JPS6064930A - 虫歯用ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、虫歯誘発能を有するストレプトコッカス・ミ
ュウタンスによって誘発されるヒトの虫歯を予防または
少なくとも抑制（以下抑制という）するためのワクチン
に関する。

虫歯（う蝕）は口腔内の細菌によって直接に誘発される
ヒトおよび動物の歯の疾患で、口腔内に露出した歯の表
面から始まり、歯の組織を進行的に破壊する。虫歯の初
発部位、ヒトの年令および原因菌からみて、虫歯を次の
三つの型に大別することができるといわれている（北野
繁雄、日本歯科医学会会報、第７巻１号、２１頁、１９
旧年）。

型　多発年令　部　位 Ａ　小窩裂溝う蝕　４−８　乳白歯、永久歯、歯の裂溝 Ｂ　平滑面う蝕　１１−１８　平滑面 Ｃ根面う蝕　５０〜６０　歯頚部、根面セメント質 ＪＪＸ因Ｍ　Ａ　ラクトバチルス・アシドフィルスラク
トバチルス・カセイ ストレプトコッカス・ミュウタンス ストレプトコツカス・サンギス Ｂ　ストレプトコッカス・ミュウタンスストレプトコツ
カス・サンギス Ｃアクチノミセス・ビスコラジス なお、根面う蝕の場合にも、ストレプトコッカスｅミュ
ウタンス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ
）および同ザンギスがアクチノミセスと共存することが
しばしば認められている。従来、たとえばバーシース・
マニュアル・オプ・デターミネイティブ・バクテリオロ
ジー、５０２頁（１９７４）は「ミュウタンスと虫歯と
関係があるとされている。ミュウタンスは、ストレプト
コッカス・サリバリウスに似た微生物であるが、詳しく
研究されたことも、サリバリウスと比較されたこともな
かった」と記載している。しかし、現在は、代表的な口
腔内のストレプトコッカス屈細菌は、たとえば次の生物
学的特徴からみて、明らかに区別されている。すなわち （イ）　ミュウタンスはマンニットとソルビットを分解
する能−力を有し、またしよ糖を分解して、水溶性のデ
キストラン様多糖体（以下ＤＰＳという）および不溶性
の固い粘着性のＤＰＳを産生ずる。

（ロ）　サンギスはしよ糖から水溶性のＤＰＳを産生ず
るが、その付着性は非常に低い。またサンギスはアルギ
ニンを分解してアンモニアを産生する。

（ハ）　サリバリウスはしよ糖からフルクタンを産生ず
る。

ミュウタンスの産生ずる不溶性ＤＰ８は歯の表面や裂溝
内面に付着して歯垢（プラーク）を形成する。口腔内の
ミュウタンスの多くはプラーク内に居住して乳酸を産生
じ、これが歯を破壊するといわれている。ミュウタンス
以外の虫歯原因菌も乳酸を産生ずるけれども、プラーク
内のミュウタンスによって産生された乳酸は解放される
ことなく、歯の表面に濃厚に蓄積される。従って、現在
ではミュウタンスは各種の虫歯原因菌のなかでも最も重
要視されている〇う蝕誘発能を有するストレプトコッカ
ス・ミュウタンスの菌体の一部または全部あるいは抽出
物を抗原とし、薬理学的に許容し得る担体と共存させて
なる、ストレプトコッカス・ミュウタンスによシ誘発さ
れるヒトの虫歯予防または抑制するだめのワクチンは公
知である。たとえば英国特許１３７５８６６号は、スト
レプトコツカス属の口腔内細菌８８Ｇを抗原とする平滑
面う蝕抑制用ワクチンを開示しているが、この菌株は、
代表的なう蝕誘発性ミュウタンスの代表的菌株として周
知のストレプトコッカス・ミュウタンスＮ　Ｇ　Ｔ　Ｃ
１０４４９株と同一の性状を有する菌株である。この英
国特許記載の実用的な抗原は細胞壁（特許請求範囲３）
および菌株の培養液由来の菌体外酵素である（同６）。

また実施例記載のワクチンは、ホルマリンまたはフェノ
ールで不活化された全菌体を抗原としている。

しかし、公知の菌体またはその一部を抗原とする虫歯予
防用ワクチンにはなお改良の余地がある。すなわち、全
菌体を用いるワクチンの虫歯抑制効果は不充分であるば
かりでなく、アレルギー反応等の副作用を起こすこと、
訃よびとくにス）・レフトコツカス・ミュウタンスの細
胞壁を抗原とするワクチンが心筋抗原と交叉反応を起こ
すことが知られている。従って、この種の全菌体ワクチ
ンがヒトの虫歯の抑制に実用化されたという報告は、本
発明者の知る限り、知られていない。

他方において、ミュウタンスのようなストレ細 ブトコツカス属口腔菌が菌体の細胞壁表層の線△ 毛によって宿主の歯や口腔粘膜に付着（感染）すること
は公知であるＣ　Ｇｉｂｂｏｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎ
ｎ。

Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２９：１９−４４
　（１９７５））。しかし虫歯抑制の観点において、上
記線毛成分抗原と細胞穂内（菌体内）抗原との抗原活性
の差は、これまでほとんど解明されなかった。

次に、プラツタール等は、ミュウタンスの菌体抽出物を
調べた結果、ミュウタンスをａからｇまでの７つの血清
型に分類できることを提案した［：　Ｂｒａｔｔｈａｌ
ｌ、　０ｄｏｎｔ、Ｒｅ１ｙ、、　２０：１４１（１９
７０）＆　１ｂｉｄ、、　２０：２３　（１９７０Ｌ’
　Ｐｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｃｔａ。

Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　８ｃａｎｄ、　５
ｅｃｔｉｏｎ　Ｂ、　８２：３５７（１９７４）：）。

その後、本発明の共同発明者の一人１荒 佐藤誠は、ミュウタンス菌株の　原の特異性を△ 血清学的に調べ、ミュウタンスをヒ）Ｉ（Ｈｌ）、ヒト
Ｉｆ　（ＨＩ［）およびラット（Ｒ）型に分類できるこ
とを提案し、次のように報告した。

（イ）大部分（９６，３係）のヒト由来のミュウタンス
はヒ）Ｉ型で、残シはヒ）ＨＩ型であった。

（ロ）　ラット由来のミュウタンスはすべてラット型で
あった。

（ハ）　マウスおよびモルモットからミュウタンスを検
出しなかった。

（に）　ハムスターおよびサル由来のミュウタンスはす
べてヒ）Ｉ型であった。

上記のヒト１１ヒト■およびラット型は、それぞれブラ
ツタール分類による「ｃ、ｅおよびｆ」、「ｄおよびｇ
」および「ａおよびｂ」血清型に対応する菌株である〔
口衛誌、２８巻、２号、　Ｚｏｏ−１２３頁（１９７Ｂ
））。

本発明は、う蝕誘発能を有するミュウタンス菌株由来の
線毛成分抗原が、ミュウタンス菌株の口腔内での感染を
特異的に抑制する活性を有すること、および、上記抑制
活性に関して、血清型ｃ、ｅ、ｆおよびｇ型ミュウタン
ス由来の線毛成分抗原と血清型ｄのミュウタンス由来の
線毛成分抗原との間に有意義差が認められるという知見
に基いている。

本発明の目的は、う蝕誘発能を有するミュウタンスによ
って誘発されるヒトの虫歯を予防または少なくとも抑制
するためのワクチンを提供することにある。

本発明により提供される虫歯用ワクチンは、う蝕誘発能
を有するストレプトコッカス・ミュウタンスの菌体の一
部または全部あるいは抽出物を抗原とし、薬理学的に許
容し得る担体と共存させてなるワクチンであって、血清
型ｃＳｅ。

ｆおよびｇ型ミュウタンス菌株から選ばれた１種以上の
菌株から単離された線毛成分抗原またはその抽出物を抗
原とすることを特徴としている。

本発明による線毛成分抗原とは、ミュウタンス細胞壁の
表層から突出する線毛状の型特異多”糖体抗原および表
層蛋白質から得られた抗原成分のことである。

代表的なヒト型ミュウタンスＮＧＴＧ　ｔ１０４４９　
株（血清型Ｃ）から単離した本抗原について、フェノー
ル硫酸法による炭水化物の定量、Ｈａｒｔｒｅｅ法によ
る蛋白質の定量、およびフォスフォリラーゼｂ、子牛血
清アル゛ブミン、鶏卵アルブミンおよびキモトリプシノ
ーゲンＡを参考としてセファデックスＧ−１００（スエ
ーデン国、ファルマシア・ファイン・ケミカルス社製）
による分子量の測定を行なった結果、本抗原は蛋白質約
２０チと炭水化物的８０％とを含む酸性の糖蛋白質の１
種であって、分子量は約７５０００と推定された。

次にポリアクリルアミドゲル・ディスク電気泳動 法では陰極側に特徴的な太いバンドが認められた。ｐＨ
３，ｓ　−１０，０のキャリヤー・アムフオライト（ス
エーデン国、エルケービー・プロダクター社製）による
等電点分画試験では、ｐＩ値は３．５以下であった。

しよ糖密度勾配超遠心法では、ミュウタンスの線毛成分
抗原はしよ糖密度約１０−１３９６付近の分画から回収
される。ゲル沢過でゆ、２つのピークが現われるが、血
清との反応が陽性である最初のピークから回収される。

血清型の差による分画パターンの差は認められなかった
。しかし、線毛成分抗原の血清型的性状は、各菌株の血
清型によシ相違し、ａ、ｂ型・Ｃｚ　＠ｓ　ｆｓｇ型お
よびｄ型に分けられる。

口腔内細菌は、菌種ごとに歯の表面や口腔粘膜等への付
着性を異にしていることは公知であるが、ミュウタンス
の歯面への付着においても、菌体表層の構造が重要であ
る。

本抗原自体は公知であるが、これをミュウタンスによっ
て誘発されるヒトの虫歯抑制に用いることは知られてい
ない。公知の虫歯抑制用ワー゛クチンは通常、細胞内抗
原のみまたは全菌体抗原であって、線毛成分抗原の特異
性を認識していない、 本発明によるワクチンをヒトに投与すると、口腔内の粘
膜や歯の表面等への、対応する野外株の付着を抑制する
作用を有する。従って、これらの野外株は、歯面に付着
（感染）する代わりに、−“唾液中などで凝集する。こ
れを、たとえば通常の歯みがき剤やうがい剤等によって
口腔から除去することは容易であるから、う蝕を抑制す
ることができる。

次に本発明の詳細な説明する。線毛成分抗原を採取する
ために、う蝕誘発能を有するミュウタ？スの野外株また
は変異株を用いることができる。実用的には、う蝕訪発
能の高い菌株の線毛成分抗原を用いるのが有利である。

たとえば試験管壁付着能の高い菌株を選別することによ
って、よい結果を得、ることかできる。

後記実施例記載の突然変異株ストレグトコツカ２ス・ミ
ュウタンス変異株に−Ｄｐ株（血清型Ｃ）と同ＫＨ２株
（血清型ｄ）とは、対応する公知のミュウタンス野外株
（親株）と同様の菌学的性状を有するが、著しく高い付
着能をもつ点が異なっている。これらはそれぞれ１９８
２年３月５日と１９８３年７月２３日ＫＦＥＲＭ　ＢＰ
−３１７号およびＦＥＢＭ　Ｐ−７１６６号として微工
研に寄託されている菌株であって、それぞれ対応するミ
ュウタンスの野外株から後記実施例記載の人工的な変異
操作によって作出されたものである。

本発明の目的に利用し得る突然変異株を、たとえば次の
方法で得ることができる。ヒトの歯垢から採取したミュ
ウタンス野外株を、常法によシ、たとえばナイトロジェ
ン・マスタードのような変異誘発剤で処理して得られた
菌株から、付着能の高い菌株、すなわち実用的には不溶
性のＤＰＳの産生能のとくに高い菌株を選んで分離し、
純粋培養する。所望によシ、変異誘発処理および選別を
くシ返すことができる。変異誘発のために、ナイトロジ
ェン・マスタード以外の公知の手段、たとえば紫外線照
射、ニトロソグアニジン尋を用いることもできると思わ
れる。

実施例記載の突然変異株は、たとえばＴＹＣ寒天平板培
地（ｐＨ７，８；３７℃；２４時間）を用いて長期間の
継代培謬をした場合、およびニトロ場合、諸性状の劣化
や他の変異株の出現は認められなかった。

は好気条件下でもよいが嫌気条件下の培養が適している
。使用培地は天然培地でも合成培地でもよいが、大量生
産には液体培地が適している。

培地のｐＨは５．６−８．０　、たとえば約７．０−７
．２で、培養温度は２３−３９℃、たとえば３７℃が適
している。酸産生は速やかで、通常は４８時間以内に培
地のｐＨは約４．２に低下し、その後、ブトコツカス属
細菌用の各種培地を使用することができるが、実用的な
培地の組成の例は次の通りである。

培地（Ａ） ポリペプトン　１．７％、ポリペプトンＳｏ、３％、酵
母エキス　ｏ、ｓ％、リン酸二カリウム　０．２５　％
、　ｍ化ナトリウム　０．５俤、フ：ドー糖　０．２５
　ｑ６（ｐＩ−１７，０−７，８）培養終了後、遠心分
離法（例、８０００ｒ、ｐ、ｍ。

７２０分間）のような常法により、培養液から菌体を分
離する。この菌体な適当な方法、たとえば０．１−　Ｉ
　Ｍ酢酸・酢酸す）　ＩＪウム緩衝液（ｐＨ６，０−７
，８）、０．０１−０．７５　Ｍリン酸塩緩衝ＩＭ食塩
水（ｐＨ６，８−８，０）、その他の緩衝液、またはこ
れらの緩衝液に非イオン系界面活性剤（トリトン−Ｘ　
１００　、米国ローム・アンド・ハース社製）のような
適当な界面活性剤を加えた緩衝液に浮遊させて超音波処
理（１０２０ｋＨｚ。

５−１０分間程度）をして線毛成分抗原を抽出する。得
られた抽出物をたとえば公知のカラム分画法、等電点沈
降法、冷溶媒分画沈降法、膜濃縮法、硫酸アンモニウム
塩析法およびしよ精密度勾配超遠心法７≧どの単独また
は適宜組合わせによって分画精製する。所望により、こ
れを適当な不活化剤、たとえば０００２−０．２係ポル
マリンを加えて不活化した後、同様な緩衝食塩水で、低
温（たとえば４℃）で透析することによて、不活化剤を
除くこともできる。本抗原はフェノールによって変質す
る。

精製された材料なＯ，’！５Ｍ’）ン酸塩緩衝食塩水（
ｐＨ約６．２−６．５　）で含有プロティンＮ５−５０
μｙ／コになるように希釈調製し、アジュバントとして
水酸化アルミニウムグルを最終アルミニウム用量２００
μｊｌ／ＴＬＩになるように加えて抗原を吸着し、防腐
剤としてたとえばチメロサール０．０１％（ｗ／ｖ　）
を加えると、本発明による点画用ワクチンが得られる。

超音波処理の代わシに、線毛成分抗原抽出液に６０ｇ６
飽和になるように硫安を加えて、かく拌溶解させ、低温
たとえば４℃で静置すると線毛成分抗原が沈降する。上
清を除いた沈殿物をＩＭ塩化ナトリウム加Ｑ、Ｉ　Ｍ　
リン酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）に濃厚に浮遊させ、低温
で同様の緩衝液で透析して、透析性不純物および硫安を
除き、心処理して得られた抽出液を、たとえば上記のし
よ精密度勾配超遠心法で精製することもできる。

ワクチンの最終処理において、水酸化アルミニウムの代
わりに等量のフロイント完全アジュバントを用いること
もできる。

本発明によるワクチンを低温（たとえば１０　’Ｃ以下
）で長期間保存することができる。

使用する際の本発明によるワクチンの投与量は、たとえ
ばヒトに対して、後記の抗原１または■についてそれぞ
れ１回０．２−１゜０ｍ７を皮下または筋肉内、好まし
くは口腔粘膜内に注射する。

免疫は、たとえば２−５週間隔で、２−５回行なうこと
ができる。所望にょシ、たとえば３−１２日間の連続投
与によって免疫することもできる。

本ワクチンをヒトまたは動物に注射すると、とくに唾液
中に免疫抗体の存在することが認められる。この抗体（
主としてＩｇＡ　）は、対応する虫歯銹発能を有する野
外株の歯の表面への付着や裂溝への侵入定着を阻止する
作用を有するが、凝集素は産生ぜず、また対応する野外
株の増殖自体やグルカン産生能を阻止しない。付着を抑
制された菌株は、たとえば唾液中で凝集するので、歯み
がき等の常法によって、口腔から容易に除去することが
でき、従って虫歯予防および抑制の目的を達成すること
ができる。

ヒトおよびハムスターを用いた試駁の結果、本ワクチン
の有効量を、たとえば数週間連続投与すると、口腔内か
らミュウタンスが消滅することが認められた。

ハムスターに対して本ワクチンを長期間（６−１２か月
間）大量連続投与しても、格別の異常のないことが認め
られた。

ミュウタンス由来の線毛成分抗原の付着抑制能と菌株の
血清型との関係を調べた結果、ｃｌｅ、！およびｇ型菌
株由来の線毛成分抗原は血清学的に共通性を示している
が、ｄ型菌株由来の線毛成分抗原は多少異なる性状を有
していることがわかった。

次に、血清型ｃ　Ｔ２Ｏ−からｇ型１での各菌株由゛来
の線毛成分抗原を用いてワークチンを調製し、これらを
ハムスターに投与して免疫効果を調べた結果次のことが
わかった。

（イ）　ｃ、ｅ、ｆおよびｇ型菌株由来の４種の抗原（
以下抗原■と総称する）は、これらの血清型を有するす
べてのミュウタンス菌株の付着能を実質的に無差別に抑
制する。

（ロ）抗原■のみでｄ型菌株の付着能を抑制することは
可能であるが、この場合の抑制活性はｅｓｅｑｆおよび
ｇ型菌株の付着に対する抑制活性よりも程度の差はあっ
ても低い。

（ハ）　ｄ型由来の抗原（以下抗原■という）のｄ型菌
株に対する付着抑制活性は、他の血清型菌株に対する付
着抑制活性よりも著しく高い。

以上の結果は、実用的に抗原■と抗原■とを併用するこ
とが有利であることを示している。

次に、ヒトに存在するミュウタンスの血清型の分布に関
して前述の佐藤誠の報告によると、ヒトの大部分はｃ　
Ｎ　ｅ　Ｎ　ｆまたはｇ型ミュウタンスの宿主であって
、ｄ型ミュウタンスの宿主であるヒトはわずかである。

従って、抗原Ｉを有効成分とするワクチンのみによって
、はとんど大部分のヒトの宿主のミュウタンスを効果的
に抑制することができる。しかし、一方ではヒトの口腔
内のミュウタンスの血清型を調べるには複雑な操作が必
要であり、他方では抗原■、■を併用しても各抗原の効
果に変わシはないから、実用的には抗原Ｉ、Ｉｔを混合
して投与するのが有利である。

下記実施例において調製したワクチンは血清型Ｃおよび
ｄの菌株を用いたが、他の血清型の菌株を用いて同様の
方法でワクチンを調製することができる。

下記実施例および試験例において、培養は特記しない限
り３７℃で嫌気培養した。市販品培地は指定ｐＨで用い
た。

実施例１ ストレプトコッカス・ミュウタンス変異株に−Ｄｐ株（
ＦＥＦＬＭＢＰ−３１７）の作出。

ヒトの歯垢から分離した新鮮なミュウタンス野外株（血
清型Ｃ）をトッド・ヒユーイツト・プロス（ｐＨ７，８
；米国、ＢＢＩ、社製）２０−を用いて２４時間培養し
、培養液を４℃で遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、　、
２０分間）して菌体を分離し、これを０．７５　Ｍリン
酸塩緩衝食塩水（ｐＨ６，８、各１００罰）で３回遠心
処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、、２０分間）して洗浄した
。ナイトロジェン・マスタード０．１チを含有する０、
７５Ｍリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ６，８）　Ｋ生菌数約
１００万／ＩＩＬｌニなるように菌体な浮遊させ、生菌
数０９０％以上が死滅するまで３７℃に保つ。浮遊液を
４℃で遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、　、２０分間）
して回収した生菌をトッド・ヒユーイツト・プロス（２
０ｒｎｌ　）　テ上記と同様に培養し、培養液の１白金
耳をＴＹＣ寒天平板培地（’ｐＨ７，２；　２０ｒｒｔ
ｌ　；　５ＴＯＰＰＥＬＡＡＲｅｔａｌ　：　Ａｒｃｈ
ｓ、　０ｒａｌ　Ｂｉｏｌ、、　１２．１１９９−１２
０１（１９６７））を用いて４８時間培養した後、培養
物を２４時間室温に静置して、不溶性ＤＰＳ産生能の高
いコロニーを分離する。所望により、上記の方法をくり
返して、ＤＰＳ産生能の高い菌株を純化培養する。

この方法で得られた菌株の付着能の極めて高いことが、
試験管壁への付着試験およびハムスターへの口腔内投与
によって認められた。各種培地を用いた長期間の継代培
養および公知の変異手段を用いた変異誘導試験の結果、
本突然変異株が遺伝学的に安定であることが確かめられ
た。

実施例２ 実施例１記載の方法に単じて、ヒトの口腔から分離した
血清型ｄの野外株から、付着能の高いストレプトコッカ
ス・ミュウタンスＫＨ２株（ＦＥＢＭ　Ｐ−７１６６）
を人工的に誘導した。

実施例３ ワクチン■の製造 ストレプトコッカス・ミュウタンス変異株に−Ｄｐ株（
ＦＩＭ、　ＢＰ−３１７）を前記培地（Ａ）の種培地５
００ｄおよび本培、地１５０００　ｍｌを用いて、各２
４時間培養した。

培養終了後、培養液に３３係飽和になるように硫酸アン
モニウムを加え、かく拌溶解させ、４゜Ｇに２４時間静
置した。この液の上澄を除去し、沈降物を遠心処理（８
０００ｒ、ｐ、ｍ、　、３０分間）によって回収し、こ
れをＩＭ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）　７５０　ｒｎｌに浮遊し、４℃、毎分１−
５回転で７２時間かく拌した。この緩衝液を遠心処理（
８０００ｒ、ｐ、ｍ、、３０分間）して菌体を除去し、
上清に６０係飽和になるように硫酸アンモニウムを加え
、かく拌溶解させた後、４℃に４８時間静置することに
よって、綿毛成分を沈降させた、上清を除き、沈降部分
を遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、、３０分間）して回
収した材料を同様のＩＭ塩化ナトリウム加０゜ＩＭリン
酸塩緩衝液１００Ｍに浮遊させた。浮遊液を透析用セロ
ファンチューブに入れ、４℃で４８時間、同様のＩＭ塩
化ナトリウム加０．１Ｍリン酸塩緩衝ｒｆｆ５００ｏｍ
１以上を用いて、硫酸アンモニウムが除去されるまで透
析した。透析内液を遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ、、
３０分間）して透析性不純物を除去し、上清を回収した
。

上清３００−を蛋白Ｎ含量２００μｉ／ＴＬｌになるよ
うに、同様のＩＭ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸塩緩
衝液で希釈し、今釈液２００ｄをしよ糖密度勾配遠心分
離装置〔日立６５Ｐ型超遠心機、ゾーナルローラーＲＰ
２３５’Ｉ’使用；しよ糖濃度５−３０％　；　３５０
００　ｒ、ｐ、ｍ、、１８時間〕で処理したとこだ。そ
の蛋白Ｎｉは７８μ９７ｍ１であって、これを塩水（ｐ
Ｈ６，２−６，５）で含有最終濃度タン・くりＮｌ０−
’２０μｐ／ｍｌになるように希釈し、アジュバントと
して水酸化アルミニウムゲルをアルミニウム量最終濃度
５００μｍ１／１ｒＬｉになるように加えて吸着し、防
腐剤としてチメロサール０．０１％（ｖ／ｗ　）を加え
、ワクチンＩを得た。

実施例４ ワクチンＨの製造 実施例２の方法で得られたストレプトコッカス・ミュウ
タンスＫＨ２株（ＦＥＢＭ　Ｐ−７１６６）を実施例３
記載の方法に迎じて、培養と処理とを行ない線毛成分を
得た。その蛋白Ｎｉは１２５μＩ／ゴであった０この線
毛成分抗原■を実施例３記載の方法に単じて処理し、ワ
クチン■を得た。

実施例５ 合し、実施例３に慈じてワクチンを調製した。

なお、実施例３．４および５で得られたワクチンを用い
て、厚生省告示生物学的製剤基鵬一般試験、Ａ試験法に
慈じて、染色試験および菌培養試験ならびに急性毒性試
験を行なったが、異常は認められなかった。後記の参考
ワクチンは強い急性異常毒性を示した。

下記の虫歯予防効果試験において、試験動物としてゴー
ルデンハムスターを用いた。動物数は特記しない限シ１
群（雌）１０匹である。

試験例 （１）実施例３．４および５記載のワクチンの免疫効果
を次の方法で調べた。

生後１８日および２５日にそれぞれ１日１回０．２　ｍ
ｌずつ頬嚢部の皮下にワクチンを注射した。実施例１お
よび２記戦の強い虫歯誘発能を有するストレプトコッカ
ス・ミュウタンス変異株に−Ｄｐ株（Ｆ’ＥＲＭ　ＢＰ
−３１７）およびストレフトコツカス・ミュクタンスＫ
Ｈ２（ＦＥＢＭＰ−７１６６）の培養液を遠心処理（８
０００ｒ、ｐ、ｍ、　。

３０分間）し、菌体な０．７５ＭＩＪン酸塩緩衝食塩水
に浮遊（生菌数約１００万／ｍｌ）して浮遊液を調製し
た。この浮遊液各０．１ｍ１７日を生後３０日より５日
間連続して試験動物の頬県内に投与した。動物はう蝕誘
発飼料ダイエツト２０００　（船橋農場製、自由摂取）
および脱イオン水で飼育された。

浮遊液投与終了から６０日後、ベンタバルビタールで麻
酔させ、０．７５　％塩酸ピロカルビン溶液を体重１０
０　＃当り０．１Ｍ腹腔内に注射し、唾液を採取した。

その後、全採血して殺し、あごを副出し、オー上クレプ
で１２０℃で１−２分間処理し、軟組織を除去し、残部
を充分に水洗したのち乾燥して標本とした。

対照群は試験群と同様に処理されたが、本発明によるワ
クチンを投与しなかった。

（２）試験群と対照群との虫歯発生を比較するために、
各群の試験動物の罹患率および全臼歯に発生した虫歯の
う触車を評価した。

（３）　試験群と対照群との保有抗体の関係を調べるた
めに、採取した血清および唾液中の抗体をマイクロタイ
タープレート法による定Ｉｋ凝集反応および付着抑制試
験によって比較評価凝集反応の抗原として、−腎骨粋中
吻強毒突然変異株に−Ｄｐ株およびヒト型（ｃ−ｇｍ）
各菌株を０．５％酵母エキスを加えたトリプトケース・
ソイ・プロス（米国、ＢＢＬ社製；ｐＨ７，８；１５ゴ
）で２４時間培養し、培養液を８００゜ｒ、ｐ、ｍ、で
２０分間遠心処理して得られた菌体な、０．２ｍＭゲル
タールアルデヒドを加えた０、７５Ｍリン酸塩緩衝食塩
水（１００ゴ；　ｐＨ７，０）に浮遊して３７℃で１２
時間処理し、遠心分離（８０００ｒ、ｐ、ｍ、、　２０
分間）により菌体を回収し、０．７５　Ｍリン酸塩緩衝
食塩水（ｐＨ７，０）でＯＤ　５５０　ｎｍ　Ｏ，５０
になるように浮遊して抗原とした。採取した唾液および
血清の各倍希釈液（各０．０２５　ｍ７　）にそれぞれ
抗原液（各０．０２５　ｍｌ　）を加え、３７℃で４時
間反応させた後、５℃で一夜静置して肉眼で判定した。

付着試験としては、血清または唾液なＴＹＣ培地（５Ｔ
ＯＰＰＥＬＡＡＲ，Ｊ、　Ｄ、　ａｔ　ａｌ、　Ａｒｃ
ｈｓ。

０ｒａｌ　Ｂｉｏｌ、　１２：　１１９９−１２０１．
１９６７）　（ｐＨ７，２）に１０倍になるように加え
、メンブランフィルタ−（米国、ミリボアー社製；　０
．４５μ）で無菌濾過し、さらに同培地で２倍希釈した
。

別にストレプトコッカス・ミュウタンス変異株に−Ｄｐ
株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３１７）とヒト型（ｃ　−ｇ型）
菌株とをｙ３１ｉ々にトッド・ヒユーイツト・プロス（
ｐＨ７，８；各１０ゴ）で２４時間培養した。上記各培
養液１白金耳を別々に上記の各倍希釈液（各３　ｍｌ　
）に接稀し、３７℃で２４時間保った後、液を培養用試
＠管から除き、試験管を水洗後、管壁への菌体の付着を
メチレン青染色液で染色し、肉眼で判定した。

後記の参考ワクチンを用いて同様の試験を行なった。

試験結果を第１−４表に示す。

第　１　表 群　１　２　３ 攻撃菌株　Ｋ　−Ｄ　ｐ　Ｋ　−Ｄ　ｐ　Ｋ　−Ｄ　ｐ
体重増加量（９）　９　ｓ　、　ｓ　６７　、５　９１
罹患率（チ）　３０　１００　９０ う触車（＠７．５　６８，３　５９．２抗体価 凝集素Ａ　＜４〜４＜４１６〜３２ ＃Ｂ＜４　＜４＜４〜４ 付着阻止能Ａ−＜１０＜１０ ／／　Ｂ　４０　＜１０　＜１０ （注）　Ａ・・・血清中、Ｂ・・・唾液中。参考ワクチ
ンの使用菌株はＮＣＴＣ１０４４９である。

第　２　表 群　１２ 免疫抗原　Ｉ　無処置対照群 攻撃菌株　Ｋ　−Ｄ　ｐ　Ｋ　−Ｄ　ｐ体重増加量（Ｉ
り　９０　９０ 罹患率（鉤　４０　１００ う触車（鉤　５．８３　６６ 抗体価 凝集素Ａ　＜４　＜４ ７ＦＢ＜４　＜４ 付着阻止能Ａ　＜１０　＜１０ 〃　Ｂ　４０〜ｇｏ　＜ｉｏ〜１０ （注）Ａ・・・血清中、Ｂ−・・唾液中。

第　３　表 群　１　２３４５６ 攻撃菌株　Ｋ−Ｄｐ　ＫＨ２Ｋ−Ｄｐ　ＫＨ２Ｋ−Ｄｐ
　ＩＧ（２抗体価 凝集素人＜４　＜４　＜４　＜４　＜４　＜４ｐＢ　−
＝　−−−− ＃　Ｂ　２０　２０−４０　１０−２０１０−２０　−
　−（注）Ａ・・・血清中、Ｂ・・・唾液中。

第　４　表 群　１　２　３　４ 攻撃菌株　Ｋ−Ｄｐ　ＫＨ２Ｋ−Ｄｐ　ＫＨ２罹患率（
鉤　２０　１０　１００　１００う触車（％）　４．２
　１，７　６０．８　３４．２抗体価 凝集素Ａ＜４　＜４　＜４　＜４ ＃　Ｂ　＜４　＜４　＜４　＜４ ｐ　Ｂ　２０　２０　＜１０　＜１０ （注）　Ａ・・・血清中、Ｂ・・・唾液中。

免疫群と無処置対照群とから得られた全臼歯の平均う触
車の間に有意の差が認められ、免疫群では虫歯の発生を
著しく抑制した。

ワクチン■とワクチン■とでそれぞれ免疫した試験群を
に−ＤＰ　（ｃ型）およびＫＨ２（ｄ型）でそれぞれ攻
撃し発生したう触車をめたが、ワクチン■で免疫しに−
Ｄｐ　（ｃ型）で攻撃したに−Ｄｐ　（ｃ型）およびＩ
Ｇ（２（ｄ型）でそれぞれ攻撃した試験群では、う触車
の有意の差は認められなかった（第４表）。

参考ワクチン（全菌体）免疫群と無処置対照群との間に
、う触車の有意義の差が認められず、参考ワクチンによ
りう蝕の発生を効果的に抑制できなかった。なお、各免
疫１群の血中および唾液中の保有抗体を肌ぺた結果、凝
集素の産生は認められたが量は小量であった。伺着阻止
抗体（抗伺着素）が唾液中に分泌されることが認められ
た。

参考ワクチン免疫群の崩清中に凝集素が認められたが、
抗付着抗体は認められなかった。

参考例 参考ワクチンの製造 英国特許１３７５８６６号実施例記載の方法に辿じて、
全菌体を用いるワクチンを製造した。ストＶ７’ト＊ツ
カス・ミュウタンス（ＮＣＴＣ１０４４９）ラフレイン
・ハート・イン７ユージヨン・ブロス（米国、ディフコ
社製；　ｐＨ７，８；　１ｇｒＬｌ）を用いて、３７℃
で２４時間培養した。培養液をルーピン（３００ｍＪ）
中のプレイン・ハート・イン７ユージヨン寒天培地（米
国、ディフコ社製ｐ　ＰＨ７゜８；１００１ｄ）の光面
に拡散させ、３７℃で２４時菌食塩水（０，６８チφ；
各１ｏｏ　ｒｔｔｌ　）を用いて３回遠心処理（８００
０ｒ、ｐ、ｍ、、　２０分間）した。

洗浄された菌体を０．６　％ホルマリン含有食塩水（０
、８５％　ｗ／ｖ　；２００　ｍｌ　）に浮遊し、室温
で一夜放置した後、菌体な食塩水（０，６８％　ｗ／ｖ
　；１００ｄ）を用いて遠心処理（８０００ｒ、ｐ、ｍ
、　；　２０分間）で洗浄した。これを食塩水（０，６
８％ｗ／ｖ　；　ｘｏｍ　）に浮遊し、浮遊液（０，１
＋＋ｌ）をチオグリコール酸培地（米国、ＢＢＬ社製；
　ＰＨ７，２；日 １０−）で３７℃、１０９間培養し、無菌検査した。

残りの浮遊液を超音波処理（２０ｋＨｚ　；　１０分間
）で均質化し、チメロザール０．０１　％含有食塩水（
０，６８％ｗ／ｖ　）で最終菌体濃度が約２　Ｘ　１０
’個／―になるように希釈することによって参考ワクチ
ンを得た。

なお、ホルマリンに代えて０．５係フエノールを用いた
ほか、同様にして得た別の参考ワクチンの結果はもつと
慾かった。

特許出願人　北里研究所（社団法人）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）　う蝕誘発能を有するストレプトコッカス・ミュ
   ウタンスの菌体の一部または全部あるいは抽出物を抗原
   とし、薬理学的に許容し得る担体と共存させてなる、ス
   トレプトコッカス・ミュウタンスによシ誘発されるヒト
   の虫歯を予防オたは抑制するためのワクチンにおいて、
   の菌株から単離された線毛成分抗原または抽出物を抗原
   とすることを特徴とするワクチン。
2. （２）　菌株が突然変異株である特許請求の範囲第１項
   記載のワクチン。
3. （３）　菌株がストレプトコッカス・ミュウタンス央轡
   変異株Ｋ　−Ｄｐ株（微工研条寄第３１７号）である特
   許請求の範囲第２項記載のワクチン。
4. （４）　う蝕誘発能を有するストレプトコッカス・ミュ
   ウタンスの菌体の一部または全部あるいは抽出物を抗原
   とし、薬理学的に許容し得る担体と共存させてなる、ス
   トレプトコッカス・ミュウタンスによシ誘発されるヒト
   の虫歯を予防または抑制するためのワクチンにおいて、
   血清型ｃ１ｅ１ｆおよびｇ型のストレプトコッカス・ミ
   ュウタンス菌株から選ばれた１種以上の菌株から単離さ
   れた線毛成分抗原または抽出物と、血清ｇｄ型のストレ
   プトコッカス・ミュウタンス菌株から単離された線毛成
   分抗原または抽出物とを抗原とすることを特徴とするワ
   クチン。
5. （５）菌株が突然変異株である特許請求の範囲第４項記
   載のワクチン。
6. （６）　菌株カストレプトコツカス・ミュウタンス変異
   株に−Ｄｐ株（微工研条寄第３１７号）である特許請求
   の範囲第５項記載のワクチン。
7. （７）　ｉ株がストレプトコッカス・ミュウタンスＫＨ
   ２（微工研菌寄第７１６６号）である特許請求の範囲第
   ５項記載のワクチン。