JPS6015320B2 - 改良されたフラクト−スの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、フラクトースの改良された製法に関する。

デキストロースをフラクトースへ酵素的に異性化するこ
とによって得られるフラクトースは、ショ糖代用品とし
て食品工業で広く用いられている。実質的なフラクトー
ス生産価格には、使用済み又は不活性化グルコースィソ
メラーゼをいましば交換する必要性がはねかえる。

グルコースイソメラーゼによるフラクトースの高い生産
性は望ましい目標である。可能な限り最少量のグルコー
スイソメラーゼを用いた最大限フラクトースの生性をあ
げることに広く研究の努力がはらわれて来た。多くの研
究者は単に安定なグルコースィソメラ−ゼを見いだすこ
とが問題の解決であると考えていた。このような努力の
中から、多数の異なったグルコースィソメラ−ゼ際品が
技術により選別され、変異議起され、製造されて来た。
これらグルコースィソメラーゼの不活性化に対する効力
及び感受性を試験するうちに、異なる微生物起源のィソ
メラーゼは異なる酵素的特性を有するという実体が技術
により明かにされた。ｐＨ及び温度のような至適異性化
条件、′Ｔソメラーゼ活性化剤（例えば、ＣＯＨ、、マ
ンガンなどのような金イオン性化剤）びその他の処理上
の変動因子は特定のグルコースィゾメラーゼの型に左右
される。一般に、異性化条件の大きな相違は異なる属か
ら誘導されたィスメラーゼ間に生じる。固定化ィソメラ
ーゼは水落性又は非結合型のィソメラーゼよりも安定で
ある。一般に、固定化グルコースィソメラーゼは老化（
ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）するまで回分又は連続操作にお
いて連続使用され得るので、商業的操作により適してい
る。老化した時点でこれらのィソメラーゼは新しい固定
化ィソメラーゼと交換される。多くの異性化反応は、ィ
ソメラーゼがデキストロースをフラクトースに変える速
度を至遜化する温度及び斑で行なわれる。他の酵素と同
様に、ィソメラーゼは失活（熱失宿を含む）に対し通常
最も安定であらり、そしてィソメラーゼの適異性化ｐＨ
で用いたときに高い酵素活性度を有する。フラクトース
含有シロップの商業的製造に現在用いられているグルコ
ースイソメラーゼは、異性化工程力ミＣｏ十十イオンの
存在下に行なわれる際に、改良された安定性及び活性度
を特徴的に有する。この目的で第一コバルト塩が供給シ
ロップにいよいよ加えられる。第一コバルトイオンの使
用を必要とせずに高い生産性を得るとが望ましい。示唆
されたグルコース異性化処理の一法として、イソメラー
ゼ活性度が減少するに従って異性化反応温度を上げる方
法である。

反応装置の温度が上がると、フラクトースの生産速度と
同時にィソメラーゼが不活性化する速度も加速される。

正味の効果はィソメラーゼにより生産される全フラクト
ースの収量を下げることになる。バチルス属に属する微
生物により文献上生産されるイソメラーゼには、Ｂａｃ
ｍｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅ‐ｎｈｏｐｈｉｌｓＡＴＣＣ
３１２６５，ＮＲＲＬＢ‐３６８０，ＮＲＲＬＢ‐３６
８１及びＮＲＲＬＢ‐３６８２；Ｂａｃｉｌｌ‐船ｓｐ
．ＮＲＲＬＢ‐５３５０及びＮＲＲＬＢ‐５３５１：Ｂ
８Ｃｊ１１ｕＳｍｅｇａｔｅｒｉ山ｍＡＴＣ。

１５４５０；ＢａＣｉ１１ｕＳｈ比ｔｏｓｕｓＡＴＣＣ
１５４５１，３弦が含まれる〔例えば、ドイツ公開特許
第２１６４３４２号に基づく米国特許第総２６７１４号
及び第３３０６７５２号、ダンノ（ＤａｎＭ）らによる
Ａ乳ｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３１巻３号、２８４〜
２９２ページ（１９６７年）を参照せよ〕。

細胞内イソメラーゼを含む生細胞の熱及び化学的処理、
天然及び合成高分子との複合体化、結合剤マトリックス
内での固定化及びその他多すのイソメラーゼ固定化法が
示唆されて来た。ィソメラーゼを固定化し、そして酵素
活性度をを高める法の例は、ケント（Ｋｅｎｔ）らによ
るＪ．ＡＰＰＩ．ＣｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈ肌１．１９７
４，２４，６６３〜６７６及びェス．ョシムラ（Ｓ．Ｙ
ｏｓｈｉｍｕｒａ）らによってＡ皮ｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，３碇蓋１び号、１０１５〜１０２３ページ、１
９６６に開示されている（例えば、１９７３手９月１１
日出願のオランダ特許出願簾ね−１２５２５号、英国特
許第１２７４１５８号、米国特許第３８２１０８２号、
第３７７９８６９号、第３６９４３１４号、第３７総９
４５号及び英国特許第１３５６２８３号の各明細書を参
照せよ）。「スウイートザ・イムーア・ニュー・イムモ
−ビライス・ド・グルコース・イソメラーゼ・（Ｓ肥ｅ
ｔＺＭｍｅ．ＡＮｅｗｌｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄＧｌｕｃ
ｏｓｅｌｓｏｍｅｒａｓｅ」と題するディー・スタルケ
（ｄｉｅＳねてｋｅ）２７，７号（９７３王）２３６〜
２４１ページに記載された最近の文献は、微生物Ｂａｃ
ｉｉｌｌｕｓｃｏａ■ｌａｎの固定定イは酵素を開示し
ている。この文献は、グルコースィソメラーゼの生産性
を活性及び安定性の組合せ効果として定義している。よ
り中性のｐＨでは、フラクトースの生産性を上げるため
にはコバルトが不可欠であると思われる。コバルト不在
下にフラクトースシロツプの至適生産性を得るには、比
較的高いアルカリ側ｐＨで連続異性化反応を行なう必要
があると著者は結論している。ィソメラーゼとシロップ
との短い接触及び反応時間を含連続的操作（例えばカラ
ム異性化）には、Ｃｏ＋＋不在下での至適生産性は文献
上８．０を上まわるｐＨ（例えば８．１〜８．５）、固
体分４０〜４５％及び６５００で得られる。本発明の目
的は、バチルス起源の固定イＱ酵素の有用寿命及びフラ
クース生性を延ばすことにある。

本発明の第二の目的は、カラム型反応装置内でグルース
をフラクトースに異性化する処理効率を改良することに
ある。

本発明の第三の目的は、望ましくない副生成物の生成を
低減する処理条件下にデキストロースシロップをフラク
トースシロップへ連続的に異性化することにある。

本発明によれば、グルコース異性化反応が【ａ｝Ｃｏ＋
＋イオンの存在下、及びｔｂー６０００以上の温度で行
なわれる際に、デキストロースからフラクトースへの高
い異性化速度を示すバチルス属微生物起源のィソメラー
ゼの固定床内でデキストロースをフラクトースに異性化
する方法において、前記方法が下記の凶〜皿を含むこと
を特徴とするデストロースをフラクトースに異性化する
方法が提供される。

■本質的にＣｏ＋＋イオンを含まず、そして全乾燥重量
に基づいて少なくとも９０％の単糖類を含有する、精製
したデキストロース供給シロップを用意する。

【Ｂー前記シロップを５５〜６１００の範囲内の異性化
温度び７．０〜７．５の異性化ｐＨで固定化グルコース
イソメラーゼ床を通すことによってデキストロース供Ｖ
給シロップを異性化する。

‘Ｃ’異性化されたシロップを回収し、一方補充量の供
Ｖ給糖液を床に満たす。

そして■実質的に５５〜６１℃の異性化温度及び７．０
〜７．５の異性化ｐＨを保ちつつ、床のィソメラーゼ活
性が至適活性水準の２０％より少なくなるまで床内での
供Ｖ給糖液の異化を続ける。

さらに本発明は、このような方法で製造されるフラクト
ースシロツプ及びこのようなシロップから単機されるフ
ラクトースにも関する。

本発明では、高い単綾類固体含量を有し、かつ本質的に
ＣｏＨイオンを含まない精製デキストロースシロツプを
用いる。

本発明は次のような工程で用いられる。すなわち、所望
の相互転化が達成されるまでシロップが高流速で反応装
置を１回通過又は循環する間に反応装置が所望のフラク
トースシロップ製品を生じるものか、又はシロップが系
列内に各反応装置を流れるとフラクトース含量が増加す
る系列に接続された複数反応装置によるものである。異
性化法の生産性は、高単糖類含量の供給シロップを用い
ることにより、一般に高められる。

（乾燥固体重量基準ｄ．ｓ．ｂ．で）０％より多いデキ
ストロース又は９５％もしくはそれ以上のデキストロー
ス（特に９７％〜９９％）を含む高デッキロース分の転
化シロップは特に有用な供給シロップである（例えば、
米国特許第３７８３１０び号及び第３８９７３０５号を
参照せよ）。異性化されたシロップの品質及びグルコー
スィソメラーゼ床の生産性は、無機及び有機系の非糠質
のシロップ混入物により悪影響を受ける。

徴量のある種の金属イオン、例えば、アルミニウム、銅
、スズ、亜鉛、水銀、カルシウムなどの、及びィソメラ
ーゼを失活及び／又は反応して不溶物を成する陰イオン
は、床の生産性を低下せる虞れがある。このような混入
物は慣用の腸イオン及び陰イオン樹脂の処理より、デキ
ストロース供聯合シロップから除くことができる。また
不完全なイオン交換処理は、異性化の系内に不落性凝集
塊又は沈澱を発生させて、異性化カラム反応装置内の圧
力降下をす塵れもある。この圧力降下は床の生産性を低
下させる。これらのイオン性不純物は、単一又は二重の
腸イオン及び陰イオン交換処理（例えば強陽イオン−弱
陰イオン−強腸イオン一弱陰イオン）によって、高デキ
ストロース分の供給シロップから適当に除くことができ
る。タンパク質物質、着色剤（例えばＨＭｍ）及びフレ
ーバー混入物などのような高デキストロース分の転化シ
ロップ中に典型的に存在する有機物質は、床の生産及び
フラクトースシロツプの品質に有害な影響を与える。

慣用のイオン交換処理では、供給シロップからこれらの
望ましくない有機物質をすべて除去することはできない
。このような有機物質は、粒状炭素、活性炭処理のよう
な慣用の手段により、シロップから首尾よく除くことが
できる（例えば、乾燥シロップ固体１０の重量部につき
活性炭約０．５〜２．０重量部の量で用いる）。不漆性
の有機及び無機物質は、異性化反応前に供給シロップか
ら慣用の手段によって適当に除いてもよい。不顔物の除
去に続く工程でシロップを精製するには、炭素による処
理とイオン交換処理とで一般に十分である。本発明の異
性化反応は、微生物の生育に適合する温度、ｐＨ値及び
その他の操作条件で行なわれる。

微生物の生育に対する適切な規制策なしには、異性化反
応装置は長期間使用時に微生物が増殖する。このことは
ィソメラーゼの生産性及びシロップの品質に悪影響を与
えることになる。供Ｖ給シロップの乾燥固体を４５重量
％より多く、好し〈は少なくとも５の重量％に調節する
ことにより、微生物が増殖する問題は容易に抑えられる
る。６０％より多い乾燥固体を含む供孫舎シロップは一
般に粘鋼であり過ぎて、異性化反応装置を効的に通過し
得ない。

約５０〜約５５重量％の範囲に乾燥固体分を調節した供
給シロップは、一般に反応装置を適当な流速で流れ、他
方微生物の増殖を最少にする。慣用の殺菌剤による供給
シロップの周期的又は連続的処理は、微生物の増殖を少
なくするための処理上の手段として用いることができる
。本発明では、バチルス属の微生物から譲導されるイソ
メラーゼを含んだ固定床にデキストロースシロツプを通
すことによって、デキストロースがフラクトースに異性
化反応を行なうのに適した固定床には、固定化イソメラ
ーゼを異性化反応帯域内に閉じ込め、一方床を通してシ
ロップを通過せるための慣用の方法び装置が含まれる。

１回の通過又は循環もしくは系列に連結した複数の反応
装置で操作されるカラム型反応装置系を用いて、シロッ
プをシロップ製品（例えばフラクトースのデキストロー
スに対する重量比が約２：３〜約１：１の間）を含む所
望のフラクトースに変える。

固定化グルコースイソメラーゼを含むカラム反応装置を
通してデキストロースシロップを連続的に流すことによ
って異性化工程が行なわれ、そしてグルコースイソメラ
ーゼの量及びカラムを通るシロップの流速はフラクトー
スシロップ分を（単糖類の重量に基づいて）約４４〜約
４７％の水準まで増すに足ることが好ましい。本発明で
用いるィソメラーゼは、次のような特性を有する。

すなわち、水６雌、無水デキストロース４雌、硫酸マグ
ネシウム０．０２Ｍ、塩化コバルト０．００３８Ｍの検
定基質を用いる６５℃、１時間にわたる標準的条件下に
測定した際、８．０〜８．５の範囲内の至適ィソメラー
ゼ活性を示すものである。これらの検定条件下に、ＰＨ
８．０〜８．５の間でィソメラーゼは前記範囲外で生産
するよりも多くのフラクトースを生産する。もし上記の
標準的検定温度を下げると（例えば６０℃又はそれ以下
）、（これらの検定条件下で）これらのイソメラーゼは
６５℃又はそれ以上で生産するよりも少ないフラクトー
スを生産する。イソメラーゼのその他の特性は次の通り
である。すなわち、標準的検定基質からコバルトが除か
れ、かつ検定が餌７．５及び６０ｑｏで１時間行なわれ
る場合、フラクトース生産は検定（ａｓｓａｙ）成分と
して０．００３８Ｍの塩化コバルトを含む場合に生産さ
れるよりも少ないものである。本異性化法は一般にバチ
ルス属由来の固定化イソメラーゼに用いるが、本発明は
母ｃｍｕｓｃｏａ‐飢ｌａｎ料（例えばＮＲＲＬＢ‐球
０５及びＮＲＲＬＢ‐５３５１）から特られ、かつ１９
７３王９月１１日出願のオランダ特許出願第７３−１２
５２５号明細書に従って固定化されたィソメラーゼとと
もに用いるのに特に適する。これらのィソメラーゼは、
安定化量のＣｏＨイオン（例えば０．００１５〜０．０
０４Ｍ）を用いる異性化工程で使用した場合失活に対し
て安定であり、そして約８．５の至通ｐＨ及び約６び０
を十分上まわる至遼異性化温度を有する。本発明を行な
うにあたり、カラム型反応装置にには（前記の標準的検
定条件で）約４００１ＧＩＵ／酵素ｇ数以上の活性を典
型的に有するィソメラーゼが適当に仕込まれる。

床は有利には約３×１ぴＩＧＩＵ以上、好ましくは約×
１ぴＩＧＩＵ床の容量（ｆぜ（約０．０２８で））を含
む。

１回通過で約４５％のフラクトース（単糖類基準）を製
造したい場合は、新しい床を通る最初のシロップ流速が
床の容量（ｆｔ３）あたり約０．１９〜０．７６そ（０
．０５〜０．２ガロン）／分（通常約０．１）となるよ
うにカラムに仕込むことが一般に適している。

異性化工程が進行するにつれて流速は比例的に低下して
床の失活を埋め合わせる。酵素的異性化は７．０から約
７．５以下のＰＨで行なわれる。

ｐＨが７．０の水準以下に下がると、（安定化量のＣｏ
＋＋の存在なしには）ィソメラーゼは永久的失活を受け
る。７．５を超えるｐＨでは、床の全フラクトース生産
性はィソメラーゼの失活のために同じく低下する。

これにより中性の−範囲内で異性化工程を行なう付随的
利点は、この範囲望ましくない着香及び着色体の生成を
阻止することである。ＰＨ８．５び６５００の工程と比
較すると、床のフラクトース生産性は本発明の工程のも
とで約５〜１０倍に高められる。この高いフラクース生
産性は、所定量のフラクトースを製造するに要する全ィ
ソメラーゼを実質的に減じ、そして操作を中断して再仕
込みを行なうとなく長時間にわたって反応装置を操作で
きる。他の酵素と同様に、イソメラ−ゼはその至適ｐＨ
を実質的に下まわるｐＨで用いたときに典型的に失活を
け易い。予期に反して、安定化量のコバルト（例えば０
．００１Ｍより多い）を用いずに、ィソメラーゼの至適
異性化餌範囲を十分に超えた餌水準で異性化反応を行な
うことにより、フラクトースの全床生産性は著しく増大
する。異性化工程の間に、デキストロースに富むシロッ
プは固定化ィソメラーゼ粒子内へ移動する。

この粒子内では、デキストロースがフラクトースに富む
シロップに異性化される。このフラクトースに富むシロ
ップは粒子から移動し、そして粒子にはしいデキストロ
ースが満たされる。従って、生体微生物における流動体
の交換と同様に、外部のシロップ相と内部の粒子相の間
に不均一性が存在する。オランダ特許出願第７３−１２
５２５号に従って製造されるようなある種の乾燥した定
化酵素標品は、潜在的酸性物質（例えば、グルタルアル
デヒドで橋かけたれた型の固定化イソメラーゼ）を含む
ことが見いだされている。これらの酸性物質は、最初は
明らかに乾燥した固定化粒子の構造内にしっかり保たれ
ている。異性化工程で用いられると、これらの酸は粒子
内に吸蔵される。この吸蔵された酸が過度に低い値の斑
を生じ、そしてィソメラーゼの失活を起こす。これらの
酸がィソメラーゼを失活するのを防ぐために、適切な処
理上の注意を払うべきである。

この問題は次のようにして首尾よく緩和することができ
る。すなわち、異性化反応の開始前（例えば仕込み直後
）に、酸を含む乾燥した固定化粒子を水和し、かつ失活
しない塩基（例えば、水酸化ナトリウムの炭酸素塩及び
炭酸塩）で中和することによるか、又はィソメラーゼに
適合する水溶性塩基又は緩衝剤を、約７．０〜７．５の
ｐＨを確保するに足る量で供給シロップに加えることに
よって行なつ。異性化の解は、失活しない塩基（例えば
、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム又は炭酸ナト
リウム）、もしくはィソメラーゼを失活しない慣用の緩
衝用（例えば、亜硫酸ナトリウム、酸性亜硫酸ナトリウ
ム又は炭酸ナトリウム）を供給シロップ又は反応装置に
加えることによって斑７．０〜０７．５の範囲内に保つ
ことができる。コーンシロップ製造業者により酸化及び
着色体の形成を防ぐために慣用的に添加された非不活化
性の還元剤、例えば亜硫酸ナトリウムを供聯合シロップ
に添合してもよい。タ本方法は熱安定化量のコバルトイ
オンの下在下に行なわれるが、異性化反応は共鰯金属イ
オンのイソメラーゼ活性化剤の存在下に行なわれる。

共働金属の活性の要求量は異なったィソメラーゼ（例え
ば、異種微生物源から得られたもの）の間０で応々異な
ることである。マグネシウムのような原子価２の金属イ
オンが広知であり、そして補助的属活性剤としていまい
よ用いられる。これら金属イオン補助活性化剤は、通常
塩として（例えば、マグネシウムの硫酸塩、酸性亜硫酸
塩、クェン酸塩又は酢酸塩として）異性化媒体に添合さ
れる。母ｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎから誘導された
ィソメラーゼが本方法に用いられる際、マグネシウムイ
オンの存在及びその濃度が全体的なフラクトース生産性
に影響を与える。マグネシウムイオンのモル濃度がバチ
ルスから誘導されるィソメラ−ゼの反応に対して約０．
００１〜約０．０１Ｍの範囲をとり得るものの、改良さ
れた生産性は異性化媒体が少なくとも約０．００２Ｍの
マグネシウムイオンを含むときに得られる。０．０１Ｍ
の水準より高ければ、ィソメラーゼのマグネシウムイオ
ン要求量の合致し、それ以上の量は単に製造価格（例え
ば、マグネシウム塩の価格及びイオンを除くために精製
系にかかる付随的費用）の増加にはねかえるのみである
。

約０．０仰Ｍ〜約０．０１ｍＭの間のマグネシウム含有
量は、全ィソメラーゼ生産性を高めるために特に有効で
あることが見いだされている。床の活性度が床の最大操
作活性度の２０％より少ない活性度、好好ましくは１５
％より少ない活性度に低下するまで床が使用される。

典型的には、新しい固定化ィソメラーゼは、（前記の標
準的検定条件のもとで）１ｇあたり少なくとも４００の
国際グルコースィソメラーゼ単位（すなわちＩＧＩＵ）
の検定活性度を有し、そして典型的にはイソメラ−ゼが
８０１ＧＩＵ／ｇ以下の活性度を有するようになるまで
連続工程で用いられる。カラム又は床を通る最も適した
シロップ流速は所望のフラクトース転化率、床のィソメ
ラーゼ活性、床の流れ圧力低下特性に左右される。一定
のフラクトス収率（例えば、約４５％のフラクトース及
び約５５％のデキストロース）を保つためには、供聯合
シロップの流速を相対的に調節して床のィソメラーゼ性
と一致するようにする。例えば、５０山単位／ｇのイソ
メラーゼ活性を有するィソメラーゼ１３．６ｋ９／０．
０２８舵（３０１ｂ／ｆｔ３）〔すなわち６８１０００
０１０１Ｕ／ｆら〕を仕込み、所望収率が約４５％のフ
ラクトースである床は、典型的には最初に０．１ガロン
／分（雛ｍ）／床のｆｔ３（約０．３８夕／分／約０．
０２８〆）の流速脈操作される。しかし、ィソメラーゼ
活性が約５０１０ｍ／ｇ（すなわち、６８１０００１Ｇ
ＩＵ／ｆら）まで減少すると、同じフラクトースの収率
を得るには、より遅いシロップの流速である。

０．０１雛ｍ／ｆら（約０．０３８そ／分／０．０２８
め）が必要とされる。

典型的な最終のシロップ流速は０．００舷ｐｍ′ｆｔ３
（約０．０１９夕／分／約０．０２８〆）より大きく、
最も一般的には約０．０１鞘ｍ化３（約０．０３８〆／
分／約０．０２８〆）である。できるだけ最高の流速を
用いることが望ましい。しかし、床の全活性により、シ
ロップがカラムを通過して所望のフラクトース量を得る
速度が限定される。４０１ＧＩＵ／ｇの水準より少ない
と、流速が遅すぎて本方法が不経済となる。

多くのカラム操作にとって、シロップの流速は約０．０
１〜約０．２ｇｐｍ／ｆｔ３（約０．３８そ〜０．７６
夕／分／０．０２８〆）の範囲内である。本発明の異性
化条件下での固定化ィソメラーゼは、典型的には低い初
活性（例えば００１ＧＩＵ／ｇ以下）を有し、そして最
初の１０〜１虫時間は比較的少量のフラクトースを生じ
る。

一方、特徴的にｐＨ８．５で操作される床は、実質的に
高い活性を有し、かつより多くのフラクトースを与える
。しかし、固定化ィソメラーゼは本方法の条件下で不規
則的に約２００〜４０加持間使用後に実質的な活性増加
（例えば２３９Ｇｍ／ｇ又はそれ以上）を示し、方、よ
り高いｐＨ及び温度で操作されたものは順次活性が低下
する。約４０畑時間後に固定化ィソメラーゼは活性が漸
減し、やがて床が老化する（典型的には３５０畑時間よ
り多い、好ましくは少なくとも４００凪時間の連続使用
後）。これは、前記のｐＨ値より高い、あるいは低いｐ
Ｈで操作れる固定床で見られる迅速な減少と対照的であ
る。本発明で用いる処理条件の全体的な真の効果は、よ
り長い時間にたって極めて漏水準のフラクト−ス生産性
を保つことである。前記のｐＨ７．０〜７．５の範囲外
で行なわれるカラム操作以外で起こるィソメラーゼの永
的失活度は、ｐＨの偏り及び接触時間に関係する。

同一時間を基準として、ｐＨ８．５より高いあるいはｐ
Ｈ６０より低い斑でのカラム操作では、餌７．８〜８．
０又は−６．５〜７．０の範囲で行なった操作よりも著
しい永久失活及び生産性の低下を生じる。ＰＨ６．０又
はＰＨ８．５のいずれかで短時間（例えば２独特間）行
なう操作では、一般にｐＨ約６．５又は８．０での長時
間（例えば３０ｍ時間）操作よりも少ない失活度を生じ
る。固定化ィソメラーゼ内に含まれる吸蔵又は結合酸性
物質（例えば、グルタルアルデヒドで橋かけされた固定
化ィソメラーゼ）のために、所望のｐＨ７．０〜７．５
の流出水準をすぐに達成することは困難である。（前記
のように異性化工程に先立った）ィソメラーゼ床の水和
及び中和は、床がｐＨ７．０〜７．５に安定化する速度
を加速する（例えば、典型的には１日以内に安定化する
）。これに反して、未処理の床は流出液流がｐＨ７．０
〜７．５に安定化するのに通常少なくとも２倍以上の時
間を必要とする。これとは別に、ＦＨを前記のｐＨ７．
０〜７．５の範囲に保つための処理助剤として緩衝剤を
用いてもよい。緩衝剤も前処理したィソメラーゼも使用
せず、かつィソメラーゼ床が比較的高水準の吸蔵された
を含む場合、流出液流のｐＨは千高めのｐＨに一時的に
調節して（例えば、ｐＨ７．５〜８．０で、より速い流
速とする）、酸性の床の物質を補強し、かつ所望のｐＨ
７．０〜７．５の流出液流を得るようにする。カラム操
作の最初の２００畑時間の間に、流出液流のｐＨの影響
を受けた際、ィソメラーゼ床は少なくともｐＨ７．０か
らｐＨ７．５までを保つことが重量である。カラムをこ
の範囲内で操作時間の少なくとも９０％、最も好ましく
はｐＨ７．０〜７．５で操作時間の９５％より多い期間
操作することにより、ィソメラーゼの高生産性が達成さ
れる。一般に、本発明の処理条件下にあるィソメラーゼ
床は、典型的には連続使用２００畑時間後に最初の２岬
時間の活性の４０％より多い（場合によっては５０％か
それ以上）の活性を保有する。ィソメラーゼ床の後半の
ライフサイクルの間に（例えば、３００畑時間後に）、
ｐＨを７．０〜７．５に保っても生産性はほとんど上ら
ない。生産性に対する上記のｐＨを保つ効果は、床の潜
在能力又は活性の水準が実質的に低下しているので小さ
い。本発明の好ましい具体例では、操作時間の少なくと
も９０％はｐＨを７．０〜７．５の範囲に保ち、そして
全操作時間の５％以下の時間はｐＨ８．０より高いかあ
るいはｐＨ６．５より低いｐＨである。実質的、永久的
なィソメラーゼの失活は、ｐＨ８．０より高いかあるい
はｐＨ６．５より低いｐＨで１０拍時間以上にわたって
本工程が行なわれたときに生じる。ＰＨ７．０〜７．５
の範囲からｐＨがずれても、ィソメラーゼ活性はｐＨを
７．０〜７．５の水準に再調節することによって部分的
に保つことができる。しかし、この方法は、７．０〜７
．５のｐＨ範囲外で操作することによって生じたィソメ
ラーゼの永久的分解及び生産性の損失を補足するもので
はない。温度もフラクトース生産性に同様の効果を有す
る。

高められた温度は床の活性を一時的に増加させるが、全
体的生産性を低下させる。下式は本方法の生産性に与え
る温度の効果を近似的に表わすものである。Ｉ肥Ｙニ１
４，４８４一（０，１０２４７）（Ｘ）ただし、Ｙはフ
ラクトース生産性であり、×は異性化温度（００）であ
る。

高められた温度に短時間、断続的にさらされることは起
り得るが、避けた方が望ましい。６０午０又はそれ以下
の温度では、６５℃の工程にくらべて最初に少量のフラ
クトースしか生じない。

６０℃の異性化温度で同等のフラク０トース生産量（す
なわち全フラクトース収量）を得ることは、連続操作１
４０拍時間後まで典型的には達成されない。

１４０幼時間後には、６０ｑｏでのフラクトース生産性
が６５ｏｏの生産性に達するか、上まわり始める。

ィソメラーゼ床は、６５ｏ０の場合よりも夕６ぴ０の方
が長時間にわたって操作上活性を保つ（例えば、１６８
四時間に対して４０５斑時間である）。カラム反応装置
を６１℃より低い温度で操作時間の少なくとも９０％、
好ましくは６０千０又はそれ以下で操作時間の少なくと
も９５％にわたって保つことによ０つて、改良された生
産性が得られる。床が老化状態に達したとき、所望によ
りカラム反応装置の温度を６５℃又はそれ以上に上げて
もよい。５５ｑｏより低い温度の操作温度はィソメラー
ゼ床の生産性に悪影響を与えることはないが、反応速度
が実質的夕にくなる。

操作温度が５５ｑｏの準より下がると、本発明で使用す
る高岡体分のシロップはざらに粘銃となり、流れにくく
なる。低い操作温度では、床の微生物増殖を防とも困難
となる。全工程的な見地から、異性化反応を５７〜６１
℃の範囲で行なうとが有利である。フラクトース分の多
い転化シロップの連続製造においては、至適操作条件を
確認するために用いられた慣用のパッチ式検定試験及び
慣用の方法は不正確であり、そして最大生産性を得るの
に要する全体的条件には時として応用できない。

これらの慣用的検定試験はィソメラーゼの初期潜在能力
又は活性度、及び高フラクトースシロップの連続操作に
使用するための適合性を決定するには有用である。前記
の試験の後にも有意義な目安は、所定量の酵素によって
実際に生産される全フラクトース量である。高フラクト
ースシロップの連続操作では、操作中のある時点でィソ
メラーゼ床により生産されるフラクトース量（並びに生
産された全フラクトース量）は、流出液流を監視するこ
とによって容易に決定される。流出液流を周期的に監視
することにより、イソメラゼが最大の生産水準に達した
時点を確認できる。その後、工程のある段階における床
の効率を、読みとったフラクトース生産量と最大フラク
トース生産量との比較で決定することができる。本方法
では、床により生産されるフラクトース量が最大フラク
トース生産量（すなわち、読み取ったフラクトース生産
量又は活性水準）の１５％より少ない値に低下するまで
、床は有益に用いられる。床の活性が最大生産量水水準
の約１０〜約１５％に低下した場合、反応床に新しいィ
ソメラーゼを補充するか交換することが好ましい。一般
に、本発明の異性化条件は固定化イソメラーゼの有用な
生産可能寿命を少なくとも２００畑時間まで延長するこ
とができる。

ＰＨを餌７．０〜７．５の間、及び温度を６１℃より低
く保つことにより、本発明は、フラクトースの製造業者
が典型的には３００餌時間以上、最も典型的には４００
独特間以上にわたってカラム反応装置を連続操作し、そ
して適切なフラクトースの相互転化を得ることを可能に
する。ｐＨ８．５及び６５℃の工程で予想される床の有
用寿命は１００畑時間以下である。本方法では高品質の
ラクトースシロツプが生産される。異性化工程から生じ
るシロップの分解は名目的であり、異臭及び異色の発現
は少ない。本発明のシロップは、さらに炭素処理及びイ
オン交換処理を必要とせずに使用可能な状態にすること
ができる。以下の例は本発明を説明するものであるが、
本発明の範囲を限定するものではない。

例１ この例は、ＮｏＶＯＳＰ‐１１班″として認定された固
定化グルコースィソメラーゼを１回通過式カラム型反応
装置中に本発明の異性化条件で用いることにより、改良
されたデキストロース生産性を説明するものである。

前記ィソメラーゼは、米国ニュージャージー州１０５４
３、マノロネツク（ＮＧｎｏｒｏｎｅｃｋ）、マノロネ
ツク・アベニュー（ＮねｎｏｒｏｎｅｃｋＡｖｅｎ雌）
１班ｕノーボ・エンザイム社（ＮｏｖｃＥｎｚｙｍｅＣ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により販売されている。前記酵
素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇのａｎから誘導され、
オランダ特許出願第７３−１２５２４号に従ってグルタ
ルアルデヒドの橋かけで固定化されたものであった。乾
燥した固定化ィソメラーゼは、９５〜９６％の精製デキ
ストロースシロップ（乾燥固体５０％）１５０泌中に乾
燥ィソメラーゼ２雌をラリー化することによて、ＰＨ７
．５、５０℃で１時間にわたって水和及び中和した。

前記ヂキストロース糖液は、（水酸化ナトリウムで）ｐ
Ｈ７．５に調節された０．００８ＭのＭｇＳｏ４・７日
２０を含む。水酸化ナトリウム処理した高膨欄性ィソメ
ラーゼのスラリーを、次いで水ジャケット付きのカラム
反応装置（高さ３仇松、直径２．５弧）に移した。この
例では、固体分５の重量％、Ｄ．Ｅ．９７．５％であり
、そしてデキストロース９６％、二糠類２．５％、三礎
類０．５％及び多糖類（重合度４又はそれ以上）を含む
供給シロップを用いた。

シロップは次のようにして精製した。すなわち、ＰＨ４
．０〜４．５で０．５〜１．０％の粉末活性炭で処理し
、炉過より不溶物を除き、続いて連続的につないだ強腸
イオン樹脂〔ローム・アンド・ハースのアンバーライト
２５２（Ｒｏｈｍ＆ＨａａｓＡｍ戊ｒｌｉに２５２）〕
、弱塩基性陰イオン樹脂〔ダイアモンド・シャムロック
のデユオライト（Ｄｉ‐ａｍｏｎｄＳｈａｍｒｏｃｋＤ
肌ｌｉｔｅ）ＥＳ−５６１〕、強腸イオン樹脂（アンバ
ーライト２５２）、次いで弱塩基性陰イオン樹脂（デュ
オラィトＥＳ−５６１）を用いるイオン交換によって精
製した。精製したシロップは０．００９ＭのＭｇＳ０４
・７４０（金属イオン活性剤として）とともに（水酸化
ナトリウムで）舟７．５に調節し、そしてメチルパラベ
ン０．総、プロピルパラベン０．な及び安息香酸ナトリ
ウム１．９７ｇ（保存料として）を加えた（ｇ数はシロ
ップ１〆についての値である）。（６０℃の）精製デキ
ストロースシロツプは、供給シロップ０．６〜２．４の
【／分の範囲の流速でカラム反応装置へ連続的に送った
。流入液又はデキストロース供Ｖ給シロップの流れのｐ
Ｈを約７．５に保ち、そして流出液流のｐＨを周期的に
監視した。

異性化反応の初期段階（約２独時間）の間に、流出液流
の柑は６．０から所望の７．０〜７．５の範囲に漸増し
た。その後、流出液流の町は本質的に７．０〜７．５の
範囲を保ったが、ただし＄６時間及び磯９時間における
読み取りＭ値は６．９２１７袖責問では８．０であり、
そして滋０１時間では８．５であった。読み取った流速
、フラクトースに異性化された全デキストロースの割合
（％）、床のィソメラーゼ活性、フラクトースの全累積
収率又は生産性、及び（２４±７時間に基づいた）流出
液のｐＨ値の例を表１に示す。次いで比較する目的から
、ＰＨ８．５のデキストロース供給シロップを用いる以
外は、６０ｏｏの供給シロツプを含む本質的に同じ条件
下にカラム反応装置を操作した。

この比較試験の結果は表２に示す。船 表２ 表１に示す通り、ｐＨ７．０〜７．５での異性化反応に
対するィソメラーゼ活性及びフラクトース収率は初め低
いが、約１０日間の操作後に２４９１単位／ｇの至薄ィ
ソメラーゼ活性（読み取り値）まで漸増した。

比較例のｐＨ８．５の反応に対するィソメラーゼ活性は
めに著しく高く、そして約１日後に至遠活性（読み取り
値）に達した。ＰＨ７．０〜７．５の方法に対する初期
生産性はｐＨ８．５の方法よりも低いが、約５日間操業
した後には生産性がｐＨ８．５の方法を上まわった。約
２２．７日間の操業後には、餌７．０〜７．５の反応に
対するフラクトースの累積生産性は１０６９．７である
のに対し、ｐＨ８．５のシロップでは６７６．２（表２
）であった。表１のデータが示すように、ィソメラーゼ
活性及びフラクトース生性は、流出液流の柵が７．０の
水準以下に落ちると低下したが、次いで柵７．０〜７．
５に戻した時点で増加した（例えば、３０５３３６及び
３５斑時間のデータを比較せよ）。

また、表１のデータは次のことも示している。すなわち
、ＰＨ８．０〜８．５の流出液はイソメラーゼ活性及び
フラクトース収率の両方を著しく低減し、そしてｐＨ７
．０〜７．５の範囲にした時点で高いフラクトースの生
産が行なわれる（２１５３〜２２２筋時間のデータ一を
参照せよ）。これらの高過ぎるｐＨ値は、たとえ連続工
程の後期に生じても望ましくなく、これらのＰＨは床の
全フラクトース生産性に悪影響を与える。ｐＨ７．５の
供給シロップを用いて３００餌時間連続操業するカラム
反応装置の残留又は残余イソメラーゼ活性（１７時間の
活性を１００％とした値）は３０％を上まわり、そして
連続操業３２０加時間後に２８％以上であった。イソメ
ラーゼ床の読み取り最大活性度（２３斑時間）を基準と
して、約２５０畑時間までは活性度が２５％又は失活度
が７５％とはならなかった。床が２０％の活性度まで低
下するには、約２９７８時間にわたって操作する必要が
あり、そして約３５５母時間、３９２餌寿間及び４３総
時間では、それぞれｌｙｏ、１２．５％及び１０％の計
算活性度となった。他方、解８．５で供給した反応装置
は、約９９畑時間で２０％の計算活性度を与え、そして
１１７虫時間の操業後で１５％の活性度、１２９幼時間
で１２．５％、１４３湖時間で１０％であった。斑７で
の供聯合に関して、１０％の活性度に対する全体の計算
生産性（最大カラム活性度に基づく値）は３．８７３で
あり、そしてＰＨ８．５での方法については１０１７で
ある。表１の実験におけるィソメラーゼの平均半減寿命
は１３８９．６４であり、これに対して表２の斑８．５
での実験では４４５．３３時間であった。表１の実験の
フラクトースに富む流出液流は、表２の実験の流出液流
よりも透明であり、混入物が少なく、そして商業的に受
け入れられる状態にするのにほとんど精製する必要がな
かった。

表４及び表２（左から右に向って）、まず連続操業時間
（時／時間）が示してある。流速は１分間あたりのびで
あり、「流速（地／分）」で表わしてある。「屈折率」
は流出シロップの（４５℃での）屈折率を表わす。「旋
光度」は流出フラクト」スシロップの（２５ｏｏで２比
ネセルを通過時の）旋タ光度である。活性（ｕ／ｇ酵素
）は、ィソメラ−ゼ１ｇに基づいた単位で表わすィソメ
ラーゼの計算活性度である。生産性とは、４２％のフラ
クトースシロップ（乾燥固体に基づいた値）にまで異性
化した際にカラムが生産するシ。ップ乾燥物質のＺ全累
積量である。流出ｐＨとは流出液流の柵であり、そして
右端の列には供給ｐＨが示てある。流出液流に対するフ
ラクトースの百分比は、下＊記の計算により屈折率及び
旋光度から決定した。乾燥物質の重量％（又は％ｄ．ｓ
．）：（４８７．７４）（屈折率）−６３９．７２比旋
光度（又はＳ．Ｒ．）−（１０似旋光度） 一（２．秋％ｄ．ｓ．） フラクトースの百分比（又は％Ｆ） ＝総７‐（０，筋）（Ｓ，Ｒ，） 活性（Ｕ／ｇ酵素）は、ある時間的間隔での床のイソメ
ラーゼ活性（フラクトース活性単位／ｇィソメラーゼ）
を表わす。

この活性は次のように計算されたものである。ィソメラ
ーゼの平衡定数（又はＥ．Ｃ．）（０．５１３）（供給
シロップ中の単糖類の乾燥物質の％ｒ）１皿〔１）供給
シロップ中のフラクトース及びデキストロースの合計％
（乾燥物質の重量に基づく）であり、９６％あった。

〕活性（Ｕ／酵素） （％ｄ．ｓ．Ｘ６０Ｘの／分ＸＩＯ）（１．２）の．Ｃ
．）ｇ酵素Ｅ．Ｃ． Ｘどｎｅ〔Ｅ．ｃ．‐％Ｆ／ｌｏａ ただし、そｎｅは自然対数であり、６０（塊／分）は１
時間あたりの地で表わした供ｖ給シロップの流速を表わ
し、そしてｇ酵素はカラム中の全酵素のｇ数である。

上記標準アッセィ法に従って二つの例において用いられ
たけＳｗｅｅｔｚＭｍｅＥ汀固定化ィソメラーゼの初活
性度は、カラム仕込み前で６００グルコースイソメラー
ゼ単位／ｇイソメラーゼ２）であった〔２）雌／時の活
性（Ｕ／ｇ酵素）に対してムモルノ分である〕。

大型カラムの操作では、ｐＨ７．０〜７．５の範囲内に
ｐＨを保つことが小型カラムの操作よりも容易である（
例えば、内部ｐＨ検査装置を用いる）。

同様に大型カラムの操作では、流出液流のフラクトース
分析計により一定％のフラクトースシロツプ分を容易に
調節できる。すなわち、供給シロッの流速を手動的又は
機械的に制限してフラクトース流出液流中に一定のフラ
クトース量を与えるようにきる。水和の目的、及び異性
化操作の開始前にィソメラーゼが第一コバルトイオンを
十分補えるようにする目的で、本発明に用いる乾燥した
固定化ィソメラーゼをデキストロース供給液により周囲
温度（例えば２３℃）及びｐＨ７．５で３０分間前処理
してもよい。

前記のデキストロース供給液は、コバルトイオン（例え
ば０．００１Ｍの硝酸第一コバルト）及び０．０２Ｍの
亜硫酸マグネシウムを含む。この例は、供給シロップに
第一コバルトイオンを加えることなく高いフラクトース
生産性を得ることを説明したものである。

この例中には示さなかったが、慣用の異性化操作で用い
られる程度の量の第一コバルトイオン（例えば０．００
１ＭのＣｏＨ）がィソメラーゼの生産性に悪影響を与え
る。所望により、低濃度の第一コバルトイオン（例えば
０．０００５以下）、そして有利には０．０００２９Ｍ
以下（最も好ましくは０．００００９Ｍ以下）のＣｏ＋
＋濃度で供給シロップの流れに連続添加できる。これと
は別に、若干高濃度の第一コバルトイオン（例えば約０
．００１Ｍ以下）を断続的に供給シロップに加えてもよ
い。例２ 例１の精製デキストロースシロッブ及びカラム反応装置
系を用いて、２種の異なる供給シロップをグルコースイ
ソメラーゼのカラム反応装置へ連続供給した。

ィソメラーゼ（ＮｏｖｏＳＰ‐１１班）はＢａｃｉｌｌ
瓜ｃｏａ級ｌａｎから誘導され、オランダ特許出願第７
３−１２５２４号の開示に従ってグルタルアルデヒドの
橋かけ及び噴霧乾燥を経て固定化されたものであった。
贋霧乾燥した固定化ィソメラーゼの輪分け分析値は、２
０号輪上で６９％であった。１回の操業には、ｐＨ７．
５、６０℃で０．０惚けの酸性亜硫酸ナトリウム（緩衝
剤）及び０．０仰けのエプソン塩（ＭがＱ・７日２０−
金属イオン活性剤）を含むデキストロース供給シロップ
を、カラム反応装置へ１，６２〜６．１＆が′分の範囲
の流速で連続的に加えた。

比較操業での供給シロップは、酸性亜硫酸緩衝剤を加え
ずにｐＨ８．５に調節し、かつ０．８０〜４．５４の分
の範囲の流速を保以外は同じであった。例１と同様に、
ｐＨ７．５での操業はｐＨ８．５の操業よりも著しく生
産性が高かった。１８９１時間の連続使用後に、ｐＨ７
．５での操業には床の最大イソメラ−ゼ活性の２８％が
残存し、そして生産性は３０１１であった。

ｐＨ８．５での操業では、８３錨時間後に２１％の活性
度に低下し、生産性はわずかに８斑であった。例３例２
のｐＨ７．５での操業を、５５〜６５℃の範囲の異なる
温度でくり返した。

６ｙｏでのィソメラーゼの初活性は６ぴ０の場合よりも
多少高かったが、長時間使用後にはィソメラーゼの生産
性性及び活性は例２の軸７．５の操業の場合より実質的
に低かった。

異なる操作温度で、かつイソメラーゼ床の活性が初活性
度の１０％に低下するまで連続的に操作したときの生産
性の計算値は、５５℃で６９９Ｌ５がｏで６２９ふ５７
０で５６７０斑℃で５１１０、５９ｑ０で４６雌、６０
ｑ０で４１＄、６１００で３７５ム６２℃で３３９２、
６３ｑ０で３０６０６４ｑｏで２７７３及び６５ｏｏで
２５１０であった。５５〜６０ｑｏの温度でのカラム操
作により、フラクトースの全生産収率が６５ｑｏで得ら
れるものよりも１７９〜６６％の範囲で増加する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルコース異性化反応が（ａ）Ｃｏ＾＋＾＋イオン
   の存在下、及び（ｂ）６０℃以上の温度で行なわれる際
   に、デキスロースからフラクトースへ高い異性化速度を
   示すバルチス属微生物起源のイソノラーゼの固定床を用
   いてデキストロースをフラクトースに異性化する方法に
   おいて、前記方法が下記の（Ａ）〜（Ｄ）を含むことを
   特徴とするデキストロースをフラクトースに異性化する
   方法。 （Ａ） 本質的にＣｏ＾＋＾＋イオンを含まず、そして
   全乾燥重量に基づいて少なくとも９０℃の単糖類を含有
   する、精製したデキストロース供給シロツプを用意する
   。 （Ｂ） 前記シロツプを５５〜６１℃の範囲内の異性化
   温度及び７．０〜７．５の異性化ｐＨで固定化グルコー
   スイソメラーゼ床を通すことによつてデキストロース供
   給シロツプ異性化する。 （Ｃ） 異性化されたシロツプを回収し、一方補充量の
   供給シロツプを床に満たす。 そして、（Ｄ） 実質的に５５〜６１℃の異性化温度及
   び７．０〜７．５の異性化ｐＨを保ちつつ、床のイソラ
   ーゼ活性が至適活性水準の２０℃より少なくなるまで床
   内での供給シロツプの異性化を続ける。 ２ 床内での単糖類の異性化が３０００時間より多い期
   間続けられる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 操作時間の９０％より多い期間にわたつて、７．０
   〜７．５のｐＨ、５８〜６１℃の温度及び０．００００
   ５Ｍより少ない供給シロツプの第一コバルトイオン濃度
   で異性化が行なわれる、特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の方法。 ４ 供給シロツプが（乾燥物質の重量に基づいて）少な
   くとも９５％のデキストロース含有率及び５０〜５５重
   量％の範囲の乾燥固体含有率を有する、特許請求の範囲
   第１項〜第３項のいずれか一項に記載の方法。 ５ デキストロース供給シロツプの異性化がバチルス・
   コアギユランから誘導されるイソメラーゼの存在下に行
   なわれる、特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一
   項に記載の方法。 ６ 供給シロツプの単糖類含有率が（乾燥物質の重量に
   基づいて）少なとも９５％であり、かつ供給シロツプが
   前記床内で３５００時間より多い期間にわたつて異性化
   される、特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか一項
   に記載の方法。 ７ 供給シロツプが少なくとも０．００２Ｍのマグネシ
   ウムイオンを含む、特許請求の範囲第１項〜第６項のい
   ずれか一項に記載の方法。 ８ 異性化ｐＨが操作時間の少なくとも９０％にわたつ
   て７．０〜７．５の範囲内に保たれ、として全操作時間
   の５％より少ない期間が８．０より大きい又は６．５よ
   り少ないｐＨで行なわれる、特許請求の範囲第１項〜第
   ７項のいずれか一項に記載の方法。 ９ 供給シロツプが乾燥物質の重量に基づいて少なくと
   も９２％の単糖類含有率、０．００３Ｍ〜０．０１Ｍの
   マグネシウムイオン含有率、４５％より多く５５％まで
   の乾燥固体重量の含有率、及び０．００００５Ｍより少
   ない第一コバルトイオン濃度を有する、特許請求の範囲
   第１項〜第８項のいずれか一項記載の方法。 １０ 異性化床の活性度が床の至適異性化活性度の１５
   ％より少ない活性度に減少するまで供給シロツプの異性
   化が続けられる、特許請求の範囲第１項〜第９項のいず
   れか一項に記載の方法。