JPS6038373B2 - 生物学的活性物質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はプロテアーゼ存在性物質から採取して得られる
新規な生物学的活性物質に係り、特にこの物質の製法並
びに医療その他の用途に関する。 本発明は各種起源のプロテアーゼ酵素製剤の活性を研究
する過程で、これらの酵素製剤が何れも低分子量の特定
有機物質の微少量を遊離もしくは各種結合状態で含有し
ており、この有機物質は生体内外に於けるプロテアーゼ
活性を始めとした各種の酵素的反応過程に対して顕著な
賦活、促進乃至調整作用を示すという驚くべき事実を見
し、出した。更に研究の結果、この有機物費は少なくと
もプロテアーゼとその起源を通にし、同種原料から採取
し得、消炎剤、健胃消化剤等の医療として或いは有機体
に於ける各種酵素過程の促進乃至調整剤として極めて有
用であることを知見し、本発明に到達したものでる。 本発明による新規な生物学的活性物質（以下、単に活性
物質と指称する）の性質、製法、薬理作用乃至その他の
用途に付き、以下に分説する。 活性物質の性質港存枕態及び溶解性： 各種親水性乃至親油性溶剤及び水に可溶、水義気蒸留可
能且つアルカリ領域下の水溶液から有機溶剤により抽出
可能。 水溶液は１００℃に至る加熱に対して安定で第１ミン溶
液と類似の液性を示す。他方、濃厚溶液では分子量数千
の会合多量体として存在。紫外吸収スペクトル： アルカリ性希薄水溶液（単量的）は２５桝ｍに鋭い単一
のピークを有する極めて単純なスペクトル（第３図）を
与え、穏和な酸処理でこのピークは約２８仇ｍにシフト
する。 生化学的特異作用： ブロメラィン試験法に準じて試験した結果プロテアーゼ
活性を示さず（プロテアーゼ非活性）、顕著なカゼイン
凝集作用を有する。 従って、活性物質はそのカゼイン凝集活性を測定するこ
とにより定量され得、本発明で採用した測定方法は下記
の通りである：５ｇのハマーステン・カゼイン（Ｈａｍ
ｍｅ鴇ｔｅｎｃａｓｅｉｎ）を５００の‘の蒸留水に溶
解し、アンモニア水でｐＨ９〜１０とし、次いで全力ゼ
インが完全に溶解するまで放置する。 次に、１雌のデフコ・スキムミルク（Ｄ的ｏｓｋｉｍｍ
ｉｌｋ）を添加し、ｐＨ４．７の１．印酢酸緩衝液を注
意しつつ加えてｐＨを５．４に調整する。かくして得ら
れた溶液を蒸留水で１１に調整後、ロ適して試液とする
。活性物質１の

【溶液（ｐＨ５．４ ０．００９ Ｍ酢
酸緩衝液又はこれに０．００２Ｍシステインを加えたも
の）に前記試液５肌を添加混合し、４５０、１時間熟成
後、０．０５％広０２含有の０．４ＭＮａＣＩ溶液５の
【で希釈し、比色計により波長斑仇血で比色定量する。 １カゼイン凝集単位（ＣＡＵ）は、０．１００（光学密
度）に相当するものと定義する。 活性物質の製法 起源及び存在状態： 少なくとも、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、
カテプシン、／ぐ／ゞイン、プロメライン、フイシン、
レンニン及び各種微生物起源プロテアーゼ等のブロテア
ーゼ類と起源を共通にし、多くはこの種のプロテアーゼ
起源原料中に於いてべプチド或いは酸性炭水化物等の高
分子物質との弱結合状態で存在。 工業上有用な起源原料としては、アナナス科、無花果属
等に属する植物；胃、すし・脇等の動物組織：或いはこ
れらの起源原料からの粗製酵素剤等の沈殿、分別又は抽
出物などを例示し得る。 特に、パィップル気根及び糠中には遊離、状態で比較的
多量に存在し、パイナップル・ステム、果実又は葉のジ
ュース中には遊離及び酸性炭水化物や蛋白質等の高分子
物質との弱結合の両状態で比較的多量に存在。従って、
パイナップル植物もしくはパイナップル・ステムジユー
スからのアセトン沈殿物として周知の粗製ブロメラィン
は、本発明に於いて極めて有用な製造原料である。採取
方法： 起源原料からの活性物質の有利な採取及び精製は、後記
各実施例に示す各種方法に準じて実施されるが、より一
般的には、カラムクロマトグラフィー、透析、函翁泳勤
法、ゲルロ過法、イオン交換樹脂法、沈殿法、溶剤抽出
、或いはこれらの手段の組合せなど、当該分野で汎用の
多くの分別精製方法で達成され得、従って本発明は特定
の採取精製方法に何等限定されるものではない。 即ち、本発明方法は、起源原料の種類、活性物質の存在
状態に応じ、前記活性物質の理化学的性質に基づいて、
上記の類の各種慣用技術を適宜組合せることにより、容
易に実施され得るものである。 下記に実施上の留意事項に付き、要約して示す。 １ パイナップル根は活性物質を遊離状態で含有する原
料として典型的なものであり、活性物質は熱湯により抽
出される。 パイナップル根の熱湯抽出液は、微量の活性物質と多量
のタンニン、有機酸、糖、無機塩、プリン及びビリミジ
ン等を含有し、抽出液はイオン交宅期樹脂力ラムクロマ
トグラフィ、溶剤抽出等の手段により分別精製されて活
性物質を与える。 ０ ブロメラインの原料でもあるパイナップル・ステム
、果実その他の部位のジュースは、活性物質を遊離及び
結合の両状態で含有する製造原料の代表例であり、結合
態のものは炭水化物コロイド及び酵素等のべブチド類に
吸着乃至弱会合した状態にあり、ｐＨ及び温度を適切に
調整或いは加水分解酵素の添加等により加水分解されて
遊離形態の活性物質を与える。 即ち、ステム等からのジュース中のべプチド類や酸性炭
水化物高分子は、特定のｐＨ領域（ｐＨ４．２〜５．８
）でのァセトン（少なくとも２倍客）、メタノール（少
なくとも３倍客）等の沈殿剤の添加により遊離形態の活
性物質を極めて効果的に吸着、共沈することが知見され
た。 パイナップル植物に関する上認知見か明らかなように、
他のプロテアーゼ存在物質を製造原料とした場合にも同
様な知見に基づく方法が適用され得る。尚、工業的に有
利な製法の１つとして、プロテアーゼ酵素製剤の製造Ｔ
程に若干の疹正を施こすことにより活性物質を製造副産
物として得る方法をあげ得よう。 活性物質の薬理作用 薬理作用の要約： 本発明活性物質は消炎剤、漣胃消化剤、血栓溶解剤乃至
壊死組織除去剤として有効である。 投与方法は、経口投与、静注、腹控内注射、塗布及びそ
の他常法による。有効１日投与量は通常、１０〜１００
にＡＵＩ個体（経ロ投与）、０．１〜１にＡＵＩ個体（
静注）である。 以下に薬理試験例を示す。なお、薬理試験では試料とし
て後記実施例１又は２で得られた活性物質を使用した。
抗炎症効果： ラットを一昼夜絶食させ、活性物質精製水溶液２三．（
２にＡＵ／舵【；０．００９Ｍシスティン舎）又は生物
学的食塩水（０．００９Ｍシスティン含有）を経口投与
した。 １時間後、各々のラットの皮膚に抗うット血清０．０５
の‘を皮内注射した。 ２時間後にラットを殺し、ｐ肌地法によりェデマ基を測
定した。 。結果を第１表に要約して示す。第１表 マウス尾出血試験： 常法を誘導ストレスをも包含するように変形した。 即ち、試料静注１時間前の各マウスに、０．１磯アドレ
ナリンｌｋ９（体重）を予め投与して置いた。活性物質
精製水溶液（２にＡＵ／似：０．００９Ｍシスティン含
有）１／４泌を各マウスに腹腔後内在射し、その５分後
に出血させた。 結果を第２表に要約して示す。 第２表 注） ＊：５隻レベルで有意差有り。 ＊＊：１０レベルで有意差有り。 ＡＤＰ誘起血小板凝集試験： ＡＤＰ異常感受性人血から血小板に富むプラズマを予め
調整する。 活性物質精製水溶液（２にＡＵ／ｍ【：０．００８Ｍシ
スティン含有）の１滴と、適当に希釈したＡＤＰ水溶液
の１滴とを５Ｍプラスチック試験管中で混合。 次いで、血小板に富むプラズマの２滴を添加し、ボルテ
ックス・シェーカーにより１分間振蟹。次に、混合物を
シリコン化スライド上に注ぎ、プラスチック・カバー・
スリップでカバーして６Ｍ音頭微鏡により凝集度を測定
。凝集度は０〜５の６段階で評価され、評価０は凝集魚
しに対応し、評価５は血４・板膜の溶解を伴なう大塊状
凝集を示す。尚、本試験に於いては、ブロメラィン、パ
バィン等の市販酵素製剤中に活性物質が含有されている
ことを併せ示すために、市販酵素製剤と、これをｐＨ３
．５下で２倍客のアセトンで２回沈殿精製して得られた
精製品とについても試験した。 全ての酵素製剤はその力価をＧＤＵ（ゼラチン消化単位
）／の‘で表示。因みに、従来はブロメライン、パパィ
ン等のプロテアーゼ自体がＡＤＰ誘起血小板凝集の阻止
館を示すものとみなされて来たものである。 結果を第３表に要約して示す。 第３表 線維素溶解系に対する作用： ２つの線縦素溶解系、即ちフィブリノーゲン分解系とフ
ィプリ分解系の各々に対す活性性物質（２ＭＣＵ／私、
０．００９Ｍシスティン含有水溶液）の作用を試験した
。 フィブリノーゲン分解系は、人血糠１の‘、試料１の‘
、生理食塩水０．１の‘の合液を３７℃、２畑時間保温
。 次いで、トロンビン（５０山単位／１０の‘）０．１泌
を添加して残余フイプリノーゲンをフィブリンに変換さ
せ、トロンビン添加３企分後、遠沈（３００比．ｐ．ｍ
．、５分）し、上蒲液中のＦＤＰ（フィブリ／−ゲソ分
解生成物）量を赤血球凝集阻止反応により定量。他方、
フィプリン分解系は、人血鰍１肌と試料１の‘との混合
物にトロンビン（５００単位／１０の【）０．１の【を
添加して血凝を凝固させ、次いで３７℃、２脚時間保温
後、生理食塩水０．１の‘を加え、遠沈（３００仇．ｐ
．ｍ．、５分）後、上清液中のＦＤＰを上記と同様にし
て定量。 尚、供試血鎌は数人の患者血数を混合して調製し、トロ
ンビンは人血数由釆で、操作はすべてプラスチックチュ
ーブ用。 結果を第４表に要約して示す。 第４表 注） ＊○・Ｋ：ゥロキナーゼ穣葦語 ＊＊２種の供試血 ブロアミラーゼ活性化試験： ミルズ社製タカジァスターゼの０．１％水溶液１００の
‘をＸＡＵの活性物質精製水溶液（２０ＡＵ／の‘、０
．００９Ｍシスティン含有）と混合し、アミラーゼ量を
経時分析した。 アミラーゼ定量法は、０．００７ＭＮａＣＩ含有の可溶
澱粉１％水溶液（ｐＨ６９）から酵素により遊離される
還元性物質（主にマルトース）量を測定するとから成る
。 還元性物質はジニトロサリチル酸法（サムナ−“エンザ
イムズ”アカデミック・プレス１班鷲参照）により定量
。結果を第５表に要約して示す。 第５表 無添加物（対照）のアミラーゼ活性；０．０２５類似の
試験をバクテリア性アミラーゼについて行なった。 結果を第６表に示す。第６表 ＊ 供試ァミラーゼは、約２時間で自己活性化を示す。 火傷痴皮除去試験： 活性物質を５にＡＵ／ｇ含有のポリエチレングリコール
ベースの軟コゥを調製。 火傷後３〜５日の家兎の痴皮除去に上記軟コウを適用し
た結果、約８０％の除去率を示した。 これは、壊死組織などの生体の変性蛋白質を分解除去す
る際、活性物質が生体内の酵素系に作用し、賦活せしめ
る機作によるものと推定される。その他、乳液、水溶液
、グリセリン、ワセリン等と適宜混合し、にさび治療、
角質除去、肌荒改良等の外用薬としても、極めて有効で
あることが確認された。用量検定： ラットを用い、厚みを測定する方法で卵白浮腫に対する
抑制作用を検定し、用量を定めた。 結果；１にＡＵ／ｋ９（ｉ．ｐ）で抑制率５０％以上。
急性蔓性：ｄｄ系雄性マウス（体重１５±１ｇ）を用い
た。 静脈注射には各濃度の検体を１匹あたり０．２の‘、腹
蛭内注射には各濃度の検体を１匹あたり０．５の‘、又
経口投与には１匹あたり０．５の‘を投与した。ｕキｏ
は２独時間後Ｌｉにｈｆｉｅｌｄ−ｗｊｌｃｏｘｏｎ法
で算定した。結果を第７表に要約して示す。 第７表 その他の生物学的作用 カゼインに対する作用： １％ハマーステン・カゼイン（ＨａｍｍｅＲｔｅｎｃａ
ｓｅｉｎ）水溶液１００の‘に、力価２訳ＣＵの活性物
質精製水溶液を添加し、生成したビュレット反応呈色物
質を経時的に比色測定（第８表）。 この過程に於いて、活性物質はＫ−カゼンのＨＩＳ−Ｓ
ＥＲ領域と協働し、そのＰｈｅ．ＡＬ−ＭＥＴ結合の切
断に寄与し、パラ−ｋーカゼィンに変成せしめるものと
推測される。ＰＭＬ−ＭＥＴ結合の切断は６母固のアミ
ノ酸より成るべプチドを提供し、これがビユレット反応
で呈色するものと考えられる。尚、このカゼイン分解機
作は、カゼイン凝集反応にとり本質的なものの１つであ
るとが今日広く認められているが、従釆はしンニンの特
異作用であると推測されて来たものである。 第８表 毅粉の可溶化促進作用： 大麦粉滋を力価にＡＵの活性物質含有水１００の‘に懸
濁して３０分間熟成し、次いで７ぴ０で１分間加熱、直
ちに遠心分離して自由水量を測定（第９表）。 第９表 魚肉の可溶化促進作用： 魚体をミート・チョッパーで粉砕し、下記Ａ〜Ｅの条件
下で熟成し、魚肉ペーストを遠心分離（５００仇ｐｍ）
した後、得られた上清水１のとにＩＮ−ＮａＯＨ１５の
【添加し、次いでべネデクト溶液（茂ｎｅｄｉｃｒｓｓ
ｏｌｕｔｉｏｎ）１の‘添加し、５６仇ｍで比色測定（
第１項表）。 Ａ 魚摺身を４５ｑｏで１時間熟成（対照）Ｂ 魚摺身
を９５午０まで加熱し、次いで４５℃、１時間熟成（対
照）Ｃ 魚摺身１０雌当り次ＡＵの活性物質を添加する
ことを除き、Ｂと同一条件Ｄ 魚酒身ｌｏ雌当り父ＡＵ
の活性物質を添加することを除き、Ａと同一条件Ｅ 活
性物質を魚体粉砕時に添加することを除き、Ｄと同一条
件第１０表 ニワトリ肉の柔軟化： 力価０，１／４及びＩＣＡＵの活性物質の生理的食塩水
１の‘を、生育】８ケ月後のオンドリの翼静脈中に注射
投与。 ５分後にニワトリを殺し、調理後、パネル官能試験（５
段階評価）に付した。 結果を第１１表に示す。第１１表 工業的用途の要約： 上記各試験例から明らかな通り、本発明活性物質は生体
内外のある種のプロェンザィムを賦活する作用を有する
。 この知見によれば、活性物質の極めて広汎に亘る工業的
利用が可能であろうが、その幾つかにつき、以下に述べ
る。Ａ 食品工業 ａ 貯蔵穀物の改質 例えば、豆、コーン、米、麦等の穀物（粉体又は種子な
ど）、或いは茶、その他の農産物を活性物質で処理する
ことにより、貯蔵プロェンザィムを賦宿させて、よりス
イート、より柔軟、可溶性の食物に敦質。 ｂ 農産食物における発酵過程の促進、例えばコーヒー
豆、カカオ豆、バニラ豆等を活性物質で処理することに
より、より香味性のすぐれた食品とすることがでる。ｃ
菓子、パン等製造用穀粉を活性物質で処理することに
より、燐上り性のすぐれた、ニデング時間の短４・でよ
い穀粉とすることができる。 ｄ 肉のィン・ビボ又はィン・ビトロ投与による柔軟化
改質。 ｅ 例えばフィシュ・ケーキ用等の魚肉沼身の粘着性の
増強。 ｆ 種子の熟成の促進。 Ｂ 食品廃棄物処理工業 ａ 魚肉廃棄物の可溶化（これは動物用飼料として好適
）。 ｂ 澱粉工業で生ずるスターチ・グルテン残澄を分解し
、高品質澱粉、有用なグルテン濃縮物とすること。 Ｃ イＱ鮭品成分としての利用 各種化粧品はその基材として、水落性乃主油瀞性原料に
、目的に応じ、薬品、香料などを加えているが、本活性
物質もまた、基質の蛋白質を分解する一つの新しいＦａ
ｃめｒであることにより従釆見られなかった化粧品の成
分として応用される。 即ち角質の主成分はプソィドケラチンで、酵素の作用を
うけ易く、絶えず新陳代謝が行われているが、天然のタ
ン白質分解酵素を人工的に加えることにより老化した角
質の分解速度を早め皮膚をなめらかにすることが知られ
ている。しかし、強度のタン白質分解酵素はかえって皮
膚をいため又その活性の消失により所期の目的を達しな
くなることが往々にしてある。活性物質は新陳代謝が自
然に行われることを助長し、且つ異常状態の皮膚に対す
る代謝を正常にコントロールするため、極めて、副作用
が少なく、且つ適確に効果を発揮する特長を有している
。更に皮膚の異常分秘物を分解するため生体に働くこと
により、にさび、しみなどを除去し、皮膚を滑らかにす
る効果が期待出来る。実施例 １ −１ パイナップル根７０ｇを各３０分間、８００１の
水で３回煮沸抽出（抽出液のｐＨ：４．８）。 熱時。過後、抽出液をＨ型の強酸性カチオン交換樹脂（
アンバラィトＩＲ−１２庇■、オルガノ社製）カラムに
通し（流出液ｐＨ：３．０）、次いで弱塩基性アニオン
交子期樹脂（アンバラィトＩＲＡ−４５■、オルガノ社
製）カラムに通した（流出液ｐＨ：７．５）。アニオン
・カラム流出液は、カゼイン凝集活性を示さなかった。
アニオン・カラムをＩＮ−ＮＨ４０ＨＩＩで溶出、１０
０の【づつ集め分析した。 始めの３００肌はカゼイン凝集非活性、次の７００ｍ‘
は全て活性。蒲性溶出液のｐＨを３．０とし、アンバラ
イトＸＡＤ一２■（オルガノ社製）カラムに通す。無色
の流出液を１００舷に縮し、活性測定した（試料Ａ）。
カチオン・カラムはＩＮ−ＨＣＩで溶出し、得られた無
色の溶出液（試料Ｂ）の力価を測定した。 各説料の活性力価を第１２歳こ示す。第１２表 −２ ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０■（ファルマシア社製
）カデムに試料Ａ，Ｂをそれぞれ通し（０．００９Ｍ塩
酸システインー０．０１ＭＮａＣＩ展開液（ｐＨ４．８
））、１０泌ずつ分取し、力価、糖、有機燐に付き、定
量した。 この複合体はチューブ恥．１０〜１３に得られ、インジ
ゴカルミン（Ｍ．Ｗ．４６６）、クロロフイリンＢ（Ｍ
．Ｗ．約１２００）をキカリプレータとした時、この部
分の平均分子量は３００の崖度と推定された。他方イン
ジゴカルミンと共にゲル孔に捕獲される、分子量８００
以下程度の活性部分が相当量、知見された。結果を第１
〜２図に示す。 第２図によれば、力チオンカラム溶出の活性物質は主と
して複合体（コムプレツクス）塩として存在することが
知見される。 −３ 塩類を析出除去した試料Ａ溶液をｐＨ８．５に調
整し、酢酸エチルで抽出。 抽出液から溶剤を除去し、少量の残糟をクロロホルムで
抽出した。ｏロホルム抽出液を桂酸カラムクロマトグラ
フ（ＣＨＣ１３、次いでＣＨＣ１３一ＭｅＯＨを展開液
とした）で分別。明瞭に区別される３画分が夫々得られ
、活性は中間画分にのみ認められ且つこの画は強いニン
ヒドリン呈色反応を示した。この活性画分のＵＶスペク
トル（第３図）は、２５乳ｍに鋭いピークを有する単一
のバンドを与える。実施例 ２ 下記実施例では、以下の如くして調製したブロメラィン
を使用した。 パイナップル植物のステム又は果実を圧搾して得たパイ
ナップルジュースを塩酸、燐酸などでｐＨ４．２〜５．
８とし、これに２倍客のアセトン又は３倍客のメタノー
ルを加えて沈殿を生成させ、遠心して沈殿物を回収し、
アセトン又はメタノールで洗浄後、減圧乾燥するとブロ
メラィンが得られる。 −１ ２雌のブロメラィン（Ｄｏｌｅ社製、ロット番号
Ｅ−Ｘ−１）を１１の０．９％ＮａＣＩ水溶液に損梓溶
解し、希塩酸でｐＨ３．２とした。 次いで、同量の５０％ァセトンを加え、混合する。溶液
を遠沈し、沈殿物を除去する。上燈液は、先ず水で充分
に洗浄し、つついて希塩酸で洗い、更に水で洗浄してカ
ラムの弱酸性反応を除いたアンバラィトＸＡＤ−２■（
オルガノ社）カラムにゆっくり通す。 通過液（５０％アセトンに溶けたタンパク、ベプチド、
糖類、塩類および有機酸の混合物）、つづいて２％ギ酸
一５０％アセトン液１１で藩出した液およびｐＨｉｌの
ＮＨ４０Ｈ−５０％アセトン液１１で溶世した液の三画
分を分取した。最初の函分をＣＨＣ１３：ＭｅＯＨ（１
：１）で抽出（試料Ａ）し、他の画分は減圧濃縮後、冷
蔵庫に放置、析出した製白沈殿物を除去し、有機酸を２
％ＣａＣ１２溶液で沈殿除去させて試料Ｂ及びＣとした
。 各試料溶液の力価は第１横長‘こ示す通りであった。第
１３表 −２ 試料８溶液のｐＨを２に調整し、９ぴＣ、１０分
間加熱し、次いでｐＨ９．５にし、５分間煮沸し、適当
に希釈してＵＷスペクトルを測定。 結果は、第４図に示す通りであり、２５肌ｍ付近に単一
のピークを示し、活性物質単量体とみなされる。 尚、酸とアルカリで加熱処理前の試料Ｂ溶液のスペクト
ルは、端部を除いて無視し得るものであつた。 実施例 ３ 一１ １雌のブ。 メライン（Ｄｏｌｅ社製、ロット番号Ｅ−ＸＩ−１）を
水５００の‘に溶解、ｐＨＩＯ．７にし１００００で２
０分間加熱しタンパク質変性によりブロテアーゼ活性を
失活せしめる。冷却後、希塩酸でｐＨ３．３とし、遠沈
。上燈液をｐＨ３．３で有機酸を除くためクロロホルム
で抽出。水溶液の力価は８ＸＡＵ／泌（計５００にＡＵ
）−２ １雌のブロメラィン（Ｄｂｌｅ社製、ロット番
号Ｎ−ＩＶ−１）を水２００双とに蝿梓溶解し、希塩酸
でｐＨＩ．８にし、プロテアーゼ活性を失宿せしめるべ
く１００ｏｏ、３０分間加熱後、希アンモニア水でｐＨ
３．５となし、遠沈。 上燈液に２倍客のアセトンを加え、遠次。上澄液のアセ
トンを蟹去後、希アンモニア水でｐＨ１２とすると、少
量の沈殿物が形成された。上燈液を前述と同様に処理し
たＸＡＤ−２カラムに適し、ｐＨ１２の水１００の‘で
洗浄、アセトン１１で溶出。アセトン蟹去後、溶出液と
最初の液をｐＨ１２で４：１クロ。ホルムーアセトン渡
液で抽出。クロロホルム層を、ｐＨ１２の水で洗い、ｐ
Ｈ３．５の緩衝液で抽出しそれぞれの力価をカゼイン凝
集法で分析した。‐３ 灰分の多い粗製ブロメラィン（
瓜ｌｅ社製、灰分約５２％）１咳を用い、前項と同様に
処理して活性物質を得た。 −４ １．５％のプロメラィン（Ｄｂｌｅ社製）水溶液
を種々のｐ則こ調製し、異つた時間放置後、３倍客のメ
タノールを加えた。 途汝後溶媒を上澄液から除き、カゼイン凝集力が残りの
液について測定された。結果を以下に分説する。 ｌ ｐＨ４．２〜５．２では上燈液のＣＡＵは最低であ
った。 これは活性物質がコロイドと共次した事を示す。活性物
質舎量の高いコロイド製品を作る場合もしも沈殿剤とし
てメタノールを使用するならば沈殿過程のｐＨは４．２
〜５．２にすべきである。２ ｐＨ３．０以下では上燈
液のＣＡＵは極端に低下する。 これは、活性物質がコロイドと共次するがその破壊の生
起を示す。しかし、他の実験では低いｐＨは、結合型活
性物質を加水分解して遊離型とするので低いｐＨは患い
ようには思われない。３ ｐＨ６で、３■ご間溶液を放
置するとカゼイン凝集反応を阻止する物質を生じる。 しかし、システィンが試験する時用いられれば、活性は
回復する。活性物質の不活性型はカゼイン凝集試験には
不活性であるのみならず、阻害剤として作用する。 還元剤が自然に存在し又は添加されることにより、安定
な活性型の活性物質が得られる。４ 酵素溶液がｐＨ７
で１時間放置される場合、上燈液中の活性を回収するに
使用される沈殿工程の最良のｐＨは；ａ ｐＨ６．０
システインを添加することは試験又は応用面に用いられ
る。 ｂ ｐＨ８、システインはこのｐＨでは必須ではない。 ｃ ｐＨ３８−５ ブロメラィン（Ｄｏｌｅ社製、ロッ
ト番号×−ＩＸ−１）の１％水溶液１００の‘をｐＨ８
０とし、種々の添加物（還元剤乃至−ＳＨ保護剤）を加
え、１時間放置後、１５０の【アセトン添加により沈殿
、速め。 上燈液からアセトン蟹去後、全量１００地、ｐＨ５．４
に調製。次いで、溶液を煮沸し、ｐＨＩＯでクロロホル
ムにより抽出。 得られたクロロホルム抽出液と残部水溶液に付き、力価
（ＣＡＵ）を測定した。結果を第１隻表１こ要約して示
す。第１４表 ＊）セチルピリジニウム −６ ｐＨ３．２で沈殿された５％ブロメラィン溶液の
１：１アセトン上燈液を、アンバラィトＸＡＤ−２■（
オルガノ社製）カラムに通し、カラムを５０％アセトン
、続いてＮＨ４０日含有の５０％アセトンで港出し、ア
ンモニア水でｐＨｉｌとする。 この画分はカゼイン凝集活性の殆んどを含む。次にカラ
ムをＩＮ−ＮａＯＨで溶出し、溶出液をクロロホルムで
抽出し、更に酸水溶液で抽出。 この画分は、システィン無添加ではカゼイン凝集活性を
示さないが、０．００２Ｍシスティンの添加により、８
ＣＡＵ／の上の活性力価を示した。実施例 ４ −１ パイナップル根・皮を沸騰水で抽出、濃縮し、凍
結乾燥した。 凍結乾燥粉を水に溶かし、ｐＨ８とし、酢酸エチルで抽
出。 抽出液をｐＨ４の緩衝液で洗った後、濃縮、乾燥する。
乾燥粉末を水に溶解し、有機鱗含量、ＣＡＵ力価を測定
した。−２ １０ｇのフィシン（ＳＩＣＭＡ社製）を２
００の‘の水に分散し、ｐＨを５から３．５へ落とした
。 有機酸をクロロホルムで抽出し、廃棄。次いで、ｐＨを
５に調整し、３０分間放置。 ｐＨを９．７とし、クロロホルム抽出して、澄明クロロ
ホルム層、ェマルジョン層及び水層の三層を得た。ェマ
ルジョン層に４倍客のメタノールを加え、沈殿物を遠沈
除去し、溶液をロ過。ロ液からクロロホルムとェタール
を留去して力価を測定。＊） システィン賦活の有無＃
） 高プロテアーゼ活性でＣＡＵ測定不能 −３ 隻のレンニン（ＤＩＦＣＯ社製）を１５０の‘の
水に分散、ｐＨを５．７とし、１時間放置。 次に、ｐＨＩＯとし、１％メタノール含有のクロロホル
ム５０の【で３回抽出。 ェマルジョン層を分取し、５倍客のメタノールを加え、
沈殿を除去。全ての分画から溶剤を留去し、力価を測定
。ＣＡＵ／ｇ（レンニン製剤） ＊） システィンで賦活 −４ 大量ペプシン（半井化学薬品社製）を水に溶解し
、ｐＨを５．５に調整。 次いでｐＨ３．０とし、２倍客のアセトンを添加。 沈殿物は水に再溶解し、３倍のアセトンで再沈殿。ＮＯ
ＲＳＨ＊ 十ＲＳＨ＊ ＊） システィン賦活の有無。

【図面の簡単な説明】

第１乃至４図は、本発明実験図。 第１図 第２図 第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 粗製ブロメラインの水溶液を加熱処理または有機溶
   媒により沈殿処理してプロテアーゼ成分を除去し、得ら
   れた残存物をカラムクロマトグラフイーにより分別後精
   製処理してプロテアーゼ非活性でカゼイン凝集作用を有
   する物質を採取すること、から成る生物学的活性物質の
   製造方法。 ２ 前記粗製ブロメラインが、パイナツプル植物のステ
   ム又は果実から得たパイナツプルジユースの酸性化後、
   これに有機溶媒を添加して生成される沈殿物から成るこ
   と、を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。