JPS60146834A - 歯周炎抑制用抗体の製法及び同抗体を含有する歯周炎抑制用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、口腔内細菌の作用によって誘発されまたは悪
化された歯周炎を予防し、または少なくとも抑制するだ
めの（以下抑制と′いう）抗体の製造方法および本抗体
を含有する−１−う触性組成物に関する。

この明細書において歯周炎というのは、ヒトおよび動物
の口腔内の歯肉、セメント質、歯槽骨のような歯周部に
生じる広節囲の疾患のことであって、一般に、歯＊ｐ漏
のような縁辺性歯周炎と根尖性歯周炎とに分類されてい
る。歯周炎には各種の病因が知られているが、たとえば
歯面におけるプラークの形成や歯周組織におけるポケッ
トの形成のような、各種の口腔内微生物による有害な生
物学的作用も歯周炎の病因の一つであるとされている。

この稗の有害な口腔内微生物の例は、アクチノミセス・
ビスコ−ジス、同ナエスルンデイ、アクチノバチルス・
アクチノミセテムコミタンス、バクテロイデス・ジンジ
パリウス等である。このうち最も重要な微生物はアクチ
ノミセス・ビスコ−ジスであって、本菌ｔましよ糖から
多幇のレバン多糖体を産生ずる。この多糖体は歯面また
は口腔粘膜に付着［７て歯周組織を傷つける。アクチノ
ミセス・ビスコ−ジス以外の前記微生物の歯周炎誘発能
は必ずＬ７もアクチノミセス・ビスコ−ジスＩ丘どに１
乍くはないが、これらは、アクチノミセス・ビスコ−ジ
スとの共存下において歯周炎をかなり悪化させることが
知られている。オた歯周炎の病巣中の口腔内細菌の大部
分が、アクチノミセス・ビスコ−リス等前記の微生物で
あることも実際にしばしば観察されている。

歯周炎を効果的に処理するための各種の提案が従来試み
られている。しかし歯周炎を予防し、または少なくとも
抑制するための抗体は従来知られていない。この間、歯
周炎誘発能全有するある樵の口腔内微生物が細胞表面に
線毛を有し、これをもって歯面や口腔粘膜の表面に付着
（感染）することが知られていたが、歯周炎の病因とい
う観点において、この稗の線毛の抗原的性負はまだ解明
されていなかった。

本発明は、歯周炎誘発能または悪化能を有する各種の口
腔内微生物の線毛由来の抗原が歯周炎を効果的に抑制し
得るという知見に基いている。

本発明の目的は、歯周炎誘発能または悪化能を有しかつ
細胞表面に線毛ｆ！：廟する口腔内微生物の作用によっ
て誘発または悪化された歯周炎を抑制するための抗体の
製造方法およびこの種の抗体を含有する非う触性組成物
を提供することにある。

本発明により、歯周炎誘発能または悪化能を有しかつ細
胞表面に線毛を有する口腔内微生物によって誘発または
悪化された歯周炎を抑制する方法が提供される。この方
法は、歯周炎誘発能または悪化能を有する口腔内微生物
の線毛から抗原を単離し、この抗原で呻乳動物を免疫す
ることによって、対応する抗体を動物の体内に産生じ、
これを動物から採取する工程からなっている。

本発明による抗体を簡単にしかも効果的に投与するため
に、本発明によって提供される非う触性組成物は、本発
明によって得られる抗体を有効成分とし、生理学的に許
容し得る担体または賦形剤と共存させてなるものである
。

本発明による抗原をヒトまたは動物に投与することによ
って、少なくとも同種にぞくする有害な口腔微生物が歯
面または口腔粘膜に付着すなわち感染するのを直接に抑
制することができないばかりでなく、活性物質は消化器
および血液を通って唾液中に現われる。しかし、本抗体
の作用によって、有害な微生物自体の増殖や、たとえば
レバン多糖体の形成を抑制することはない。抑制された
口腔微生物は、歯面や口腔粘膜表面に付着する代わシに
、塊状になって唾液中に凝集されるので、たとえば歯み
がき剤、うがい剤のような常法によって、口腔から容易
に除去することができる。ヒトおよびハムスターを用い
た各種試験の結果、本発明による抗体を、とくに非う触
性組成物の形状で投与することによって、たとえば数週
間の連続投与の後に有害微生物が駆除されることがわか
った。

この明細書において、線毛成分抗原というのは、歯周炎
誘発能または悪化能を有゛しかつ細胞表面に線毛を有す
る口腔微生物の線毛から単離した抗原のことである。

本発明による線毛抗原製造原料として、歯周炎誘発また
は悪化能を有しかつ細胞表面に線毛を有するすべての口
腔内機生物、たとえばアクチノミセス・ビスコ−ジス、
同ナエスルンデイ、バクテロイデス・ジンジバリウス、
アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス等を用
いることができ、また歯周炎誘発または悪化能を有しか
つ細胞表面に線毛を有する限シ、これらの微生物の変異
株も用いることができる。最も重要な微生物は、アクテ
ノミセス・ビスコ−ジスであるが、前述の理由によって
、一つ以上の他の微生物起源の抗体とアクテノミセス・
ビスコ−ジス起源の抗体とを併用することが実用的であ
る。

本発明の目的にとって、歯面または口腔粘膜表面への付
着能の高い口腔微生物を、線毛抗原製造原料とするのが
有利である。所望の菌株を選矩するために、たとえば試
験管壁への高い付着能やハムスターの口腔内での高いう
蝕誘発能を基準とすることができる。

下記の笑施例および試験例において、アクチノミセス・
ビスコ−ジス’Ｒ異味に−ＴＬ＋　株（Ａｃｔ、ｉ−ｎ
ｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ　Ｍｕｔａｎｔ　５ｔ
ｒａｉｎ　Ｋ−ＴＬ＋　）　（微工研条寄第４１１号）
およびバクテロイデス・ジンジパリウス株に−Ｂｇ−ｍ
１株（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉ　−ｎｇｉｖａｒ
ｉｕｓ　５ｔｒａｉｎ　Ｋ−Ｂｇ−ｍｌ　）　（微工研
東寄第４１０号〕が用いられている。前者は、本発明者
によって、対応する野外株から常法によって誘導された
人工的変異株である。本変異株を、たとえばＴＹＣ寒天
平板培地等で培養すると、しょ糖から多祉のレバン多糖
体を産生ずる。また液体培地で培養すると、増殖した多
葉の自体が管壁に付着する。本変異株を長期間継代培養
するか、または、ニトロングアニジン、ナイトロジエン
マスタード、紫外線照射のような各種の公知変異手段で
処理しても、親株への逆変異や他の変異株の用現線認め
られず、本変異味社遺伝学的に安定であることがわかっ
た。本襞異味をハムスターに投与すると、口腔内で歯面
や粘膜表面によく付着し、動物をう蝕銹発飼料で飼育す
ると、歯槽骨吸収の調査から、強い歯周炎誘発能の存在
が認められた。

バクテロイデス・ジンジバリウム株に−Ｂｙ、−ｍ１株
は、強い赤血球凝集能および高い細胞付着能の観点から
、ヒトの歯周炎から分離された多数の野外株を選別して
得られた菌株でらる。これを同種の多くの野外株とくら
べると、本菌株は口腔粘膜上皮細胞への強い伺宥能と強
い赤血球凝集能とを特徴としている。本菌株をハムスタ
ーに経口投与した場合、その付着能は必ずしも甚しく高
いわけではないが、たとえば、前記の変異株に−ＴＬ十
株をハムスターに一感染させ、次に歯周炎の病状か始ま
る直前またａ直後に、本ジンジバリウス株を経口投与す
ると、本菌株はよく付着する。この種の混合感染によっ
て生じる歯周炎は、上記変異株に一’Ｉ’Ｌ十株単独感
染の場合よシも著しく強力であることがわかった。

これら菌株の菌学的性状は下記の通りである。

（Ａ）　アクチノミセス・ビスコ−ジス変異株に−ＴＬ
十株（微工研条寄第４１１号） １、形態　グラム陽性桿菌、Ｉ　Ｘ　３−４μ■、生育
特性　嫌気性 ■、各様培地での生育 （ｌｌ　ＴＹＣ寒天平板培地［ｐＨ約７．２；ストッペ
ラー他、Ａｒｃｈ　０ｒａｌ　Ｅｉｏｌ、、　１２＋　
１９１１−１２０１　（１９６７）　］ コロニーは粗く、盛シ上がり、粒状で、固く、白色で、
多量のレバ／多糖体で覆われ、縁辺は不規則である。

（２）　フレイン・ハート・インフユーリョン寒天平板
培地（ｐＨ約７．４＋９ｃｍシャーレ；米国、ＢＢＬ社
製） コロニーは円形、無色、厚く透明で、 表面は均一で平滑。縁辺は規則的。

（３）トリプトケース・ソーイ・ブロス（ｐＨ約７．８
　ｉ　ＢＢＬ　） 培地の下層から増殖する。

（４１１−ラド・ヒユーイツト・ブロス（ｐＨ約７．８
；米国、ＢＢＬ社！！り 培地の下層から増殖する。

■、生理学的性状 （１）レバ／多糖体産生能　＋ （２）管壁付着能　＋＋＋ （３）　色素産生能　− （４）生育範囲　ｐＨ６−８，５、温度２２−３９°Ｃ
（５１糖分解 アトニット、アラビノース、デキスト リン・・・陰性；フラクトース、ガラクトース、グルコ
ース・・・陽性；キシロース、イヌリンおよびラクトー
ス・・・陰性；マルトース、マンノース、メルビオース
、ラフィノース、ンユクロース・・・陰性 ■、その他 （１）　カタラーゼ　＋ （２）インドール　− （３）　硝酸塩還元性　＋ （４）　仇化水素産住　十 （５）ゼラチンの液化　− （６）エスクリン加水分解　＋ （７）　口腔粘膜上皮細胞への付着能　＋＋Ｖ１．Ｑ物
への感染能 歯周炎誘発（歯槽骨吸収により判定）＋＋＋（Ｊ３）　
バクテロイデス・ジンジパリウス株に−Ｂｇ−ｍ１株（
微工研条寄第４１０号） ■、形態　グラム陰性桿菌、０．５　Ｘ　Ｏ，８μＵ、
生育特性　個性、嫌気性 ■、各種培地での生育 （１＋　１０チ血液寒天平板培地（ｐＨ約７．３；米国
、ＢＢＬ社製） コロニーは円形、大きく、偏平、やや 沢 光ｒがあり、黒色で表面と縁辺は平滑。

溶血性なし、 （２）バクテ四イデス寒天平板培地（ｐＨ約７．２；９
ｃＷＬシャーレ；日永製薬製） コロニー性円形、やや小さく、偏平、 均一、透明。表面および縁辺は平滑である。

（３）トリプトケース・ソーイ・ブロス（ｐＨ約７．８
；米国、ＢＢＬ社製） 培地の下層から生育する。

■、生理学的性状 （１）　色素産生能　陰性 （２）生育範囲　ｐａ５．ｏ−８，５、温度２２−３９
℃（３）糖分解 アトナイト、アラビノース、デキスト リン、フルクトース、ガラクトース、グルコース、イヌ
リ／、ラクトース、マニトール、マンノース、メリビオ
ース、ラフィノース、シュクロース・・・陰性 ■、その他 （１）運動性　陰性 （２）インドール産性　十 （３）硝酸塩還元性　陰性 （４）硫化水素産性　十 （５）ゼラチンの液化　＋ （６）　エスクリンの加水分解　陰性 （７）　口腔粘膜上皮細胞への付着性　千十＋（８）赤
血球凝集能　＋十＋ ■、動物への感染性 歯周炎誘発能（歯槽骨吸収により判定）土木発明に用い
られるアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス
およびアクチノミセス・ナエスルンディは、米国、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション・カタログ
、第１４版。

漢および２７頁、（１９８０年）Ｋ記載されている公知
劇でおる。

本発明の目的に用いられる微生物は、対応する種の各種
微生物の培養に用いられる常法にょシ培養することがで
きる。従って、天然培地でも合成培地でも培養できるが
、大量生産には液体培地が適している。たとえば温度２
２−３９℃（とくに約３７℃）　、ｐ）１５．０−８．
０　（とくに約７．４）で嫌気的に、たとえば２４−７
２時間培養するとよい。適当な培地の例は次の通シであ
る。

培地Ａ トリプトケース・ペゾトン（・１．７　％％ＢＢＬ）、
ファイトン・ベブトｙ　（０，３％、ＢＢＬ　）、イー
スト・エキス（０，５％、米国、ディフコ社製）、ノリ
ン酸カリウム（０，２５１）、塩化ナトリウム（０，５
チ）、グルコース（０，，２５％）、ｐ）ｌ＝約７．４
゜ 培地Ｂ 培地Ａにヘミン（０，００７チ）を加える。

培地Ｃ 培地Ａにヘミン（０，００５％　）ビタミンＫ（０，０
００１チ）を加える。

培地Ａはアクチノバチス属、培地Ｂ、δはアクチノバチ
ルス属およびバクテロイデス鵬微生物に適している。

免疫用抗原液の調製方法を次に例示する。微生物を３５
−３７℃、ｐＨ６，５−７，５，２４−４８時間培養す
ると種培地が得られる。これを同じ組成の本培地に移し
、同じ条件で４８−７２時間培養する。

培養終了後の培養物中の生菌数は通常約１０８個／ｍ１
以上で必る。たとえば遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、
　）／ガ）分）によって培養物から菌体を分離し、周知
の適当な緩衝液、たとえば０．１−１　Ｍ酢酸／酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６，８−８，０）、０．０１−０
、’７５Ｍリン酸塩緩衝ＩＭ食塩水（１）Ｈ６，５−８
，０）などに浮遊させる。浮遊液にトリトンＸ　−１０
０（ｏ、ｏｏｉ　−ｏ、ｏｉ％、米国、ローム・アンド
・ハース社製）のような非イオン系界面活性剤を加えて
もよい。

細胞浮遊液を超音波処理（例、１０−２０　ｋＨｇ　１
５−１０分）することによって、所望の線毛抗原を抽出
する。所望の抗原を含む抽出液をたとえばカラム分画法
、等電点沈降法、冷ｍ媒（例、エタノール）を用いる分
別沈殿法、膜濃縮法、硫酸アンモニウムを用いる塩析法
などの単独または組合わせ使用によって、分画精製する
ことができる。

所望により、得られた抗原液を、たとえばホルマリン（
０，２−０，０２％）のような適当な不活化剤で処理し
、次に同様の緩衝液を用いて透析することによシ、抗原
を不活化することもできる。

抗原液を適当な緩衝液、たとえば０．１−　Ｉ　Ｍリン
酸塩緩衝０．９チ食塩水（ｐ）１６．２−７．０ンで希
釈して、タンパクＮの量を５−５ｏμｔ／ｌｎｌに調整
する。希釈液に水酸化アルミニウムをアリュバンドとし
て加え、抗原を吸着する。アルミニウムの最終濃度を約
１００−５００μ９７−とすればよい。水酸化アルミニ
ウムの代わりに、等量のフロイント完全アリュパントを
用いてもよい。

この液にテメロサール（０，００５−０，１＊　ｗ／ｖ
　）のような適当な防腐剤を加えてもよい。以上によっ
て免疫用抗原液が得られる。

超音波処理に代えて、細胞浮遊液に硫酸アンモニウム約
２０−７０％（例、ａＯＳ）を加え、液をかく拌して硫
酸アンモニウムを溶解させ、溶液を低温、たとえば４℃
で２４−４８時間、所望の抗原が沈殿するまで放置する
。上清を回収し、沈殿部を集め、０．０５−０．５Ｍリ
ン酸酸塩緩衝材食塩水（ｐＨ約７．０−８．０　）のよ
うな適当な緩衝液に濃厚に浮遊させ、同様の緩衝液を用
いて低温（例、４℃）で透析する。透析内液を遠心処理
（例、８０００　ｒ、ｐ、ｍ、／加分）し、得られた抽
出液を上記と同様の方法で分別精製することもできる。

こうして得られた抗原液を低温（例、１０℃以下）で長
期間保存することができる。

本発明の目的に用いられる線毛成分抗原の変質を未然に
防止するために、抗原の回収、−単離および精！１１！
は、実用的には低温、たとえば１０’Ｃ以下で行われる
。

たとえばアクテノミセス・ビスコ−ジス由来の抗原液を
バクテロイデス・ジンジパリウス由来の抗原と混合し、
混合液で哺乳動物を免疫してもよい。または２つの抗原
液を別々に用いて同じ哺乳動物を免疫してもよい。

哺乳動物の免疫は常法による。通常、たとえばアクテノ
ミセス・ビスコ−ジス由来の抗原で１つの動物を免疫す
るが、所望にょシ、異なった菌株由来の２つ以上の抗原
で１つの動物を免疫することもできる。

免疫される哺乳動物として、たとえばマウス、ラット、
ウサギ、モルモット、山羊、馬、牛等を用いることがで
きる。抗原の用量は動物の種類や抗原の種類等によって
異なるが、通常、小動物にａ　ｉｏ　−５００μ９１大
動物には１００−２０００μｆ（タンパクＮ換算、１日
１回）を用いることができる。実用的には、たとえば２
−５回、２−５週おきに注射によって免疫することがで
きる。所望により、たとえば５−２ｎ倍量の抗原を連続
的に３−１２日間経口投与することもできる。

たとえばウサギをアクチノミセス・ビスコ−ジス由来の
抗原液で免疫する場合、タンパクＮ換算１００−３００
μ？の抗原を２−５回、２−５週問おきに注射すること
かできろう所望により、たとえばバクテロイデス・ジン
リバリウス、アクナノεセス・ナエスルンデイやアクチ
ノバチルス・アクテノミセテムコ２タンス由来の抗原を
加えてもよい。最終免疫から約２週間後に、常法によプ
動物から採血し、抗原を含有するプラズマを得る。所望
にょシ、プラズマを精製して抗血清とすることもできる
。哺乳動物の体内に投与された線毛抗原によって免疫グ
ロブリンが産生されることがわかった。得られたプラズ
マまたは抗血清を凍結乾燥して低温で長期間保存するこ
とができる。。

こうして得られた抗体をヒトおよび動物に直接投与する
こともできるが、簡単に効果的に投与するために、本抗
体を生理学的に許容し得る担体また社賦形剤と共存させ
てなる非う触性組成物が提供される。

本発明による非う蝕性組放物は固体、半固体または液状
であってよく、たとえば粉末、シ四ツブ、カプセル、粒
、錠剤、懸濁液、ドロップ、バッカル、トローチ等ても
よい。適嶋な賦形剤の例は、ラクトース、ポテトまたは
可溶性でん粉、ステアリン酸マグネシウム等で、適当な
担体の例は、食塩水、アーモンド油、乳酸菌料（ヨーグ
ルト）、フルーツジュース等である。

所望により、組成物は結合剤、安建剤、乳化剤、懸濁剤
、潤滑剤、防腐剤等筒知の添加物を含んでもよい。また
歯みがき剤、うがい剤、ギャンデー、アイスクリーム郷
の形状であってもよい。

本発明による抗体の足置を投与するため吟、組成物を、
たとえば錠剤、アンプル、バッカル、トローチ等の投与
単位として形成することができる。この種の投与単位は
、各抗体をヒトに対する日量２−４単位（後記）で投与
できるように形成することもできる。たとえば日量２−
４単位の各抗体を連続的に数週間経口投与すると、少な
くとも同種の有害微生物がヒトの口腔から消滅すること
が認められた。１種以上の多量の抗体がハムスターの口
１１９’ｒｃ長期間（６−１２ケ月以上）連続投与され
たか、病理学的試験の結果特記すべき異常は認められな
かった。

本発明を説明するための下記の実施例および試験例にお
いて、特記しない限り、培養は３７°Ｃで嫌気的に行な
われ、市販品培地は指定ｐＨで用いられ、試験動物とし
てはゴーデンノ・ムスター（１群１０匹）が用いられた
。

実施例】 アクテノミセス・ビスコ−ジス変異株に−ＴＬ十株（微
工研条寄第４１１号）の作出。

ヒトの歯槽膿漏病巣から採取し、菌学的および血清学的
性状からアクチノミセス・ビスコ−ジスの野外株である
ことを同定した菌株を、トリプトケース・ソイブロス培
地（ｐＨ７，３ｉ　４０＃Ｉ’　ｉ米国ＢＢＬ社製）で
３７℃、ス時間培養した。培養液を遠心処５！Ｍ（８０
００ｒ、ｐ、ｍ、；　２０分間）して菌体を分離した。

菌体を０．７５Ｍ１ｊン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７，０；
各２００　ｍｌ　）で３回遠心処理（各８００Ｏｒ、ｐ
、ｍ、　ｉ　２０分間）で洗浄後、０．２１ナイトロジ
エ／マスタードを含む０．７５Ｍリン酸塩緩衝食塩水（
＋）Ｈ７，０；　ｔｏｙ　）に浮遊し、３７℃で菌体数
の９０係以上が死滅するまで常温槽中に保持した（約６
０−９０分間）。この菌体浮遊液全上記方法に準じて、
０．７５Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７，０；各２００
　ｍｌ　）で３回遠心分離して洗浄した。残シの菌体を
ＴＹＣ寒天平板培地（ｐ）１７．４；９濡シャーレ；５
ｄ）上に塗り、３７℃、絽時間培養後、室温にＵ時間静
置し、できた集落を観察し、質的に硬い、辺縁不規則な
、塊状の多量のレバン多糖体を形成する集落を選んだ。

所望によシ、前記と同様の変異誘導、洗浄、選別を〈シ
返して、レバン多糖体産生能の高い菌株を分離して純粋
培養して、所望の変異株を作出した。

実施例２ バクテロイデス・ジンジパリウス株に−Ｂｇ　−ｍ１株
（微工研条寄第４１０号）の作出。

ヒトの出血性歯周炎の病巣から分離し、菌学的および血
清学的性状からバクテロイデス・ジ同 ンジパリウス野外株と２定した多数の菌株を次の方法で
処理して、赤血球凝集能および細胞付着能が著しく強い
菌株を選んた。

分離１株を１０％血液寒天平板培地〔血液寒天基礎培地
（米国、ＥＢＬ社ＩＩ　）　；　ｐＨ約７．３　；　９
　ｃｍシャーレ；１８ｍＡり上で３７℃、７２時間培養
をくシ返し、集落を選別し、それぞれトリシトケース・
ソイブロス（前記）２０１に３７℃、７２−９６時間培
養した。各培養液をマイクロタイタープレート法により
生理食塩水（１）Ｈ７，０）で倍数希釈し、各希釈液（
０，０２５ｒｎｌ　）に０．５１緬羊赤面球浮遊液（０
，０２５ｍｌ　）　ｆ加えて充分混和して室温にω−１
２０分間靜置した０ホール底に赤血球が一面にひろがっ
ているものを凝集陽性とし、最高希釈倍数の凝集力価を
示した。

実施例３ 抗体の製造 （ｌ）　アクチノξセス・ビスコ−ジス変異株に−ＴＬ
十株（微工研条寄第４１１号）を培地Ａ１００ｄで３７
℃、冴時間培養した種培養を同じ組成の培地Ａ　ｌ５０
００　ｍｌに接種し、３７℃、ス時間培養した。培養物
に結晶硫酸アンモニウムを３３憾飽和になるように加え
、４℃で一夜放置し、次に遠心処理（８０００ｒ、ｐ、
ｍ、／２０分間）によって菌体を分離した。これを０．
１Ｍリン酸塩緩衝１Ｍ食塩水（ｐＨ７，０−８，０；　
１５０　ｔｎｌ　）に浮遊し、４℃で毎分１−５回転で
約７２時間かく拌した。この浮遊液を遠心処理（８００
０ｒ、ｐ、ｍ／１）会１１１１）１．イ萌仕を詮委Ｌ−
μ漕ｆ　ｌ’（１蛎鉤和になるように硫酸アンモニウム
を加え、かく拌溶解させた後、４℃に４８時間靜靜置る
ことによって線毛成分を沈降させた。上清を除き、沈降
部分を遠心処理（５０００ｒ、　ｐ、　ｍ、　７１０分
間）して回収した沈降分画を、同様のリン酸塩緩衝１Ｍ
食塩水１００１１Ｌｌに浮遊させた。浮遊液を透析用セ
ロファンチューブに入れ、４℃、４８時間、同様のリン
酸塩緩衝１Ｍ食塩水５０００４以上を用いて、硫酸アン
モニウムが除去されるまで透析した。透析内液を遠心処
理（ｓｏｏ。

ｒ、ｐ、ｍ、／３０分間）して沈降物を除去して上清を
回収した。

上清（約２４０　ｍｌ　）をプロティンＮ含ｉ　１００
μｔ／ｙｄになるように、同様のリン酸塩緩衝１Ｍ食塩
水で希釈し、希釈液２００　ｍｌをしよ糖密度勾配超遠
心分離装置〔日立６５　Ｐ型超遠心機；ゾーナルロータ
ーＲＰ２３５Ｔ使用；しよ糖濃度５−３０％；　３５０
００　ｒ、ｐ、ｍ、　／　１８時間〕で処理したところ
、しよ糖濃度ｌｌ−２２チ付近の分画に所望の抗原が見
出された。そのタンパクＮ量は約４０μり／ｄであった
。こうして得られた抽出液をセロファンチューブに入れ
、ポリビニールピロリドンを用いて約１７ｔｏ量になる
まで濃縮した。濃縮液を０．７５ＭＩＪン酸塩緩衝食埴
水（ｐＨ６，２−６，５）テプロテインＮＦＩ）−１０
０μ２／ゴになるように希釈し、希釈液に等量のフロイ
ント完全アジュバントを加え免疫用抗原液とした。

（２）得られた抗原液を体重的３Ｋｆの家兎の背部゛　
皮下ＩＯケ所に常法により０．１Ｎ注射し、４週間後６
ｃ同じ方法で同量追加免疫し、さらに４週間後に常法に
より全採血した。分離した血清に硫酸アンモニウムを３
３％飽和になるように加え、かく拌溶解させ、４℃に４
８時間靜渡し、沈降した部分を遠心処理（８０００ｒ、
ｐ、ｍ、／加分間ンによって回収し、セロファンチュー
ブに入れ、４℃精製水中で硫酸アンモニウムがなくなる
まで透析したのち凍結乾燥して所望の抗体を製造した。

実施例４ バクテロイデス・ジンジバリウスに−Ｂｇ−ｍ１株（微
工研条寄第４１０号）を実施例３記載の方法に準じて、
培地Ｃで３７℃冴時間培養した培養液を遠心処理（８０
００ｒ、ｐｏｍ、　７２０分間）した菌体を０．１Ｍリ
ン酸酸塩緩衝材食塩水（ｐＨ８，０）　１５ＯＮに浮遊
し、４℃で毎分Ｊ−５回転に温和にかく拌しながら抽出
を行なうつこれを遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、７２
０分間）　して菌体ｆ除去する。！：抽出液１２０ｍ／
が得られた。

培養液遠心上清にＩＯ係塩化亜鉛溶ｔｉ、全かく拌しな
がら小量ずつ添加し、最終ｐ度１チになるようにした。

これを１０％炭酸ナトリウム溶液でｐＨ６，０に補正し
、４℃で冴時間静置して沈降させた。上清をサイフオン
で除去“し、沈降部分を遠心処理（５０００ｒ、　ｐ、
ｍ、　／　５分間）して集めた。

この沈殿に結晶リン酸二ナトＩＪウム・】２水塩１５０
　ｆを加えてよく練りまぜる。これをガラスフィルター
で吸引ｒ過し、さらにｌＯチリン酸二ナトリウム溶液約
３０ｙを流して洗浄吸引して生成したリン酸亜鉛を除去
すると約ｇ５　ｍｌの抽出液が得られた。

両抽出液約２１５ｄを混合し、飽和硫酸アンモニウム溶
液をＬ５０係飽和になるように加え、４℃、冴時間装置
して沈降させた。上清を除去し、沈降部分を遠心処理（
５０００ｒ、ｐ、ｍ、１５分間）によって分離した。こ
の沈殿をｌＯａ＋！！の０．Ｉ　Ｍ　ＩＪン酸塩緩衝Ｉ
Ｍ食塩水（ｐＨ８，０）に溶解し、２０００ｍＪの同処
方緩衝液中でセロファンチューブによって４℃、囚時間
以上透析した。

透析内液を遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、／３０分間
）して沈殿を除去すると約４５コの上清が得られた。

この溶液はタンパクＮ約２２■／　ｍｌであった。

精製濃縮は実施例３の方法に準じて行なった。

しよ糖密度勾配超遠心法でしょ糖濃度１６−２２　’Ａ
分画に線毛成分分画が回収された。この分画の緬羊赤血
球凝集能は１　：　１４８００倍以上でらった。

この抽出液を０．７５ＭＩＪン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ６
，２−６，５）でプロティンＮ　１００−２００μｔｈ
ａｔになるように希釈し、実施例３記載の方法に準じ、
フロイント完全アジュバント抗原ｔ−調製し、同様に家
兎に免疫して、所望の抗体を製造した。

実施例５ ヒトの歯周炎病巣から採取したアクチタノ９テルス・ア
クチノミセテムコミタンスを実施例３記載の方法に準じ
て培地ｃ　（１５０００ｍｌ　）で３７℃、冴時間培養
した培養液に結晶硫酸アンモニウムを３３チ飽和になる
ように加え、４℃、−夜装置し、遠心処理（８０００ｒ
、ｐ、ｍ、　７２０分間）によッテ菌体を分離した。こ
れを１５０ｍの０．１ＭＩＪン酸塩緩酸塩緩衝塩水（ｐ
Ｈ８，０）で線毛成分を抽出し、硫酸アンモニウム６０
多飽和で沈降分画を遠心処理（５０００ｒ、ｐ、ｍ、／
１０分間）して集め、同様のリン酸塩緩衝ＩＭ食塩水５
０００ｍ１以上を用いてセロファンチューブで透析した
のち遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、／３１分間）して
１ｓｏｍｚの上清を回収した。これをプロティンＮ含量
２００μｙ／ｒＩＬｔになるように同様のリン酸塩緩衝
１Ｍ食塩水で希釈し、希釈液２００ｄをしよ糖密度勾配
超遠心分離装置で処理した。しよ糖濃度１２−１５チ付
近の分画に所望の線毛成分抗原が回収された。そのタン
パクＮ量は約１４■／―でめった。

これを実施例３記載と同様に０．７５Ｍリン酸塩緩衝食
塩水（ｐＨ６，２−６，５）でプロティンＮ１００μｆ
／ｍｌになるように希釈し、等量のフロイント完全アジ
ュバントを加えて免疫用抗原を作成し、家兎に免疫し、
常法によシ全採血し、分離した血清を３３係硫酸アンモ
ニウム分画で精製し、所望の抗体を製造した。

実施例６以下記載の組成物に含有される抗体として、実
施例３、実施例４および実施例５記載の抗体の１種以上
を用いることができるが、便宜上１種の抗体量を示す。

各抗体の力価はグル内沈降反応による、２−４グル内沈
降価程度に調整した。

実施例６ ブドー糖１ｆ、抗体０．０５ｄ、可溶性でん粉０．０５
ｆを用いて常法によシバッカルを作った。

実施例７ ＣＭＣナトリウム０．２ｆ、２０俤果糖液２０ｄ、エチ
ルパラフィン０．０４　ｔ、抗体０．１　ｄを用いて、
常法によシシロップヲ作った。

実施例８ 歯みがき剤ケ次の方法で作った。

リン酸水素カルシウム微粉末６０％、グリセリｙ３０％
、ｃＭｅナトリウムｔＯ係およびパラベン（防腐剤）　
０．２５９６を混合し、抗体を加え、抗体の力価が前記
測足法で４ゲル内沈降価１５０ｙになるように調整した
。

試験例 下記試験において、２種以上の抗体を併用した組成物に
よる、野外株の付着抑制能をヒトおよび試験動物（ゴー
ルデンハムスターおよび砂ネズミ）を用いて試験した。

試験動物（ゴールデンハムスター−および砂ネズミ）の
数は特記しない限シ、各群雄６匹であった。

試験例１ 実施例８記載のアクテノミセス・ビスコ−ジス抗体含有
歯みがき剤を用いて、成人口腔７０−ラ中のアクチノミ
セス・ビスコ−ジス１Ｆ外株の変動を次の方法で調べた
。

成人男子加各から各３回、口腔から歯垢を採取し、ＴＹ
Ｃ寒天平板培地およびゾロピオン酸寒天平板培地を用い
て３７℃、冴時間培養して調べた結果、４名の口腔内に
アクテノミセス・ビスコ−ジスの存在ｆ：認めた。この
４名に朝夕食後に上記歯みがき剤を用いて任意の仕方で
歯みがきを実施させた。その後、週１回以上各人の歯垢
を採取して、前記の方法と同様に培養して、アクチノミ
セス・ビスコ−ジス含有菌数の変動を調べた結果、３名
については約２−３週後、残シの１名については約４週
後に野外株がほとんど検出されなくなった。結果を第１
表に示す。

即１表 試験例２ ボーデンハムスターの生後間日令を用いて試験を行なっ
た。第１、第２群は試験群で、第３．４群は対照群であ
る。実施例１記載のアクチノミセス・ビスコ−ジス変異
株に−ＴＬ十株（微工研条寄第４１０号）を培地Ａを用
いて３７℃、冴時間培養し、得られた培養液（生菌数約
１０８個／ｍＡ）の日量各０．１ｄを全群に５日間連続
して口腔内に投与し、定着させた。次に実施例２記載の
バクテロイデス・ジンジノ々リウスに−Ｂｇ−ｍ１株（
徽工研条寄第４１０号）全培地Ｃを用いて３７′ＵＳ２
４時間培養した培養液（生菌数約１０８個／ｍｌ）日量
各０．１ｍｌをあ日令から５日間連続して第２群および
第４群の口腔内に投与した。第１群と第２群は、４０日
令より臼歯面を実施例８記載の歯みがき剤、各個体当り
約０．１ｔを用いて歯間部清掃用ブラシ（ルミプントＳ
；バイエル日本歯科株式会社）で充分にみがき、これを
１日１回、１４日間連続した。なお試験期間の飼料は、
う蝕誘発飼料ダイエツト２０００（船橋農場ＩＭ）を用
い、脱イオン水と共に自由に摂取させた。試験期間は歯
みがき開始後間日間とし、各個体から適宜に口腔被検材
料を採取し、ＴＹＣ寒天平板培地、プロピオン酸寒天平
板培地およびＩＯ係血液寒天平板培地を用いて、３７℃
、７２時間培養することにより歯牙への定着様態を調べ
た。第１群および第２群は本発明による歯みがき剤の使
用により投４菌株の濃度は漸減し、一部では１週以内に
、残りは２週以内に口腔から菌株が消滅した。

対照群では口腔内のアクチノミセス・ビスコ−ジス陥株
の減少は認められなかったが、バクテロイデス・ジンジ
パリウス菌株は徐々に減少する傾向がみられた。

各試験群を試験期間終了後に、ペンタノミルビタールで
麻酔死させ、顎を摘出し、オートクレーブ処理（１１８
−１２１℃、１−２分間）したのち軟組織を除去し、よ
く水洗した後、２０係硝酸銀溶液で５分間染色する。水
洗乾燥して骨標本とした。試験群と対照群との歯槽骨吸
収の差を、とくに下顎第１臼歯を中心に発生した歯槽骨
吸収を築山氏（口腔衛生会誌、第四巻第３号１４９頁、
１９７８年）の方法に従って評価した。両群の歯槽骨吸
収の差を第２表に示す。

ボ２表 試験例３ 砂ネズミ（２０日令）を用いて試験を行なった。

第１群は試験群で第２群が対照群である。実施例５で用
いたアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス野
外株を培地Ｃを用いて３７℃、冴時間培養して得られた
培養液（生菌数約１０８個１ａｌ）Ｑ日量０．１ｄを用
いて５日間連続して口腔内に投与し定着させた。その後
Ｉ日令よシ臼歯面を実施例８記載の歯みがき剤を用いて
試験例２記載の方法と同様に歯みがきを行ない、各個体
別に口腔被検材料を採取し、１０チ血液寒天平板培地を
用いて、３７℃、７２時間培養することにより、口腔へ
の定着を調べた。本発明による歯みがき剤使用によって
第３表に示すように、投与菌株は急減し、はとんど１週
間以内で消滅した。これに対して対照群では減少は認め
られたが、消滅したものはなかった。

第　３　表 （自発的）手続補正書（方式） ％式％ （１ １、事件の表示 昭和５８年　特許　願第２５１９７５号３　補正をする
者 事件との関係　特許出願人 Ｍｌ＋“瘤　東京都港区白金五丁目９番１号氏　名（名
称）北里研究所　（社団法人）代表者　吉　岡　勇　雄 ４・　代　理　人　電話　３１ｉ３−５５□１５、　補
正命令の日付 ６、　補正により増加する発明の数　なし（１）　別紙
の通り浄書した明細書を提出する（内容に変更なし）。

（２）　別紙の通り委任状を提出する。

（自発的）手続補正書 昭和６０年３月２７日 昭和５８年　特許　願第２５１９７６号２発明ノ名称　
歯周炎抑制用抗体の製法および同抗体事件との関係　特
許出願人 。、　所　東京都港区白金五丁目９番１号氏　名（７称
）北里研売所　（社団法人）代表者水之江公英 ４°　代　理　人　電話　０３−３５３−５５２１ａ補
正０内容　方式　と７ｓ、、、。

明細書を次の通り補正する。

（１）　第６頁１５行、「方法」を「抗体の製法ｊに補
正する。

（２）第１１頁１１行、［９１１Ｊを［１１９９Ｊに補
正するｎ （３）　第１７頁１０行、「ｋＨｇ」を「ｋＨｌ」に補
正する。

（４）　同１７行、「できる。」の後Ｋ「高張液の作用
によって線毛層抗原のみを抽出することができる。」を
加入する。

（５）　第１９頁１６行、「免疫してもよい。」の後に
次の通り加入する。

「アクチノミセス・ビスコ−ジス変異株に−ＴＬ＋から
単離した本抗原について、Ｄ−グルコースを基皐とした
フェノール硫酸法による炭水化物の定量、牛血清アルブ
ミンを基箪とした１（ａｒｔｒｅＩ法による蛋白質の定
量、およびフォスフォリラーゼｂ１子牛血清アルブミン
、鶏卵アルブミンおよびキモトリプシノーダンＡを参考
としてセファデックスＧ−１００（スエーデン国、ファ
ルマシア・ファイン・ケミカルス社製）による分子量の
測定を行なった結果、本抗原は炭水化物的１５−２５％
（例、約２０％）と蛋白誓約７５−８５％（例、約８０
％）とを含む酸性の糖蛋白質のＩａｌであって、分子量
は約５−８ＸｌＯ’（例、約５５０００　）と推定され
た。

次に、ポリアクリルアミｒゲル・ディスク電気泳動法で
は陰極側に特徴的な太いノンドが認められた。ｐｉ（３
，５−１０，０のキャリヤー・アムフ第２イト（スエー
デン国、エルケービー・プロダクター社製）による尋電
点分画試験では、ｐｉ値は３．５以下であった。

しよ糖密度勾配超遠心法では、線毛成分抗原は、しよ糖
密度約１１−２２％およびしよ糖比重約１．４〜１．６
付近の分画から回収される。粗抗原液のゲルｒ過では、
２つのピークが現われるが、ヒ）またはウサギ血清との
反応が陽性である最初のピークから回収される。

アクチノミセス・ナエスルンデイ、バクテロイデス・ジ
ンリノセリウス、アクチノバチルス・アクチノミセテム
コミタンス由来の抗原の性状も上記のものと実質的に著
差がなかった。

（６）　第２２頁３行、「アイスクリーム」の後に「、
チューインガム」を加入する。

（７）　同２０行、「用いられた。」の後に次の通り加
入する。

「本明細書において抗体の力価は、ゲル内沈降反応によ
る２ゲル内沈降価によって示した（　Ｇｏｌｄｍａｎ、
　Ｊ、　Ｃ，、ａｔ　ａｌ、　ｌ５ｏｌａｔｌｏｎ　ａ
ｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇ１１
ａｌ　Ｆｉｌａｍｅｎｔｓ　ｆｒｏｍＨｕｍａｎ　Ｂｒ
ａｉｎ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　７８：４２
６　（１９７８））。

（８）第３２頁８行、「調整した。」の後に次の通ψ加
入する。

［実施例９ 下記の成分のチューインガムを製造した。

ガムペース　２０　１？ フルクトース　５５ｇ レシチン　０．２Ｊｉｌ コーンシロツプ　２５ｇ クエン酸　０．ＩＩ！ 抗　体　０．０５ｍｊ ガムペースを溶解（９５℃）シ、これにコーンシロップ
、レクチンを加え、５分間８０℃で混合して、フルクト
ースとクエン酸を加え充分に練り、６０℃に冷却した後
、抗体を混合した。これから公知の技術を用いてチュー
インガムを形成した。

抗体として、実施例３記載のアクチノミセス・ビスコ−
リス由来の抗体を用いたほか、所望によシ、実施例４紀
載のバクテロイデス・ジンク」　ノ々リウス由来の抗体
、実施例５記載のアクチノバチルス・アクチノミセテム
コミタンス由来の抗体および実施例３記載の方法に珈じ
て、ヒトの口腔から採取されたアクチノミセス・ナエス
ルンデイのＰＬ８抗原を用いて得られた抗体を用いた。

」 （９）第３４員６行、「第４１０号」を「第４１１号」
に補正する。

（１０）　第３７頁最下行の後に次の通り加入する。

「試験例４ 実施例９記載の方法に迦じて、実施例９記載の各抗体（
各０．０５＋ｎ７ｔ）を含有するチューインガムをつく
り、その投与による成人口腔内の歯周炎誘発能を有する
口腔内細菌の濃度変化を調べた。成人男子５名、女子５
名の口腔内にアクチ／ミセス・ビスコ−ジスのほか、ア
クチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス、ノクテ
ミ ロイデス・ジンクパリウス、アクチノ〆セス・ナエスル
ンデイの１種以上の存在を確認した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）由周炎誘発節または悪化能を有しがっ細胞表面に
   純毛を有する口腔内微生物の純毛から抗原を単離１２、
   この抗原で哺乳動物を免疫することによって、哺乳ｉ物
   の体内に対応抗体を産生じ、この抗体を哺乳動物から採
   取する工程からなる、歯周炎抑制用抗体の製法。 （２１微生物がアクチノバチス属に属する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 （３ｉ　ｔ＆　生物がアクチノミセス・ビスコ−ジスま
   たはその変異株である特許請求の範囲第２項記載の方法
   。 （４）微生物Ｉがアクチノミセス・ビスコ−ジス変異株
   に−ＴＬ十株（４Ｘ］−研条寄第４１１号）である特許
   請求の範囲第４項記載の方法。 （５）微生物がアクチノミセス・ナエスルンディまたは
   その変異株である特許請求の範囲第２項記載の方法。 （６）　微生物がバクテロイデス属またはアクチノバチ
   ルス属に属する特許請求の範囲第１　ｘｂ記載の方法。 （７）微生物がバクテロイデス・ジンジ／ぐりｈス、ア
   クチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスまたはこ
   れらの変異株である特許請求の範囲算６項記載の方法。 ｆｉ＋　微生物バクテロイデス・ジンジパリウス株Ｋ　
   −Ｂｇ−ｍ１株（微工研条寄ｐ　４１０号）である特許
   請求の範囲第７項記載の方法。 （９）歯周炎蒋発卵または悪化トヒを有しかつ細胞表面
   に純毛を有する口腔内微生物の純毛から抗原を単離し、
   この抗原で哺乳動物を免疫することによって、哺乳動物
   の体内に対応抗原を産生し、この抗体を採取し、生理学
   的に許容し得る担体または賦影削と共存させてなる、非
   う一性糾成物。 （１０１ｌＴｆ許請求の範囲Ｍ９項記載の可食性組成物
   。 （印　特許請求の範囲第１０項記載のチューインガム。 （１２（特許請求の範囲第１０項記載のアイスクリーム
   捷たはシロップ。 旧１　特許請求の範囲第９項記載のバッカル、トローチ
   またはキャンデー。 （１・ｌ・　特許請求の範囲第９項記載の歯みがきまた
   はうがい剤。