JPS6017345A - 電極センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体混合物中の１種または２種以上の選定され
た成分の存在を検出し、その分υを測定し、その含有量
を監視するが、または該成分の存在を検出し、その分量
を測定するための装置に関するものである。

本発明は化学工業、特に複雑な混合物に′ｉｆｉ遇する
場合（例えば食品化学または生化学技術）に用いられる
が、特に生物学の研究および制御技術において特に価値
がある。更に特に動物または人間の医薬、特に体液中の
成分を生体内で測定または監視するのに役立つ。

便宜上、本発明を、特に生体内における一つの測定に関
して、特定な基準で使用し得るが、一時的または永久的
注入に役立つ装置の使用により糖尿病患者のグルコース
を測定することにつき記載する。生物流体内の成分のセ
ンサを提供することが本発明の一つの目的であるが、他
の広い目的も含まれる。

生体内グルコースセンサは既に提案されている一つノ提
案は触媒白金電極におけるグルコースの直接酸化にｇづ
〈（）ｉｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　ＭｅｔａｂｏｌｉｃＲ
ｅｓｅａｒｃｈ、　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　５ｅｒｉｅ
ｓ　Ａ　Ｒ，ｐｐ　１０−１２（１９７９））が、特異
なものでなく、妨害物質により容易に被毒する欠点を有
する。グルコースに対し更に特定されない操作に対する
提案は、師禦電極にグルコースオキシダーゼを使用する
ことを含む（、ＡｄＶ、　ＥＸｐ、　ＩＫｅｃｉ、　Ｂ
ｉｏｌ、　５０　ｐｐ　１．８９〜１０７（１，９７４
３）が、高い夛ルコース濃度に著しい応答を示さない。

グルコースオキシダーゼを使用する他のシステムが提案
されたが、生体内方法（例えばＪ、　５ｏ１１ｄ−Ｐｈ
ａｓｅ　Ｂ土００ｈ６ｍ、　４　ｐｐ２５８〜２６２（
１，９７９）　）で十分研究されていない。

本出願人のヨーロッパ特許出願８２８０５５９７号明細
書には、導電性材料から成り、少なくとも外表面に酵素
と、酵素が接触的に活性である場合に電子を電極に搬送
するメゾイエイタ化合物を組合せて有するセンサ電極が
記載され、請求されている。

かかる電極の目的は、上記酵素により触媒された反応を
行なうことができる１種または２種以上の選定きれた成
分の存在を検出し、その量を評価することおよび／また
は監視することにある。電極の構造、メゾイエイタおよ
び使用の例が該Ｂ　−ロツパ特許出願に記載されている
。

本発明はヨーロッパ特許出願に例示された特別の１種の
メゾイエイタ化合物が広範囲の酵素に対するメゾイエイ
タとして一般的効用を有する。

本発明者等はＢｉｏｔｅａｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ　８　ｐｐ　１８７〜１９２　（１９８１）に記載
されている如く、酵素の作甫している間酵素から生ずる
電子を直接電極に搬送するため溶液中でメゾイエイタを
使用する酵素触媒反応の研究を試験管内で実施した。

酵素触媒電極システムに対し満足すべきメゾイエイタを
見出すため多数の試みが企てられた。かかる試みが開示
されている文献を数例挙げると一１米国特許第８，８８
８．０３８号、同第４．２２４．１２５号、同第４　、
１４４　、１．４８号および同第４．８８８．１．６６
号がある。

組織の潅流の悪さか嵯する°酸素張力レベルの低下は、
糖尿病患者の皮下組織から取った血液中のグルコースを
検出するだめの特別の問題である。

電子搬送のメゾイエイタとして酸素に依存しない、グル
コースオキシダーゼに基づく、他の電流滴定検出方法を
見出ずことが特に望ましい。前述のグルコースオキシダ
ーゼの電子受容体にはへキサシアノフエレート（Ｉｌｌ
）（２）および一定の範囲の有機染料（８）が含まれ、
前者は電極で容易に閉じ込められず、後者は分光光度計
の測定において広範囲に使用されているが、電気化学的
に用いるには、容易な自動酸化、還元された形態での不
安定およびｐＨ依存酸化還元電位を含む多くの欠点を有
する。

更に一般的に、定量電気化学分析の特に強い要求を満足
するメゾイエイタを見出すことが望ましい。

本発明者等は、一群のメゾイエイタ化合物が電極検知シ
ステムにおいて酵素−触媒反応を媒介するため極めて有
用な性質を有することを見出した。

特に本発明は、少なくとも２個の有機環から構成、され
、これらの夫々が、共役関係にある少なくとも２＠の二
重結合を有する有機金属化合物を電極センサメゾイエイ
タとして用いることを特徴とし；金属原子がかかる有機
環と接触して電子共有状態にある。これ等のメゾイエイ
タは相互に絶縁された２個の導体を有する電極センサシ
ステムに極めて有用であり、かかる導体の夫々は導電面
を介して、検知されるべき選定された化合物を含む混合
物と接触する。選定された化合物？７′４１度の代表的
な反応速度で、反応に触媒作用を及ぼすすごとのできる
酵素は上記混合物と接触し、メゾイエイタ化合物が酵素
と導体の−の導電面との間において、酵素触媒反応速度
の代表的な速度で電子を移動させる。

本発明においては、メゾイエイタは主としてフェロセン
タイブの化合物であるが、メゾイエイタとしてルテノセ
ンタイブの化合物も含まれ、特に不溶性のものであり、
酵素は無酸素特異フラ゛ビン蛋白質酵素またはキノプロ
ティンである。グルコースオキシダーゼおよびグルコー
スデヒドロゲナーゼは特に好適な酵素である０ グルコースオキシダーゼ（酵素分類Ｅ　Ｏ１，１゜８．
４のＢ−Ｄ−グルコース：酸素酸化還元酵素）は良く知
られたタイプの酵素である。細菌性のグルコースデヒド
ロゲナーゼが最近発見され、これは多環式キノンの補欠
分子族（ＰＱＱ）を有するキノプロティン（ｑｕｉｎｏ
ｐｒｏｔｅｉｎ　）であると考えられる（デユーイン氏
等著のＴｌＢ５．　（１９８１年ｌＯ月）２７８〜２８
０オよヒＡｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　（１９８２
’）１８１、２７〜８１参照）。

本発明におけるかかる細菌性のグルコースデヒドロゲナ
ーゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の使用は、グルコースオキシダー
ゼの使用に優る若干の利点を有する。主な利点は、この
グルコースデヒドロゲナーゼにより酸素−非感応性グル
コースセンサを得ることができることである。この理由
は、酵素が電子受容体として酸素を用いないからである
。適当な酵素を（以下詳細に述べるように）従来のクロ
マトグラフィーの技術により、または微生物範囲からの
二相水性分配法により精２“。

製することができる。好適な微生物はアシネトバクタ−
属カルコアセティクスであるが、梱々のグルコノバクタ
−属種（例えば、グルコノバタターオキシダーゼ）また
はプソイドモナス属ｒす＋　（例えば、緑膿菌、螢光菌
）も使用することができる。

上述のように、特に好適な形態のメゾイエイタ化合物は
フェロセンまたはフェロセン誘導体である。

フェロセンは、その基礎構造として２個のペンタジエチ
ル環の間に供与結合により”はさまれて維持された鉄原
子を有する。これはｐＨに無関係な可逆的−電子供与体
として作用する電気活性有機金属化合物である。酸化還
元電位、水溶性、およびグルコースオキシダーゼまたは
細菌性のグルコースデヒドロゲナーゼへの結合定数が異
なる４１１（々の誘導体（例えば、環構造に種々の置換
基を有するもの、あるいは重合体形態のもの）が入手可
能である。

例えば、母体化合物の還元電位はＮＨＫに対し＋　４２
２　ｍＶである。環状梁に官能基を導入することにより
、Ｅ’を＋８００−＋６５０　ｍＶ（７）間０ で変動させることができる。更に、カルボギシル貯換フ
ェロ七ンの水溶性は母体化合物の水溶性よ・り大である
。詳細はＡＣＳシンポジュームシリーズ、８８、ｌ　５
４ｊ（ウワナ・ティー、、１９７７）に記載されている
。

この形の特定なメゾイエイタ化合物の中にはフＸＯセン
自体、１．１１−フェロセンジカルボン酸、ジメチルフ
ェロセンおよび例えば約１６０００の平均分子量を有す
るポリビニルフェロセンがある。

メゾイエイタに課せられた要求は特に緊急なものがある
。メゾイエイタは酵素と導電性電極との間に電子を、潜
在的に相いれない反応を煎意味にするに十分高い速度で
容易に搬送するのが好ましい。従って応答速度は迅速で
ある。ざらに、応答はできるだけ大きい領域に亘り濃度
の読みの正確さを増すべきである。メゾイエイタは′間
予の搬送を達成するのに十分な濃度で’Ｉ！ｊ極表面で
濃厚であるべきである。メゾイエイタが電極および／ま
たは酵素に共有結合する場合には、この結合は媒介作用
を干渉すべきではない。従ってメゾイエイタは大部分の
用途において比較的非不溶性であるべきである。メゾイ
エイタは酸素の如き妨害物質またはｐＨに対して安定で
あり応答すべき′ではない。

然し最も重要なことは、電子の搬送速度が、酵素触媒反
応の速度に依存すべきである。すなわちメゾイエイタは
触媒活性を示す速度でその活性の期間中電子の搬送に影
響を与えるべきである。

上記で掲げた領域での満足な性能は、センサシステムの
極めて広域に亘るフェロセンタイブの化合物で得られる
。例えば、フェロセンは広範囲に亘る酵素に関して電子
搬送の媒介をなすことができる。

１．１−ジメチルフェロセンは特に好適なメゾイエイタ
である。検知すべき選定した化合物は酵素触媒反応化合
物に関する基質であるのが好ましい。また、酵素および
／またはメゾイエイタを、導体の内の一つの導電性表面
に制限するのが好ましい。最後に、好適なシステムにお
いては、メゾイエイタが電子を酵素から電極表面に搬送
する。

母体化合物の性質と一緒にフェロセン誘導体の性質を以
下に示す。

１．１／−ジメチル−１００Ｉ＋Ｄ　−酢酸　１２４　
Ｓ　８７０ ヒドロキシエチル−１６１３− フェロセン　１６５　１．Ｄ　８８５ ］、】ｌ−ビス（ヒドロキシメチル）−２２４３８８５
モノカルボン酸　２７５　Ｓ　、４２０１゜１１−ジカ
ルボン酸　８８５　Ｓ　−クロロ−８４５工、Ｄ メチルトリメチルアミノ−４００３ 第１表中Ｓは水に溶解性、■、Ｄは水に不溶性で８％洗
剤（Ｔｗｅ’ｅｎ　−２０）に溶解することを意味する
。Ｅｏは標準力四メル電極（！ｊＯＥ　）に対するｍｖ
で、Ｅはｃｍ　Ｍ−で表わぎれる測定値である。

上表の種々のフェロセンのリン酸緩衝溶液、ｐＨ７中に
おけるＥ。値は一定の範囲の電位に及び、Ｅｏ＝　１０
０〜４００　ｍｖ／ｓａＥである。ＥＯ値の傾向は置換
基の影響に基づき期待されるものと一致する。

一般に電子供与基は陽電荷を安定化し、従って電子受容
基より一層酸化を促進する。

−□つの好適な特定例においては、電極を、生体内でグ
ルコースを測定するように設計する。従って酵素はグル
コースオキシダーゼまたはできるだけグルコースデヒド
ロゲナーゼであるのが好ましい。例えば細菌性のグルコ
ースデヒドロゲナーゼが挙げられる。

予じめ形成されたロンド若しくは炭素粒子または炭素繊
維のペーストから構成された電極成形体の如く、電極自
体の導電性材料は、金属、特に銀、または炭素とするこ
とができる。ＴＬｉ極の表面条件は一般に重要である。

金属の場合には、活性物質（酵素および／またはメゾイ
エイタ）と接触する表面を粗面とすることができる。固
体炭素の場合には、表面を「酸化」させることができ、
すなわち表面を酸素雰囲気を有する炉で予め加熱処理す
ることができる。

グルコースの代表的検定結果について示きれた２種の酵
素についてはデヒドロゲナーゼが好ましく、またメゾイ
エイタについてはフェロセンタイブの化合物が好ましい
。

上記物質の一定の組合せおよび電極の一定の配置が実際
に好ましい。

酵素°固定化材料、重合体電極混合物、例えばテフロン
、または分子量が大きくなったために移動度が減じたメ
ゾイエイタの長鎖アルキル誘導体を随意に混入すること
ができる。

しかし、本発明の特に重要な形態においては、電極は、
炭素コアと、その表面上のフェロセンまたはフェロセン
誘導体の層と、該フェロセン若の表面上のグルコースオ
キシダーゼ若しくはグルコースデヒドロゲナーゼの層と
から成る。この酵素の層を、好ましくはメゾイエイタ上
の自己支持性ゲル層に維持させて下層の該メゾイエイタ
の表面゛に固定化しざらに／またはこの上にグルコース
分子に透過性である保持層を有するのが好ましい。

炭素コア自体を固形炭素とするか、若しくは炭素粒子ま
たは炭素繊維のかたいペーストとすることができる。一
般に、この炭素コアにはフェロセンまたはフェロセン誘
導体に対する平？ｉｔな而を設ける。かかるフェロセン
またはフェロセン誘導体は種々の方法、例えば： （ａ）　単量体のフェロセン若しくはフェロセン誘導体
の場合には、容易に蒸発し得る液体、例えばトルエンの
如き有機溶媒の溶液からｊｌＴ出させることにより： （ｂ）　重合体のフェロセン誘導体の場合には、クロロ
ホルムの如き重合体用の容易に蒸発し？１１る有機溶媒
から析出させることにより（Ｊ、　Ｄｏｌｙｍｅテｓｃ
土、　１９７６、１應−２４８８には、このようにして
析出させることのできる平均分子亀約１６０００のポリ
ビニルフェルセンの製造方法が開示されている）： （Ｃ）　重合性フェロセンタイブの単量体の場合には、
例えば約ＬＭ濃度のｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムペル
クロレートを含む有機電解液にビニルフェロセンを溶解
し、そのまま−７００ｍｖの電位でビニルフェロセンラ
ジカルを重合体として析出させることによってその場で
重合を電気化学的に行なわせることにより； （ｄ）例えば、炭素上へのフェロセン若しくはフェロセ
ン誘導体のカルボ−ジイミド架橋結合による炭素電極の
共有変性（ｃｏｖａｌｅｎｔ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ）により； 炭素コアに被着させることができる。

フェロセン若しくはフェロセンｉＴｌ［体上に被覆すべ
き酵素は、グルコースオキシダーゼまたは細菌性のグル
コースデヒドロゲナーゼとすることができる。グルコー
スオキシダーゼは、例えば強力に結合した薄層、低グル
コース濃度に対する良好な比例応答、および酸素に対す
る無感応性（基質から酵素レドックス中心へ移動する電
子について酸素とフェロセンからのものとが競合するか
らである）を与えるカルボ−ジイミド材ＤＯＧ（１−シ
フ四へキシル−８（２−モルホリノエチル）カルボ−ジ
イミドメト−ｐ−）ルエンスルホネート）により、下層
面に固定化することができる。また、フェロセンへのグ
ルコースオキシダーゼのＤＯＧ固定化を用いると、セン
サの比例領域（ｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅ　）のトップエ
ンドが約２　ｍｖから４０　ｍＶまで延びる。

固定化の他の方法、または保護の他の形態、例えば自己
支持型ゼラチン層に混入する保護形態も可能である。

また、細菌性のグルコースデヒドロゲナーゼをメゾイエ
イタ表面に固定化することもできるが、これは蒸発し得
る溶液から単に析出させるか、またはゼラチン層に保持
させることができる。

随意ではあるが、ライブブラッド（１ｉｖｅ　ｂｌｏｏ
＆’）に対して使用する場合には、水およびグルコース
分子に透過性である保護膜により酵素およびメゾイエイ
タ層の両者を包囲するのが好ましい。これは例えば弾性
的な０−リングにより弾性的に保持される透析フィルム
とすることができる。しかし、かかる保護膜を、例えば
アセトンに酢酸セルロースを俗解させた溶液に電極を浸
漬することにより形成でれる如き酢酸セルロースの層ま
たはポリウレタンの層とすることも有益である。膜は浸
漬、スプレーまたはスピンｗ、覆法により被着すること
ができる。

本発明はセンサ電極、特にグルコースに関する特殊なセ
ンサ電極に関するものであるが、一方ではまたかかる電
極と一時的または永続的注入手段、例えば針状プローブ
との組合せに関するものである。また、他の観点がら信
号装置または制御装置と、更に特にインスリン管理手段
と結合しているか若しくは結合し得るかかる電極も本発
明を構成する。更に、上述の一時的若しくは永続的注入
電極の使用を伴う糖尿病患者の監視方法も本発明の範囲
内にある。

本発明に係る電極により、現在あるタイプの病院用グル
ツース検知装置に使用される硬れたマクロ−センサを製
造することが可能となる。既知の装置と比較した場合の
利点は、酸素に極めて低感・応性であると共に比例領域
が高められるので、従゛来の装置における血液分析に伴
う希釈工程を排除することができることである。更に、
以下で一層詳細に述べる如く、かかる電極の応答時間が
短がいことである（溶液の複雑さにもよるが９５％の定
常状態につき２４〜３６秒である）。

本発明に係る電極を、マクロ的規模で、外科医または糖
尿病の家庭内検査用キットに関する簡単で安価な電子デ
ジタル表示装置に組み込もことができる。

マクロ−センサの僅かな変型は、自動的に指から血液を
抹集し、該血液をセンサと接触させ、信号を増幅し、デ
ジタル表示が得られる装置に使用することができる。皮
膚におけるグルコース介在流体を監視するための監視型
装置にミクロ的変型のセンサを使用することも考えられ
る。このセンサは手首につけられ、１または２以上の別
個の細い鋸状センサと後方に使い捨てのセンサカートリ
ッジを有する。各センサは、数個のセンサを使用した場
合に電流入力を参照して信頼度を確保するエレクトロニ
クス技術を用いること力（できる。

かかる装置を外部インスリン供給システムに接続すると
、インスリンポンプに関してフィートノくツクコントロ
ールループとして作用させることができる。実際、かか
る装置を、ｌンプから体内にインスリンを供給するため
に使用するカニユーレに収容し、再びフィードバックル
ープ用センサとして役立てる。他に、例えば低血糖警報
装置またはデジタル表示モニタとして使用することもで
きる。

フェロセン媒介システムを用いて使用することのできる
酵素には：酸素を含む種々の電子受容体ヲ使用すること
のできるフラピン蛋白ｆｉ　：　ＮＡＤＰＨ−またはＮ
ＡＤＨ−結合酵素、例えばリボアミドデヒドロゲナーゼ
およびグルタチオンリダクターゼ；上述の多環式キノン
補欠分子族（ＰＱＱ）を含む、ギツプロチインと称する
デヒドロゲナーゼがある。

Ｈ２Ｏ２を発生する上記フラビン蛋白質はＣ１ａｒｋ氏
等によるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　Ｓ
ｙｍｐ、　８　＋　８７７（１９７２）に開示されてい
る。特に好適なフラビ゛′蛋白質９１乳酸”ｖ＃’−Ｊ
・７′：ｌ　ｆ　＞　、ｔ　＃、”ダーゼ、リボアミド
デードロゲナーゼ、グルＪ’Ｊ−オンリダクターゼ、カ
ルボンモノオキシド−リダクターゼ、グルコオキシダー
ゼ、グリコレートオキシダーゼ、Ｌ−アミノオキシダー
ゼ、ガラクトースオキシダーゼである０ 好適なキノプロティンには、グルコースデヒドロケナー
ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、メタノールデヒド田
ゲナーゼがある。ＰＱＱキノプロテインノ明細はフィン
（Ｑｕｉｎｅ　）等のＪ、　ＴｌＢ５６　。

２７８　（１９８１）に記載されている。

最後に、ヘム含有酵素はフェロセン媒介電極システムに
使用することができる。かかる酵素にはホースラデツシ
ュペルオキシダーゼ、ホースノλ−トチトクローム、チ
トクロームペルオキシダーゼ、イーストシトクロムＣペ
ルオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ即ちイーストシ
トクロムＢ２かあるｔ。

上記酵素の如き酵素と７エロセンとの相容性は、作用す
る電極における電流が掃引電圧に亘り測定されるり、Ｏ
，サイクリックボルタムダラムを用いで表わすことがで
きる。

測定される電流は、溶液中の電気活性種への電子搬送お
よびＴ′！ｉ気活性種がらの電子搬送により生ずる誘導
電流成分を含む。電子活性種間の電子移動速度が十分に
速い場合には、銹導電流は電気活性種の拡散速度により
制御される。酵素触媒反応は、電圧掃引に必要な時間と
比較して、反応速度に依存する混乱をボルタムダラムに
生ずる。従って、特定酵素と電極間の移動に関する特定
メゾイエイタの適否を例１２〜２８において後述する如
くして評価することができる。

酵素、例えばグルコースオキシダーゼおよびグルコース
デヒドロゲナーゼである。

上述した如く、好適なる七ンザシステムにおいては、測
定すべき選定化合物が酵素に対する基質であり、また酵
素およびメゾイエイタを電極表面に限定する。この電極
を選定化合物を含む混合物・にａ露すると、酵素が触媒
活性となり、化合物の濃度を表わす電流を生ずる。

しかし、酵素触媒反応速度が酵素ノ昌でない他の化合物
の濃度の代りとなる他の配置が可能である。

次に本発明を例につき説明する。

例Ｉ アシネトバクタ−硯カルコアセティクスからのキノプロ
ティンデヒドロゲナーゼ （Ｇ　Ｄ　Ｈ’）の精製 （＆）　有機体の成長 ＺトレインＮ０ＴＯ’７８４４を／（ッチｋｉ’ｆ　４
１Ｊ：においてＩ）Ｈ８，５および２０’Ｃでコハク酸
ナトリウム（２０り／　ｔ　）　上テａｒ’＜　’ａ　
セタ。１ｉｌｌｌ　Ｉｌｆ’ｌ　全２０時間経過後（Ａ
６ｏｏ＝　６．０　）シュープレス型遠心分離機を用い
て採集し、冷凍保存Ｉ７た。

この方法はシュー・ニー・デユーイン氏等の方法（Ａｒ
ｃｈ　Ｈｌｅ：ｒｏｂ土ｏ１．　［８２ｖｊ−ｄｅ　５
ｕｐｒａ　）　ニ基づくものであるが、以下の修正を行
なった。

１　１００９（７）細胞を解凍し、８８００ｄ（１’）
５６　ｍＭ　）リス７８９　ｍＭグリセリンに懸濁させ
、６０■のリゾチームを用い室温で２０分間処理した。

２　トリトンＸ−１００抽出物を混合し、０．０１”■
ｆ　のデオキシリボスクレアーイエを用いて室温で１５
分間処理した。次いで生成した懸濁液を４℃において４
８０００ｘ９で２５分間遠心分離した。次いでこの遠心
分陰により得られた上澄液を硫酸アンモニウムで処理し
た。硫醐アンモニウム５５％と７０％の間で沈殿した黄
色蛋白質を１％トリトンＸ−１００を含有する８　６　
ｍＭ　）リス／　８９　ｍＷ　クリシンに懸濁させ、４
℃で５時間緩衝液に対し透析した。

８　０Ｍセファローズ０ｌ−６Ｂからの活性部分。

正常の体温における操作の安定性、広い範囲の比例応答
、他の代謝物による有意な干渉のないことおよび酸素に
依存しないことは試験管内使用および生体内グルコース
の連続監視に対する・−の新規な電流滴定酵素電極の開
発に値する。カラムを組合せ、ミリボアＣＸ−８０浸式
限外−過器を使用し濃縮した。

例２ アシネトバクタ−属カルコアセティクスからのキノブ四
チイングルコースデヒドロゲナーゼの精製（他の方法） （ａ）有機体の成長 例１の方法で行なった。

（ｂ）ＣＤＩ（の精製 この方法は２液相間での蛋白質の分配に基づくものであ
る。この工程は： ｌ　細胞を解凍し、ｐＨ７，，０の５０　ｍｌのリン酸
す）　ＩＪウム溶液に８イ／９の湿潤重置で懸濁させた
。次いで、かかる細胞を氷で予備冷却し、１７５８に９
／ｃＪ（２５０００ｐＳｉ・）で標準圧力セル（５ｔａ
ｎｓｔｅｄ　Ｆｌｕｉｄ、　Ｐｏｗｅｒ社製、５ｔａｎ
ｓｔｅｄ、　Ｅｓ５ｅｘ、　ＵＫ　）を−回通過させた
。

これにより細胞不存在の抽出物が得られた。

２　次いでこの細胞不存在の抽出物を５０重量％のポリ
エチレングリコール１０００．５０重祉％のリン酸ナト
リウム、ｐＨ７および蒸留水と夫々２：４：８：Ｉの割
合で室温にて１５分間混合した。この混合物を５０００
ｒｐｍで５分間遠心分離して乳濁液を破壊した。

８　底部層を吸出し、１００００ｍｗｔに切断したアミ
コン（Ａｍ１ｃｏｎ　）中空繊維の限外濾過カートリレ
ジを用いダイアフィルトレージョンするか、若しくはセ
ファデックス（５ｅｐｈａ−ｄｅｘ　）　（中級）ゲル
ろ過カラムを通すことにより脱塩した。

４　得られた溶液を、アミフンＰＭＩＯメンプランを用
いて窒素加圧セル内で濃縮した。

例８ フェロセンとグルコースオキシダーゼとの間の相互作用 ＤＣサイクリックポルタムメトリーを用いて基質過剰東
件下でフェロ−センとグルコースオキシダーゼとの間の
均一反応速度を研究した。ルジン（Ｌｕｇｇｉｎ　）細
管を取り付けたｌ、０ｍｌ容積の電気機械式２室セルを
用いた。このセルは、４−０ｍｍの金のディスク動作電
極、白金網の対向電極および参照電極としての飽和カロ
メル電極を備える。フェロセンに関する一連のポルタモ
グラフを、５（１ｍ％のリン酸カルシウム緩衝液ｐＨ７
，０において１〜１００　ｍＶｓ−１の走査速度で記録
した。このデータは、メゾイエイタが可逆的な一電子受
答体Ｅ。■−＋　１６５’　ＭＶ　Ｓ　Ｏ’Ｅとして作
用したことを示す。

５０　ｍＭのグルコースの添加では、メゾイエイタ（５
００μｍ）の１！気化学に対する認識し得る効果はなか
った。しかし、グルコースオキシダーゼ（１０μｍ）を
添加すると、メゾイエイタに関し陽極の電流増大が酸化
電位でポルタモグラムにて観察された。このことは、グ
ルコースオキシダーゼによるメゾイエイタの還元形態の
触媒再生を示ス。確立サレテイた方法（Ｎ１ｃｈｏｌｓ
ｏｎ、　Ｒ，Ｓ。

および５ｈａｉｎ、　Ｊ、　１９６４年Ａｎｌａ１．　
Ｏｈｅｍ、　、　８６゜７１１７）を用いることにより
、この反応に関して定量的な反応速度データが得られた
。このメゾイエイタに°ヨリ、フェリジニウムイオンと
還元グルコースオキシダーゼとの間の反応についてＫ　
＝１．０’　ｍ−１３−１の二次反応速度定数が得られ
た。グルコースオキシダーゼに対する迅速な酸化体とし
て作用するフェリジニウムイオンのかかる能力は、グル
コースの酵素酸化の有効なカップリングを容易にする。

例４ 例８の方法を７エロセンの代りに１　、１／−７エロセ
ンジカルボン酸を用いて実施した。Ｅ０／の値を測定し
た結果＋４２０　ｍＶであり、またフェリジニウムイオ
ンと還元グルコースオキシダーゼの二次反応速度定数は
また１０　ｍ　ｓ　であった。

これにより例８から導き出された結論を確認することが
できた。

例５ グルコースオキシダーゼ１　、１−ジメチルフェロセン 生体内での皮膚のグルコース検知用小形電極第２図に示
すように、酸化された表面を有するグラファイト俸１３
（長さ８０門×直径Ｑ、９ｍｍ）をナイロン管１４（長
き２５　ｍｙ＋１．内径０．９關、外径１．３ｍｍ）内
にエポキシ樹脂により接着ｔ７た。′眠極１５の端部を
ジメチルフェロセン（１，０ｍｙ　／　ｍｌ　）のトル
エン溶液に浸漬し、次いで溶媒を蒸発ぎゼだ。電極１５
の端部を水溶性Ｄ　ＯＯ（２５ｍｇ／　ｍｌ）の酢酸塩
緩衝液溶液、ｐＨ４，５内に１時間置いた。

次いで饅衝液で・５分間洗浄し、然る後グルコースオキ
シダーゼ（１０■／−）の酢酸塩緩衝液溶液、ｐＨ５，
５内に１％時間おき再び緩衝液中で洗浄した。

ジメチルフェロセンの層および固定した酵素の層を備え
た電極１５の先端を酢酸セルロースをアセトンとＮＮ／
−ジメチルホルムアミドに溶１１１￥した浴液に浸漬し
、数分間氷水中において保ｄ〃シた安定な電極を得た。

この電極を適当な対向電極とカロメル参照電極と一緒に
ポテンシオスタットに接続した。作動電極の電位をカロ
メル電極に対し＋１００　ｍＶ〜８０（１ｍＶに維持し
、即ちできるだけ低く維持して潜在的に干渉する物質の
酸化を防止した。グルコース濃度に比例する一流が生じ
た。９５％応答時間１１・１分未満で、電極は第８図に
示すように０〜８２ｍＭの範囲に亘りほぼ比例する応答
を示した。フェロセンの活性の緩徐な損失（フェロジニ
ウムイオンの緩徐な損失に基づく）は、電極を、使用し
ていない場合一定の電位、０．〜−１００ｍＶ／標準カ
ロメル電極に維持することにより、最小にすることがで
きた。

第４図に一例の電極の断面を示す。この電極においては
、第２図に示すような、大きさの極めて小ざい電極を、
１７の位置で栓をしであるが、血液若しくは他の体液を
通過ぎせるための側部惣】８を備えた皮下注射針１６内
に維持する。かかる％　桶の大１！さが小ぎいことおよ
びグルツース濃度の広い範囲に亘るその比例応答により
、ひどい糖尿病患者および正常の人に対する生体内での
グルコース測定のためにこの電極を使用することが可能
である。

例６ 第５図に示すように、金属コネクタ２ｏを備えた炭素棒
１９（ウルトラ・カーボン、グレードＵ５．６鴎Ｘ　ｌ
　５　ａｒｎ　）をガラス管２１（ホウケイ酸ガラス、
内径６朋）の一端に固定し、エボギシ樹脂（アラミド樹
脂）で封止した。２２の位１ｉ゛７でシ１に出した表面
を、金剛砂紙で磨き、蒸留水で洗浄した。棒金体をオー
ブン内２００　’Ｃで４１０時間加熱して２２の位置に
酸化された表面を得た。

１５μどのフェロセン（トルエン中に２０ｍ９／ｉ）を
酸化させた表面上にピペットで移し、十分に乾燥させた
。次いでロッドをｌ　ｍｌの水溶性Ｄ　ＯＧ　（０，１
Ｍの酢酸塩緩衝液に２５■／イ、ｐＨ４，５）中に室温
で８０分間入れた。しかる後に棒を０．２　Ｍの炭酸塩
緩衝液ｐ）（９，５で洗浄し、次いでグルコースオキシ
ダーゼ溶液（シグマタイプＸ　、　１２．５１ｎ９／ｒ
ｎり中に室温でｌｙ２時間入れた。最終的にこれを水、
０．２２／〕のグルコースを含むＩ））Ｉ　７の緩衝溶
液で洗浄し、４“Ｃで保存した。

上記電極の特性を窒素飽和緩衝溶液（（１，２ＭＮａ　
ＰＯ，、ｐＨ７，８）において測定し、これを第６・図
に示す。第６図において曲線はグルコースが２〜２５　
ｍＭまで直線であり、グルコースが１００ｍＭで飽和電
流に達した。

８　ｍＭのグルコースにおける空気飽和緩衝溶液による
別の試験において、電流が窒素飽和緩衝溶液中で生じた
電流の少なくとも９５％として測定された。

また、応答時間を測定した。尚、この時間は所定濃度に
おいて最大電流の９５％に達するのに要する時間である
。窒素飽和緩衝溶液を用いた場合、上述の如き電極は２
　ｍＭのグルコースで２４秒、また６　ｍＭのグルコー
スで６０秒の応答時間を示した。同様の緩衝液を用いた
場合に、酢酸セルロース膜のコーティングにより改質し
たかかる電極（例７の如くして製造）は、８６秒（２ｍ
Ｍ　）および７２秒（６ｍＭ　）の応答時間を示した。

血液の場合、この改質電極は８６秒（既知の２　ｍＭの
グルコース含量を有する血液）および７２秒（既知の６
　ｍＭのグルコース含量を有する血液）の応答時間を示
した。

上記の如き電極を安定度試験としてｐＨ７のＮａＰｏ、
　２０　ｍＭ中において４　’Ｃで４週間保管し、然る
後上述の如くして再試験した詩られた結果は新しく造っ
た電極の１０％以内であり、一般的には５％であった。

例７ グルフースデヒドロゲナーゼ／フェ四セン硬い炭素ペー
ストを１．６７のデュルコ（Ｄｕ、ｒｃｏ）活性炭およ
び２．５記の液体パラフィンから製造した。６咽ノ内％
　ヲ有するバスツールピペットヲ、接続線をろう付けし
た銀ディスクにより該ピペットの幅広端部から２關のと
ころを塞さいだ。ディスクとピペット端部との空間を炭
素ペーストで満たし、ペースト表面を平滑で同一の平面
となるまでペーパーで磨いた。

フェロセンのトルエン溶液（２０＋＋＋ｓ＋／ｌ）の−
滴２０μｔをかかる平滑な表面上に滴下し、これを広げ
蒸発させてフェロセンのフィルムを残存させた。

更に１づ当り１〜１０ｔｎｇの蛋白質を含む、例１・に
おいて得た如き細菌性のグルコースデヒドロゲナーゼの
溶液の一滴２５μｌを上記フェロセン表面上に滴下し、
これを広げた。

透析膜のカバーを、締り嵌めＯ−リングにより上記の如
く被覆した電極端部の上に固定した。

例８ グルコースデヒドロゲナーゼ／フェロセン例７の操作を
繰返し行った。但し同じ炭素ペーストを用いこれをナイ
ロン管の末端と管末端より２間短かく挿入されたステン
レススチール製皮下注射針シャフトとの間に画成された
空間に充填して小形電極体を画成し電極として用いた。

この電極を更に僅か５μｔのフェロセン溶液と１μどの
酵素溶液を用いて組立てた。

例９ グルコースデヒドロゲナーゼ／フェロセン例８の操作を
繰返し行った。但し電極として固形炭素棒（ウルトラグ
レードＵ５、直径（３ｒｒ、ｍ　）をパイレックスガラ
ス管（長さ３ｃｍ、内径６問）内に入れ、ステンレスス
チール製皮下注射シャフト・に接ｔ４シ、第５図に示し
た構１ｉｆと同様の碑活とした。炭素体の末端をエメリ
ークロスおよび酸化アルミニウム粉末で磨き平滑にし、
その後７エロセン溶液を塗布した。

例１０ グルコースデヒドロゲナーゼ／フェロセン２５■のゼラ
チン、Ｑ、５ｔｎｌの例９に記載した如きグルコースデ
ヒドロゲナーゼおよび２．５ＩｔｌのＴＥＭＥＤを８７
°Ｃで混合することによりグルコースデヒドロゲナーゼ
を含むゼラチンをつくったｇゼラチンを十分に溶解させ
た後、２００μｌの溶液を２ＣＭの領域上に拡げ、低温
空気流下で乾燥させた。

次いで例８における酵素溶液の滴の代りに０．２５ｃｒ
ｌの面積のディスクを用いた。

例１１ グルコースデヒドロゲナーゼ／フェロセン例１０の操作
を繰返し行った。但し］−ｒｎｎ？の面積のゲルを塗布
したディスクを使用し、例１０における酵素溶液の滴の
代りに上記ゲルを用いた。

例７〜１１に記載した電極を用いて得た結果は同様であ
り、低酸素感応性の極めて特異な１！極であることが分
かった。例示するため、例１０の電極を検定し、第７図
に示す結果を得た。

例１２〜２４ Ｄ、Ｃ，サイクリックポルタムメトリーを用いて次に示
す酵素とそれぞれの基質を一緒に存在させて陽極電流を
生じ高めるフェロセン化合物（通常フェロセンモノカル
ボン酸）の性能を示した。

第　２　表 ピルビン酸オキシダーゼ　ピルベート Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ　Ｌ−アミノ酸アルデヒドオ
キシダーゼ　アルデヒド キサンチンオキシダーゼ　キサンチン グルコースオキシダーゼ　グルコース グリコール酸オキシダーゼ　グリコレートサルコシンオ
キシダーゼ　サルコシン ・乳酸オキシダーゼ　ラクテート グルタチオンレダクターゼ　Ｎ　Ａ、　ＩＴＩ　（Ｐ　
）　Ｈリボアミドデヒドロゲナーゼ　Ｎ　、Ａ、　Ｄ　
ＨＰＱＱ＃素 グルコースデヒドロゲナーゼ　グルコースメタノールデ
ヒドロゲナーゼ　メタノールｉ５よび他のアルカノール メチルアミンデヒドロゲナーゼ　メチルアミンヘム含有
酵素 乳酸デヒドロゲナーゼ　ラクテート （イーストシトクロムＢ２） ホースラディツシュペルオキシダーゼ　過酸化水孝イー
ストシトクロムＣペルオキシダーゼ　過酸化水素それぞ
れの場合、酵素／メゾイエイタ糸は、酵素触媒反応を示
す増大した陽極電流を生ずる。このようにして得られた
データから計算した二次均一速度恒数は、フェロセン化
合物が、電極検定系をつくるのに適するように酵素電極
の電子搬送を効果的に媒介したことを示した。

サイクリックポルタムメトリーに対する代表的記゛□録
は次の通りである。

例２５ ａ）電気化学的計測 電位制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
　）電気化学的方法であるり、Ｏ，サイクリックポルタ
ムメトリーは、セル８０内において作動電極（ＷＥ）と
対向！−Ｍ　（Ｇ　Ｅ　）との間に電流を流すことによ
り、参照電極に対し作動電極（ＷＥ）の電位を維持する
ことに基づくものである。第８＠は、２個の演算増幅器
を組み込んだ、使用した回路を示す。これら増幅器をオ
ックスフォードエレクトローズ（０ｘｆｏｒｄ　Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｄｅｓ　）ボテンシオスタットニ組込んだ。電
流−電位曲線を、ブリアンズ（Ｂｒｙａｎｓ　）Ｘ−Ｙ
２６０００Ａ３チャート記録計を用いて記録した。印加
した電位−ｖｉｎ＋電流−■。ｕｔ／Ｒとした。

デジタル−アナログおよびアナログ−デジタル変換器を
介してポテンシオスタットに接続した８８０Ｘマイクツ
コンピユータ（リサーチマシンズ社製）を電位ステップ
法に用いた。ボテンシオ”、スタットは、１以上の作動
電極の切替および監視を容易にするマルチプレクサ−を
取入れた。

ｂ）セルおよび電極 り、Ｏ，サイクリックポルタムメトリーの実験を、第９
図に示す配置、即ち２個のセルを第９図中のルジン細管
８１により連結して配置する２室セルを用いて行なった
。

直径４鰭の金製作動電極８２（白梅および熱分解グラフ
ァイトも十分に使用できた）の他に、セルは１　ｃｍ”
の白金網対向電極３８および基準として−１０°Ｃタロ
０℃の範囲において正確な飽和カロメル電極８４型に４
０１を備える。すべての電位は、標準水素電極（ＮＨＫ
）に対し２０°Ｃで＋２４１　ｍＶである飽和カロメル
電極（ＳＯＥ）を参照した。

作動電極をコツトンウール上でアルミナ−水ペーストを
用いて各実験前に磨き上げ、次いで脱イオン水で洗浄し
た。粒度約０．８μｍをＢＤＨにより得た。

、ｃ　）温度制御 電気化学的実験を、電気化学的セルを配置した水浴に接
続したチャーチル（（３ｈｕｒｃｈｉｌｌ　）チラーサ
ーモサーキュレータを用いることによりサーモスタット
制御下で行ナツタ。

ｄ）分光光度測定 すべての光スペクトルを、適切な光路１　ｃｍの石英の
小形キュベツトに試料および標準溶液を入れＰｙｅ　−
Ｕｎｉｃａｍ　Ｓ　Ｐ　８２００分光光度計で記録した
Ｏ ｅ）水の精製 可能な場合には、全ての溶液を、ミリボア（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ　）社製のＭｉｌｌｉ　−ＲＯ４とｌシ１ｌｌ
ｉ　−Ｑとを組合せたシステムを用いて一連の逆浸透イ
オン交換および炭素ｐ過により精製した水を用いて調製
した。

蛋白質の限外ｐ過およびダイアフィルトレージョンを、
適当なシアフロ（Ｄｉａｆｌｏ　）膜を備えた、適当寸
法のアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）セルを用いることによ
り行なった。

蛋白質の精製をファーマシア（ｐｈａｒｍａｃｉａ　）
社製のＦＰＬｑを用いて行なった。これは、単波長ＵＶ
−モニタ（λ−２６０ｎｍ　）および自動画分コｌ／ク
タＦＲＡＯ−１００と共に操作されるグラジェントプロ
グラマＧＰ−２５０により制御される２個のｐ−５００
ポンプを備えた。分析イオン交換カラムおよび予備イオ
ン交換カラムもファーマシア社製のものであった。

Ｄ、０．サイクリックポルタムメトリー実験を次のよう
にしてアルゴン飽和溶液にて行なった。先ず、適当な電
解液中の７エロセンモノカルボン酸（２００μＭ）の可
逆的電気化学特性を、０〜４００　ｍＶの電位範囲に亘
り種々の走査速度（シー１〜１００ｍＶＳ）でポルタム
モノグラムを記録することにより確立した。次いで基質
をセルに、代表的には最終濃度が１０　ｍＭまで且つ常
に酵素に対するミカエリシスーメンテン定数を越えるま
、で添加した。ポルタムモアグラムのセットを記録し−
Ｃメゾイエイタの電気化学特性に対する基質の作用を評
価した。次いで酵素を１０〜１００μ１６の範囲の最終
濃度となるまで添加した。陽極の電流が高められ、また
走査速度に対する陽極電流作用の依存性が触媒反応を示
す場合には、最終成分としての基質を添加して実験を繰
返し行ない、反応が基質の存在に依存することを確かめ
た。

用いた条件下においては、基質はフェロセンの電気化学
的作用を妨害しなかった。ＳＣＥに対しθ〜４００　ｍ
Ｖの範囲に亘り、基質または酵素は如何なる直接的な電
気化学的作用をも示さなかった。

ｈ）材料１ フラビン蛋白質、ピルビン酸オキシターゼ（ＥＯｌ、２
．３．３）、キサンチンオキシターゼ（Ｅ　Ｃ１，２，
８，２）、サルコシンオキシターゼ（Ｅ　Ｏ１，５，３
，１）、リボアミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ　Ｃ１，６，
３，４）およびグルタチオンリダクターゼ（Ｅ　Ｏ１，
６，４，２）をボエリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　
）より得、これらを−２０°Ｃで保、管した。フラビン
蛋白質の各濃度を触媒活性フラビンの分量で表わした。

一酸化炭素オキシドーリダクターゼをＤｒ、Ｊ。

Ｃ０１ｂｙ氏著のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ　。

５ｕｎｄｅｒｌａｎｄ　Ｐｏ１ｙｔｅｃｈｒｒｉｃによ
りプソイドモナス属す−七カルポキシドボランズから単
離し、安定剤として５０％のエタンジオールを含むリン
酸塩緩衝液に８．６■ｆ１の濃度で供給した。使用する
前に、酵素を２０　ｍＭのトリス−ＨＧｌ−（１）Ｈ７
，５）に対し４°Ｃで透析し、分析用ＭＯｎｏ　−Ｑカ
ラムを用いてＦＰＬＯにより精製した。次いでこの酵素
を２０　ｍＷのトリス−ＨＣＩＩ）Ｈ７，５（緩衝液Ａ
）中に１、Ｏｍｇｍｒ”の濃度でカラム上に負荷し、緩
衝液（Ａ　＋１．、ＯＭＫＯ７）を直線的イオン強度勾
配で用いて溶離した。−酸化炭素オキシド−リダクター
ゼは、第１０図に示す如く、８５％の緩衝液Ｂと等しい
イオン強度において１つの主要なピークとして溶離した
。

キノ−プロティンアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ（３
１，１，９９，８）の精製は上述した。乳酸デ、ヒドロ
ゲナーゼ（ＥＯｌ、１．１．２７）およびイソクエン酸
デヒドロゲナーゼ（ＥＯｌ、１．１゜４２）をボエリン
ガ−（Ｂｏｅｈｒｉｎ（＜ｅｒ　）より得た。

乳酸ナトリウム、イソクエン酸ナトリウム、サルコシン
、ピルビン酸ナトリウム、キサンチン。

コレステロール、シュウ酸カリウム、コリ、ンおよび還
り得た。−酸化炭素をＢＯＧから得た。フェロセンセ／
カルボン酸をフルオロケム（Ｆｌｏｕｒｏｃｈｅｍ　）
より得た。

１）電解液 すべての実験で１００　ｍＭのトリス−ＨＣ７緩価１ｐ
Ｈ７，ｏを用いた。但し、１１００Ｉｎのコハク除塩緩
衝液ｐＨ３，０を用いたオキサレートオギシダーゼを含
むものおよび１４　ｍＭのＮＨ，Ｏ７を含む１００　ｍ
Ｍのはう砂−ＮａＯＨを用いたアルコールデヒドロゲナ
ーゼを有するものを除いた。

すべての実験において４朋の熱分解グラファイト円板作
動電極を組み入れた第９図に示す電気化学的セルを用い
た。但し、かかる実験においてリポアミドデヒドロゲナ
ーゼおよびグルタチオンリダクターゼに対する実験にお
いては、４鰭の円板金電極を用いた。シトクロムＣを一
酸化炭素オギシド・リダクターゼを用いて調べた実験に
おいては、ビス（４１、４，７−ピリジル）−１，２−
エテン改質金電極を使用した。

上述のサイクリックポルタムメトリーを用いて、グルコ
ース／グルツースオキシダーゼシステムで掲げた種々の
フェロセン化合物の電子搬送能力を示した： ７エロセン　１６５　１５ ビニル−２５０１８ カルボキシ−２７５１１５ １，１７−ジカルボキシ−８８５１，５ト１１７ナルア
ミノー　４００　：３００、ａ）溶液速度論 一定の範囲の電位（ＳＯＥに対し１００〜４００　ｍＶ
）を有する第８表の種々の７工ロセン誘導体を、Ｄ、Ｏ
，サイクリックポルタムメトリーを用いてグルコースオ
キシダーゼに関する可能す酸化体として研究した。第１
１図は、可逆的な１電子カツプルとして電気化学的判定
規準を満足するカルボキシフェロセンのポルタモグラム
を（ａ）テ示ｔ　（δＥｐ−６ｏ　ｍｖ　＋　ｌｐ　／
　Ｘ−一定）０溶液にグルコースだけを添加した場合に
は、ポルタモグラムに対し認識できる影響はなかった。

しかし、溶液にグルコースオキシダーゼを更に添加した
場合（ｂ）、ポルタモグラムに著しい変化が生じた。陽
極の電流の増加は触媒的カップリング反応の特徴であり
、次の図式として表わすことができる： Ｒ−ｅ”−＝＝２０〔２〕 Ｓ ０＋２−一一一うＲ〔３〕 ここで、Ｒはフェロセン、０はフェリジニウムイオン、
および２は還元されたグリコースオキシダーゼを示す。

増加した陽極電流は還元されたグリコースオキシダーゼ
と７エリシニウムイオンとの間の反応に起因する。尚、
後者のイオンは酸化電位で生ずる。グルコースオキシダ
ーゼと多数のフェロセン誘導体との間の均′−反応の機
構ヲニフルソンおよびシャインにより誘導された理論に
よって分析した。データから、走査速度に関係なく疑似
−次速度定数を誘導することができた。グルコースオキ
シダーゼの濃度の関数としてのかがるパラメーターの変
化は、二次反応速度定数をもたらした。この分析の有効
性は満足されるべき２条件に左右され；不均一な電極反
応は、触媒カップリング均一反応に比し速くしなければ
ならず、また酵素が常に還元形態にあることを確保すべ
く十分なグルコースが存在していなければならない。こ
れら同条件はこの研究において正しがった。第８表に示
すデータは、研究した酸化形態の全ての７工ロセン誘導
体が、ｋｓ−１０’Ｍ−１・ｓ−１の値を有する自然の
電子受容体である酸素分子の反応速度、に匹敵する反応
速度を有する酵素に関する急速な酸化体として作用する
ことを示す。

第８表に示す全てのフェロセン誘導体はグルコースオキ
シダーゼを介してグルコースの有効な′電気化学的酸化
を生ぜしめるが、実際に使用される酵素電極を設計する
際に他の基準が重要である。

水性媒質中の還元形態の７工ロセン誘導体の溶解度は、
？ｌ！極内に取り込み易くするために低くしなければな
らずづ酸化形態は生理学的ｐＨで安定とすべきでありｉ
見掛けの電位は、生理学的試料に存在する還元化合物に
よる妨害を防止するため低くスヘきである。１　、１’
−ジメチルフェロセンは、これらファクタにより課せら
れる束縛の間で最良の妥協点を提供し、酵素電極に組み
込むために選定した。

ｂ）酵素電極 デジタルシミュレーション技術は、’４流明定用酵素電
極に関する定常状態電流を見掛はミカエリス−メンテン
定数、Ｋ旧、膜透過率、有効電極表面積、および酵素、
負荷ファクタ（単位容積当りの濃度）により主に決定さ
れることを示した。有効な酵素固定化技術を考慮した場
合に、機能化された電極表面への共有結合により一般に
最良の酵素活性が得られた。更に、得られた単層の被覆
が最適な応答特性に関し最も適していた。これに基づき
、１バッチ２４個の標準のグルコース酵素′成極を以下
に示す何く構成し、これらの性能を６１１価した。

Ｃ）試薬 グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１，］、　８．４タイプ
２、黒色麹菌クロカビからのもの）をボエリンカーマン
エイムカら得た。尚、このグルコースオキシダーゼは２
７４ＩＵ／ｍ９の活性を有した。

Ｄ−グルーｒ　−ス（ＡｎａｌａＲ）をＢＤＨからイ１
↓；フェロセンおよびその誘導体をＳｔｒｅｍ　（３ｈ
ｅｍ、　Ｑｏ、から得た。すべての溶液を高純度水（マ
イリボア）でアリスタブレード（Ａｒ１５ｔａｒ　ｇｒ
ａｄｅ　）　試薬から調整した。支持電解液はＨＯＩＯ
，で要求されるｐＨ値に調節きれた０　、　１Ｍ　、に
２ＨＰＯ，とし、グルコース溶液は一晩保管してα−お
よびβ一形態（ａｍｏｍｅｒ　）を平衡にさせた。この
酵素の性質を以下の表に示す０ 第４表 給源　；黒色周面クロカビ ＲＭＭ　叫８６００ Ｃ゛−ファクタ　２　ＦＡＤ ｃｏ−基質　酸素 最適ＰＨ５，６ Ｋ［Ｉｌグルコース　３．０ｍＭ ｄ）生物試料 糖尿病患者のヘパリン添加血漿試料を英国ロンドンのガ
イズ病院、メタポリツク部門により得、予じめグルコー
スに関してイエロースプリングスインストルメンツ社製
のグルコース分析器により分析した。

ｅ）装置 ｌ　ｍｌの作用容積を有する２室セルを用いてり、Ｃ。

サイクリックポルタムメトリー実験を行った。このセル
は４　ｔｈ、ｒｎの熱分解グラファイト円板作動￥ｉｔ
　ｆＩｌｌ！のほかに、１ｃｍ”白金網対向電極と、飽
和カロメル参照電極とを有した。（ボーディロン等、Ｊ
。

Ａｍｅｒ、　Ｑｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０２　、４２８
１　、１９８０　）。

全ての電位は飽和カロメル電極（ＳＯＥ）に対するもの
とした。ＤゆＣ，サイクリックボルクムメトリーに関し
て、オックスフォードエレクトローズボテンシオスタッ
トをプライアンズＸ−Ｙ２６０００Ａ３チャート記録計
と一緒に用いた。、電位′電解的に制御した定常状態の
電流測定は、７個までの酵素電極を収納するようにした
、１００ｆｎｌの使用容積と、対向および参照電極用の
別々の室を有する、セルを用いて行った。電流一時間曲
線をブライアンズＹ−ｔＢｓ−２７１記録計で記録した
。実験中電気化学セルの湿度をチャーチルザーモツーキ
ュレータを用いて±０．５°Ｃの範囲内で制御した。

ｆ）グルコース酵素電極の構成 ユニオンカーバイド社製の１間部グラファイト箔をベー
スセンサとした。このグラファイトをｉｆ、径４　ｍｍ
の円板に切断し、ガラス俸にエポキシ樹脂で結合するこ
とにより電極を形成した。次いで、これら電極を大気中
２００°Ｃで４０時間加熱し、冷却し、１５μｌの１，
１１−ジメチルフェロセン（トルエン中０．１．Ｍ）を
電極表面上に堆積させた後風乾した。グルロースオキシ
ダーゼの酸化されたグラファイト表面への共有被着はボ
ーディロンにより記載されたものと類似の方法により達
成した。電極をシグマケミカルカンパニー製の水溶性１
−シクロヘキシル−８−（２−モルホリンエチル）カル
ボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートの１ｍｌ溶
液（０，１Ｍアセトン中０．１５　Ｍ　、　ｐＨ−４，
５）中に２０°Ｃで８０分間浸漬し、水洗し、次いでグ
ルコースオキシダーゼ（１２，５■／ｍｌ）を含有する
酢酸塩緩衝液（ｏ、１Ｍ　、　ｐＨ−５，５）の攪拌溶
液中に２０°Ｃで９０分間放請した。洗浄後、電極をポ
リカーボネート膜（ヌクレオボア、０．０３μｍ）で被
覆し、１ｍＭのグルコースを含有する緩衝液中４°Ｃで
貯蔵した。

、ｇ）酵素電極予備処理 組立て終了後で実験開始前に、電極を８　ｒｌ１Ｍグル
コース中１６０ｍＶの電解電位制御下１０時間にわたっ
て連続操作することにより電極応答を安定化した。然る
後、この電極は更に１００時間操作し続ける間一層安定
な応答が得られることを確かめた。８　ｍＭ緩衝グルコ
ース液中で、電極は上記操作期間中８％±１の平均電流
減少を示した。

グルコースオキシダーゼで変性した全ての電極にかかる
予備調整処理を施した。

全ての電極は０．１〜８５　ｍＭのグルコースの範囲内
で直線状電流応答を示し、最終的には約７０ｍＭのグル
コースで飽和された。直線状領域内で、電極は６０〜９
０秒で定常電流の９５％に達する急速応答時間を示した
。電極構造成績表の再現性は各電極に対する定常電流を
８　ｍＭグルコース中で測定することにより検討した。

各標準電極のバッチは２．８の標準偏差で７゜９μＡの
平均電流応答を得た。

、ｈ）温度の効果 酵素電極応答に対する温度の効果を１０〜５０°Ｃの範
囲内で研究し、温度上昇に伴なう定常電流の増加が約０
．２μＡ／’Ｃであることを示した。全ての電極が類似
の挙動を示した。アレニウス形挙動を仮定すると、電極
応答における極大の欠如は５０℃までの温度での固定化
酵素の熱安定性を示す。この電極（ｉｑ造は標準体温で
長期間の使用に適合する。同様の熱安定性が可溶性酵素
にもあることを確かめ、その二次速度定数の温度依存が
４９．６　ＫＪ　ＭＯｌ−１の反応活性化エネルギを伺
与する。

ｉ−）妨害物質 直接電ｔ＋　Ｑ？化、メゾイエイタとの反応または酵素
の阻止により電極応答を妨害する物質の影■（を検討し
た。代闘物を添加して標準血液濃度を得た８　ｍＭグル
コース含有溶液の分析を行った。Ｏ，Ｉ、８＼ ｍＭの最終濃度でのＬ−アスコルビン酸塩は約４１．０
％の平均電流増加を示すが、尿ｍ（ｏ、ｚｏｍ７４）の
添加により低血糖から高血糖への転移が約０．５、〜１
３０　ｍＭの血中グルコース変化を反映する場合、実際
のグルコース電極は試料希釈の必要性を排除するために
上述した範囲内で直線状に応答することが要求される。

この点に関し、フェロセン２（電極に対する固定化成績
表が直線性の高い−１−限値になるグルツース用グルコ
ースオキシダ〜ゼの見掛けのミカエリス−メンテン走数
ＫＭ、を変える唱こ重要であると思われる。電極応答が
拡散制御状）１４よりむしろ動力学的状態にある、すな
わち定常電流が溶液の静止又は攪拌と無関係にある場合
、軸を計算することができる。動力学的にｆｌ；ＩＩ御
されたものであることを確がめた標準のフェロセン基ν
Ｕ極では、ＫＭ７の値が３０〜４０　ｍＭの範囲にあっ
た。これをグルコ−スの非固定化酵素に対する８ｍＭの
ＫＭ、と比較する。

特定の妨害物質、すなわち電位的に妨害する物質を次の
第５表に示す。これがら列挙した全ての物質がグルコー
スオキシターゼの基質であるが、その反応の相対速度は
一次基質、すなわちグルコースのものより一層低い。こ
れら基質のグルコ−、ス検定に対する効果が極微である
ことを実験により確かめたが、本発明の電極センサをグ
ルコース不在下で列挙した任意の基質検定に使用し得る
ことが分る。

β−Ｄ−グルコース　１００ ２−デオキシ−Ｄ−グルコース　２５ ６−メチル−Ｄ−グルコース　２ Ｄ−マンノース　１ α−Ｄ−グルコース　０．６ Ｌ−システィンＨＧｌ　（０，０８ｍＭ　）、還元クル
タチオン（０，４９ｍＭ　）、ギ酸ナトリウム（７，３
り１ｍＭ　）、Ｄ−キシｏ−ス（８，００ｍＭ　）、α
−ガラクトース（７，７７ｍＭ）およびα−マンノース
（７，７７ｍＭ　）はグルコースに対する電極応答に関
し何等観察し得る妨害を生じなかった。

しかし、窒素飽和緩衝液から空気飽和緩衝液に変えると
、電流応答が４，０％の平均減少を生じた。□・・酸素
からの妨害は驚くべきことでないが、酵素反応により発
生した過酸化水素を再酸化するに十分にベース電極を正
に釣合せないと、電流減少が生ずる。過酸化水素を再酸
化するに十分に正の電位で電極を操作すると、Ｌ−アス
コルビン酸塩からの妨害が増大することになる。

ｊ）ｐＨの効果 糖尿病患者の血漿試料のｐＨはヘパリンの添加又は二酸
化炭素のロスにより変化するため、グルコース電極の応
答に関するｐＨの効果を臨床的に関連する範囲にわたっ
て検討した。上述した酵素電極の定常電流は実質的にｐ
Ｈと無関係である。

これは可溶性酵素の挙動に匹敵し、この場合第３表に示
す全てのフェロセン誘導体に関する二次速度定数が６〜
９のｐＨ範囲でｐＨ変化に無関係であることを確かめた
。かかるｐＨに依存しない応答という望ましい事項は多
分酸素で媒介されるグルコース酵素電極と比較してプロ
トン転移が７エロセン酸化に含まれないことによる。

例に示したような装置は現在入手し得る大部分の酵素基
センサに対し種々の利点を付与する。希釈工程前にこれ
らセンサと比較した場合、本発明の電極は同等か又は一
層早い応答時間と、嫌気条件下での操作可能性、−１９
１大きな酸素不感受性（酸素濃度が可変な血液試料にお
いて重要）、完全な生理学的範囲と比較し得る特異性を
保護する広い線状範囲と、製造の安定性並びに容易さと
を有する。

更に、本発明において指定したメゾイエイタの内に、メ
ゾイエイタが金電極に直接結合することができるフェロ
センのチオールまたは同様の硫黄誘導体が含まれる。

ヂオール基は、例えば１〜６個の炭素原子を有する低級
アルキル基によりフェロセン構造の１個の環に直接また
は間接的に結合することができる。

Ｊ、Ｏｈｅｍ、Ｓｏｃ、　６９２　（１９５８）に記載
されているようにしてつくられた簡単なチオール（フェ
ロセン）−８Ｈを使用することができる。本発明者らは
アルキルチオール ン、（フェロセン）　−　０，Ｈ８ＳＨが貴重なもので
あ、ることを確めた。他の、更に複雑なチオール糸化合
物、例えば２個の環が硫黄原子の鎖により結合している
１，２．８−）リチア−（３）−７エロ七ノフアンも可
能である（鎖硫黄原子の数の異なる物質の混合物）。

金電極は、繰返し使用するため例えばかがる化合物の溶
液に浸漬してメゾイエイタフェロセン構造を導電性金属
に結合することにより、製造することができる。

かかる物質の製造例をあげると次の通りである１、２．
３−トリチオ−（３）−フェロナノファン（　Ｊ　−Ｏ
ｒｇａｎＯｍ６ｊａｌｌｌＯ　Ｏｈｅｍ．　１　９　７
　１　、２　７　＋２４１） 文献の操作に従ったが、生成物は粗製混合物の昇華によ
り明らかにはつきりしなかった。最も明らかな（即ち最
も臭いがする）可能性を有した昇華物質を、溶離剤とし
てヘキサンを用いシリカ上でクロマトグラフィーして８
種の生成物を得た。

１、分析の結果硫黄ではない。

２、Ｃ　：　４　８．７　２、Ｈ　：　２．８　８、Ｓ
　：　８　８．０　５、Ｃ工。Ｈ８ＦｅＳ８　は　（３
　：　４，　２．９．８　、Ｈ　：　２．８　９　、Ｓ
　；：　３　４．４　２であることが必要で、収量０．
４５り８、０．１１り複雑な分子、買置スペクトルの外
に調べられず、１個の硫黄原子をもったフエロセンファ
ンではないことが示された。

フェロセンチオベンクン（フェロセニルチオブタン） １フエロセニル酪酸（　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ　
１　９　５７　。

７９、８４２０） Ｆｏ−　ＧＯ　−　ＣＨ２−　（３Ｉ（２−　０）１２
−　ＯＨ２−　ＯＨ２０００Ｈ・文献の方法によってつ
くった。

２、フェロセニル酪酸 Ｆｏ−　ＯＨ２−　ＯＨ２−　（３Ｈ２−　ＯＨ２−　
０００Ｈ（上述の如くタレメンソンの還元、亜鉛／水銀
および塩化水素酸によりつくった） ３フエロセニルブタノール Ｆｏ−　ＯＨ２−　ＯＨ，−　ＯＨ２−　（ＥＩ（２−
　ＯＨ２０Ｈ酸（２）（１２ｇ）をエーテル（ナトリウ
ム／カリウムから蒸留した）に溶解し、窒素雰囲気下で
水素化リチウムで処理した。反応が終了した場合、水素
化アルミニウムリチウムを酢酸エチル、次いで水を用い
て破壊した。有機相を分離し、水性相をエーテルで洗浄
した（２Ｘ２０ｔｎｌ）。有機相を混合し、乾燥（　Ｍ
ｇＳＯ４’）　Ｌ、濾過した後溶媒を回転蒸発器で除去
した。得られた赤色油状物は２種の成分を含有していた
。シリカ上でカラムクロマトグラフィー（　８　０　Ｃ
ｍ　Ｘ　２　Ｃｍ　）によりエーテル：ヘキサンｌ；ｌ
で溶離しアルコールとエステルを得た。

Ｆｏ−　ＯＨ２−　ＯＨ２−　ＣＨ２−　ＯＨ２　−　
０００ＣＨ８４フエロセニルチオブタン （８）（４ｏｏｍ９）をピリジン（水酸化ナトリウム上
で乾燥したもの、ｌＱｉ）に溶解し、水浴内で冷却した
。塩化トシル（１！７）を添加し、溶液を透□明になる
までかきまぜ、次いで４°Ｃで２４時間放置した。固形
ピリジンヒドロクロリドを含有する混合物を氷／水上に
注入し、トリス塩を沈殿させた。これを水ポンプで濾過
して黄色固形物を得た。この乾燥した部分は特徴あるト
リス塩の赤外スペクトルを与えた。残留物、（０，６５
り、尚湿潤しているもの）をエーテル：メタ／−ル（１
：１）に溶解し、水硫化ナトリウム水和物（Ｘ）Ｉ２０
　’）　１．６９をかきまぜ乍ら添加し、混合物を５°
Ｃに維持した。８０分後、水浴を除去し、混合物を室温
まで加温した。８時間後ｆ、１．ｃ。

（シリカ、エチルエーテル（Ｅｔ２ｏ　）　’ヘキサン
１：１）により反応が完了したことが示された。

混合物を還元して回転蒸発器上で乾燥し、次いでＥｔ２
０／ヘキサン（１：１１）の最小緻に溶解し、シリカ上
でクロマトグラフ（６０〜１２０メツシユ、２５　ｃｍ
　Ｉ２５　ｃｍ　Ｘ　２ｃｍカラム、Ｅｔ２０　／ヘキ
サン（１：１１）で溶離）した。チオールは極めて迅速
に通過し、約１５０記集められた。収率は２００　ｍ９
であった。

Ｆｏ−０Ｈ２−Ｃ１（２−０Ｈ８−０Ｈ２−０Ｈ２ＳＨ

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の１例グルコースセンサ電極の部分縦
断面図、 第２図は、本発明の他の例の形態のグルコースセンサ電
極の縦断面図、 第８図は、グルコースの１ｌａｌＦと、第２図に示す電
極により検知した電流との関係を示す線図、第４図は、
皮下注射器の針内に設けた第２図に示す電極の縦断面図
、 第５図は、本発明の更に他の例のグルコースセンサ電極
の縦断面図、 第６図は、第５図に示す電極に関する第３図と同様の線
図、 第７図は、グルコースデヒドロゲナーゼを組み込んだ電
極に関する第８図と同様の線図、第８図は、Ｄ、Ｏ，サ
イクリックポルタムメトリーに使用することのできる回
路を示す系統図、第９図は、Ｄ、Ｏ，サイクリックポル
タムメトリー用の２室セル、 第１０図は、プソイドモナス属す−モカルボキシドボラ
ンズから単離した一酸化炭素オキシドーリアクターゼの
、ＦＰＬＯにより精製した場合の緩衝液Ｂの濃度と時間
による変化を示す線図、第１１図は、カルボキシフェロ
センのポルタモグラムを示す線図である。 、１３・・・グラファイト棒１４・・・ナイロン管１５
・・・電極　１６・・・皮下注射針１８・・・側部窓　
１９・・・炭素棒 ２０・・・金属コネクタ　２１・・・ガラス管８０・・
・セル　８１・・・ルジン細管８２・・・作動電極　３
３・・・対向電極。 ＦＩＧ、１１゜ （ＧＢ）■８４０５２６２ ■１９８４年２月２９日■イギリス （ＧＢ）■８４０５２６３ ０発　明　者　エリオツド・ベルヌ・プロトキン イギリス国ベッドフォード・エ ムケイ４３ニスジー・ジョージ・ ストリート１４ 手　続　補　正　書（方式） ％式％ １事件の表示 昭和５９年特許願第　９０８３５号 ２、発明の名称 電　極　セ　ン　力 ３そ１１ｉ正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ジェ２・ティックス・インターナショナル・イ
ンコーホレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　成分の混合物の内少くとも１種の選定した成分の存
   在を検知する電極センサにおいて、導電性表面を介して
   上記混合物と１！気的に接触する、相互に絶縁された少
   くとも２つの導電性装置と、 酵素が触媒的に活性である場合に酵素と一方の上記導電
   性表面の間を、電子を搬送するメゾイエイタ化合物とを
   備え、 上記メゾイエイタが少くとも２個の有機の環ヲ有し、夫
   々がフンシュゲートされる少くとも２個の二重結合およ
   び上記環の夫々と電子共有接触する金属原子を有する有
   機金属化合物である ことを特徴とする電極センサ。 λ　上記メゾイエイタを上記導電性表面に限定する特許
   請求の範囲第１項記載のセンサ。 ＆　上記酵素を上記導電性表面に限定する特許請求の範
   囲第１項記載のセンサ。 森　上記選定した成分が上記酵素触媒反応に対する基質
   である特許請求の範囲第１項記載のセンサ。 ５　上記メゾイエイタ化合物がフェロセンタイブの化合
   物である特許請求の範囲第１］′ｃＩ記載のセンサ。 ６　上記フェロセンタイブの化合物をフェロセン、クロ
   ロフェロセン、メチル−トリメチルアミ７フエロセン、
   １．１−ジメチルフェロセン、１．１／−ジカルボキシ
   フェロセン、カルボキシフェロセン、ビニルフェロセン
   、トリメチルアミ／フェロセン、１　、１／−ジメチル
   フェロセン、ポリビニルフェロセン、フェロセンモノカ
   ルボン酸、ヒドロキシエチルフェリセン、アセトフェル
   七ンおよび１　、１／−ビスヒドロキシメチルフェロセ
   ンから成る群から選定した特許請求の範囲第５珀記載の
   センサ。 ７、　上記酵素が酸素特異フラビン蛋白質である特許請
   求の範囲第１項記載のセンサ。 ＆上記フラビン蛋白質をメタノールオキシダーゼ、ピル
   ビン酸オキシダーゼ（ＥＯｌ、２゜ａ、　Ｓ、　）、キ
   サンチンオキシダーゼ（ＥＣ３１゜２、８．２．　）、
   サコシンオキシダーゼ（ＥＣ１、５，８，１，）、リボ
   アミドデヒドロゲナーゼ（Ｅ　Ｏ１，６，８，４，）、
   グルタチオンレダクターゼ（ＥＯｌ、６゜４．２．　）
   、カルボンモノオキシオキシド−レダクターゼ、グルコ
   ースオキシダーゼ、グリコール酸オキシダーゼ（ＥＣ１
   ，１，８，１，）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ１
   ，４，８，２，）およびラクトースオキシダーゼ（Ｅｃ
   ｌ、、ｔ、ａ、ｔ、）から成る群から選定した特許請求
   の範囲第７項記載のセンサ。 ９　上記酵素がキノプロティンである特許請求の範囲第
   １項ｄ己載のセンサ。 １０、上記キノプロティンをグルコースデヒドロゲナー
   ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよびメタノールデヒ
   ド四ゲナーゼから成る群から選定した特許請求の範囲第
   ９１１記載のセンサ。 １１　上記金属原子が鉄である特許請求の範囲第１項記
   載のセンサ。 １ａ　上記金属原子がコバルトである特許請求の範囲第
   １項記載のセンサ。 １＆上記メゾイ工イタ化合物がコバル）センである特許
   請求の範囲第１項記載のセンサ。 １４　上記金属原子がクロムである特許請求の範囲第１
   項記載のセンサ。 ｌ［１，上記メゾイエイタ化合物がジベンゼンクロムで
   ある特許請求の範囲第１４項記載のセンサ。 １ａ　酵素がグルコースの反応を触媒しグルコースセン
   サが得られる特許請求の範囲第１項記載のセンサ、。 １７、酵素がグルコースオキシダーゼである特許請求の
   範囲第１６項記載のセンサ。 １＆　酵素が細菌性のグルコースデヒドロゲナーゼであ
   る特許請求の範囲第１６項記載のセンサ。 １９、グルコースデヒドロゲナーゼがアシネトノ（フタ
   −属カルコアセティクスから分離されたものである特許
   請求の範囲第１８項記載のセンサ。 ２０、　１に極が銀、炭素粒子ペーストおよび固形炭素
   から選定した材料から成る特許請求の範囲第１項記載の
   センサ。 ２１　一方の上記導電性装置が炭素と、電子搬送メゾイ
   エイタ化合物としての外表面のフェロセンタイブの化合
   物の層と、メゾイエイタ化合物の層上に設けた、グルコ
   ースオキシダーゼおよび細菌性のグルコースデヒドロゲ
   ナーゼから選定した酵素から成る電極を備えた、グルコ
   ースの存在に応答させるためグルコースを含む液体混合
   物中で使用する特許請求の範囲第１項記載のセンサ。 ｚ２　フェロセンタイブの化合物を、容易に蒸発だせ得
   るその有機溶媒を用いて表面上に被着する特許請求の範
   囲第２１項記載のセンサ。 ２＆　フェロセンタイブの化合物が重合体の形態であり
   、対応する単量体の重合により表面上に得られる特許請
   求の範囲第２１項記載のセンサ。 ２４　フェロセンタイブの化合物を、カルボ−ジイミド
   架橋結合により炭素電極に結合する特許請求の範囲第２
   ２項記載のセンサ。 ２５、酵素がＤＯＯによりメゾイエイタ上に固定される
   グルコースオキシダーゼである特許請求の範囲第２１項
   記載のセンサ。 ２＆　酵素が蒸発可能な溶液からメゾイエイタ層上に被
   着された細菌性のグルコースデヒドロゲナーゼである特
   許請求の範囲第２１項記載のセンサ。 ２７、酵素がメゾイエイタ層の表面でゼラチン層中に維
   持された細菌性のグルコースデヒドロゲナーゼである特
   許請求の範囲第２１項記載のセンサ。 ２８、水およびグルコース分子を透過しイびる最外層の
   保護膜を有する特許請求の範囲第２１項記載のセンサ。 ２９　保護膜が酢酸セルロースの溶液がら被着した酢酸
   セルロースである特許請求の範囲第２９項記載のセンサ
   。 ８０　人ｎ１１に注入するのに適する注入装置を備えた
   特許請求の範囲第１項記載のセンサ。 ８１　上記メゾイエイタ化合物が電子を上記酵素から上
   記導電性表面に搬送する特許請求の範囲第１項記載のセ
   ンサ。 ８ｚ　酵素がヘム含有酵素である特許請求の範囲第１２
   項記載のセンサ。 ８＆　ヘム含有酵素が乳酸デヒドロゲナーゼ、イースト
   シトクロムＣペルオキシラーゼおよびホースラディッシ
   ュペルオキシターゼがら成る群から選ばれる特許請求の
   範囲第８２項記載のセンサ。 ８盃　酵素がキューブロブロチインである特許請求の範
   囲第１項記載のセンサ。 ８＆　キュプロプロティンがガラクトースオキシターゼ
   である特許請求の範囲第８４項記載のセンサ。