JPS6016404B2 - 生物学的活性物質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロテアーゼ存在性物質から採取して得られる
新規な生物学的活性物質に係り、特にこの物質の製法並
びに医薬その他の用途に関する。

本発明者は各種起源のプロテアーゼ酵素組剤の活性を研
究する過程で、これらの酵素製剤が何れも低分子量の特
定有機物質の微少量の遊離もしくは各種結合状態で含有
しており、この有機物質は生体内外に於けるプロテアー
ゼ活性を始めとした各種の酵素的反応過程に対して顕著
な賭活、促進乃至調整作用を示すという驚くべき事実を
見し、出した。更に研究の結果、この有機物質は少なく
ともプロテアーゼとその起源を共通にし、同種原料から
採取し得、消炎剤、健胃消化等の医薬として或いは有機
体に於ける各種酵素過程の促進乃至調整剤として極めて
有用であることを知見山、本発明に到達したものである
。

本発明による新規な生物学的活性物質（以下、単に活性
物質と指称する）の性質、製法、薬理作用乃至その他の
用途に付き、以下に分説する。

活性物質の性質溶存状態及び溶解性： 各種親水性乃至親油性溶剤及び水に可溶、水蒸気蒸留可
能且つアルカリ領域下の水溶液から有機溶剤により抽出
可能。

水溶液は１００℃に至る加熱に対して安定で第１アミン
溶液と類似の溶性を示す。他方、濃厚溶液では分子量数
千の会合多量体として存在。紫外吸収スペクトル： アルカリ性希薄水溶液（単量的）は２５柚ｍに鉄い単一
のピークを有する極めて単純なスペクトル（第３図）を
与え、穏和な酸処理でこのピークは約２８皿ｍにシフト
する。

生化学的特異作用： プロメラィン試験法に準じて試験した結果プロテアーゼ
活性を示さず（プロテアーゼ非活性）、顕著なカゼイン
凝集作用を有する。

従って、活性物質はそのカゼイン凝集活性を測定するこ
とにより定量され得、本発明で採用した測定方法は下記
の通りである；５夕のハマーステン・カゼイン（Ｈａｍ
ｍｅＲｔｅｎｃａｓｅｉｎ）を５００の‘の蒸留水に溶
解し、アンモニア水でｐＨ９〜１０とし、次いで全力ゼ
ィンが完全に溶解するまで放置する。

次に、１０夕のデフコ・スキムミルク（Ｄｉｆｃｏｓｋ
ｉｍｍｉｌｋ）を添加し、ｐＨ４．７の１．州酢酸緩衝
液を注意しつつ加えてｐＨを５．４に調整する。かくし
て得られた溶液を蒸留水で１夕に調整後、ロ過して試液
とする。活性物質１の【溶液（ｐＨ５．４、０．００８
Ｍ酢酸緩衝液又はこれに０．００２Ｍシステインを加え
たもの）に前記試液５の‘を添加混合し、４５℃、１時
間熟成後、０．０５％比０２含有の０．４ＭＮａＣそ溶
液５私で希釈し、比色計により波長５８仇ｍで比色定量
する。

１カゼイン凝集単位（ＣＡＵ）は、０．１０Ｄ（光学密
度）に相当するものと定義する。

活性物質の製法： 起源及び存在状態： 少なくとも、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、
力テプシン、／ぐ／ぐイン、プロメライン、フィシン、
レンニン及び各種微生物起源プロテア−ゼ等のプロテア
ーゼ類と起源を共通にし、多くはこの種このプロテアー
ゼ起源原料中に於いてべプチド或いは酸性炭水化物等の
高分子物質との弱結合状態で存在。

工業上有用な起源材料としては、アナナス料、無花果属
等に属する植物；胃、すし、織等の動物組織；或いはこ
れらの起源材料からの粗製酵素製剤等の沈殿、分別又は
抽出物などを例示し得る。

特に、パイナップル気根及び根中には遊離状態で比較的
多重に存在し、パイナップル・ステム、果実又は葉のジ
ュース中には遊離及び酸性炭水化物や蛋白質等の高分子
物質との弱結合の両状態で比較的多量に存在。従って、
パイナップル植物もしくはパイナップル・ステムジユー
スからのアセトン沈殿物として周知の粗製プロメラィン
は、本発明に於いて極めて有用な製造原料である。採取
方法：起源原料からの活性物質の有利な採取及び精製は
、後記各実施例に示す各種方法に準じて実施されるが、
より一般的には、カラムクロマトグラフィー、透析、電
気泳動法、ゲルロ過法、イオン交換樹脂法、沈殿法、溶
剤抽出、或いはこれらの手段の組合せなど、当該分野で
汎用の多くの分別精０製方法で達成され得、従って本発
明は特定の採取精製方法に何等限定されるものではない
。

即ち、本発明方法は、起源原料の種類、活性物質の存在
状態に応じ、前記活性物質の理化学的性質に基づいて、
上記の類の各種慣用技術を適宜組夕合せることにより、
容易に実施され得るものである。

下記に実施上の留意事項に付き、要約して示す。

１ パイナップル根は活性物質を遊離状態で含有する原
料として典型的なものであり、活性物質は熱湯により抽
出される。

パイナップル根の熱湯抽出液は、徴量の活性物質と多量
のタンニン、有機酸、糖、無機塩、プリン及びピリジン
等を含有し、抽出液はイオン交換樹脂力ラムクロマトグ
ラフィ、溶剤抽出等のの手段により分別精製されて活性
物質を与える。

０ プロメラインの原料でもあるパィップル・ステム、
果実その他の部位のジュースは、活性物質を遊離及び結
合の両状態で含有する製造原料の代表例であり、結合態
のものは炭水化物コロイド及び酵素等のべプチド類に吸
着乃至弱会合した状態にあり、ｐＨ及び温度を適切に調
整或いは加水分解酵素の添加等により加水分解されて遊
離形態の活性物質を与える。

即ち、ステム等からのジュース中のべプチド類や酸性炭
水化物高分子は、特定のｐＨ領域（ｐＨ４．２〜５．８
）でのアセトン（少なくとも２倍客）、メタノール（少
なくとも３倍容）等の沈殿剤の添加により遊離形態の活
性物質を極めて効果的に吸着、共沈することが知見され
た。

パイナップル植物に関する上記知見から明らかなように
、他のプロテァーゼ存在性物質を製造原料とした場合に
も同様な知見に基づく方法が適用され得る。尚、工業的
に有利な製法の１つとして、プロテアーゼ酵素製剤の製
造工程に若干の修正を施こすことにより活性物質を製造
副産物として得る方法をあげ得よう。

活性物質の薬理作用 薬理作用の要約： 本発明活性物質は消炎剤、健胃消化剤、血栓溶解剤乃至
壊死組織除去剤として有効である。

投与方法は、経口投与、静注、腹腔内注射、塗布及びそ
の他常法による。有効１日投与量は通常、１０〜１００
０ＡＵＩ個体（経ロ投与）、０．１〜１０ＡＵＩ個体（
静注）である。

以下に薬理試験例を示す。なお、薬理試験では試料とし
て後記実施例１又は２で得られた活性物質を使用した。
抗炎症効果： ラットを一昼夜絶食させ、活性物質精製水溶液（２にＡ
Ｕ／の【；０．００９Ｍシスティン含有）又は生物学的
食塩水（０．００８Ｍシステイン含有）を経口投与した
。

１時間後、各々のラットの皮膚に抗ラット血清０．０５
私を皮内注射した。

２時間後にラットを殺し、ｐ皿地法によりヱデマ量を測
定した。

結果を第１表に要約して示す第１表 マウス尾出血試験： 常法を誘導ストレスをも包含するよに変形した。

即ち、試料静注１時間前の各マウスに、０．１のリアド
レナリン／ｋ９（体重）を予め投与して置いた。活性物
質精製水溶液（２にＡＵ／の上：０．００９Ｍシスティ
ン含有）１／４の‘を各マウスに腹腔内在射し、その５
分後に出血させた。

結果をを第２表に要約して示す。

第２表 注）＊：５％レベルで有意差有り。

＊＊：１％レベルで有意差有り。

ＡＤＰ誘起血小板凝集試験： ＡＤＰ異常感受性人血から血小板に富むプラズマを予め
調整する。

活性物質精製水溶液（２にＡＵ／の【；０．００９Ｍシ
スティン含有）の１滴と、適当に希釈したＡＤＰ水溶液
の１滴とを５の【プラスチック試験管中で混合。

次いで、血小板に富むプラズマの２滴を添加し、ボルテ
ックス・シェーカーにより１分間振盤。次に、混合物を
シリコン化スライド上に注ぎ、プラスチック・カバー・
スリップでカバーして６“音顕微鏡により凝集度を測定
。凝集度は０〜５の６段階で評価され、評価０は凝集無
いこ対応し、評価５は血小板膜の溶解を伴なう大塊状凝
集を示す。尚、本試験に於いては、プロメライン、パパ
ィン等の市販酵素製剤中に活性物質が含有されているこ
とを併せ示すために、市販酵素製剤と、これをｐＨ３．
５下で２倍客のアセトンで２回沈殿精製して得られた精
製品とについても試験した。

全ての酵素製剤はその力価をＧＤＵ（ゼラチン消化単位
）／地で表示。因みに、従釆はプロメラィン、パパィン
等のプロテアーゼ自体がＡＤＵ誘起血小板凝集の阻止能
を示すものとみなされて来たものである。

結果を第３表に要約して示す。

第３表 線総素溶解系に対する作用： ２つの線総素溶解系、即ちフイブリノーゲン分解系とフ
ィブＩＪ分解系の各々に対する活性性物質（２０ＡＵ／
の‘、０．００８Ｍシスティン含有水溶液）の作用を試
験した。

フィブリノーゲン分解系は、人血※１泌、試料１の上、
生理食塩水０．１泌の混合液を３７０、２独特間保温。

次いで、トロンビン（５０山単位／１０の‘）０．１の
‘を添加して残余フイブリノーゲンをフィブリンに変換
させ、トロンビン添加３０分後、遠沈（３００仇．ｐ．
ｍ、５分）し、上清液中のＦＤＰ（フィブリノーゲン分
解生成物）量を赤血球凝集阻止反応により定量。他方、
フィブＩＪン分解系は、人血※１Ｍと試料１の‘との混
合物にトロンビン（５００単位／１０の‘）０．１ｍ‘
を添加して血数を凝固させ、次いで３７ｏｏ、２餌時間
保温後、生理食塩水０．１の‘を加え、遠沈（３００仇
．ｐ．ｍ、５分）後、上清液中のＦＤＰを上記と同様に
して定量。

尚、供試血数は数人の患者血数を混合して調製し、トロ
ンビンは人血糠由来で、操作はすべてプラスチックチュ
ーブ使用。

結果を第４表に要約して示す。

第４表 注）×Ｕ・Ｋ；ゥロキナ−ゼ標準 キ×２種の供試皿策 プロアミラーゼ活性化試験： ミルズ社製タカジアスターゼの０．１％水溶液１００の
【をＸＡＵの活性物質精製水溶液（２にＡＵ／地、ｏ．
ｏｏ８Ｍシスティン含有）と混合し、アミラーゼ量を経
時分析した。

アミラーゼ定量法は、０．００７ＭＮａＣク含有の可溶
澱粉１％水溶液（ｐＨ６．９）から酵素により遊離され
る還元性物質（主にマルトース）量を測定することから
成る。

還元性物質はジニトロサリチル酸法（サムナ−“ェンザ
ィムズ”アカデミック・プレス１９４４参照）により定
量。結果を第５表に要約して示す。

第５表 無添加物（対照）のアミラーゼ活性：０．０２５類似の
試験をバクテリア性アミラーゼについて行なった。

結果を第６表に示す。第６ 表 ｘ供誌ァミラ−ゼは「約２時間で自己 活性化を示す。

火傷痴皮除去試験： 活性物質を５０ＡＵ／タ含有のポリエチレングリコール
ベースの軟コウを調製。

火傷後３〜５日の家鬼の姉皮除去に上記軟コウを適用し
た結果、約８０％の除去率を示した。

これは、壊死組織などの生体の変性蛋白質を分解除去す
る際、活性物質が生体内の酵素系に作用し、賦活せしめ
る機作によるものと推定される。その他、乳液、水溶液
、グリセリン、ワセリン等と適宜混合し、にきびの治療
、角貿除去、肌荒改良等の外用薬としても、極めて有効
であることが確認された。用量検定： ラットを用い、厚みを測定する方法で卵白浮腫に対する
抑制作用を検定し、用量を定めた。

結果：１０ＡＵ／ｋ９（ｉ．ｐ）で抑制率５０％以上。
急性毒性：ｄｄ系雄性マウス（体重１５±１夕）を用い
た。

静脈注射には各濃度の検体を１匹あたり０，２の‘、腹
腔内注射には各濃度の検体を１匹あたり０．５の上、又
経口投与には１匹あたり０．５肌を投与した。ＬＤ３は
２４時間後Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ−ｗｉｌｃｏｘｏｎ法
で算定した。

結果を第７表に要約して示す。

第７表 その他の生物学的作用 カゼインに対する作用： １％ハマーステン・カゼイン （也ｍｍｅｒｓにｎｃａｓｅｉｎ）水溶液１００地上に
、力価２にＡＵの活性物質精製水溶液を添加し、生成し
たビュレツト反応呈色物質を経時的に比色測定（第８表
）。

この過程に於いて、活性物質はＫーカゼィンのＨＩＳ−
ＳＥＲ領域と協働し、そのＰｈｅ．ＡＬ一ＭＥＴ結合の
切断に寄与し、パラｍｋーカゼィンに変成せしめるもの
と推測される。ＰＡＬ−Ｍ旧Ｔ鯖合の切断は６６個のア
ミノ酸より成るべプチドを提供し、これがビュレット反
応で呈色するものと考えられている。尚、このカゼイン
分解機作は、カゼイン凝集反応にとり本質的なものの１
つであることが今日広く認められているが、従来はしン
ニンの特異作用であると推測されて釆たものである。

第８表 毅粉の可溶化促進作用： 大麦粉９夕を力価本ＡＵの活性物質含有水１００５のと
に懸濁して３０分間熟成し、次いで７０００で１分間加
熱、直ちに遠心分離して自由水量を測定（第９表）。

第９表 魚肉の可溶化促進作用： 魚体をミート・チョッパーで粉砕し、下記Ａ〜タＥ条件
下で熟成し、魚肉ペーストを遠心分離（５００仇ｐｍ）
した後、得られた上清水１叫にＩＮ−ＮａＯＨ１５の【
添加し、次いでべネデクト溶液（控ｎｅｄｉｃｔ′ｓｓ
ｃｌｕｔｉｏｎ）１Ｍ添加し、５６仇ｍで比色測定（第
１項長）。

Ａ 魚摺身を４５ｄｏで１時間熟成（対照）Ｂ 魚摺身
を９５ｏｏまで加熱し、次いで４５ｏｏ、１時間熟成（
対照）Ｃ 魚摺身１００夕当り次ＡＵの活性物質を添加
することを除き、Ｂと同一条件Ｄ 魚楢身１００夕当り
にＡＵの活性物質を添加することを除き、Ａと同一条件
Ｅ 活性物質を魚体粉砕時に添加することを除き、Ｄと
同一条件第１０表 ニワトリ肉の柔軟化： 力価０，１／４及びＩＣＡＵの活性物質の生理的食塩水
１の‘を、生育１８ケ月後のオンドリの翼静脈中に注射
投与。

５分後にニトリを殺し、調理後、パネル官能試験（５段
階評価）に付した。

結果を第１１表に示す。第１１表 ｘ）１〜極めて硬い ５〜極めて柔軟 工業的用途の要約： 上記各試験例から明らかな通り、本発明活性物質は生体
内外のある種のプロェンザィムを賦活する作用を有する
。

この知見によれば、活性物質の極めて広汎に亘る工業的
利用が可能であろうが、その幾つかにつき、以下に述べ
る。Ａ 食品工業 ａ 貯蔵穀物等の改質 例えば、豆、コーン、米、麦等の穀物（粉体又は種子な
ど）、或いは茶、その他の農産物を活性物質で処理する
ことにより、貯蔵プロェンザィムを賦活ごせて、よりス
イート、り柔軟、可溶性の食物に改質。

ｂ 農産食物における発酵過程の促進、例えばコーヒー
豆、カカオ豆、バニラ豆等を活性物質で処理することに
より、より香味性のすぐれた食品とすることがでかさる
。

ｃ 菓子、パン等製造用穀粉を活性物質で処理すること
により、競上り性のすぐれた、ニーディング時間の短少
でよい穀粉とすることがきるｄ 肉のイン・ビボ又はィ
ン・ピトロ投与による柔軟化改質。

ｅ 例えばフィシュ・ケーキ用等の魚肉摺身の粘着性の
増強。

ｆ 種子の熟成の促進。

Ｂ 食品廃棄物処理工業 ａ 魚肉廃棄物の可溶化（これは動物用飼料として好適
）。

ｂ 澱粉工業で生ずるスーチ・グルテン残澄を分解し、
高品質澱粉、有用なグルテン濃縮物とすること。

Ｃ イｑ艦品成分としての利用 各種イＱ姓品はその基材として、水溶性乃至油溶性原料
に、目的に応じ、薬品、香料などを加えているが、本活
性物質もまた、基質の蛋白質を分解する一つの新しいＦ
ａｃｔｏｒであることにより従来見られなかった化粧品
の成分として応用される。

即ち角質の主成分はプソィドケラチンで、酵素の作用を
うけ易く、絶えず新陳代謝が行われているが、天然のタ
ン白質分解酵素を人工的に加えることにより老化した角
質の分解速度を早め皮膚をなめらかにすることが知られ
ている。しかし、強度のタン白質分解酵素はかえって皮
膚をいため又その活性の消失によ所期の目的を達しなく
なることが往々にしてある。活性物質は新陳代謝が自然
に行われることを助長し、且つ異常状態の皮膚に対する
代謝を正常にコントロールするため、極めて、副作用が
少なく、且つ適確に効果を発揮する特長を有している。
更に皮膚の異常分必物を分解するため生体に働くことに
より、にきぴ、しみなどを除去し、皮膚を滑らかにする
効果が期待できる。実施例 １ −１ パイナップル根７０夕を各３０分間、８００その
水で３回煮沸抽出（抽出液のｐＨ：４．８）。

熱時ロ趣後、抽出液をＨ型の強酸性カチオン交ｆ奥箇脂
（ァンバラィトＩＲ−１２皿■、オルガノ社製）カラム
に通し（流出液ｐＨ：３．０）、次いで弱塩基性アニオ
ン交換樹脂（ァンバライトＩＲＡ−４５■、オルガノ社
製）カラムに通した（流出液ｐＨ：７．５）。アニオン
・カラム流出液は、カゼイン凝集活性を示さなかった。

アニオン・カラムをＩＮ−ＮＨ４０ＨＩそで溶出、１０
０の上づつ集め分析した。

始めの３００の‘はカゼイン凝集非活性、次の７００奴
は全て活性。活性溶出液のｐＨを３．０とし、アンバラ
ィトＸＡＤ−２■（オルガノ社製）カラムに通す。無色
の流出液を１００の‘に濃縮し、活性測定した（試料Ａ
）。カチオン・カラムはＩＮ一日Ｃそで藩出し、得られ
た無色の溶出液（試料Ｂ）の力価を測定した。各試料を
活性力価を第１２表‘こ示す。

第１２表 試料Ａ Ｉ０３２５（ＣＡＵ） 試料Ｂ ２６００（ＣＡＵ） −２ ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−ｌｏ■（ファルマシア社製
）カラムに試料Ａ，Ｂをそれぞれ通し（０．００９Ｍ塩
酸システィン−０．０１ＭＮａＣそ展開液（ｐＨ４．８
））、１０の【ずつ分取し、力価、糖、有機燐に付き、
定量した。

この複合体はチューブ地．１０〜１３に得られ、インジ
ゴカルミン（Ｍ．Ｗ．４６６）、クロロフイリンＢ（Ｍ
．Ｗ．約１２００）をキカリプレータとした時、この部
分の平均分子量は３０００程度と推定された。他方イン
ジゴカルミンと共にゲル孔に捕獲される、分子量８００
以下程度の活性部分が相当量、知見された。

結果を第１〜２図に示す。

第２図によれ‘よ、力チオンカラム溶出の活性物質は主
として複合体（コムプレツクス）塩として存在すること
が知見される。

−３ 塩類を析出除去した試料Ａ溶液をｐＨ８．５に調
整し、酢酸エチルで抽出。

抽出液から溶剤を除去し、少量の残澄をクロロホルムで
抽出した。クロロホルム抽出液を桂酸カラムクロマトグ
ラフ（ＣＨＣそ３ 、次いでＣＨＣそ３ −ＭｅＯＨを
展開液とした）で分別。明療に区別される３画分が夫々
得られ、活性は中間画分にのみ認められ且つこの画分は
強いニンヒドリン呈色反応を示した。この活性画分のＵ
Ｖスペクトル（第３図）は、２敗血に鋭いピークを有す
る単一のバンドを与える。実施例 ２ 下記実施例では、以下の如くして調整したプロメライン
を使用した。

パイナップル植物のステム又は果実を圧搾して得たパイ
ナップルジュースを塩酸、燐酸などでｐＨ４．２〜５．
８とし、これに２倍客のァセトン又は３倍客のメタノー
ルを加えて沈殿を正成させ、遠心して沈殿物を回収し、
アセトン又はメタノールで洗浄後、減圧乾燥するとブロ
メラィンが得られる。

−１ ２０夕のブロメラィン（瓜ｌｅ社製、ロット番号
Ｅ−Ｘ−１）を１その０．９％ＮａＣそ水溶液に蝿梓溶
解し、希塩酸でｐＨ３．２とした。次いで、同量の５０
％アセトンを加え、混合する。溶液を遠沈し、沈殿物を
除去する。上燈液は、先ず水で充分に洗浄し、つづいて
希塩酸で洗い、更に水で洗浄してカラムの弱酸性反応を
除いたアンバラィトＸＡＤ−２■（オルガノ社）カラム
にゆっくり通す。

通過液（５０％アセトンに溶けたタンパク、ベプチド、
糖類、塩類よび有機酸の混合物）、つついて２％ギ酸−
５０％アセトン液１夕で溶出山た液およびＰＨｉｌのＮ
Ｈ４０日−５０％アセトン液１そで溶出した液の三画分
を分取した。最初の画分をＣＨＣ〆３：ＭｅＯＨ（１：
１）で抽出（試料Ａ）し、他の画分は減圧濃縮後、冷蔵
庫に放置、析出した蛋白沈殿物を除去し、有機酸を２％
ＣａＣそ２溶液で沈殿除去させて試料Ｂ及びＣとした。

各試料溶液の力価は第１箱表に示す通りであった。第１
横表 試料Ａ ２００（ＣＡＵ） 〃Ｂ ５６００（ＣＡＵ） 〃Ｃ ０（ＣＡＵ） −２ 試料Ｂ溶液の−を２に調整し〜 ９０００、１０
分間加熱し、次いでｐＨ９．５にし、５分間煮沸し、適
当に希釈してＵＶスペクトルを測定。

結果は第４図に示す通りでありｈ２５仇ｍ付近に単一の
ピークを示し、活性物質質単量体とみなされる。

尚、酸とアルカリで加熱処理前の試料Ｂ溶液のスペクト
ルは、端部を除いて無視し得るものであった。

実施例 ３ −１ １０夕のプロメラィン（Ｄゆｅ社製、ロット番号
Ｅ−ＸＩ−１）を水５００の【ｌこ溶解、ＰＨＩＯ．７
にし１００午０で２び分間加熱しタンパク質変性により
プロテアーゼ活性を失活せしめる。

冷却後、希塩酸でｐＨ３．３とし、遠沈。上燈液を柵３
．３で有機酸を除くためクロロホルムで抽出。水溶液の
力価は８ＸＡＵ／の【（計５００にＡＵ）‐２ １０夕
のプロメラィンン（比ｌｅ社製、ロット番号Ｎ−ＩＶ−
１）を水２００泌に縄梓溶解し、希塩酸でｐＨ１．８に
し、プロテアーゼ活性を失宿せしめるべく１０ぴ○、３
０分間加熱後、希アンモニア水でｐＨ３．５となし、遠
沈。

上燈液に２倍客のアセトンを加え、遠耽。上燈液のアセ
トンを蟹去後、希アンモニア水でＰＨ１２とすると「少
量の沈殿物が形成された。上燈液を前述と同様に処理し
たＸＡＤ−２カラムに通し、ＰＨ１２の水１００初‘で
洗浄、アセトン１とで溶出。アセトン留去後、溶出液と
最初の液をｐＨ１２で４：１クロロホルム−アセトン混
液で抽出。クロロホルム層を、ｐＨ１２の水で洗い、Ｐ
Ｈ３．５の緩衝液で抽出しそれぞれの力価をカゼイン凝
集法で分析した−３ 灰分の多い粗製ブロメラィン（Ｄ
ｏｌｅ社製、灰分約５２％）１０夕を用い、前項と同様
に処して州性物質を得た。

‐４ １．５％のプｏメラィン（瓜ｌｅ社製）水溶液を
種々のｐＨ‘こ調製し、異つた時間放置後、３倍客のメ
タールを加えた。

遠沈後溶媒を上燈液から除き、カゼイン凝集力が残りの
液について測定された。結果を以下に分説する。

１ 冊４．２〜５．２では上燈液のＣＡＵは最低であっ
た。

これは活性物質がコロイドと共次した事を示す。活性物
質舎量の高いコロイド製品を作る場合もしも沈殿剤とし
てメタノールを使用するならば沈殿過程のＰＨは４．２
〜５．２にすべきである。

２ ｐＨ３．０以下では上燈液のＣＡ山ま極端に低下す
る。

これは、活性物質がコロイドと共沈するがその破壊の生
起を示す。しかし、他の実験では低いｐＨは、結合型活
性物質を加水分解して遊離型とするので低い解は悪いよ
うには思われない。３ ｐＨ６で、３０分間溶液を放置
するとカゼイン凝集反応を阻止する物質を生じる。

しかし、システィンが試験する時用いられれば、活性は
回復する。活性物質の不活性型はカゼイン凝集試験には
不活性であらるのみならず、阻害剤として作用する。

還元剤が自然に存在し又は添加されることにより、安定
な活性型の活性物質が得られる。４ 酵素溶液がｐＨ７
で１時間放置される場合、上澄液中の活性を回収するに
使用される沈殿工程の最良の母は：ａ ＰＨ６．０シス
ティンを添加することは試験又は応用面に用いられる。

ｂ ＰＨ８、システインはこのＰＨでは必須ではない。

Ｃ ＰＨ３．８‐５ ブロメラィン（比ｌｅ社製、ロッ
ト番号Ｘ−ＩＸ−１）の１％水溶液１００の【をｐＨ８
．０とし、種々の添加物（還元剤乃至一ＳＨ保護剤）を
加え、１時間放置後、１５０羽アセトン添加により沈殿
、遠沈。

上燈液からアセトン蟹去後、全量１００のと、ＰＨ５．
４に調製。次いで、溶液を煮沸し、ｐＨＩＯでクロロホ
ルムにより抽出。

得られたクロロホルム抽出液と残部水溶液に付き、力価
（ＣＡＵ）を測定した。結果を第１４表に要約して示す
。第１４表 ４ ０ 十 ２８０ ５６ ４ 十 ０ ５２ １８ ４ 十 十 ２６８ ４２ 外）セチルピリジニウム ー６ ｐＨ３．２で沈殿された５％ブロメラィン溶液の
１：１アセトン上澄液を、アンバラィトＸＡＤ−２■（
オルガノ社製）カラムに通し、カラムを５０％アセトン
、続いてＮＨＯＨ含有の５０％アセトンで溶出し、アン
モニア水でＰＨｉｌとする。

この函分はカゼイン凝集活性の殆んどを含む。次にカラ
ムをＩＮ−ＮａＯＨで溶出し、溶出液をクロロホルムで
抽出し、更に酸水溶液で抽出。

この画分は、システィン無添加ではカゼイン凝集活性を
示さないが、０．００２Ｍシスティンの添加により、約
ＡＵ／の上の活性力価を示した。実施例 ４−１ パイ
ナップル根・皮を沸騰水で抽出、濃縮し、凍結乾燥した
。

凍結乾燥粉を水に溶かし、ｐＨ８とし、酢酸エチルで抽
出。

抽出液をｐＨ４の緩衝液で洗った後、濃縮、乾燥する。
乾燥粉末を水に溶解し、−２ １０夕のフイシン（ＳＩ
ＧＭＡ社製）を２００の上の水に分散し、ｐＨを５から
３．５・落とした。有機酸をクロロホルムで抽出し、廃
棄。次いで、ｐＨを５に調整し、３０分間放置。

柵を９．７とし、クロロホルムで抽出して、澄明クロロ
ホルム層、ェマルジョン層及び水層の三層を得た。ェマ
ルジョン層に４倍客のメタノールを加え、沈殿物を遠沈
除去し、溶液をロ過。ロ液からクロロホルムとエタノー
ルを留去して力価を測定。水層中のコロイド沈殿物 Ｎ
ＯＲＳＨ＊ ＋ＲＳＨ×からのァセトン上燈液
２ ４＊ システィン賦活の有無＃ 高プロテア
ーゼ活性でＣＡＵ測定不能一３ ４夕のレンニン（Ｄ『
ＣＯ社製）を１５０の‘の水に分散、ｐＨを５．７とし
、１時間層。

次に、ＰＨＩＯとし、１％メタノール含有のクロロホル
ム５０泌で３回抽出。

ェマルジョンン層を分取し、５倍客のメタノールを加え
、沈殿を除去。全ての分画から溶剤を留去し、力価を測
定。ＣＡＵ／夕（レンニン製剤） −４ 大量のペプシン（半井化学薬品社製）を水に溶解
し、ｐＨを５．５に調整。

０ 次いでｐＨ３．０とし、２倍客のアセトンを添加
。

沈殿物は水に再溶解し、３倍のァーセトンで再沈殿。

【図面の簡単な説明】

第１乃至４図は、本発明実験図。 第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ パイナツプル根を熱水または沸騰水により抽出処理
   し、次いで得られた水溶液をイオン交換クロマトグラフ
   イーにより分別後精製処理してプロテアーゼ非活性でカ
   ゼイン凝集作用を有する物質を採取すること、から成る
   生物学的活性物質の製造方法。