼ遺伝子Ｃ３゜Ｃｈａｎｇ、ｅｔ ａｌ
： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ＧｅｎｅＲｅｇｕｌｒｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｌｌｌｌ
、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
はアミノ末端側におよそ２０〜３ｏアミノ酸残基からな
るシグナルペプチドを持つ前駆体として合成サレタのち
、この部分がシグナルペプチターゼによって切断されて
、鴫し菰蛋白質になると考えられている。すでにＢａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ−ｅｎｓ
のａ−アミラーゼ遺伝子（１，’ Ｐａ１ｖａ ｅｔ
ａｌ： Ｇｏｎｅ、 ２２．２２９（１９８３） 、）
、 Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｌｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
のベニンリナーゼ遺伝子Ｃ３゜Ｃｈａｎｇ、ｅｔ ａｌ
： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ＧｅｎｅＲｅｇｕｌｒｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｌｌｌｌ
、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
６５９頁、１９８２年 ） 、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａ
ｕｂｔｉｌｉｓのα−アミラーゼ遺伝子〔山根国男、化
学と生物。
ｕｂｔｉｌｉｓのα−アミラーゼ遺伝子〔山根国男、化
学と生物。
２１． ６ｓ９（ｔｃ＋５３））がクローン化され、こ
れらのシグナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が
報告されている。また、Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｃｆ
ａｃｉ−ｅｎｓ の中性プロテアーゼ遺伝子も最近クロ
ーン化されたと報告された（富岡登ら９日本農芸化学会
昭和５８年度大会講演要旨集、３３頁）がその塩基自己
列を決定した結果、該】貴仏子は中性プロテアーゼをコ
ードしていないことが明らかにされた〔古谷義夫：第１
回次世代産苑基盤技術シンポジウム予稿集、２２３頁、
１９８３年〕。
れらのシグナルペプチドを利用した異種蛋白質の分泌が
報告されている。また、Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｃｆ
ａｃｉ−ｅｎｓ の中性プロテアーゼ遺伝子も最近クロ
ーン化されたと報告された（富岡登ら９日本農芸化学会
昭和５８年度大会講演要旨集、３３頁）がその塩基自己
列を決定した結果、該】貴仏子は中性プロテアーゼをコ
ードしていないことが明らかにされた〔古谷義夫：第１
回次世代産苑基盤技術シンポジウム予稿集、２２３頁、
１９８３年〕。
本発明者らはＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎ
ｓから既知のものとは異なる制限階素切断地図を有し、
中性プロテアーゼ１１″ｉ伝子を含むＤＮＡをクローン
化したことおよびこのＤＮＡをベクターに連結してＪ（
ａｃｉｌｌｕｓ ７．’ｉＪＩＭに導入することにより
、すぐれた中性プロテアーゼ生産菌を育種し得ることを
見出し、このシグナルペプチドをコードする領域を利用
すれば有用な分１必ベクターの構築が可能であることを
知って木づｉツ明な完成した。
ｓから既知のものとは異なる制限階素切断地図を有し、
中性プロテアーゼ１１″ｉ伝子を含むＤＮＡをクローン
化したことおよびこのＤＮＡをベクターに連結してＪ（
ａｃｉｌｌｕｓ ７．’ｉＪＩＭに導入することにより
、すぐれた中性プロテアーゼ生産菌を育種し得ることを
見出し、このシグナルペプチドをコードする領域を利用
すれば有用な分１必ベクターの構築が可能であることを
知って木づｉツ明な完成した。
すなわち、本発明はプロモーターおよび中性プロテアー
ゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含有し
、中性プロテアーゼをコードする領域を３末端側から一
部ないし全部欠（ＤＮＡを提供するものである。
ゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含有し
、中性プロテアーゼをコードする領域を３末端側から一
部ないし全部欠（ＤＮＡを提供するものである。
中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードす
る領域を含有するＤＮＡとしては中性プロテアーゼを産
生ずる微生物のものであればいかなるものであってもよ
く、微生物としてはたとえばＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑ、
ｕｅｆａｃｉｅｎｓなどの中性プロテアーゼを産生ずる
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌があげられる。
る領域を含有するＤＮＡとしては中性プロテアーゼを産
生ずる微生物のものであればいかなるものであってもよ
く、微生物としてはたとえばＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑ、
ｕｅｆａｃｉｅｎｓなどの中性プロテアーゼを産生ずる
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌があげられる。
プロモーターとしてはＢａｃｉｌｌｕｓ属繭体内でプロ
モーターとして機能するものであればいかなるものであ
ってもよく、たとえばスタフィロコッカス（３ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ）属、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｔ
、などのダラム陽性菌から得られるプロモーターがあげ
られる。好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ属菌から得られる
プロモーターがあげられ、該バチルス属菌としてはたと
えば、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｓ。
モーターとして機能するものであればいかなるものであ
ってもよく、たとえばスタフィロコッカス（３ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ）属、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｔ
、などのダラム陽性菌から得られるプロモーターがあげ
られる。好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ属菌から得られる
プロモーターがあげられ、該バチルス属菌としてはたと
えば、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｕｍｉｌｕｓ。
Ｂ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどがあげ
られる。
られる。
上記プロモーターおよび中性プロテア−ぜ遺伝子のシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡは上記した微生物の染
色体ＤＮＡから得ることができる。
ナルペプチドをコードするＤＮＡは上記した微生物の染
色体ＤＮＡから得ることができる。
菌体からの染色体ＤＮＡの調製はそれ自体公知であり、
たとえばｌ、ｏｖｅｔｔ らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＦ；ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６８．３４２ （１９
７９） ）などを用いて行うことができる。
たとえばｌ、ｏｖｅｔｔ らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＦ；ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６８．３４２ （１９
７９） ）などを用いて行うことができる。
染色体ＤＮＡから中性プロプアーゼ（行伝子を含むＩ）
Ｎ Ａ断片をクローニングする宿主−ベクター系とし
ては、ベクターに挿入された染色体ＤＮＡ断片上に中性
プロテアーゼ遺伝子の存在が確認できるものであればク
ロ何なるものであってもよく、好ましくは枯草菌宿主−
ベクター系があげられる。
Ｎ Ａ断片をクローニングする宿主−ベクター系とし
ては、ベクターに挿入された染色体ＤＮＡ断片上に中性
プロテアーゼ遺伝子の存在が確認できるものであればク
ロ何なるものであってもよく、好ましくは枯草菌宿主−
ベクター系があげられる。
ベクターを用いて中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片をクローニングする場合、たとえば制限酊紫を用い
てベクターを開裂させた後、ＤＮＡリガーゼを用いてＤ
ＮＡ断片を挿入し、これを用いて、たとえばＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉａ の中性プロテアーゼ非生産
株または低生産株を形質転換させることによって中性プ
ロテアーゼ産生株を選択すればよい。ベクターが薬剤耐
性遺伝子を有し、さらに該遺伝子上に挿入不活性化部位
を有する場合、該部位にＤＮＡ断片を挿入することによ
シ、薬剤に対する感受性を選択の指標として利用するこ
ともできる。ベクターとしては具体的にプラスミドｐＢ
ＴＭ１１９．ｐｌＪＢｌｌＱ などがあげられる。
断片をクローニングする場合、たとえば制限酊紫を用い
てベクターを開裂させた後、ＤＮＡリガーゼを用いてＤ
ＮＡ断片を挿入し、これを用いて、たとえばＢａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉａ の中性プロテアーゼ非生産
株または低生産株を形質転換させることによって中性プ
ロテアーゼ産生株を選択すればよい。ベクターが薬剤耐
性遺伝子を有し、さらに該遺伝子上に挿入不活性化部位
を有する場合、該部位にＤＮＡ断片を挿入することによ
シ、薬剤に対する感受性を選択の指標として利用するこ
ともできる。ベクターとしては具体的にプラスミドｐＢ
ＴＭ１１９．ｐｌＪＢｌｌＱ などがあげられる。
菌体外中性プロテアーゼ産生株は、たとえは４％カゼイ
ンを含有する寒天培地上でコロニーのまわりにハローを
形成する株として選択できる。また中性プロテアーゼ低
生産株としては、たとえばＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ
Ａ ２７４ を挙げることができる〔Ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ ：Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ、 ２ｎ
ｄ ｅｄｄｉｔｉｏｎ （１９８２）〕。形質転換の方
法それ自体は公知であシ、たとえばプロトプラスト法（
Ｓ、 Ｃｈａｎｇ＆ Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ：λ（ｏ
ｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、１６８． １１１（１９７
９））やコンピテント法（Ｉ）、 Ｄｕｂｎａｕ ＆
Ｒ，Ｄ、 Ａｂｅｌｓｏｎ、 Ｊ。
ンを含有する寒天培地上でコロニーのまわりにハローを
形成する株として選択できる。また中性プロテアーゼ低
生産株としては、たとえばＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｉ
Ａ ２７４ を挙げることができる〔Ｔｈｅ Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒ ：Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ５ｔｒａｉｎｓ、 ２ｎ
ｄ ｅｄｄｉｔｉｏｎ （１９８２）〕。形質転換の方
法それ自体は公知であシ、たとえばプロトプラスト法（
Ｓ、 Ｃｈａｎｇ＆ Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ：λ（ｏ
ｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、１６８． １１１（１９７
９））やコンピテント法（Ｉ）、 Ｄｕｂｎａｕ ＆
Ｒ，Ｄ、 Ａｂｅｌｓｏｎ、 Ｊ。
Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、 ５６． ２０９（１９７１）
）などを用いることができる。得られた形質転換株の菌
体からプラスミドを抽出し、これをたとえば制限酸素で
切１１Ｊ１後、たとえばアＩロースゲル電気泳動あるい
はポリアクリルアミドゲル れた中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡを単離するこ
とができる。これら一連の基本操作は公知であシ、文献
（ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．
６８（１．９７９）； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８２） 、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒｐＬｔｏｒｙ ）に詳しく￥Ｌ
！載されている。
）などを用いることができる。得られた形質転換株の菌
体からプラスミドを抽出し、これをたとえば制限酸素で
切１１Ｊ１後、たとえばアＩロースゲル電気泳動あるい
はポリアクリルアミドゲル れた中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡを単離するこ
とができる。これら一連の基本操作は公知であシ、文献
（ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．
６８（１．９７９）； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８２） 、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒｐＬｔｏｒｙ ）に詳しく￥Ｌ
！載されている。
中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードす
る領域を含有し、中性プロテアーゼをコードする領域を
３”末端側から一部ないし全部欠くＤＮＡは、中性プロ
テアーゼ遺伝子を含むＤＮＡを、たとえば制限＃素で完
全あるいは部分消化することにより得ることができる。
る領域を含有し、中性プロテアーゼをコードする領域を
３”末端側から一部ないし全部欠くＤＮＡは、中性プロ
テアーゼ遺伝子を含むＤＮＡを、たとえば制限＃素で完
全あるいは部分消化することにより得ることができる。
まだ、中性プロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡを制限酵素
で切断して中性プロテアーゼ遺伝子を含む、よシ小さな
りＮＡ断片をサブクローニングした後に、たとえば制（
呉酵．素で完全あるいは部分消化してもよい。
で切断して中性プロテアーゼ遺伝子を含む、よシ小さな
りＮＡ断片をサブクローニングした後に、たとえば制（
呉酵．素で完全あるいは部分消化してもよい。
サブクローニングは中性プロテアーゼ遺伝子のクローニ
ングと同様な方法に従つ一Ｃ、ベクター上に、より小さ
なＵＬＮＡ断片をクローニングし、その形質転換体がコ
ロニーの周囲にカゼインを分解したことを示すハローを
形成することを指標として中性プロテアーゼ遺伝子がク
ローニングされたことを確認することができる。使用さ
れるベクターは枯草菌ベクターたとえばｐＢＴＭ１１９
，ｐＵＢｌｌｏ、ｐＰＬ６０３などが挙げられる。
ングと同様な方法に従つ一Ｃ、ベクター上に、より小さ
なＵＬＮＡ断片をクローニングし、その形質転換体がコ
ロニーの周囲にカゼインを分解したことを示すハローを
形成することを指標として中性プロテアーゼ遺伝子がク
ローニングされたことを確認することができる。使用さ
れるベクターは枯草菌ベクターたとえばｐＢＴＭ１１９
，ｐＵＢｌｌｏ、ｐＰＬ６０３などが挙げられる。
また、中性プロテアーゼ遺伝子のシグナルペプチドをコ
ードする領域を含有するＤＮＡは自体公知の方法、たと
えばトリエステル法［ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ。
ードする領域を含有するＤＮＡは自体公知の方法、たと
えばトリエステル法［ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ− ＳｃＬ， ＵＳＡ 、 ７５ 、 ５７６
５（ １９７８） ）によって化学的に全合成あるいは
半合成したものでもよい。
５（ １９７８） ）によって化学的に全合成あるいは
半合成したものでもよい。
染色体ＤＮＡを用いてプロモーター活性を有するＤＮＡ
断片をクローニングする場合に用いられるベクター（プ
ロモータークローニングベクター）としては、たとえば
制限＃累切断部位にバチルス属菌の染色体ＤＮＡ断片を
挿入させ、その断片中にプロモーターが存在しているこ
とを知ることが出来るプラスミドであればいかなるもの
であってもよく、たとえばプロモータ一部分が欠損した
遺伝子を有するプラスミドなどがあげられ、具体的には
プラスミドｐＰＬ６０３（ｐＢＴＭ１２６）Ｃ；ｆ−Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏＬ，１４６．１１６２（１９８１））な
どがあけられる。
断片をクローニングする場合に用いられるベクター（プ
ロモータークローニングベクター）としては、たとえば
制限＃累切断部位にバチルス属菌の染色体ＤＮＡ断片を
挿入させ、その断片中にプロモーターが存在しているこ
とを知ることが出来るプラスミドであればいかなるもの
であってもよく、たとえばプロモータ一部分が欠損した
遺伝子を有するプラスミドなどがあげられ、具体的には
プラスミドｐＰＬ６０３（ｐＢＴＭ１２６）Ｃ；ｆ−Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏＬ，１４６．１１６２（１９８１））な
どがあけられる。
プロモーター活性を有するＤＮＡ断片は染色体ＤＮＡ断
片が挿入されたベクターで形質転換させた菌株から自体
公知の方法でプラスミドを調製した後、これ愛、たとえ
ば制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲル 気泳＋１ｉ１１などの自体公知の方法を用いて単にする
ことができる。まだ、単離されたＤＮＡ断片の塩基配列
は自体公知の方法、たとえばジヌクレオチド合成鎖停止
法（ Ｐｒｏｃ． ＮａｔＬ Ａｃａｄ− Ｓｃｉ．
、 Ｕ Ｓ Ａ 。
片が挿入されたベクターで形質転換させた菌株から自体
公知の方法でプラスミドを調製した後、これ愛、たとえ
ば制限酵素で切断し、ポリアクリルアミドゲル 気泳＋１ｉ１１などの自体公知の方法を用いて単にする
ことができる。まだ、単離されたＤＮＡ断片の塩基配列
は自体公知の方法、たとえばジヌクレオチド合成鎖停止
法（ Ｐｒｏｃ． ＮａｔＬ Ａｃａｄ− Ｓｃｉ．
、 Ｕ Ｓ Ａ 。
７４、５４６３（１９７７））を用いて決定できる。
また、プロモーター活性を有するＤＮＡ１１片は自体公
知の方法、たとえばトリエステル法を用いて化学合成す
ることもできる。
知の方法、たとえばトリエステル法を用いて化学合成す
ることもできる。
目的とする蛋白質は転写開始に必要なプロモーター、リ
ポソーム結合部位（ＳＤ配列）および中性フ゛ロチアー
ゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域の下流に
目的とする蛋白質をコードする遺伝子を連結させたＤＩ
ＩＡでバチルス属菌を形質転換させ、得られる形質転換
株を培養するととにより得ることができる。
ポソーム結合部位（ＳＤ配列）および中性フ゛ロチアー
ゼ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域の下流に
目的とする蛋白質をコードする遺伝子を連結させたＤＩ
ＩＡでバチルス属菌を形質転換させ、得られる形質転換
株を培養するととにより得ることができる。
上記のＳＤ配列としては枯草菌内で機能するものであれ
ばいかなるものであってもよく、またその配列のいくつ
かは、すでに公知である（ 、Ｔ． Ｒ。
ばいかなるものであってもよく、またその配列のいくつ
かは、すでに公知である（ 、Ｔ． Ｒ。
ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ＦＬｌ；、ｒ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｒａ， ２５６ 、 １１２８３（１９８
１）、ＣＰ．Ｍｏｒａ．ｎ Ｊｒ．、ｅｔ ａｌ： Ｍ
ｏ：Ｌ．Ｇｅｎ。
ｌ． Ｃｈｅｒａ， ２５６ 、 １１２８３（１９８
１）、ＣＰ．Ｍｏｒａ．ｎ Ｊｒ．、ｅｔ ａｌ： Ｍ
ｏ：Ｌ．Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １８６， ３３９（１９８２）
）。したがって、ＳＤ配列を含むオリゴヌクレオチドを
染色体ＤＮＡから単離するか、または自体公知の方法、
たとえばトリエステル法（前出）によって化学合成し、
プロモーターと中性プロテアーゼ１１す伝子のシグナル
ペプチドをコードする領域を有するベクターにおいてプ
ロモーターの下流に挿入すればめる発現ベクターを構築
することができる。
）。したがって、ＳＤ配列を含むオリゴヌクレオチドを
染色体ＤＮＡから単離するか、または自体公知の方法、
たとえばトリエステル法（前出）によって化学合成し、
プロモーターと中性プロテアーゼ１１す伝子のシグナル
ペプチドをコードする領域を有するベクターにおいてプ
ロモーターの下流に挿入すればめる発現ベクターを構築
することができる。
発現に使用される遺伝子は介在配列を有さず、かつ塩基
配列の明らかなものがよシ望ましく、染包体から単離さ
れた遺伝子、ｍＲＮＡから得られた相捕ＤＮＡ 、化学
合成したｊｌｌ壬子半合成遺伝子などいかなるものであ
ってもよい。具体的にはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ ｖ
）表面抗原遺伝子、ＨＢＶコア抗原市伝子、免役グロフ
リンＥ ｉ［’、を伝子。
配列の明らかなものがよシ望ましく、染包体から単離さ
れた遺伝子、ｍＲＮＡから得られた相捕ＤＮＡ 、化学
合成したｊｌｌ壬子半合成遺伝子などいかなるものであ
ってもよい。具体的にはＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ ｖ
）表面抗原遺伝子、ＨＢＶコア抗原市伝子、免役グロフ
リンＥ ｉ［’、を伝子。
ヒト成長ホｐモン］４伝子、インターロイキン−２直仏
子、免疫インターフェロンｉｆｄ仏子などがあげられ、
該ｉｔｆ伝子の全部またはその一部を使用してもよい。
子、免疫インターフェロンｉｆｄ仏子などがあげられ、
該ｉｔｆ伝子の全部またはその一部を使用してもよい。
また、これらのＪｉ伝子を発現ベクターに挿入して発現
プラスミドを横梁する際、必−）Ｕに応じて適当な合成
オリゴヌクレオチドを３４仏子に連結させてもよい。
プラスミドを横梁する際、必−）Ｕに応じて適当な合成
オリゴヌクレオチドを３４仏子に連結させてもよい。
このようにして得られるプラスミドでバチルヌ７、ｔ・
＜菌を形質転換させる場合、宿主は特に限定する必要は
なく、たとえば、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ Ｇ Ｓ
ＣＩＡＩ、ＢＧＳＣＩＡ２７４ などが挙げられる〔
Ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃ
ｋ Ｇｅｎｔｅｒ：Ｃａｔａ：１ｏｇｏｆ ５ｔｒａｉ
ｎｓ 、 ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８２）〕。
＜菌を形質転換させる場合、宿主は特に限定する必要は
なく、たとえば、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ Ｇ Ｓ
ＣＩＡＩ、ＢＧＳＣＩＡ２７４ などが挙げられる〔
Ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃ
ｋ Ｇｅｎｔｅｒ：Ｃａｔａ：１ｏｇｏｆ ５ｔｒａｉ
ｎｓ 、 ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８２）〕。
得られる形質転換株の培養に使用される培地としては形
質転換株が生育して菌体外に目的とする蛋白質を産生じ
得るものであればいかなるものであってもよい。
質転換株が生育して菌体外に目的とする蛋白質を産生じ
得るものであればいかなるものであってもよい。
該培地に含有される炭素源としては、たとえばグルコー
ス、シュークロース、グリセリン、でん粉、デキス）９
ン、糖蜜、有機酸などが用いられる。該培地に含有され
る窒素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス、酵
母エキス、カザミノ酸〔ディフコ社（米国）製〕、ＮＺ
−アミンＡ〔シェフイールド社（米国） 製） 、ソイ
ビーンミール１落下生粉などの有機窒素源、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無
機窒素源が用いられる。その他、力ｐシウム塩、マグネ
シウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マン
ガン塩、鉄塩、コバルト塩などの無機塩が必要に応じて
培地に添加される。さらに、栄養要求を示す醒株を用い
る場合は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すれ
ばよい。該栄養物質としては、たとえば、アミノ酸類、
ビタミン類、核酸塩基類などが挙げられる。
ス、シュークロース、グリセリン、でん粉、デキス）９
ン、糖蜜、有機酸などが用いられる。該培地に含有され
る窒素源としては、カゼイン、ペプトン、肉エキス、酵
母エキス、カザミノ酸〔ディフコ社（米国）製〕、ＮＺ
−アミンＡ〔シェフイールド社（米国） 製） 、ソイ
ビーンミール１落下生粉などの有機窒素源、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無
機窒素源が用いられる。その他、力ｐシウム塩、マグネ
シウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マン
ガン塩、鉄塩、コバルト塩などの無機塩が必要に応じて
培地に添加される。さらに、栄養要求を示す醒株を用い
る場合は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すれ
ばよい。該栄養物質としては、たとえば、アミノ酸類、
ビタミン類、核酸塩基類などが挙げられる。
さらに必要により、消泡剤（例、大豆油、ラード油など
）などを培地に加えてもよい。
）などを培地に加えてもよい。
また、培養に際して必要があれば、培地に抗生物質たと
えばクロラムフェニコールが加えられる。
えばクロラムフェニコールが加えられる。
培養温度は、通常的１５ｔｉないし４２し、さらに好ま
しくは約２４℃ないし３７℃であシ、培地のｐｉ（は初
発ｐＨが約５０ないし９．０でありさらに好１しくけ約
６５ないし７，５である。培養時間は、通常的３ないし
７２時間、さらに好ましくはＦＪ５ないし４８時間であ
る。
しくは約２４℃ないし３７℃であシ、培地のｐｉ（は初
発ｐＨが約５０ないし９．０でありさらに好１しくけ約
６５ないし７，５である。培養時間は、通常的３ないし
７２時間、さらに好ましくはＦＪ５ないし４８時間であ
る。
目的とする蛋白質は自体公知の方法、たとえば遠心分離
などの方法で菌体を除去した後、自体公知の蛋白質精製
法に従って精製することができる。
などの方法で菌体を除去した後、自体公知の蛋白質精製
法に従って精製することができる。
以下に参考例、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらに限定されるべきものではな
い。
明するが、本発明はこれらに限定されるべきものではな
い。
参考例１
クローニングベクターｐＢＴＭ１１．９の４ＵＪ１）槃
剤＋＋ｉｉｔ性プラヌミドの調製財団法人発ｈｆ４ａｆ
究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦ０−１４２０３として寄
託されているクロラムフェニコール耐性のスタフィロコ
ッカス・エビデルミゾイス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ） Ｆ’５５０３０を
１％トリプトン（ディフコ社、米国）。
剤＋＋ｉｉｔ性プラヌミドの調製財団法人発ｈｆ４ａｆ
究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦ０−１４２０３として寄
託されているクロラムフェニコール耐性のスタフィロコ
ッカス・エビデルミゾイス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ） Ｆ’５５０３０を
１％トリプトン（ディフコ社、米国）。
０゜５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７
，２からなる５ ｍｌ ＯＬ培地を含む試験管で３（１
，１８時間振とり培養した。得られた培養液２０献（試
験管４本分）を遠心分離し、菌体を１０ｍＭＥＤＴＡ、
ｐＨｓ、ｏ 、で洗浄したのち２ｔｘｌのＴＢＬ−１溶
１酵素溶液（１’ｆ／ｌｎｔ 、 １０ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ。
，２からなる５ ｍｌ ＯＬ培地を含む試験管で３（１
，１８時間振とり培養した。得られた培養液２０献（試
験管４本分）を遠心分離し、菌体を１０ｍＭＥＤＴＡ、
ｐＨｓ、ｏ 、で洗浄したのち２ｔｘｌのＴＢＬ−１溶
１酵素溶液（１’ｆ／ｌｎｔ 、 １０ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ。
ｐＨ８，０）に懸濁し、３７℃で３０分間保温した。
４ｔｔｔｌの１％ラウリ／Ｌ’ 硫Ｗナトリウムを含む
０．２Ｎ水酸化ナトリウムを加えて混合し、０℃で５分
間放置した。さらに６ｗｔ１の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｉ（４，８）を加えて混合し、ＯＣで６０分間放置した
のち遠心分離した。その上清に２倍量の冷エタノールを
加え、−２０して１夜放置し、遠心分ト１した。沈醗を
０．４ ｇｅの０，４％ザルコシ−μに溶解し、２、４
ｍｌのＴ Ｅ Ｓ Ｍ前液（３０ｍＭ）リス・塩酸緩
衝液ｐＨａ０．５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭｇＤ’
ｒＡ）、０．Ｂゴの５Ｍ塩化ナトリウムおよび８ｍｌの
冷エタノールを加えたのち、−２０ｔＥで１夜放置し、
遠心分離した。沈澱を０．４ ＭｔのＴＥＮ衝液前液０
ｍＭｌ−リス・塩酸緩渭液ｐＨ８，０、１ｍＭＥＤＴＡ
）に溶解し、同じ緩衝液で透析して粗デラヌミドを調製
した。
０．２Ｎ水酸化ナトリウムを加えて混合し、０℃で５分
間放置した。さらに６ｗｔ１の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｉ（４，８）を加えて混合し、ＯＣで６０分間放置した
のち遠心分離した。その上清に２倍量の冷エタノールを
加え、−２０して１夜放置し、遠心分ト１した。沈醗を
０．４ ｇｅの０，４％ザルコシ−μに溶解し、２、４
ｍｌのＴ Ｅ Ｓ Ｍ前液（３０ｍＭ）リス・塩酸緩
衝液ｐＨａ０．５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭｇＤ’
ｒＡ）、０．Ｂゴの５Ｍ塩化ナトリウムおよび８ｍｌの
冷エタノールを加えたのち、−２０ｔＥで１夜放置し、
遠心分離した。沈澱を０．４ ＭｔのＴＥＮ衝液前液０
ｍＭｌ−リス・塩酸緩渭液ｐＨ８，０、１ｍＭＥＤＴＡ
）に溶解し、同じ緩衝液で透析して粗デラヌミドを調製
した。
クロラムフェニコー／Ｖ４性のＳ、 ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｄｉｓＦＳ５０３０の徂プラスミドを用いて、プロトプ
ラスト法によるＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｊ Ｂ−１−１６８（ＩＦＯ−１４１４４）の形質転換
を行い、クロラムフェニコール！ｉ吋１生（１２，５μ
ｑ クロラムフエニコー）Ｖ／ｙｑｌで生育）の形質転
換株を分―ｔした。
ｄｉｓＦＳ５０３０の徂プラスミドを用いて、プロトプ
ラスト法によるＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
Ｊ Ｂ−１−１６８（ＩＦＯ−１４１４４）の形質転換
を行い、クロラムフェニコール！ｉ吋１生（１２，５μ
ｑ クロラムフエニコー）Ｖ／ｙｑｌで生育）の形質転
換株を分―ｔした。
このように、このプラスミドがＢａｃｉｌｌｕｓ 属テ
モ増殖可能であシ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌内でその肩仏
子を発現させ得ることから、こ←のプラスミドがＢａｃ
ｉｌｌｕｓ属のベクターとなり得ることが明らかとなっ
た。そこで、形質転換株の中からクロラムフェニコール
ｌ’ｌ！Ｊ性を示すものをＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ
２３と命名し、Ｊ′〜択した。
モ増殖可能であシ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属菌内でその肩仏
子を発現させ得ることから、こ←のプラスミドがＢａｃ
ｉｌｌｕｓ属のベクターとなり得ることが明らかとなっ
た。そこで、形質転換株の中からクロラムフェニコール
ｌ’ｌ！Ｊ性を示すものをＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ
２３と命名し、Ｊ′〜択した。
このＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ’Ｔ ２３をＬ培地で２
８℃。
８℃。
１６時間振とり培養した。得られた５００ｇ／の培養液
を遠心分離して集めた菌体に、６０ｙｔｔｌの２５％シ
ョ糖を含むＴＢＳ緩繭液、 １２ｙｐｔｌ（Ｄｏ、 ２
５ ＭＥＤＴＡ ｐＨ８，０、１６薄ｊの５ Ｍｇ／
ｍｌリゾチーム溶液および０．８コの５Ｑ’／＊ｌ！ｊ
ボヌクレアーゼＡ溶液を加え、３７しで３０分間保温し
た。さらに８ゴの１０％ラウリμ硫酸ナトリウムを加え
、３７℃で１５分間保温した。つぎに２０ｎｔの５Ｍ塩
化ナトリウムを加え、０１で３時間放置したのち遠心分
離した。その上清に２倍容の冷エタノ−μを加え、−２
０ｔで１夜放置した。遠心分離して得られた沈陶を８．
６ ｔｎｌの０．４％ザμコシールを含むＴ Ｅ Ｓ
ａ！衝前液溶かし、９ｆの塩化セシウムおよび０．２５
ｍｌの３０’ｌＷ／ｌｅｌエチジウムブロマイド溶液
を加えたのち、ベックマン超遠心機（ロー１’−５０Ｔ
ｉ）を用いて２（ｌで３８．００Ｏｒｐｍで４８時間遠
心した。紫外線照射によって検出されるプラスミドのバ
ンドを取り、これに（比重）＝１．６の塩化セシウム−
エチジウムブロマイド溶液を加え、再び３８．ｏｏｏｒ
ｐｍで４８時間遠心した。プラスミドのバンドを取シ、
ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロマイドを除
去したのぢＴＥ緩衝液で透析し、クロラムフェニコール
耐性グフメミドｐＢＴＭ１０３ を得だ。２６０ ｎｍ
の吸光度から約７５μすのプラスミドが得られたことが
わかった。
を遠心分離して集めた菌体に、６０ｙｔｔｌの２５％シ
ョ糖を含むＴＢＳ緩繭液、 １２ｙｐｔｌ（Ｄｏ、 ２
５ ＭＥＤＴＡ ｐＨ８，０、１６薄ｊの５ Ｍｇ／
ｍｌリゾチーム溶液および０．８コの５Ｑ’／＊ｌ！ｊ
ボヌクレアーゼＡ溶液を加え、３７しで３０分間保温し
た。さらに８ゴの１０％ラウリμ硫酸ナトリウムを加え
、３７℃で１５分間保温した。つぎに２０ｎｔの５Ｍ塩
化ナトリウムを加え、０１で３時間放置したのち遠心分
離した。その上清に２倍容の冷エタノ−μを加え、−２
０ｔで１夜放置した。遠心分離して得られた沈陶を８．
６ ｔｎｌの０．４％ザμコシールを含むＴ Ｅ Ｓ
ａ！衝前液溶かし、９ｆの塩化セシウムおよび０．２５
ｍｌの３０’ｌＷ／ｌｅｌエチジウムブロマイド溶液
を加えたのち、ベックマン超遠心機（ロー１’−５０Ｔ
ｉ）を用いて２（ｌで３８．００Ｏｒｐｍで４８時間遠
心した。紫外線照射によって検出されるプラスミドのバ
ンドを取り、これに（比重）＝１．６の塩化セシウム−
エチジウムブロマイド溶液を加え、再び３８．ｏｏｏｒ
ｐｍで４８時間遠心した。プラスミドのバンドを取シ、
ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブロマイドを除
去したのぢＴＥ緩衝液で透析し、クロラムフェニコール
耐性グフメミドｐＢＴＭ１０３ を得だ。２６０ ｎｍ
の吸光度から約７５μすのプラスミドが得られたことが
わかった。
１１）クローニングベクターの構築
４、５ ／ＺりのｐＢＴｕｔ６３を制限酵％１１ｐａｌ
Ｉで３７℃、６０分間完全消化した。いっぽう６７５／
１ｇのｐＵ Ｂ １１０ （Ｊ、 Ｓｃｈｅｅｒ−Ａｂ
ｒａｎｌｏｗｊ、ｔｚｅｔａｈ、 ＰｌａＦ４ｍｉｄ、
６ 、 （ｉ７（１９８１） ２’３Ｎ、＠ ）を制
限酵素Ｈｐ ａ ＩＩで３７ｔＥ、１時間消化した。前
反応【夜を６５℃で１５分間加熱処理して反応を停止さ
せ、エタノール沈澱を行った１１両沈細をそれぞれ３５
μＥの水に溶解して混合し、６６ｎ−１：）ｖのアデノ
シン三すンｒｉ２！、１ｏユニットのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ存在下で１１Ｃ，３１時＋１０反応させ、エタノ−ｐ
沈ｅＱを行った。沈鍜を５０１１１のＴＥ緩衝液に溶か
し、その２５μＥを用いてＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｊ
Ｂ−１−１６８の形質転換を行った。カナマイクンおよ
びクロラムフェニコールの両方に耐性を示す形質転換株
の中からＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ ３９を選び、こ
の菌株の培養液５００ｖ／から参考例１−１）と同様の
方法でそ＾ぞも複合プラスミドｐＢＴＭ１１９（２０９
μｇ ）を得た。プラスミドＰＢＴＭ１１９の分子量は
約３，２５メガダμトンであり、その制限酵素切断地図
は８１図のごとくであった。
Ｉで３７℃、６０分間完全消化した。いっぽう６７５／
１ｇのｐＵ Ｂ １１０ （Ｊ、 Ｓｃｈｅｅｒ−Ａｂ
ｒａｎｌｏｗｊ、ｔｚｅｔａｈ、 ＰｌａＦ４ｍｉｄ、
６ 、 （ｉ７（１９８１） ２’３Ｎ、＠ ）を制
限酵素Ｈｐ ａ ＩＩで３７ｔＥ、１時間消化した。前
反応【夜を６５℃で１５分間加熱処理して反応を停止さ
せ、エタノール沈澱を行った１１両沈細をそれぞれ３５
μＥの水に溶解して混合し、６６ｎ−１：）ｖのアデノ
シン三すンｒｉ２！、１ｏユニットのＴ４ＤＮＡリガー
ゼ存在下で１１Ｃ，３１時＋１０反応させ、エタノ−ｐ
沈ｅＱを行った。沈鍜を５０１１１のＴＥ緩衝液に溶か
し、その２５μＥを用いてＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｊ
Ｂ−１−１６８の形質転換を行った。カナマイクンおよ
びクロラムフェニコールの両方に耐性を示す形質転換株
の中からＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｔ ３９を選び、こ
の菌株の培養液５００ｖ／から参考例１−１）と同様の
方法でそ＾ぞも複合プラスミドｐＢＴＭ１１９（２０９
μｇ ）を得た。プラスミドＰＢＴＭ１１９の分子量は
約３，２５メガダμトンであり、その制限酵素切断地図
は８１図のごとくであった。
参考例２
プロモータークローニングベクターｐＢＴＭ１２６の構
築 プラスミドｐＢＴＭ１２６は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ らの
方法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４６ 、１１
６２（１９８１） ）に従い以下のように作製した。財
団法人発酵研究所より入手したＢ、 ｐｕｍｉｌｕａ
Ｎ Ｃより８６００ （工ＦＯ−１２０８９）よシＤＮ
Ａを調製し、そのＤＮＡ（６５μｇ）を４０ユニツトの
制限酵素ＥｃｏＲＩと３７℃、１時間反応させて切断し
たのち、６８℃で１５匁間加熱し、エタノール沈味を行
った。
築 プラスミドｐＢＴＭ１２６は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ らの
方法（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、 １４６ 、１１
６２（１９８１） ）に従い以下のように作製した。財
団法人発酵研究所より入手したＢ、 ｐｕｍｉｌｕａ
Ｎ Ｃより８６００ （工ＦＯ−１２０８９）よシＤＮ
Ａを調製し、そのＤＮＡ（６５μｇ）を４０ユニツトの
制限酵素ＥｃｏＲＩと３７℃、１時間反応させて切断し
たのち、６８℃で１５匁間加熱し、エタノール沈味を行
った。
一方、プラスミドｐＵＢ１１０（２，０ｆｇ）を２０ユ
ニツトの制御８酵素ＥｃｏＲ工と３７Ｃて１時間反応さ
せて切（Ｕ１シたのち、６８ｔ：で１５分間加熱し、エ
タノール沈峠を行った。両法澱を水に溶かして混合し、
これに６０ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、ｌＱ、：Ｌニット
のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（全酒造製）およびリガーゼ緩
衝液を加えた反応液（１００μｌ）を１１′Ｃで３０時
間保温し、エタノ−ｐ沈滞を行つ転換を行った。クロラ
ムフェニコール耐性の形質転換株よりグラスミドを調製
し、該プラスミドをｐＢＴＭ１２４ と命名した。次に
プラスミドｐＢＴＭ１２４（２，５μｇ）を１４ユニツ
トの制限酵素ＰｓｔＩと３７ｔ、：、１時間反応させて
切断し、６８しで１５分間加熱処理したのち、エタノー
ル沈厳を行った。沈殿を水に溶解し、６６ ｎｍｏｌｅ
のＡＴＰ、ＩＱユニットのＴｄＤＮＡリガーゼ（宝酒
り製）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μ
りを１１℃で２４時間保温し、エタノール沈澱を行った
。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉ１１．
ｓ Ｍ Ｉ １１４を形質転換させ、カナマイシン：耐
性の形質転換株からプラスミドを調製して、該グラスミ
ドをｐＢＴＭ１２５ と命名した。本プラスミドはグラ
スミドｐＢＴＭ１２４のクロラムフエニコーｐ アセチ
ルトフンスフエヲーセ（ＣＡＴ）遺伝子のプロモータ一
部位（ＰｓｔＩ断片）が脱落したものである。次にグラ
スミドｐＢＴＭ１２５（２，５μｇ）を１８ユニツトの
制限酵素ＢａｍＨ工および１５ユニツトの制限酵素Ｂｇ
ｌｌＩと３７ｔＥで１時間反応させて切断し、６８Ｃて
１５分間加熱処理したのちエタノール沈鍛を行った。
ニツトの制御８酵素ＥｃｏＲ工と３７Ｃて１時間反応さ
せて切（Ｕ１シたのち、６８ｔ：で１５分間加熱し、エ
タノール沈峠を行った。両法澱を水に溶かして混合し、
これに６０ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、ｌＱ、：Ｌニット
のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（全酒造製）およびリガーゼ緩
衝液を加えた反応液（１００μｌ）を１１′Ｃで３０時
間保温し、エタノ−ｐ沈滞を行つ転換を行った。クロラ
ムフェニコール耐性の形質転換株よりグラスミドを調製
し、該プラスミドをｐＢＴＭ１２４ と命名した。次に
プラスミドｐＢＴＭ１２４（２，５μｇ）を１４ユニツ
トの制限酵素ＰｓｔＩと３７ｔ、：、１時間反応させて
切断し、６８しで１５分間加熱処理したのち、エタノー
ル沈厳を行った。沈殿を水に溶解し、６６ ｎｍｏｌｅ
のＡＴＰ、ＩＱユニットのＴｄＤＮＡリガーゼ（宝酒
り製）およびリガーゼ緩衝液を加えた反応液（１００μ
りを１１℃で２４時間保温し、エタノール沈澱を行った
。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉ１１．
ｓ Ｍ Ｉ １１４を形質転換させ、カナマイシン：耐
性の形質転換株からプラスミドを調製して、該グラスミ
ドをｐＢＴＭ１２５ と命名した。本プラスミドはグラ
スミドｐＢＴＭ１２４のクロラムフエニコーｐ アセチ
ルトフンスフエヲーセ（ＣＡＴ）遺伝子のプロモータ一
部位（ＰｓｔＩ断片）が脱落したものである。次にグラ
スミドｐＢＴＭ１２５（２，５μｇ）を１８ユニツトの
制限酵素ＢａｍＨ工および１５ユニツトの制限酵素Ｂｇ
ｌｌＩと３７ｔＥで１時間反応させて切断し、６８Ｃて
１５分間加熱処理したのちエタノール沈鍛を行った。
沈澱を水に溶解したのち、６５ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ
、１３ユニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（全酒造製）お
よびリガーゼ緩衝液を含む反応Ｍ（１００μｌ）中で１
１℃で２８時間保温し、これを用いてＢ。
、１３ユニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（全酒造製）お
よびリガーゼ緩衝液を含む反応Ｍ（１００μｌ）中で１
１℃で２８時間保温し、これを用いてＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｍ Ｉ １１４の形質転換を行った
。カナマイシン耐性の形質転換株からプラスミドを調製
し、該プラスミドをｐＢＴＭ１２６ と命名した。
。カナマイシン耐性の形質転換株からプラスミドを調製
し、該プラスミドをｐＢＴＭ１２６ と命名した。
実施例１
中性グロテアーゼ遺伝子のクローニングＢ、 ａｍｙｌ
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （Ｉ Ｆ’ Ｏ−１４１
４１）（Ｉｒ＋５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ、 ０ｓａｋａ。
ｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （Ｉ Ｆ’ Ｏ−１４１
４１）（Ｉｒ＋５ｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎ
ｔａｔｉｏｎ、 ０ｓａｋａ。
ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ＆ｌ
１（１９８３） ’３より、自体公知の方法ＣＭｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
１（１９８３） ’３より、自体公知の方法ＣＭｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
６８、３４２（１９７９） ）に従い、染色体ＤＮＡを
調ＦＰｕＬだ。その染色体Ｄ Ｎ Ａ ８．８μすを３
６ユニツトの制限酵素ＢｇｌＩＩと３７℃、５０分間反
応させて切断し、６５′Ｃで１５分間加熱処理したのち
、エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。一方、参考
例１でＮＬＭ 製したクローニングベクターｐＢＴＭ３
４９（２，９μｇ）を３０ユニツトの制限酵素Ｂｇｌ：
［と３７℃、５０分間反応させて切断し、０５ユニツト
のアルカリ性フオヌファターゼを加えて６５′Ｃ，３０
分間保温したのちフェノール抽出。
調ＦＰｕＬだ。その染色体Ｄ Ｎ Ａ ８．８μすを３
６ユニツトの制限酵素ＢｇｌＩＩと３７℃、５０分間反
応させて切断し、６５′Ｃで１５分間加熱処理したのち
、エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。一方、参考
例１でＮＬＭ 製したクローニングベクターｐＢＴＭ３
４９（２，９μｇ）を３０ユニツトの制限酵素Ｂｇｌ：
［と３７℃、５０分間反応させて切断し、０５ユニツト
のアルカリ性フオヌファターゼを加えて６５′Ｃ，３０
分間保温したのちフェノール抽出。
エーテル抽出し、エタノール沈みを行った。両法ｔ・夕
を水に溶解して混合し、これに６６ ｎｍｏｌｅのＡＴ
Ｐ 、２８ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造鎧）
およびリガーゼｆｉ６ｒ液を加えた反応液（１００μｂ
）を１１で３２時間保温したのち、エタノール沈殿を行
った。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解し、これを用いてＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌ Ａ２７４の形質転換を行った。
を水に溶解して混合し、これに６６ ｎｍｏｌｅのＡＴ
Ｐ 、２８ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造鎧）
およびリガーゼｆｉ６ｒ液を加えた反応液（１００μｂ
）を１１で３２時間保温したのち、エタノール沈殿を行
った。沈殿をＴＥ緩衝液に溶解し、これを用いてＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌ Ａ２７４の形質転換を行った。
カナマイシン耐性の形質転換株の中からＣＰ寒天培地（
酵母エキス０．２％、ペプトン１％１食塩０．２％、カ
ゼイン１％、寒天１．５％、ｐＨ７，３）のプレート上
でハロー（Ｌ （／ｅｈａｒａら、 、ｒ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏＬ、 １１９ 、８２（１９７４） 〕を形成
する菌株を選択し、その１株から単４したグラスミドを
ｐＢＴＭ１２７ と命名した。本プラスミドはグラスミ
ドｐＢＴＭ１１９のＢｇｌＩＩ部位にＢ、ａｍｙ−１ｏ
１１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （工ｔｏ−１４ｔ４ｘ）の
中性グロテアーゼ遺伝子を含むＢｇｌｌＩ断片（３，９
Ｋｂ）が挿入されたものである（第２図参照）。
酵母エキス０．２％、ペプトン１％１食塩０．２％、カ
ゼイン１％、寒天１．５％、ｐＨ７，３）のプレート上
でハロー（Ｌ （／ｅｈａｒａら、 、ｒ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏＬ、 １１９ 、８２（１９７４） 〕を形成
する菌株を選択し、その１株から単４したグラスミドを
ｐＢＴＭ１２７ と命名した。本プラスミドはグラスミ
ドｐＢＴＭ１１９のＢｇｌＩＩ部位にＢ、ａｍｙ−１ｏ
１１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （工ｔｏ−１４ｔ４ｘ）の
中性グロテアーゼ遺伝子を含むＢｇｌｌＩ断片（３，９
Ｋｂ）が挿入されたものである（第２図参照）。
なお、本プラスミドｐＢＴＭ１２７ を有するＢ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７４／ＰＢＴＭ１２７ は財
団法人発酵研究所に工ＦＯ−１４３０６として寄託され
ている。
団法人発酵研究所に工ＦＯ−１４３０６として寄託され
ている。
実施例２
中性プロテアーゼの生成
り、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ （工ｒｏ
−ｚ４１４ｔ）、ｐＢＴＭ１１９を保持するＢ、 ５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ Ｉ Ａ ２７４（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ Ｉ Ａ２７４／ｐＢＴＭ １１９ ）およびｐＢＴ
Ｍ１２７ を保持するＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌ Ａ
２７４（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７４／ｐＢ
ＴＭ１２７）をそれぞれＦＷ、ｉｎエキス０．２％、ペ
プトン１％、 Ｎａ１ｌ ０．２％、カゼイン１％から
なる４０耐のＣＰ培地（ｐＨ７３）を含む２００ｖｌ容
三角フラスコで２８℃２４時間及び４８時時間表り培養
した。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎ−ａ 以外の場合には培地中に５μＱ／ｌ
ｔｉのクロラムフェニコールを加えた。得られた培うｆ
液を遠心分離し、その上清を水に対し−Ｃ１８１４１１
１透析して酵素液を調製した。プロテアーゼ活性はＭｊ
、ｙａｔａ らの方法（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ。
−ｚ４１４ｔ）、ｐＢＴＭ１１９を保持するＢ、 ５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ Ｉ Ａ ２７４（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ Ｉ Ａ２７４／ｐＢＴＭ １１９ ）およびｐＢＴ
Ｍ１２７ を保持するＢ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌ Ａ
２７４（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７４／ｐＢ
ＴＭ１２７）をそれぞれＦＷ、ｉｎエキス０．２％、ペ
プトン１％、 Ｎａ１ｌ ０．２％、カゼイン１％から
なる４０耐のＣＰ培地（ｐＨ７３）を含む２００ｖｌ容
三角フラスコで２８℃２４時間及び４８時時間表り培養
した。なお、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎ−ａ 以外の場合には培地中に５μＱ／ｌ
ｔｉのクロラムフェニコールを加えた。得られた培うｆ
液を遠心分離し、その上清を水に対し−Ｃ１８１４１１
１透析して酵素液を調製した。プロテアーゼ活性はＭｊ
、ｙａｔａ らの方法（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｕ、 ３４ 、３１０（１９７０） ）を用いて
、ｐＨ７および１０で測定し、表１にその結果を示した
、。
、ｐＨ７および１０で測定し、表１にその結果を示した
、。
表１ 各１−１ｎ菌株の菌体外グロテアーゼ活性屯位は
ユニット１ｍ１ｗ１養上清 表１に示したように１３．５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７
４／ｐＢＴＭ１２７はＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ （工Ｆ’０１４１４１）に比べ１０倍以上
高い中性プロテアーゼ生産能を示した。なお、このプロ
テアーゼ活性は１０ ｍＭ ｌｉｌ：ＤＴＡ によって
完全に失活した。
ユニット１ｍ１ｗ１養上清 表１に示したように１３．５ｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ２７
４／ｐＢＴＭ１２７はＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ （工Ｆ’０１４１４１）に比べ１０倍以上
高い中性プロテアーゼ生産能を示した。なお、このプロ
テアーゼ活性は１０ ｍＭ ｌｉｌ：ＤＴＡ によって
完全に失活した。
以上の結果から、クローニングされた遺伝子は中性プロ
テアーゼをコードすることが明らかになった。
テアーゼをコードすることが明らかになった。
実施例３
中性プロテアーゼ遺伝子のサブクローニング実施例１で
得られたプラスミドｐＢＴＭ１２７（８０μｇ ）を制
限酵素ＢｇｌＩＩ ＜ ２００ ユニット）と３７ｔ：
、１時間反応させて切断しだのち０．７％アガロ−スゲ
／Ｌ’電気泳動にかけ、分子量の小さい！方０パ′ド′
）″を切シ取９だ・こ０ゲ′中０Ｄ、ＮＡを電気泳動溶
出法（遺伝子操作マニュアル。
得られたプラスミドｐＢＴＭ１２７（８０μｇ ）を制
限酵素ＢｇｌＩＩ ＜ ２００ ユニット）と３７ｔ：
、１時間反応させて切断しだのち０．７％アガロ−スゲ
／Ｌ’電気泳動にかけ、分子量の小さい！方０パ′ド′
）″を切シ取９だ・こ０ゲ′中０Ｄ、ＮＡを電気泳動溶
出法（遺伝子操作マニュアル。
１Ｋｂ）が得られた。
１ 得られたＢｇｌＪＩ断片（３μｇ ）を制限酵素Ｈ
１ｎｄＩＩ！ （６ユニツト）で３７℃、１時間処理し
てＡ断片（Ｂｇｌｌ［−Ｈｌｎｄｌｌ（、約Ｑ８Ｋｂ
）、Ｂ断片（Ｈ１ｎ＋１ｌｌｌ −ＩＬｌ、ｎｄｌｌｌ
、約１，１４ｂ）訃よびｃ ＋ｊＪｉ片（ＴＨｎｄＪｌ
Ｆ−１３ｇ１１１ 、約ｔ、ｃ＋ｘｂ）の３つの断片に
切断し、エタノール沈巖を行った。一方、プラスミドｐ
ＢＴＭ１２６ （］、ＩＩリ ）を制御膜酵素Ｔ（ｉｎ
ｄＩ［ｒ（５ユニツト）で３７１Ｅ、１時間反応させて
切断したのちエタノール沈婚を行った。両法嵯を水で溶
解し、これにｌ Ｑ Ｑ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、８．
４ユニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｉガーゼ（宝酒造練）および
リガーゼ緩ｆ＋ｊ ？＆を加えた反応液（１００／ｚ７
１）を１１℃で２４時間保温し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ＳＩＡ２７４の形質転換を行った。カナマイシンｌｌ′
ｌｉ↑性、クロラムフェニコール感受性の形質転換株か
らプラスミドを調製した結果、２種類のプラスミドが得
られ、それぞれをｐＢＴＭ５０８ （６，２Ｋｂ ）お
よびｐＢＴＭ５１５ （７，７Ｋｂ ）と命名した。プ
ラスミドｐＢＴＭ５１５はプラスミドｐＢＴＭ１２６の
ＨｌｎｄＩｌ［部位にＡ ｌｌｉ片とＣ断片が互に逆方
向で挿入されたものであり、プラスミドｐＢＴＭ５０８
はプラスミドｐＢＴＭ１２６のＨｉｎｄｌ［部位にＢ断
片が挿入されたものである（第３図参照）。これらのプ
ラスミドを保持する菌株のｃｐ培地プレート上でのハロ
ー形成能を調べたところ、ｐＢＴＭ５１５保持株はハロ
ー形成能を示し、ｐＢＴＭ５０８保持株はハロー形成能
を示さなかった。
１ｎｄＩＩ！ （６ユニツト）で３７℃、１時間処理し
てＡ断片（Ｂｇｌｌ［−Ｈｌｎｄｌｌ（、約Ｑ８Ｋｂ
）、Ｂ断片（Ｈ１ｎ＋１ｌｌｌ −ＩＬｌ、ｎｄｌｌｌ
、約１，１４ｂ）訃よびｃ ＋ｊＪｉ片（ＴＨｎｄＪｌ
Ｆ−１３ｇ１１１ 、約ｔ、ｃ＋ｘｂ）の３つの断片に
切断し、エタノール沈巖を行った。一方、プラスミドｐ
ＢＴＭ１２６ （］、ＩＩリ ）を制御膜酵素Ｔ（ｉｎ
ｄＩ［ｒ（５ユニツト）で３７１Ｅ、１時間反応させて
切断したのちエタノール沈婚を行った。両法嵯を水で溶
解し、これにｌ Ｑ Ｑ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、８．
４ユニツトのＴ４ＤＮＡ！Ｉガーゼ（宝酒造練）および
リガーゼ緩ｆ＋ｊ ？＆を加えた反応液（１００／ｚ７
１）を１１℃で２４時間保温し、Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉ
ＳＩＡ２７４の形質転換を行った。カナマイシンｌｌ′
ｌｉ↑性、クロラムフェニコール感受性の形質転換株か
らプラスミドを調製した結果、２種類のプラスミドが得
られ、それぞれをｐＢＴＭ５０８ （６，２Ｋｂ ）お
よびｐＢＴＭ５１５ （７，７Ｋｂ ）と命名した。プ
ラスミドｐＢＴＭ５１５はプラスミドｐＢＴＭ１２６の
ＨｌｎｄＩｌ［部位にＡ ｌｌｉ片とＣ断片が互に逆方
向で挿入されたものであり、プラスミドｐＢＴＭ５０８
はプラスミドｐＢＴＭ１２６のＨｉｎｄｌ［部位にＢ断
片が挿入されたものである（第３図参照）。これらのプ
ラスミドを保持する菌株のｃｐ培地プレート上でのハロ
ー形成能を調べたところ、ｐＢＴＭ５１５保持株はハロ
ー形成能を示し、ｐＢＴＭ５０８保持株はハロー形成能
を示さなかった。
次にプラスミドＰＢＴＭ１２７ （１μｇ ）をＥｃ。
ＲＩ（３ユニツト）およびＢｇｌｌＩ（２ユニツト）で
、またプラスミドｐＵＢ１１０（１μｇ）をＥｃ。
、またプラスミドｐＵＢ１１０（１μｇ）をＥｃ。
ＲＩ（３ユニツト）およびＢａｍＨＩ （５ユニツト）
で３７ｔ：、１時間それぞれ反応させて切断したのち、
６５℃で１０分間加熱して反応を止め、それぞれエタノ
−１？°／沈鎌を行った。両法澱を水に溶解したのち混
合し、これにｌ Ｑ Ｑ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、８．
４ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリ
ガーゼ緩衝液を含む反応液（１００μｌ）を１１℃で２
４時間保温し、これを用いてａｓｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ
２７４の形質転換を行った。カナマイシン耐性の形質転
換株の中からハローを形成する株を選びそのプラスミド
をｐＢＴＭ５２３ と命名した。本プラヌミドはプラス
ミドｐＵＢ１１０のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ工部位にプラ
スミドｐＢＴＭ１２７のＥｃｏＲニーＢｇｌｌＩ断片が
挿入されたものである（第４図参照）。なおこのＥｃｏ
ＲＩ−ＢｇｌＩ［断片はｐＢＴＭ１２７のＢｇ：Ｌｌ［
断片のＢ断片の１部およびＣ断片からなっている。
で３７ｔ：、１時間それぞれ反応させて切断したのち、
６５℃で１０分間加熱して反応を止め、それぞれエタノ
−１？°／沈鎌を行った。両法澱を水に溶解したのち混
合し、これにｌ Ｑ Ｑ ｎｍｏｌｅ のＡＴＰ、８．
４ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造製）およびリ
ガーゼ緩衝液を含む反応液（１００μｌ）を１１℃で２
４時間保温し、これを用いてａｓｕｂｔｉｌｉｓ ｌＡ
２７４の形質転換を行った。カナマイシン耐性の形質転
換株の中からハローを形成する株を選びそのプラスミド
をｐＢＴＭ５２３ と命名した。本プラヌミドはプラス
ミドｐＵＢ１１０のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ工部位にプラ
スミドｐＢＴＭ１２７のＥｃｏＲニーＢｇｌｌＩ断片が
挿入されたものである（第４図参照）。なおこのＥｃｏ
ＲＩ−ＢｇｌＩ［断片はｐＢＴＭ１２７のＢｇ：Ｌｌ［
断片のＢ断片の１部およびＣ断片からなっている。
以上の結果から、中性プロテアーゼ遺伝子はＣ実施例４
実施例３で得られたＢｇｌＩＩ−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片（
１，９Ｋｂ ）の１０ｔｔＱを制限赫素ＡｃｃＩ （５
０ユニツト）と３’１．１時間反応させて切断した。こ
の反応面を１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、１
、７ Ｋ、ｂのＨｌｎｄＪｌｔ−ＡｃｃＩ 断片のバン
ドを切シ取り、電気泳動浴出したのち、フェノ−μ抽出
。
１，９Ｋｂ ）の１０ｔｔＱを制限赫素ＡｃｃＩ （５
０ユニツト）と３’１．１時間反応させて切断した。こ
の反応面を１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、１
、７ Ｋ、ｂのＨｌｎｄＪｌｔ−ＡｃｃＩ 断片のバン
ドを切シ取り、電気泳動浴出したのち、フェノ−μ抽出
。
エーテル抽出およびエタノ−７し沈婚を行い、３μｑの
ＨｌｎｄＪＩＬ−ＡｃｃＩ 断片を得た。本断片の塩基
配列をＭｏｘａ、ｒａ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法ＣＰｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｏａｄ、 Ｓｃｉ。
ＨｌｎｄＪＩＬ−ＡｃｃＩ 断片を得た。本断片の塩基
配列をＭｏｘａ、ｒａ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法ＣＰｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｏａｄ、 Ｓｃｉ。
ぴ、５６０（１９７７））によって決定したところ、中
性プロテアーゼの構造遺伝子のＣ末端がら約３０コのア
ミノ酸をコードする領域が欠損していることが明らかに
なった。
性プロテアーゼの構造遺伝子のＣ末端がら約３０コのア
ミノ酸をコードする領域が欠損していることが明らかに
なった。
第１図はプラスミドｐＢＴＭ１１９の制限酵素切断地図
を示し、第２図はプラスミドｐＢＴＭ１２７の制限酵素
切断地図を示す。 第３図はプラスミドｐＢＴＭ５０８およびｐＢＴＭ５１
５ の構築図を示し、第４図はプラスミドｐＢＴＭ５２
３の構築図を示す。 第５図はＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎａ
（Ｉ Ｆ’ Ｏ−１４１４１）から得られた中性プロテ
アーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限＃累地図を示す。 洟乞Ａ 〒 ｈｏＪｏ＋
を示し、第２図はプラスミドｐＢＴＭ１２７の制限酵素
切断地図を示す。 第３図はプラスミドｐＢＴＭ５０８およびｐＢＴＭ５１
５ の構築図を示し、第４図はプラスミドｐＢＴＭ５２
３の構築図を示す。 第５図はＢ、 ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎａ
（Ｉ Ｆ’ Ｏ−１４１４１）から得られた中性プロテ
アーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限＃累地図を示す。 洟乞Ａ 〒 ｈｏＪｏ＋
Claims (1)
- プロモーターおよび中性プロテアーゼ遺伝子のシグナル
ペプチドをコードする領域を含有し、中性プロテアーゼ
をコードする領域を３゛末端側から一部ないし全部欠く
ＤＮ八へ
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59001204A JPS60145090A (ja) | 1984-01-06 | 1984-01-06 | Ｄνａ |
| EP84115551A EP0151760A1 (en) | 1984-01-06 | 1984-12-15 | Novel DNA and use thereof |
| KR1019850000022A KR850005497A (ko) | 1984-01-06 | 1985-01-05 | Dna 및 그의 이용 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59001204A JPS60145090A (ja) | 1984-01-06 | 1984-01-06 | Ｄνａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60145090A true JPS60145090A (ja) | 1985-07-31 |
Family
ID=11494928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59001204A Pending JPS60145090A (ja) | 1984-01-06 | 1984-01-06 | Ｄνａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60145090A (ja) |
-
1984
- 1984-01-06 JP JP59001204A patent/JPS60145090A/ja active Pending
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