JPS6017360A - 特異結合剤を使用する検定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は検定方法、特に生物学的に生ずるのが普通であ
って、他の類似分子との複雑な混合物であることが多い
複雑な分子または部分−分子構造（ｐａｒｔ　−ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　）　（７）検出
、測定および監視に関するものである。本発明方法は特
異結合剤、すなわち普通静電作用または疎水性作用に基
づいて所定のタイプの分子のみの１個以上の活性位置と
特異反応を行う・複雑な分子種を使用する。 本発明の一つの而は生体内または生体外で行われる免疫
検定方法、すなわち天然に存在しているかあるいは血漿
、血清、全血、尿、間質液、脳を髄液または滑液のよう
な体液中に人工的に生じさせた（またはモノクロナール
抗体として作られた大きな抗体または抗原の分子と、普
通特異的に反応する小さいリガンド分子とを反応させる
免疫検定、方法に関するものである０これらのリガンド
はそれ自体抗原性ではないが、適当なキャリヤに交差結
合させることにより抗原性にすることができ・る種であ
る。 本発明の他の面は、第］に、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列
を調査する方法、すなわち分子鎖（ｓｔｒａｎｄ）の部
分とその特定の対応する相補部分とを反応させる方法に
関するものであって、第２に、酵素と抑制因子または補
因子との反応；受容体とホルモン、ビタミン、トキシン
または成長因子との反応；複合糖質とレクチンとの反応
；核酸とタンパク質との反応；芳香族基を有するマクロ
分子と染料との反応；および金属と相互に作用するマク
四分子と金属イオンとの反応のような、特異的な非免疫
結合が生ずる他のタイプの反応に関するものである。 説明の都合上本発明の上述の二つの面をリガンドとアン
チリガンドとの間の特異的な結合反応ニついて一緒に説
明する。 さらに本発明はそのままであるいは使用するのに便利な
調整された部品キットとして上述の方法に有用である装
置および材料に関するものである。 既知の免疫検定方法は、これらの方法が抗体襞、合体の
標識リガンドを検定試料中の標識の付ｌ／Ａでない物質
で置換する競走反応に基ツＸ／）でおす、標識リガンド
の置換は検定試料中の標識の付し）でないリガンド最に
比例Ｔる点で密接に関連してし）る。 例えば、薬剤を検定する場合には、かかる方法としては
下記のものがある： ａ）放射線免疫検定法（ＲＩＡ）：この方法では検定し
ようとする薬剤または他のものを、これらに８Ｔ（、１
４（３、１８１１、７５Ｓｏ、８５３　オよび１２６エ
（７）ような放射性同位元累で標識を付け、シンチレー
ション計数器によって定量する。ＲＩＡはｌ、Ｎわゆる
不均一免疫検定法であって、その理由は抗体に結合して
いる薬剤から置換された標識薬剤を定置前しこ除去する
ために分離工程が必要であるからである。ＲＩＡは１０
〜１０−１０Ｍオーダーの感度を有する有力な方法であ
る。この方法が適用されティる薬剤としては、アスピリ
ンのような鎮痛剤、アドリアマイシンおよびゲンタマイ
シンのような抗生物質、フェニトインのような鎮痛剤、
メトトレキセートのような抗腫瘍剤等がある。 、ｂ）スピン免疫検定方法：この方法では標識は安定型
の遊離基で、その不対電子はその特性であるスピン共鳴
によって検出可能である。この場合には遊離のスピン−
標識リカンドのＥＳＲスペクトルを幅狭の高いビークツ
は結合しているスピン−標識リガンドのＥＳＲスペクト
ル（幅広の低いビークツとは異なる。従って結合してい
るリカンドと遊離リガンドとを分離する必要がなく、こ
のタイプの免疫検定方法は均一な免疫検定方法であると
いえる。この方法の感度は最高で１０−４〜１０−゛モ
ルの範囲内にある。この方法の重要な限界は計測の費用
が高いこと、計測の特殊性および要員の訓練が必要なこ
とである。この方法の一例では、モルフインにニトロキ
シトスピンラベルを付ける。 この化合物は溶液状態では８本の幅狭のＥＳＲラインを
与えるが、結合している場合には幅広の１本のピーク（
これによって上述のノイズを検出するのは困畔なことが
ある〕が観察されるっＣ）均一な酵素免疫検定方法（ま
た酵素結合免疫検出方法−ＥＬ　ＩＳＡとして知られて
いる）：こ、の方法では酵素と検定しようとする薬剤と
を酵素活性が変化しないように結合させる、酵素の大き
さは比較的大きいため、これを達成するのが困難である
ことがある。しかし、薬剤−酵素コンジュゲー）　（ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ　）を薬剤に時素的な抗体に結合させ
た場合には、構造上（形態上）の変化が起り、次いでこ
れにより酵素活性が低下するか、あるいは酵素の活性位
置が立体障害によって妨害きれる。従って試料中にフリ
ーな薬剤が存在している場合には、この薬剤は抗体と結
合し、かくして酵禦−薬剤コンジュゲートを釈放する。 従って酵素の活性は試料中に存在するフリーな薬剤の公
社に比例する。免疫検定方法は酵素活性の検定方法にな
るので、フリーな薬剤と結合している薬剤との分離は不
必要になる。さらに、この検定方法で用いられる標識は
ある程度の増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｊを与
える。この理由は、標識の付いてない薬剤の１個の分子
は］伊の酵素分子を放出させることができ、この酵素分
子は酵素基質の多くの分子が検出できるものに転化する
際に触媒作用をするから・である。これらの検定方法は
不幸にも酵素活性の比色測定を必要とすることが多い。 均一な酵素検定方法はヘロイン、メタトン、コカイン、
ＴＨＣｌＬＳＤ、Ｓ’［’ＰおよびＰＯＰのような麻薬
用、テオフィリンのような抗ぜん息薬用、リドカインの
ような抗不整脈剤ｔ　ＣａｒｄｉＯａＣｔｉＶｅ　ａｒ
ｕｇ　）用、サイロキシンのような甲状腺ホルモン用お
よびエトサクシミドのような治療制御に用いる薬剤用に
開発されてきた。 ｄ）螢光励起移動免疫検定方法：この方法は２種の標識
を使用するもので、螢光励起移動現象に基づいており、
この方法により低濃度の薬剤を使用して迅速な検出を行
うことができる。この方法の一つの変形例では、薬剤に
・はフルオレセイン１のような螢光物質で標識を付け、
抗体にはＤ−ダミン■のような受容体（消光物質）で標
識を付ける。 （薬剤）（ｓ識抗体）複合体中の消光物質と螢光物質と
の間の平均距離か双極子−双極子カツブリングおよびエ
ネルギー移動を可能にするのに充分な程度に接近してい
る場合には、複合体が形成す・ると螢光の消光が起る。 標識の付いてない薬剤をこの検定混合物に添加すると消
光程度が減少する。 不幸にもこの方法も高価な装置および高度に訓練された
要員を必要とする。 既知のＤＮＡ（ＲＮＡ）プローブ（ｐｒｏｂｅ　）技術
は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）重合体をその固有の生化学的活性
によって検出することが容易でない点で類似性を持って
いる。従って、ＤＮＡ（ＲＮＡ　）重合体にある信号を
発生する化学種または生化学種の印を付けることが必要
で、かかる方法としては下記のものがある： ａ）アビジン−ビオチン反応：この技術は卵白中ノ糖タ
ンパク質であるアビジンのビオチンに対スる親和力に基
づくものである。ビオチン（ビタミンＷ）はＤＮＡ重合
体の単鑑体サブユニットであるヌクレオチドＧこ共有結
合Ｔることができる。変性されたサブユニットはなお二
重鎖ＤＮＡの相補鎖間で古典的結合反応を行うことがで
きるので、かかるザブユニットを合成りＮＡプローブ中
に組込むことができる。相補ＤＮＡ試料に′曝した後に
、形成した短い二重鎖領域蝉有するかかるプローブの存
在を検出するには、先ず結合していないプローブをＤＮ
Ａ試料／結合プローブ複合体から分離する必要がある。 これはＤＮＡ試料が基質上に固定される条件下に結合反
応させ、次いで洗浄することによって行うのが普通であ
るが、遠心分離が同様な作用を行うことがある。結合プ
ローブは螢光マーカー標識抗体または酵素が結合してい
るアビジンを加えることによって検出される。上述の方
法における一つの問題は、オリゴヌクレオ千ドブローブ
（２０個のヌクレオチドンがビオチンの結合している位
置（ｏｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ｓｊ、ｔｅ　）を小数
しか持っていないので、結合可能なアビジン足が限定さ
れることである。７０−ブＤＮＡに数十個以下の塩基か
らなる長い「尾部」を加けることが試みられ、ある程度
の成功を収めた。この場合にはＳ識を付ける必要がある
のは尾部のみである。 この方法はｌｏ　１８　ｇのＤＮＡの分解能（ｒ６ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）まで、あるいは１個の遺伝子の約１ＯＬ
１個のコピーマチ検出可能である。当初アビジンにおけ
るマ・−カーは西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（寿命の
可成り短い酵素）であったが、この方法は今日ではアル
カリ性ホスファターゼをＳｔｒように拡大されている。 不幸にもこの方法は、ビオチン−結合プローブＤＮＡが
製造困難であるかあるいはＳ識尾部が感度を妨害するた
めに、新しい診断体系として確立するのが一般的に困難
である。 ｂ〕放射性同位元票法：この方法は特定のＤＮＡ配列を
検出する最初の方法である。、ＤＮＡプローブ８Ｈ、１
４０または８Ｑｐを有するヌクレオチドから構成され、
ターゲット配列に対するプローブの結合はバイブリド部
分（ｈｙｂｒｉｄｉｓｅｃｔｉｏｎ　）で形成されたＤ
ＮＡデユーブレックス（ｄｕｐｌｅｘ　）のエミッショ
ン（ｅｍｉｓｓｉｏｎ　）をオートラジオグラフィーに
よって測定することにより検出される。この方法ではタ
ーゲットＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼでダイジエス
）　（ｄｉｇｅｓｔ　）し、次し）で、アカロースゲル
上のフラグメントを電気泳動により分離し、しかる後に
ニトロセルリース・フィルタで「吸取らせる（　ｂｌｏ
ｔｔｉｎｇ　）　Ｊのが普通であツテ、ニトロセルロー
ス・フィルタはターゲットＤＮＡと結合し、放射性プロ
ーブに曝されている間ターゲソ）ＤＮＡＴｉ：所定位置
に保持する。不幸にモ、特定のニトロセルリース区域の
オートラジオグラフを得るのに数週間を要することかあ
り、またこの方法で使用する試薬が崩壊を起し、潜在的
に危険である。 Ｃ）他の方法：他の方法は「制限酵素フラグメント長さ
多形現象Ｊ（ＨＥＬＰ）を使用することにより興味ある
特定のＤＮＡ配列を間接的に検出す１・・ることを含む
。この種の方法は、胎児の栄養芽層から取り出したほぼ
１００μｇという少量の胎児のＤＮＡを調べることによ
って胎児期における病気の検出に用いることができる。 化学発光ｍ識が用いられたが成功度は色々であった。 これまで開発されてきたＤＮＡプローブ技術および酵素
検出／検定技術の一つの目的は神々の「遺伝病」および
遺伝性病気の原因になる物質代部に組み込まれたエラー
を検出することであった。 この種の病気にはありふれた甲状腺腫（ヨードチ、ロシ
ンデハロゲナーゼ欠損〕、かえで糖蜜尿病（α−ケトデ
カルボキシラーゼ欠損）、キサチン尿症（キサンチンオ
キシダーゼ欠損］およびメトヘモグロビン血症（メトヘ
モグロビンレダクターゼ欠損）がある。欠損遺伝子によ
る８５０００条件の完全なリストはマンククシンク（Ｍ
ｃｋｕｓｉｃｋ）の「男におけるメンデルの遺伝（Ｍｅ
ｎｄｅｌｌａｎＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ
　）　Ｊに示されている。 しかし、上述の説明から分るように、現在使用るいは光
の作用を受け易いもの）高度に訓練された要員または（
オートラジオグラフィー、ＥＳＲ測定または低水準光検
出のための）高価な装置を若干あるいは全部必要とする
ので確実に不利であ１５る。 抗原／抗体およびＤＮＡ／相補ＤＮＡ以外の結合反応用
の既知の検定方法は、一般に上述の方法に類似しており
、同じような問題がある。 本発明は簡単な電気化学的測定技術を使用する・ことに
より上述の欠点を克服するためのもので、欧州特許出願
第８２８０５５９７号に記載されている発明に関連して
いる。 本発明の目的は上述の欠点を有していない特異結合剤を
検出、測定または監視する方法を促供することにある。 本発明の他の目的はかかる本発明方法を実施するのに使
用する装置および試薬を提供することにある。 上述のすべてに関する従来の出願は、メディエータ化合
物を使用して電極に電荷を移１１１Ｊ　’ｇせて、酵素
の特異基質における酵素の触媒反応の進行を適当な電極
によって直接測定することに関するものである。 本発明は、他の点は同一であるが、（ａ）メディエータ
の有効レベルが変化する場合、（ｂ）酵素の有効レベル
が変化する場合、（Ｃ）両者が変化する場合、（Ｃ１）
　ｔ！極の有効表面が変化する場合に測定可能な差異が
達成されることを見い出したことに基づいており、さら
にリガンドとアンチリガンドとの間の特異結合反応によ
って、測定可能な作用をリガンド／アンチリガンド結合
の生起またはその程度に関連させることができるように
、前記変化を引き起すことができることを見い出したこ
とに基づいている。 従って、本発明は、その−面において、（ａ）リガンド
およびアンチリガンドを含む反応性種の間の少くとも１
個の特異結合反応段＠を、酵素が触媒的に活性であるレ
ベルの基質に電気化学的に結合している酵素／メディエ
ータ系と関連させて、前記結合反応が前記酵素／メディ
エータ系の少くとも１個の成分の電気化学的アベイラビ
リティ（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｖａｉｌ
ａｂｉｌｉｔｙ　）に影響を与えるように行い、次いで
（Ｅｌ前記電気化学的アベイラビリティに及ぼ丁作用を
検出または測定シテ信号を得、この信号から前記反応性
種の存在または分散をめることを特徴とする検定方法で
ある。 本発明方法はリガンドおよびアンチリガンド、例えば抗
原／抗体またはＤＮＡターゲット配列／ＤＮＡプローブ
配列；基質；基質に特異的な酵素、およびメディエータ
化合物の使用を含む。本発明方法において特異結合反応
は溶液全体中で行うことができ、すなわち均一反応であ
ることができ、あるいは１固体表面で行うことができ、
例えば不均一反応であることができる。かかる方法で使
用される固体表面は収容する容器の壁または電極表面と
することができ、またかかる電極自体は簡単な炭素電極
とすることができ、あるいは金または他の責金属の電極
とすることができ、あるいは種々の成分、特にメディエ
ータ、抗体またはアンチリガンドおよび基質さらに場合
によっては基質のうちの１種または２種以上のコーティ
ングを行った多少偵雑なものとすることができるので、
上述の本発明を実施する方法には多くの別法がある。こ
れらの方法並びにその有用性および利点を以下に例につ
いて詳述する。 本発明では、そのすべての面において、方法および物質
のある特徴、特に一方では酵素／基質の性質、他方では
メディエータの性質を利用Ｔることができる。 酵素／基質対は単に特異結合反応の存在または程度を示
すインディケータとして存在している。 従って、理論上酵素／基質対は反応雰囲気に無関係であ
る対、すなわちその電気化学的またはその他の作用が全
試験混合物中に天然に存在している成分の前部作用と混
同されることがない対とすることができる。勿論、選定
される方法が酵素レベルすなわち酵素の電気化学的アベ
イラビリティを低下することに全面的または部分的に依
存している場合には、選定される酵素は特異結合反応が
上述のアイラビリテイに影響を及ぼすようなものとする
必要がある。 メディエータ化合物と関連した電気化学的特性が研究さ
れている酵素／基質対は次のものである：ピルビン酸オ
キシダーゼ　ピルベート Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ　Ｌ−アミノ酸アルデヒドオ
キシダーゼ　アルデヒド類キサン千ンオギシダーゼ　キ
サンチン類グルコースオキシダーゼ　グルコース グリコース酸オキシダーゼ　グリコレートサルコシンオ
キシダーゼ　サルコシン ラクテートオキシダーゼ　ラクテート グルタチオンレダクターゼ　ＮＡ　Ｄ　（Ｐ）　Ｈリボ
アミドデヒドロゲナーゼ　ＮＡ　ＤＨＰＱＱ＃累 グルコースデヒドロゲナーゼ　グルコースメタノールデ
ヒドロゲナーゼ　メタノールおよび他のアルカノールメ
チルアミンデヒドロゲナーゼ　メチルアミンヘム含有酵
素 ラクテートデヒドロゲナーゼ　ラクテート（イーストシ
トクロムｂ２） ホースラディツシュペルオキシダーゼ　過酸化水素イー
ストシトクロムＣ過酸化水素 これらのもののうち、特性が極めて詳細に明らかになっ
ていて、良好で好ましくは線形の応考を予想される測定
範囲にわたって与える酵素／基質対を使用するのが明ら
かに有利である。グルコース酵素はクルコースの生体内
感知（例えば糖尿病叡者の場合）に関する試験のために
注意して研究されている。Ｎ　ＡＤＰ　Ｈ−非依存性グ
ルコースデヒドロゲナーゼ、例えば、アシネトバクチル
、カルコア七−Ｆ−り７．　（ａｃｉ、ｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ　ｃａｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ　）から得られる
もののような酵素がこの目的に有用であり、本発明にお
いて使用できることが分った。 グルコースオキシダーゼは周知の反応を行い、本発明に
おける特異結合反応の生起または程度に対する有用なマ
ーカーを形成する。またこの酵素は貯藏の際に安定であ
り、工業的に使用することができ、かつ安価である。グ
ルコースオキシダーゼがある程度好ましい場合があるが
、上述のリストに示した他の酵素も本発明のある変形例
で有利に使用できる。特に、グルコースオキシダーゼの
反応速度が有用であることがある。 上述の特許出願明細書において使用できることが示され
ているメディエータはポリピロゲン、り四うニル、プロ
マニル等を含んでいるが、普通「メタロセン」として知
られている化合物、特に少くとも２個の有機環と１個の
金属原子とからなり、かつ前記有機環は電荷共役系であ
り、前記金属原子は前記環のそれぞれと原子共有接触し
ている化合物である。 フェロセン類（ビス−シクロペンタジェニル鉄およびそ
の誘導体）は上述の最後に挙げた群に属し、電荷移動を
目的とする酸素／基質反応と併用される他のメディエー
タよりも優れている。 フェロセン（ビス７５シクロペンタジェニル鉄：Ｆ８Ｃ
ｐ、　）およびその誘導体の独特な構造および性質は多
くの理論的および実験的研究を生んだ。フェロセンは最
初１９５１年に合成され、今日では良く知られているメ
タロセン化合物の最初の試料である。 フェロセン類は水溶液中での溶解性が小さくまた吸光係
数が小さいので分光光度検定法において限られた価値を
有することが知られていたが、フェロセン類は生物電気
化学系に’ｋｍ−Ｊ￥１適合していることが分った、フ
ェロセン類は：　（ａ）　ａｌｌ能化し得るシクロペン
タジェニル環の置換により変化し得る広範８な酸化還元
電位；（ｂ）電気化学的に可逆、性である→−電子レド
ックス特性；および（Ｑｌ　１）Ｈに無関係な酸化還元
電位および還元・された状態のものの緩徐な自動酸化特
性を有する。 かかる一般的な種類の７エロセン類、すなわち一方また
は両方の環において置換されている単量体および重合体
の誘導体としては、下記のような個々の７エロセン類が
有利であることが分った＝１．１Ｌジメチルフエロセン
　＋００　Ｉ、Ｄ　−フェロセン酢酸　１２４　８　８
７０ ヒ）−ロキシエチルフエロセン　１６１　Ｓ　−フェロ
セン　１６５　１．Ｄ　８８５ フエロセンモノカルボン酸　２７５　Ｓ　４２０フェロ
セン１．１′−ジカルボンｅｌ　８８５　Ｓ　−クロロ
フェロセン　８４５　１．Ｄ　−メチルトリメチルアミ
ノフェルセン　４００　８　−（上表中、Ｓは水溶性で
あること、１．Ｄはそれぞれ水に不溶性で８％洗剤（Ｔ
ｗｅｅｎ　−２ｇ　）溶液２０に可溶性であることを示
し　ＥＯは標準カロメル亀１極（以下ＳＯＥと略記する
）に対するｍｖで示す値であり、Ｅは礪　Ｍ−で示す測
定値である。）上表に示す種々の７エロセン類のｐＨ＝
　７における燐＠壌緩衝液中でのＳＯＥに対するＥ　値
は１００〜４００　ｍＶの電位範囲内にある。このＥ０
値の傾向は置換作用に基づいて予想されるものと一致す
る。一般に、電子供与基は正の電荷を安定化し、従って
電子求引基より酸化を促進する。 以下に詳述するように、ある特定例ではリガンドまたは
酵素のいずれかとメディエータとの間の化学的結合が存
在することがある。これは、フェロセンまたは他のメデ
ィエータをリガンドに化学的に結合させることができる
ことが予想ざｎる場合Ｇこ、治療薬を監視するのに特に
有用である。例１えは、次の薬都： フエノバルビタール フェニトイン プロ力インアミド テオフィリン 、がメディエータと結合して、薬剤濃度が好適な治療範
囲内にあるか否かを測定することができる検定系を形成
することができる場合が考えられる。 上述のもの以外の薬剤も使用できる０、フェロセン変性
電極はいくつかの異なる方法で製造することができる。 最も簡単な方法は疎水性ｔＦ［Ｋ、例エバ、フェロセン
、ビニルフェロセンおよび１．１′−ジメチルフェロセ
ンを、有機溶媒溶液から蒸発させることにより白金また
は黒鉛の表面上に被着させることである。あるいはまた
、置換誘導体は炭素または白金上の水酸基に、次式で示
すように、共有結合させることができる：かかる特定の
変形例の場合は、以下に詳述するように、１個または２
個以上のチオール基を組入れて、これによりフェロセン
が全電極に直接結合できるよう

【こすることである。 また電極表面は次式で示すように、置換フェロ１センが
共有結合している機能化重合体、例えは、ポリチラミン
で被覆することができる：あるいは、ビニルフェロセン
を重合させてホ゛す（ビニルフェロセン）　：　（ＯＨ
２−ＯＨＯ６Ｈ，Ｆｅｃｐ）ｎを得、これを溶媒蒸発ま
たは電着のいずれかによって車１１・極に被着させるこ
とができる。 フェロセン−カルボン酸は本発明に広く使用するのに最
適な実際的な性質を併せ有していて、後述のように、カ
ルボキシル基を介してリガンド、アンチリガンドおよび
／または酵素に化学的に結１′′合する機会を与えるこ
とが分った。 本発明の範囲内のいくつかの方法は実際的な検定方法と
して特に有用であることが明らかになった。これらの方
法としては次のものがある：■、　混合物中の所望のリ
ガンド、例えは、抗原ま２“。 たは抗体の分層を検出または測定するための均・−免疫
検定方法。 ■、酵素に化学的に結合することができ、またリガンド
に対して特異結合反応することができる被検体（ａｎａ
ｌ：ｙｔｅ　）の分量を検出または測定す・るための均
一免疫定量方法。 Ｉｎ、相補配列に対する特異結合が混合物中の１種また
は２種以上の種の電気化学的ア宮うビリテ慣こ影響を及
ぼす均一核酸プローブ技術。 ■、既知のＥＬＩＳＡ方法と関連しているがこれ・・よ
り優れている不均一免疫検定方法。 ■１電極への電荷の移動に影響を及ぼ丁ように、適当な
電極の表面が特異結合反応によって被覆または変性され
ている免疫検定方法。 上述の方法のそれぞれについて以下に説明する。 ■、リガンドに対する均−免疫検定方法一つの観点にお
いて、この方法は： ａ）−緒に特異的に結合することのできるリガンド−ア
ンチリガンド対と、 ｂ）メディエータ、酵素および対応する基質のドーリプ
レットとからなっていて、前記基質が酵素によって生成
物に転化する際に電荷が発生し、この電荷がメゾエータ
を経て電極に移動し、この際、前記対の内の１種の少く
ともある部分と、前記トリブレンドの内の１種の少くと
もある部分とが化学的に交さ結合して、前記リガンドお
よびアンチリガンドの対が一緒に結合した場合に、上述
の電荷移動の少くとも一部が阻止されるようにした検定
系である。 この形態の第１の例では、本発明は、測定子べきリガン
ド種の未知量と、前記リガンド種に対するアンチリガン
ド種であって、それ自体が前記メディエータ化合物と化
学的に結合しており、その結合状態においてのみ酵素／
基質反応からの電荷移動に利用できる前記アンチリガン
ド押の過剰であることが分っている既知量とを特異結合
反応させて、これによって生ずる過剰量の未結合メディ
エータ／アンチツガ２１種の電気化学的活性によって前
記リガンド種の分量を測定する上述の方法である。 この形態の第２の例では、本発明は、測定すべきリガン
ド種の未知量と、前記リガンド種に対するアンチリガン
ド種であって、それ自体が前記酵素と化学的に結合して
おり、その結合状態においてのみ酵素／基質反応に利用
できる前記アンチリガンド種の過剰であることが分って
いる既知量とを特異結合反応させて、これによって生ず
る未納合酵素／アンチリガンド種からの電荷移動の際の
メゾエータの電気化学的活性によって前記リガンド種の
分量を測定する上述の方法である。 ここに「リガンド種」という用語を使用したのは、（ａ
）当初の抗原または抗体、すなわちヒトまたは動物であ
る被検体において天然に存在しているか人工的に生成さ
れていて、検定用または完全に精製されている形態また
は部分精製されている形態の血清、全血、尿、間質液、
脳を髄液または滑液としであるいはモノクロナール°抗
体として存在している抗原または抗体、および（ｂｌ抗
原／抗体、例えば、過剰であることが分っている既知量
のそれ自身のアンチリガンドによって生成するような、
抗原／抗体からの部分反応形態のものまたは相補１誘導
体物質の形態のものを包合させるためである。 従って、例えば、この形能の本発明は、（ａ）（１）検
定すべきリガンドを含有する試料と、過剰であることが
分っている既知量のアンチリカ（１１）生成した混合物
と、メディエータ化合物と化学的に結合しているリガン
ドの過剰であることが分っている既知量とを混合して、
前記フ１０リーなリガンド結合性位置の丁べてを占有さ
せ、若干のリガンド結合メディエータを電気化学的に利
用できる状態のままとし； （１）ｌ酵素とこれに対する基質とを液体混合物中で混
合し； （Ｃ）前記酵素／基質混合物と工程（ａ）からのロリ記
混合物とを接触させ、次いで （ｄｌ生成した混合物とセンサ電極とを接触させ、かく
して前記センサ電極に移動する電荷が利用可能な未結合
のりガント結合メディエータＢ（によって変動し、従っ
て最初のリガンドｌの偏差が許容される ことを特徴とする均−酵素免疫検定方法である。 特徴である工程（１１および（１１）は逐次行うのは勿
論であるが、他の工程の順序は若干変えることができる
。特に、酵素、基質および電極は組合せることができ、
工程（ａ）の添加生成した混合物すなわち工程（ａＪの
混合物は予め存在する酵素基質混合物の液体系等のなか
で生成させることができる。 他の段階的方法も、これによって未知量をメディエータ
結合物質に結合できる最後の測定用形態にすることがで
きる場合には、考えることができる。また、当業者は、
リガンド／アンチリガンドがいくつかの結合用の位置を
持〃）る場合、結合の分布および／または異なる種の平
衡結合がある程度予測できる場合には、数学的誘導が簡
単な引算であるとは必ずしも予想されない。これらの特
徴は測定し、説明Ｔることができる。本発明のこの面に
おいて、有用な酵素−基質系はグルコース／グルコース
オキシダーゼである。 、ＬＩＪガント被検体に対する均一酵素免疫検定方法こ
の形態の第１の例では、本発明は、上述の方法において
、 （，１）　（ａｌ未知量の検定すべきリガンド種Ｘと（
ｂｌある分量の種Ｘ−Ｅ（ただし、Ｘは酵素活性を破懐
することなく酵素Ｅと化学的に結合している）とを溶液
中で混合し、 （１１）この混合物をセンサ電極の存在下に前記酵素に
対する基質Ｓおよびメディエータ化合物Ｍと接触させて
、酵素的に触媒作用が行われる反応に依存して測定電荷
を前記センサ電極に移動し、（ｌｉＤアンチリガンドＡ
を前記溶液と接触させて次の反応式■およびｎ： で表わされる競、走平衝結合反応を生起させて、前記酵
素的に活性な種Ｘ−Ｅの部分を酵素的に不活性な種Ａ−
Ｘ−Ｅに転化させ、これにより反応程度および電極にお
ける測定電荷を変え、次いでＧＶ）　［荷の減少または
減少速度から被検体Ｘの濃、度を測定値恕することを特
徴とする上述の方法である。 上述の方法の変形例どして、工程（１１］でメディエー
タＭをリガンド被検体Ｘに化学的に結合きせることかで
き、かつメディエータダＭを酵素Ｅおよび基質Ｓと接触
させて、工程（Ｉｌｌ）における直接的に類似している
競走反応、すなわち全体にわたってＥをＭで置換する反
応を生起させることができる。 例えば、被検体Ｘのレベルを測定するための「ドライス
トリップ」試験が開発される場合には、好ましい程度は
小さいが、複合体Ａ’−Ｘ＝Ｅ（またはＡ−Ｘ＝Ｍ　）
から出発し、次の反応式：％式％ で表わされる緩徐な置換反応のみによって操作すること
ができる。 本発明は、その一つの形態において、 （ａ）　Ｗ検体Ｘと酵素Ｅとを共有結合させて酸素的に
活性な種Ｘ−Ｅを生成し； 佃）　この酵素的活性種Ｘ−Ｅと適当な反応性リガンド
Ａとを反応させて特異結合位置が完全に占有されている
酵素的に不活性な種Ａ−Ｘ−Ｅを生成し； （０）　この酵素的不活性種Ａ−Ｘ−Ｅを検定すべき種
Ｘと接触させて種Ｘとの競走特異結合反応を生起させ、
次式； ％式％ で表わぎれる平衝を達成させて、前記種Ｘ−Ｅの全量か
ら前゛記検定すべきＭＸの分量を測定できるようにし；
次いで ＋（１）　この混合物をＸ−Ｅに対する基質と接触させ
、この結果生ずる酵素的に触媒作用が行われる反応から
センサ電極にメディエータ化合物によって電荷を移動さ
せて存在する酵素的活性種Ｘ−Ｅの全量を測定し、この
洞窟結果から種Ｘの分、　量をめる ことを特徴とする種Ｘに対する免疫検定方法である。 酵素と被検体とを酵素の活性位置に接近させて結合させ
て（Ｘ−Ｅ）、リガンドＡが効果的に前記活性位置を封
鎖するか前記活性位置において形態上の変化を生ずるよ
うにするのが好ましいことが分る。あるいはまた、リガ
ンド被検体Ｘを酵素の補欠分子族に結合させることがで
きる。 この場合にも、使用する工程の正確な順序およ！び追加
工程の存在は当業者によって変更することができる。ま
た、電極自体に配ＨされているＡ−Ｘ−Ｅ複合体を使用
して操作し、かくして被検体Ｘと接触させることにより
若干のリガンドが電極から離れ、電極表面において基質
および種Ｘ−Ｅの存在下に酵素活性が生ずるようにする
ことができることがある。 本発明のこの一般的な形態では、酵素的活性種の分量が
測定される。これは酵素とメディエータとが化学的に結
合している前述しかつ後で詳述する追加の任意の特徴に
とって有用である。 この形態では、本発明はメディエータおよび酵素の少く
とも一方を核酸プローブ配列に化学的に結合させて、調
査すべき一重鎖核酸物質中のターゲット配列に対する前
記核酸プロ−１配列の特異結合が、酵素基質の存在下に
センサ電極によって検出されるように前記化学的に結合
している種の電気化学的アベイラビリティに影響を及ぼ
し、このようにして前記ターゲット配列の存在を検出可
能にする上述の方法である。 核酸配列はＲＮＡ例えばメツセンジャーＲＮＡとするこ
とができるが、普通ＤＮＡである。 表現を変えれば、この形態の本発明は：（ａ）　調査す
べき一重鎖核酸物質を所定のターゲット配列に対して供
給し； （ｂ）　前記ターゲット配列に相補的な核酸配列を有す
るプローブ物質を選定し； （ｃ）　次の８種の処理； 中　前記プ四−プと酵素とを結合させ、この酵素結合プ
ローブを、前記酵素に対する基質お、よびメディエータ
の両者を含有する溶液に添加する処理、 （＋ｌ）　前記プローブとメディエータとを化学的に結
合させ、このメディエータ結合プローブを、基質および
前記基質に対する酵素の両者を含有する溶液に添加する
処理、および １１ｉｉ）　前記プロー１をメディエータ／酵素の組合
せと化学的に結合させ、このようにして変性したプロー
ブを、前記酵素に対する基質を含有する溶液に添加する
処理、からなる群から選定した１種の処理を選択して行
ない；（ｄ）　前記化学的に結合したプロ−１配列を含
有する溶液をセンサ電極と接触させて、前記酵素が触媒
作用を行うＮ％基質反応から前記電極に前記メディエー
タによって電荷を移動させ、次いで （ｅ）　前記溶液を前記−重鎖物質と接触させて、酵素
、メディエータまたはこれらの組合せのアベイラビリテ
ィに影響を及ぼす前記プローブと前記ターゲットとの特
異結合反応を電荷移動いの変化によって表示することを
特徴とＴる核酸物質中のターゲット配列の検出方法であ
る。 プローブ物質は天然に存在するＤＮＡフラグメントまた
は合成した物質とすることができる。 工程順序の変更は容易に行うことができる。 またセンサ電極自体がメディエータまたは酵素を含むこ
とができるが、普通プローブ配列およびターゲット配列
が共に溶液中に存在しているのが好ましい。 メディエータはリンカ−グループＧこよってプローブ配
列に間接的に結合させることができ、リンカ−グループ
に反応性である物質を電極上に存在させることができる
。この場合には全複合体が電極上に存在しており、ター
ゲット配列が存在し、プローブ配列と結合している場合
には、電流に変化が生じる。 ＩＶ、ＥＬＩＳＡ方法から誘導した不均一酵素免疫検定
方法 この形態では、本発明は、検定すべきリガンドを適当な
表面上に固定し、次いで酵素に化学的に結合している適
当なアンチリガンドの過剰量と特異結合反応させ、しか
る後にこの過剰量を除去し、前記固定化酵素に対する基
質を添加し、次いでメディエータおよびセンサ電極と接
触させて、前記？ｊｌ極に移動する電荷が存在する酵素
量に比例するようにすることを特徴とする上述の方法で
ある。 好適例では、本発明は： （ａ）　検定すべきリガンドを適当な表面において、例
えば、前記表面に予め結合しているアンチリガンド種に
前記リガンドを結合させることにより固定し、 （ｂ）　前記リガンドを、酵素と化学的に結合している
アンチリガンドからなる酵素活性種の過剰量と接触させ
て固定化リガンドとの特異結合反応を行わせ、前記検定
すべきリガンドの分量に相当する分量の固定化酵素的活
性種を生成し；Ｕ　過剰の非固定化化学的結合酵素／ア
ンチリガンドを除去し、次いで （ｄ）　前記固定化酵素をこの酵素に対する基質および
電荷移動性メディエータと接触させて、前記メディエー
タと接触している１！極が前記固定化酵素の分量に相当
する電荷を信号として出し、これから検定すべきリガン
ドの最初の分量をめることを特徴とする不均一酵素結合
検出方法）である。 上述の諸工程はその順序を変えることができ、メディエ
ータを溶液中または電極上に存在させることができる。 ■、電極表面における酵素免疫検定方法この形態におい
て、本発明は、特異結合反応をセンサ電極の表面で行わ
せて少くとも部分的に前記表面を封鎖するかあるいは前
記表面の特性を変えて、前記特異結合反応の存在または
程度を検出電荷における減少の存在または減少量によっ
て測定することを特徴とする上述の方法である。 −好適例では、本発明は： （〜　検定すべきリガンドを含有する液体媒質を選定し
； ■）　前記液体媒質に、酵素と酵素が触媒作用をする反
応を行うことができる既知量の基質を添加しくＣ）　前
記液体媒質を、（１）前記検定すべきリガンドと特異結
合反応することができるアンチリガンドと、（ＩＩ　）
前記酵素と、＜　＋＋＋　＞メディエータ化合物との組
合せを表面に有するセンサ電極と接触だせ、このように
して前記酵素が触媒的に活性である場合に前記酵素から
前記電極に電荷を移動させて信号を出し、次いで （ｄ）　前記信号と前記リガンドの存在しない場合に受
けた信号とを比較し、存在する前記リガンドの分量を、
前記特異結合反応によって生ずる前記電極表面における
封鎖状態または形態上の変化の関数としてめることを特
徴とする免疫検定方法である。 リガンドはアンチリガンドと免疫学的に反応性であって
、先に例示したような生化学的または医学的な試験にお
いて生ずる抗原であってもよい。 その一般的性質は、大きなタンパク質様分子のように、
リガンドが電極表面上のアンチリガンドと反応した際に
電極表面の部分を封鎖する作用を有していることである
。このため電流の低下が起り１１これを観察Ｔるかその
程度をめることによってリガンドの存在を示ずかそのレ
ベルを測定することができる。比較的小ざな分子、１−
なわちハブソテン、例えばニトログリセリンと、ウシ拍
Ｉン「７アルプミンのような比較的大きい分子とを結合
させ、この組合せを動物被検体に注射し、ニトログリセ
リンに感じ易いアンチリガンドを生成し、次いでこのア
ンチリガンドを電極に結合させることもできる。かかる
場合には、小ぎい結合ニトログリセリン分子はおそら〈
電極表面を封鎖しなかが、（特に抗体および／またはニ
トログリセリンの濃度が比較的高い場合には）アンチリ
ガンドに形態上の変化を生じさせ、従って信号を変化す
る。 基質物質は理論的には上述の基質のいずれでもよい。こ
の理由はかかる電極を使用する場合には基礎１となる酵
素／基質反応が広い適応性を持っているからである。し
かし、簡単で、入手が容易で、実証済みの基質を使用す
るのが好都合であり、このためへ樽グルコースを使用す
るのが好ましい。 、　電極上に存在している酵素は同様にいずれの酵素で
もよいが、特に先に示した７ラビンタンパク質およびキ
ノンタンパク質が好ましい。しかし、好ましい基質はグ
ルコースであるから、好ましい酵素はグルコースオキシ
ダーゼまたはグルコースヒドロゲナーゼ、例えばアシネ
トバクチルカルコアセチフスから得られるようなもので
ある０後者は前者よりターンオーバー数が１００倍大き
いので好ましい。 上述の説明では本発明を酵素／メディエータ結合化合物
の若干のものを使用した場合について説明した。 曹通、本発明を実施するかかる形態では、１個より多数
の険ンドイツチ型」ユニット例えばフェロセンを酵素中
に、分子の変形および酵素活性の損失が観察される濃度
まで存在だせる。例えば、グルコースオキシダーゼと約
８〜１２個の７エロセンとのユニットは酵素的になお活
性であって、既知方法、例えば、カルボジイミド結合を
使用することにより炭素電極に結合させることかできる
。 ・変性された酵素は酵素的に活性であるだけでなく、電
気化学的にも活性である。 上述の説明は検定方法に関してであるが、変性された電
極およびかかる電極を含む部品を適当に配置してなるキ
ットも本発明の部分を構成することは当業者にとって明
らかである。特に、本発明における必要な成分をすべて
含んでいて、ただ試験液中に浸漬すればよいように形成
したストリップテスト電極を使用することができる。 以下、本発明を実施例および図面に基づき説明する。 例１ グルコースオキシダーゼおよび７エロセンを用いる検定 第１図において、検定すべき抗原（１）を含む患者の匍
清を緩衝液中既知の濃度の抗体（２）溶液と混合する。 この抗原は例えば薬剤である。血清中の抗原（１）は特
定の抗原結合位置（８）Ｏこて溶媒和した抗体に結合し
、抗原／抗体伽÷４ル複合体（４）を生成する。抗体上
の可能な抗原結合位置は全部が占有されてはおらず、多
数のフリーな結合位Ｗ（５）が残っている。フリーな位
置の数は血清中の抗原（１）数の函数である。 メディエータ結合抗原（６）を過剰に第１工程“から得
られる混、金物に添加する。この実施例では、メディエ
ータ（７）は抗原（８）に化学的に結合した７工ロ七ン
誘導体であるが、他のメタロセンを置換することができ
る。フェロセン結合抗原は抗原／抗体結合反応によって
抗体（２）の７リー・な位置（５）を占める。しかし、
７工ロ七ン結合抗原（６）はフリーな位置σ）数よりも
過剰にあり、従って７工ロセン結合抗原（９）の若干は
溶液中に残存Ｔる。 グルコースおよびグルコースオキシダーゼ（Ｇ′ＯＤと
いう）を、得られた混合物に過剰に加え、グルコース上
のＣＯＤの酸化還元作用によって生じる電流を電極（Ｅ
）を用いて測定する。抗体（２）に結合していない７工
ロセン結合抗原（９ンコンプレツクスのみが、電極（Ｋ
）に１１Ｌ気化学的“にＧＯＤをカップリングすること
ができる。抗体に結合するフェロセン結合抗原複合体−
φ巻必は、著しく大きい抗体（２）からの立体障害のた
めに電極にＣＯＤをカップリングさせない。 酵素（ＣＯＤ）およびその基質の添加後に存在゛するメ
ディエータの電気化学的効果を測定することによって、
どの位のメディエータ（６）の既知量が、抗体（２）に
結合しているかを計算し、どの位のフリーの抗原（１）
が元の試料に存在しなければならなかったかを決定する
ことができる。 電極（Ｅ）は金、炭素、白金または任意適当な。 材料から製造できる。 ＣＯＤおよびグルコースの添加は、特定の選ばれたメデ
ィエータが酵素／基質反応を電極にカップリングするこ
とができるように用意する任意の・。 他の酵素／基質ベアを添加することによって置換するこ
とができる。酵素も基質も（共に過剰に存在する）、す
なわちこの実施例ではＣＯＤもグルコースも、因子を制
限しない。制限因子は、フリーの位置が占有された場合
、フリーに拡散するメＩＯディエータの量である。 例２ この検定を示す図が第２図である。検定全部を室温（ｌ
ｓ−２５°Ｃ）にて過剰の基質（１０ｏｍＭ’）を用い
てＰ　Ｈ７，５の５０　ｍＭ　）リス／ＨＯｌ緩衝液中
で行った。特定でない結合には補正をしなかった。溶液
はすべて脱気し、フェロセンモノカルボン酸をメディエ
ータとして用いた。電極にはＨ２０中０．３アルミナの
スラリーを用いてランとランとの間に研摩した熱分解グ
ラファイトを用いた。成分は固定せず、 中　熱分解グラファイト電極、 （１１）　白金　対　ｉ極、 ｆｌｕｌｌ　カロメル参照電極 から成る８個の１！ｌｓセルを用いた。 全試料容量は１−であった。 グルコースオキシダーゼ標識Ｔ４チロキシンおよびＴ、
チロキシンへの抗体をコーニング・グラス・インコーホ
レーテッドによって調達した（メトフィールド、マス、
Ｕ、Ｓ、Ａ　）。 トリス／　ＨＯｌ　１）Ｉ（７，５緩衝液から吸る試料
溶液に７エ四センモノカルボン酸ヲ添加シタ。１．６６
μＡの電流を示した。１００　ｍＭグルコースを過剰に
加えると、この電流は１．４６８μＡまで落ちた。 ５０μｌのＧＯＤ橡ｍＴ４を添加すると、有効なグルコ
ースによってグルコースオキシダーゼの触媒活性のため
、電流が２．１０μＡまで上昇した。グルコースオキシ
ダーゼから除いた電子はメゾイエ、−夕を介して電極に
移った。 ＣＯＤ標識Ｔ４に抗体を添加するとこの電流は１．５９
μＡに減少した。 これらの結果から、抗体の添加はＧＯＤ標識Ｔ４の活性
を阻害し、分析の定置および／または定量。 測定を与えるために用いられる１Ｒｉｔ流における探知
でき測定できる変化を生じぎせる。これを第　（２図に
示すが、抗体の結合位置に対し酵素結合分析とフリーな
分析との間の競合反応を示す。 ＣＯＤ標識Ｔ４が抗体に結合しない場合にのみ酵素はグ
ルコースを酸化することができる。得られた電子をメデ
ィエータ化合物によって電極に対し動かし、メディエー
タを電極表面で再生する。 例８ （１）第３ａ図において、グルコースオキシダーゼ（Ｇ
ＯＤ　）はグルコースをグルコン酸に転化ｆる触媒作用
を示し、酸化状態から還元状態に７エロセンメデイエー
タＦを還元する電子を放出する。還元したフェロジニウ
ムを電極で酸化し４通過電流を測定するとグルコースの
存在員に比例する。 任意適当な方法によって、天然産ＤＮＡ配列から誘導す
るかまたは合成したＤＮＡフラグメントＤをＧＯＤに結
合する。 （Ｉｔ）過剰のグルコースの存在で定常状態の電流が得
られる。ＤＮＡ７ラグメン）Ｄの配列に補足する特定の
ターゲット配列に対し検定されるＤＮＡ試料は任意適当
な方法によって一重鎖に転化し、次いで反応混合物に添
加される。ＤＮＡフラグメン）Ｄに補足するターゲット
配列が混合し、グルコースと酵素の酵素反応を阻害する
。 従って、グルコース酸へのグルコースＳの生産量が減り
、フェロセンのカップリング反応が減少する。７エロセ
ンの減少速度の変化は電極での電流の減少に反映される
。電流の変化は、ターゲットＤＮＡに結合するＤＮＡフ
ラグメントＤの量に比例し、従って存在するターゲット
ＤＮＡの量に比例する。 、　例３ｂ　ＤＮＡプローグに結合したメディエータ　
１（Ｉ）例８ｂでは、酸化還元活性１Ｍ換７エロセンＦ
を直接、プローグとして用いられる切断されたＤＮＡに
結合させる。メディエータ結合ＤＮＡプローブの生成は
メディエータＦの′は流滴短応答、または検定されるＤ
ＮＡ中に含まれた相補ターゲット配列とのメディエータ
ＤＮＡプローブの結合相互作用を妨げない。 （旧メディエータＤＮＡプローブを検定混合物に添加し
て生ずる電流滴定応答を測定する。プ０１・・−ブを補
足する一重鎖遺伝物質が存在する場合、プローブは試料
ＤＮＡにおけるプローブは試料Ｄ’　Ｎ　Ａにおける相
補配列に結合する。これは電流滴定応答を著しく減らす
かまたは完全に阻害する。すなわち、メディエータＤＮ
ＡブローブトトターケットＤＮＡのコンプレックスは電
流滴定に活性ではない。初期の電流滴定応答の減少は、
生成したメディエータＤＮＡプローブ／ターケラ）ＤＮ
Ａ複合体伝挙李５の量に比例し、従ってメディエータＤ
ＮＡプローブの既知の配列に対し相補配列を含む遺伝物
質の量に比例すする０ この実施例では、酵素活性は変わらないが、電極に移送
される範囲は変化する。 （Ｉ）この例では（第８Ｃ図参照）７エロセンＤＮＡプ
ローブが１種または２種以上のリンカ−グループＬを含
む（例えばビオチンを用いることができる）。電極表面
にはリンカ−グループＬを１．。 認識する電気化学的に活性な物質Ｒ（例えば７（ＩＩ）
メディエータリンカ−ＤＮＡプローブを一重鎖遺伝物質
の混合物で処理すると、メディエータリンカ−ＤＮＡプ
ローブは存在する任意の相補配列に結合する。初期の電
流はメディエータリンカ−ＤＮＡプローブ／ターゲット
ＤＮＡ複合体ヤ−ｉに対する電気化学的活性物質Ｒの結
合で減少する。電流の減少は再び既知のＤＮＡ！・・プ
ローブ配列に相補するターゲット配列と共に、付加した
一重鎖配列の量に比例する。 この実施例ではＤＮＡ　！デオキシリボ核酸）の語で記
載したが、メツセンジャＲＮＡのようなＲＮＡの形でも
応用できる。 例４ 第４図に示すように、抗体をポリエステルまたはポリス
チレン容器（１１）に入れると、若干の抗体（１２）は
容器の壁に結合する。以下に記載するように、抗体の結
合を促し、および／または次の抗体（１２）の非特異結
合を妨げるように、容器を処理する。非特異結合を避け
るかまたは減らずためのこの処理には、牛血清アルブメ
ンを用いた容器（１１）のコーティングを含むことがで
きる。 抗原試料は１２ａにて添加され容器の壁に結合した抗体
自体に結合する。 抗体＼結合ン酸素、この実施例ではさらに抗体（１２）
に結合したグルコースオキシダーゼ（１５）を添加する
と、抗原／抗体結合反応が進む。結合、を確実にするた
め、抗体を異ならせて、異なる割合の抗原１２ａに結合
することができる。 容器を洗浄して過剰の抗原酵素複合体←÷φ葉を除去し
、可溶なフェロセン（１６）を含む溶液をグルコース基
質のアリコツトと共に添加する。 参照電極（１７）、例えばカロメル、銀−塩化銀、金、
白金または任意の他の適当な貴金属電極を、フェロセン
の外皮を有するか有しない電子移動電極（１８）と共に
溶液内に置く。 電極（１８）で生成する電流をライン（１９）を介して
読取る。 電流はグルコースオキシダーゼ（１５）の活量に比例し
、従って抗体グルコース結合に対し、従ってこれが結合
する試料抗原１２ａに対して化学量論的関係を持つ。所
望により、メディエータを抗体に結合し、酵素を基質と
共に添加することができる。他の変更も可能である。 例５ ・　この例を図式で第５表に示す。 （Ｉ）この例ではリガンドを検定する。リガンドに特異
的に結合できるアンチリガンド２ｏを電極表面Ｅに固定
する。リガンド２１がないと、溶液中のメディエータ２
２はフリーで、酵素が基板Ｓ上で触媒的に活性である場
合、酵素ＥＮＺから電極表面に電荷を移す。 （■）シかし、リガンド２１が溶液中にある場合、リガ
ンドはアンチリガンドと結合した場合に電極表面の一部
をふさぐらしく、従って電流を引下げるので、その結果
はリガンドの存在を示し、その範囲でリガンドのレベル
を測定する。この検定系はりガントが大きい、例えばＩ
ｇＥのような免疫グロブリンである場合に価値がある。 且↓ 改質酵素の調製 フェロセンモルカルボン酸をイソブチルクロロホルメー
トを用いてグルコースオキシダーゼにカップルした。タ
ンパク質の末端アミンを７エロセン無水炭酸と反応させ
るために含ませた。 反応を次のように行った。フェロセンモノカルボン酸（
乾燥テトラヒト四フラン８ｍｌ中に１　ｍＭ２８５■）
溶液をがきまぜ冷却（−８°ｃ）し、この溶液にイソブ
チルクロロホルメート（０，１３ｍ１）およびトリエチ
ルアミン（０゜１４罰）を絶えずかきまぜながら添加し
た。この段階では反応水を含まないように、無水物の加
水分解を妨げるように注意しなければならない。乾燥管
を装置に装着するか密閉し、あらかじめアルゴンで掃気
した。 混合物を８０分間−８“Ｃでかきまぜ、次いで室温まで
暖めてさらにかきまぜた。得られたフェロセンの無水炭
酸を一滴ずつグルコースオキシダーゼの冷却（２°Ｃ）
溶液（ｏ、ｔ　Ｍ　ＮａＨＯＯ８溶液５０ｍ１中１５０
１ｖ）に加えた。フェロセンを加えなから１）Ｈを０．
Ｉ　Ｍ　ＮａＨＯＯ８を用いて８に維持した。反応混合
物を４°Ｃにて２４時間がきまぜ、次いで遠心分離した
。これにより大量の未反応フェロセンおよび若干の沈澱
した酵素を除失した。次いでタンパク質をＩ）Ｈ８，５
のホウ酸塩緩衝液（０，２Ｍホウ酸、０．０５Ｍホウホ
ウ砂ｇをホウ砂で′＃Ｍ整）に残・らず透析した。 改質酵素の特性 グルコースオキシダーゼの約１０％アミノ酸残留物な改
質に利用できるので、各酵素分子にカップルすることが
多くの７エｐセンに期待できる。５数置を測るため次の
方法を行った。 改質酵素の鉄含量を原子吸光によって決定した。 タンパク質含量を決定するために分光分析技術を用いた
。この分光分析は、酸性ｐＨでタンパク質に結合する際
の有機染料クマシーブルーの４６５ｎｍ、・・〜５９５
　ｎｍの吸光度のシフトに基づくものである。 ２０％の染料水溶液を濾過した。改質グルコースオキシ
ダーゼの標準溶液（１，４〜／ｍＪ）を調製し、この濃
度のグルコースオキシダーゼをクマシープルー溶液と混
合した。次いで５　ｆｌ　５　ｎｍでの光学濃度を各濃
度の酵素にて測定し、改質していない酵素に対して標準
曲線を得た（第４．２図）。 改質酵素のタンパク質濃度をこのように、試料の光学濃
度を見つけ、標準曲線と比較して評価することができる
。調製した試料において、タンパ！【−り質濃度は１１
．０４μＭであった。鉄濃度は８７．５１μＭであった
。 従って、平均８個の７エロセンがグルコースオキシダー
ゼの各分子にカップルしたと推論できる。 改質酵素の電気化学 上述の酵素の調製から、ホウ酸塩緩衝液中１１μＭの酵
素溶液が得られる。改質酵素の電気化学を調べるため、
通常の８電極セルを用いてサイクリックボルタモダラム
を得た。次のように実験を行ッた。セルを８００　ＰＬ
の改質酵素（］］μＭ）で充填した。前もって参照アー
ムをｐＨ８のホウ酸塩緩衝液で充填した。 代表的な拡散制御動力学は（アミドを介して酵素に結合
した）フェロセン分子が可逆的な１電子メデイエータと
して頬くことを示し、タイプ■の動力学を示す。 グルコースがないと、酵素はその酸化形態、酵素−ＦＡ
Ｄとして存在し、触媒反応は認められない。しかし、β
−Ｄ−グルコースが１個付加すると酵素は酵素−Ｆ　Ａ
　Ｄ　Ｈ２として存在し、触媒反応・・・はこの還元形
態と酸化ポテンシャルでの７エリシニウムイオンとの間
で行われる。 フェロセンとグルツースオキシダーゼの８元形態との間
の反応に対する二次速度定数Ｋを８．６×１０５ｍ−１
８−１として計算した。この値を同じ系の溶液動力学に
対して得られるものと比較する場合、（１，１５Ｘ　１
０’　ｍ−１Ｂ−”　）、改質は反応速度を増加させる
ことが認められる。 また、上記表の酵素を７エロセンモノカルボン岐全介し
て電気化学的にカップルした。 これらの各酵素はシグマ・ケミカル・カンパニー（セン
ト・ルイス）製を精製しないで使用した。 一般に、例示した技術を若干のリガンドに応用すること
ができ、このリガンドに特異的に結合する「特異結合パ
ートナ−」が存在する。 この相互作用の例を次に示す。 ＩＪ　カント　特異結合アンチリガンド抗　原　抗　体 ハブテン　ハプテンコンジュゲートまで高められた抗体 ＤＮＡプローブまたは　ポリペプチド鎖への抗体フラグ
メント タンパク質またはタン　タンパク質フラグメントへのバ
ク質の７ラグメント　抗体 このリガンドは（ａ）免疫的に活性なタンパク質または
ポリペプチド鎖（ｂ）分子量１００〜２０００のハブテ
ンである。後者の場合、ハブテンをタンパク質（例えば
牛血清アルブミン）にコンジュゲートさせて抗体をハプ
テンまで高めて免疫させることができ（０）炭水化物ま
たは他の有機分子を免疫させることができる。 リガンドの例 ホルモン例ツマトロピン　胎盤ラクトゲン甲状腺刺激ホ
ルモン　組織ホルモン インシュリン　卵胞刺激ホルモン グルカゴン ゴナドトロピン ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇホＡ／モン ビールス　レトロビールス ヘルペスビールス 肝炎ビールス 酵　素　血清酵素（アマリアーゼ、コリンエステラーゼ
その他） シトクロム プロスタチック酸フォスファターゼ モノアミンオキシダーゼ バクテリアおよびそのフラグメント、セル表面標識およ
びセル表面ポリサッカライドを含むＤＮＡフラグメント 免疫グロブリン　ＩｇＧ　、　ＩｇＭ　、　ＩｇＡ　、
　ＩｇＥ　、　ＩｇＤおよびこれら各７ラグメントＦａ
ｂおよびＦ。 血液凝固因子 ハブテンリガンドの例 ビタミン　Ａ、Ｂ、Ｏ，Ｄ、Ｅ、に、葉酸薬　剤　（ａ
）アミノグリコシド例アミカシン、ゲンタマイシン、ネ
チルマイシン、 トブラマイシン、シソマイシン、カ ナマイシン （ｂ）ヌクレオチド例ＦＡＤ、ＮＡＤ。 ＡＤＰ （０）ステロイド例コーチゾール、テトステロン （ｅ）その他フェノバルビタール リドカイン、アンフェタミン、カテ クロアミン、カフェイン、ジゴキシ ン、キニジン、シソピラミド、 テオフィリン、カンナピノイド、ア ヘン剤、パルピッレート、ベンゾジ アゼピン、メタトン （ｆ）抗てんかん剤、フェニトイン、 ブリミドン、フエメバルビタール、 カルバマゼピン （ｇ）抗腫瘍剤 メトトレキセート、ミドマイシンＣ ブレオマイシン、イフォスファミド、 シクロフォイスファミド、シスプラ チナ剤 ビンブラスチン ビンクリスチン 上述のように、この技術に対して、不均一または均一と
もに、多くの検定図を展開することができる。 これらには次のものがあげられる。 （１）　フェロセンに結合したりガント。全成分は自由
に拡散する。 （１１）　フェロセンに結合したリガンド。ｍ極表面に
共有結合で結合し作用する７エロセン。フェロセンを作
用させるために用いられる基の例とし”’Ｃ−（ＯＨ）
　ＮＨｔりけ−（０Ｈ２）ｎＯＯＯＨソノ他２　ｎ　２ がある。 （Ｉｌｌ）　上記（１１）と同じであるがｍ極表面に吸
着、架橋ｌ結合または固定されたグルコースオキシダー
ゼを有する。 ０ｖ）ＣＯＤに結合し作用してＣ０Ｄ−フェロ七ンーリ
ガンド複合体−−スを生成するフェロセンＯ ・（Ｖ）ＣＯＤに結合し作用するフェロセン。単独にＧ
’ＯＤに結合し作用するリガンド。７エロセンは順番に
所望により電極表面に結合することができる。 （Ｖｌ）　フェロセンフリー、ＧｏＤに結合したリガン
ド。 〜ゆ　ＦＡＤまたは酵素の配合団に結合しリガンドにモ
結合したフェロセン。ＦＡＤ−フェ四センー＋７ガンド
複合体←＋−）＝Ｘを生成。ＦＡＤ−７エ田セン−リガ
ンド複合体←≠今鴫は、リガンドが特異結合パートナ−
を含まない場合、アポ酵素に結合するだけである。これ
を示す競合検定を示す。 （ＣＯＤ（７ボ酵素））−Ｘ−Ａｂ−ＡｇｇＡｂＡ９＋
（ＧＯＤアポ醇素−Ｘ） 各Ｓ合のＸはＦＡＤ−７工胃七ンーリガンド複合体−呻
唾である。 種々の電気化学手法を用いて例えば差動パルスポルタム
メトリー、サイクリックポルタムメトリー、または方形
波ポルタムメトリーにおける電気・化学変化を決定する
ために用いることができる。 応答時間を最小にするために、最終点測定よりはむしろ
反応速度電流測定の方が好ましい。 さらに、本発明によれば、メディエータの中でチオール
または類似の７エロセンの硫黄誘導体を表わす必要があ
り、これによってメディエータは直接会または類似の貴
金属電極に結合する。 チオール基は直接または間接に、例えば１〜６個の炭素
原子を含有する低級アルキル基によって、フェロセン構
造の１個の環に結合することができる。Ｊ、Ｏｈｅｍ、
ＳＯｏ、　６９　ｇ　（１，９５８）　／ックスおよび
ボーソンによる簡単なチオ−／Ｉ／（フェロセン）−８
Ｈを用いることができる。また、アルキルチオ−／Ｌ／
７エロセニルチオブタン、すなわち（フェロセン）　−
０，Ｈ８−ＳＨが有効である。さらに他の倍合体−発券
４チオール様化合物は、例えば、１．２８、トリチア−
（８）−ｙ工四セノファンであり、２個の環が硫黄原子
鎖によって結合している（異なる数の鎖硫黄原子を有す
る物質の混合物である）。 金電極を用意して、例えばこの種の化合物の浴−・・・
液に浸し、メディエータフェロセン構造を導電性１金属
に結合するようにする。 この種の物質の製造例を次に示す。 例７ この方法は次に示す通りであるが、粗混合物の昇華から
は生成物は明らかでなかった。最も明らかな（すなわち
最も臭いがある）ポテンシャルを１・・有する昇華物質
をシリカクロマトグラフィ（３０Ｃｍ　Ｘ　２　ｃｍの
カラム）にかけてヘキサンで流し出し８種類の生成物を
得た。 １　分析で硫黄を含まない。 ２、Ｏ：４８．７２、Ｈ：２．８８、Ｓ＋８８．０５、
ＣＩｏＨ８ＦｅＳ８はＯ：　４２．９Ｂ、Ｓ　：　８４
．４２を必要とする。収量０．４５ｇ。 １個の複合体ヤ十≠蛎分子８．０１１ｇ、質量分析の他
は試験しなかった。この分析では】個の硫黄原子をもつ
＄７エロ七ノファンは示されながった。 上玉 フェロセンチオベンクン（７エロセニルチオブタン）１
、　７ｘａセ／イ１酪酸（Ｊ、Ａｍ、Ｇｈ８ｍ、８００
．１９５７゜７９．８４２０　） Ｆｏ−Ｃｏ　−ＯＨ，−ＯＨ，−０Ｈ２−０００Ｈ前記
刊行物の方法によって調製 ２．７エロセニル酪酸 Ｆｏ−ＯＨ，−ＯＨ，−０Ｈ２−０Ｈ２−Ｃ００Ｈタレ
メンゼン還元によって調製 （皿鉛／水銀および塩酸） ３、　フェロセニルブタノール Ｆｏ−０Ｈ２−ＯＨ，−０Ｈ２−０Ｈ２−ＯＨ，−ＯＨ
酸（２）（ｔｚり）を（ナトリウム／カリウム力）ら蒸
留した）エーテルに溶解し、窒素雰Ｉｊ５気中、水素化
アルミニウムリチウムを用いて処理した。 反応完了時に過剰の水素化アルミニウムリチウムを酢酸
エチル、次いで水を用いて分解した。有機相を分離し、
水相をエーテルで洗浄した（　２Ｘ２０＋！Ｌｔ）。有
機相を合わせて乾燥（Ｍｇ５Ｏ，）　Ｌ、た。−過後、
溶媒をロータリーエバポレーターで除去シた。２成分か
ら成る赤色油が得られた。シリカクルマドグラフィーＣ
Ｃ８０Ｃ’１２ １のエーテルとヘキサジを用いて流出し、アルコールと
エステル、Ｆｏ−ＯＨ２−ＯＨ２−ＯＨ２−ＯＨ，−０
０００Ｈ８が得られた。 ４、７エロセニルチオブタン （３）　（’４　０　０ｍｇ’）をピリジン中に溶解し
く１０ゴ、水酸化す）　ＩＪウムで乾燥）水浴で冷却し
た。 塩化トシル（１り）を添加し溶液を透明になるまでかき
まぜ、次いで４°Ｃにて２４時間放置した。 固体のピリジン塩酸塩を含有する混合物を氷／水に入れ
、トシレートを沈澱させる。これを水で一過し黄色固体
を得た。この乾燥した部分は１．Ｒ．スペクトルでトシ
レートの特性を与えた。残部（０．６５り、まだ湿気を
含む）をエーテ／Ｉ／：メタノール（　１　：　１．　
）に溶解し、かきまぜながら硫化水素ナトリウムＸＨ，
０　（１．６り）を加え、混合物を５°Ｃに維持した。 ３０分後、水浴を除き、混合物を室温まで暖めた。８時
間後薄層クロマトグラフィ（シリカ、１　：　Ｉ　Ｅｔ
，Ｏ　ｎヘキサン）は反応が完了したことを示した。混
合物をロータリーエノ＜ｄζレータ−で乾燥させ、次い
で最小量のＥｔ２０／ヘキサン（１：１１）に溶解し、
シリカクロマトグラフィ（６０　〜１２０メツシュ、２
　５　Ｘ　２ｃｍカラム）　６コかけてＩｔ　Ｏ　／ヘ
キサン（　１．　：　１　１　）で流し出した。 チオールが極めて早く流れ出したので、約１５０ｍ１を
集めた。Ｆｏ−ＯＨ，−０）（２−ＯＨ２−ＯＨ，−（
３Ｈ２−３Ｈ　２　０　０　ｇの収量。 氾 電気化学酵素免疫学的検定の原理 ユ１．−一一一一一一一一１６−１０　−この酵素結合
した免疫学的検定の原理を以下しこ図式で示す。 ２　ＦｅＤ　＋　２　Ａｂ　−　２　ＡｂＦｅＤ２　Ｆ
ｅＤ　＋　２Ｄ＋　２Ａｂ　−　ＡｂＦｅＤ　＋　Ａｂ
Ｄ　＋　Ｄ＋ＦｅＤＦｅＤ　＋　Ｄ＋　Ａｌ１　−　Ａ
ｂＦａＤ＋Ｄ式中のＤ−薬剤 Ａｂ−抗体 ＦｅＤ−フェロセン−薬剤　コンジュゲートフェロセン
を問題の治療剤にフンシュゲートすする。この抗体がな
いと、フェロセン−薬剤コンジュゲートはグルコースオ
キシダーゼと電極との間の仲介がフリーである。過剰グ
ルコースを使用するので酵素は基質を制限しない。 この抗体があると、フェロセン−Ｘ　剤コンジュゲート
を抗体に結合するので、フェロセンは酵素と電極との間
の仲介がフリーではなくなる。しかし、そのままの薬剤
が試料中に存在すると、その抗体に対してフェロセン−
薬剤フンシュゲートと１・・競合することができ、薬剤
−７エロセンコンジユゲートの結合を妨げて、グルコー
スとｍ４ｄＡとの間の仲介がフリーのままとなる。 問題の理想の７エロセン標識治療薬はその抗体に対して
自然薬から観察される結合特性を変える１・必要がない
。すなわち抗体は標識薬剤ならびに未標識薬剤を結合す
る必要がある。 フェルセン標識薬剤の存在は直接電気化学技術を用いて
検出できるが、酵素結合系を用いると極めて低濃度で容
易に測定できる増幅「ビルトイン」・手段を与える。 （ａ）　フェロセンアセトニトリルの調ｔＪ！（化合物
Ｉ）ジメチルアミンメチル７エロセンメチオダイド（９
り）とシアン化カリウム（１０９）を１００ｍ１の水に
溶解して２時間還流した。次いで混合物を冷却しエーテ
ルで抽出しく　３　Ｘ　１５０　ＴＲ１）　、合わせた
抽出物を水で洗浄した（　６　Ｘ　１００　ｒｎｌ　）
。 硫酸ナトリウムでエーテル相を乾燥した後、溶液を濾過
し、溶媒を真空で除去し、黄色結晶粉末を生成した（　
Ｊ、Ｏｒｇ、Ｏｈｅｍ、２８　（１９５８）　６５８参
照〕′。 生成物はＩ、Ｒ，スペクトルが２２４０　Ｃｍ−’　（
−ＯＮ伸縮）、１．００２ｃｍ−’７ｘロセン（０−Ｈ
）べ＞　）’および１．１０８　Ｃｍ’−”非対称項パ
ルスの特徴を有する。その融点は７７〜７８゛Ｃである
。 （ｂ）７エロセン酢酸の調製（化合物ｎ）ニトリ・ル（
６，２０９）をエタノール（１００ゴ）に溶解し、水酸
化カリウム（１８ｇ）の水（１５０Ｍ）溶液に添加して
、溶液を１８時間還流した後、冷却した。溶媒のバルク
をロータリーエバポレーターで除去し、最終容量を１０
０ｍとした。この１・・溶液をエーテル（ａ　ｘ　１．
５０　ａｔ　）および水相で抽出し、次いで濾過し、酸
性にした（正リン酸８５チを用いてｐＨａ、ｏにする）
。黄色沈澱物を漣過し、乾燥しくリン酸、デシケータ〜
）、黄色粉末を与えた、４．５４ｇ１０ 分析＝ｔｍ値　０：５９．０５％　Ｈ；４．９６％実測
値　Ｃ：　５８，７６％　Ｈ：　４．９９％融点１５８
〜１５５℃（ｌｉｔ、１５２〜１５６°）（Ｃ）１ｔ２
ｔＢｔθ、７−ベンタヒドロー１．８−ジメチル−２，
６−ジオキソプリン−８−メチルフェロセンの調製（化
合物■） フェロセン酢酸（５，１ｇ）と５，６−ジアミノ−１，
８−ジメチルウラシル水和物（３，５７７７）をディー
ジ・スタルク装置を用いてジメチルアニリン（３Ｑ　ｍ
ｌ　）中で窒素下に還流した。１８時間後、溶液を冷却
し、水酸化ナトリウム水溶液（８％、３６プ）を添加し
て、溶液を蒸気蒸留した。終了時に容器−内容物を濾過
し、次いで酢酸を用いてｐ）１４．５に酸化した。生成
した沈澱物を吸ｉｊＩ濾過し、真空デシケータ−中、五
酸化リンで乾燥した。収量１，６７９、褐色粉末。 触点：う８０℃。 質量分析　分子展−３７８ 微量分析　Ｃ□８Ｈ□８Ｎ、Ｏ，Ｆｅに対して計算値０
　：　５７，１４チ、Ｈ：４゜７６％、　Ｎ　！　１４
，８１チ実測値０　：　５８．００％、）Ｉ　：　５．
１５％、　Ｎ　：　１８．８０ｆｒ工、Ｒ，７００〜８
ＱＱｅｍ−”　、１６０（１〜１７５０ｃｍ−１７−オ
フイリン。 １０００ｃｍ””　、１１００ｃｍ−１１個の猿に７工
ロセン誘導体置換。 質量分析データーから、この物質は試料を揮発させるた
め１０″″８ａｍ　Ｈｇの圧力で０．６アンペアの電流
を必要としたので非揮発性である。 （ｄ）　フェロセンエチルアミンの調製（化合ａｙ＞０
．８５９のＬｉＡｌＨ４を４　Ｑ　ｒｎｌ　（７）　：
ｃ　−ｆ　ル中、１時間静かに還流させた。ｇＱｍＪの
エーテル中で溶解したフェロセニルアセトニトリル（ｚ
、１り）をＮ２圧を維持する間に還流させるような割合
で添加した。２時間還流を続けた後、混合物を冷却し２
＋ｎ１（７）水を添加し、次いで１ゴの１０％Ｎａ、Ｏ
Ｈ％最後に５　ｍｌの水を添加した。エーテル層を固体
からデカントし、固体を８　Ｘ　１０　ｍｌのエーテル
で洗浄した。合わせた有機相をＨＯＩガスで処理し、Ｎ
２下にデカントして分離する７エロセンエチルアミン塩
酸塩の黄色塩を与えた。固体（なおエーテルで浸した）
を２　Ｎ　ＮａＯＨに添加し、混合物をエーテルで抽出
した。次いでエーテル相をＭｇ５Ｏ，で乾燥し、溶媒を
真空中で蒸発させて暗褐色の油を１゜２９生成した。 （ｅ）　１　、２　、８　、６　、７−ベンタヒドロー
１，３−ジメチＡ／−２，６−シオキソプリンー８−酪
酸（化合物Ｖ）４．５−ジアミノ−１，８−ジメチルピ
リミジン−２，５−ジオン（１９、５，９ミリモル）お
よび無水グルタル酸１１，８４９　、１１．８ミリモル
）をＮ２下に２．５時間デイーン・スタ〃クトラップを
用いて１０ＩＩＩｔのＮ、Ｎ−ジメチンンアニリン中で
還流した。 ５Ｉ＋＋／の溶媒を添加し、さらに０．５時間還流を続
けた。反応混合物を冷却し濾過した。固体物質をベンゼ
ンで洗浄し、水から再結晶して、６００ｎ夕の白色結晶
を生成した。融点２８８〜２４０’Ｃ。 質量分析からの分子量、２６６゜ Ｃ１１Ｈ１４”４０４分子ｆｆ１２６６ｍｆｆ１分析　
実測値０　：　５０．０４％、　Ｈ：　５．１４’％、
　Ｎ　：　２１．１２％計算値０：４９．６２％、　Ｈ
：　５．２６俤、Ｎ：２１，０５条（ｆ）　１，２，８
，６．７−ベンタヒドロー１．８−ジメチル−２，６−
シオキソプリンー８−（Ｎ（２−エチルフェロセニルコ
ブタンアミド）（化合＃！ｌ’）化合物Ｖ（１８１ｍ！
；１，０．５ミリモル）および化合物Ｎ　（１，１５ｍ
９　、０．０５ミリ％／ｌ／）を５　ｍｌのＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミドに溶解した。ジシクロへキシルカル
ボジイミド（１２０■、０．６ミリモル）を、かきまぜ
た溶液に室温で添加した。４時間続けてかきまぜた。反
応は薄層クロマトグラフィをみて完了した。プレートを
、シクロヘキサン−酢酸エチル−メタノール４：２：１
の溶媒系を用いて実験した。反応混合物を５０ｍ／のエ
ーテルに注入した。沈澱した物質を濾過し、エーテルを
用いてよく洗浄し、褐色粉末２２０ｍｇを生成した融点
２１６〜２２０℃ 質量分析からの分子量４７７ ０．８Ｈ，７１Ｊ、０８Ｆｅ分子量４７７微量分析実測
値０　：　５６．８０チ、　Ｈ：　５．４２％、Ｎ　：
１４゜２８％計算値Ｃ：　５７．８６％、Ｈ：５．６６
％、Ｎ：１４゜６７チ１、Ｒ，スペクトルは７００〜８
００ｃｍ　、１６００〜１７５Ｑｃｍ　にテオフィリン
、１．０００〜１　］　ＯｎＣｍ″″１に１個の環に置
換したフェロセン成分による信号の特徴的なピークを示
す。 （ね　コンジュゲートの抗原性 フェロセンテオフィリンコンジュゲートＩｌｌおよび■
を検定するため、免疫技術−二抗体酵素免疫学的検定キ
ットを用いて、抗原特性を決定した。 これは不均一酵素免疫学的検定法であり、競合結合の原
則に基づき、試料中のテオフィリンフェロセンコンジュ
ゲートまたは標準物が特異抗体に対してテオフィリン酵
素フンシュゲートと競合する。 分離工程は二抗体免疫沈澱を用いて行った。酵素活性を
小球内で決定すると、テオフィリンに対して０〜４ｏｐ
ｇ／ゴの問題の治療上の範囲で得られ・た。 通常、標準曲線は濃度の対数に対するプランクチとして
示した試料の吸収または４００１ｍでの吸収のいずれか
のプロットとして示す。しかし、一層有益な方法はデー
ターのロジ）　（ｌｏｇｉｔ　）　変換を行うことであ
る。 ロジト％Ａ／Ａｏを濃度の自然対数に対してプロットし
て直線を得る。化合物の架橋反応性を試験するために、
これらのロジト変換は平行な直線を得る必要がある。 データを第７Ａ表および第７Ｂ表に示す。第６図にはテ
オフィリン、および化合物■に対する標準曲線を示す。 化合物■はテオフィリン自身よりもテオフィリン抗体に
対して一層抗原性があった。 ％　Ａ／Ａｏ−５０（すなわちロジト％Ａ／Ａｏ−０）
に対する結果の比較は、化合物■がテオフィリンよりも
７．６倍も抗原性があることを示している。 同様に化合物■の実験では、テオフィリンより・も約４
００倍も抗原性があることがわかった（データは示さな
かった）。 第７Ａ表 （μ９ｍり ０　−　− ２．５　８８　１．９９ ５．０　８１　ｉ、、４５ １０．０　６７　０．７１ ２０．０　４９　−０．０４ ４０．００　８５．５　−０．６０ ロジ）　ｂ−Ｉｎ　（ｂ／１００−ｂ　）　ｂ−’ＡＡ
／Ａ。 ｒ−−０，９９８こう配−−０，９６ 第７Ｂ表 （テオフィリン） ０．２５　８４　１．６６ ０．５０　７８　１．２２ １．００　６９，６　（１，８８ ２，５０５０，１０，００４ ６，００３８゜２　−０．７０ ７．５０　２５．６　−１．０７ １０．００　１８．０　−１．５２ １５．００　１．５．９　−１．６６ ２０．００　１２，４　−１．９６ ｒ　−−０，９９７こう配−−０，９５グルコースオキ
シダーゼ（ＦＣ１，１，８，４＞はべ一リンガー・マン
ハイム製であった。Ｄ−グルコース（ＡｎａｌａＲ）は
ＢＤＨ製であった。全浴液を高純・・、度の水（ミリボ
ー／Ｉ／）中でアリスター等級試薬か１ら調製した。支
持電解質はＨａｉ６．を用いて必要な１）Ｈに調整され
た０゜１．　Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ，であった。 装　置 り、Ｏ，サイクリックポルタムメトリー実験ヲ、９．５
ｍ／の作業容社を有する２個の区１σ１１セルを用いて
行った。４闘の金ディスク作業電極の他に、セルには］
　ｃｍ”の白金ガーゼ逆電極およびｍ　１４Ｃ４として
飽和カロメル電極を含ませた。全′屯位は飽和カロメル
電極（Ｓ、０．Ｅ、　）を参照する。 サイクリックポルタムメトリーに対し、て、オックスフ
オート電極ポテンシオスタットにブリャンＸ　−Ｙ　２
６００ＯＡ＋３チャートレコーダを用いた。 手順 化合物ｍおよび■は水溶液に不溶だったので、必要量を
少量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、この
溶液を緩衝溶液に添加ｔ７て最終ＤＭＦ濃度１０％（Ｖ
：Ｖ）を与えた。この方法では、電気化学実験に対して
化合物用とＭを水溶液に保持することができた。 、結　果 この研究に用いた実験条件では、Ｓ、Ｏ，Ｅに対する走
査した電位の全範囲（−ｔｏｏ　Ｎ５ｏｏｍｖ）および
電子走査速度（−２〜５０ｍＶｓ）に関して、化合物■
および■は金電極での可逆１電子レドツクス剤と一貫し
たボルタモダラムを示した。 化合物ｍ　ｅ　Ｅ　Ｈ−１０５ｍｖ 化合物Ｍ　、　Ｅｙ、−１５ｏｍｖ 化合化合物子オフィリン抗体に対して極めて抗。 原性であることがわかったので（テオフィリンの約４０
０倍）、化合物■をさらに研究したこの化合物はテオフ
ィリンの７．６倍だけの抗原性があり、従って、電気化
学反応を阻止するため、化合物■によって必要とされる
程の抗体の量を必要としない。しかし、化合物■と化合
物■はグルコースオキシダーゼ反応に対してメディエー
タとして作用した。 化合物■の濃度が増加するとピーク電流が変化する研究
では、グルコースオキシダーゼ結合反応・を行った。そ
の結果を第７０表にまとめた。 第７０表 化合物■の濃度（μＭ）　ｉｐ結合　ｉｐ非結合（μＡ
）　（μＡ） ２０　０．８　９．１ ４０　０．６２　２５．１ （１００，８９０８ ８０、１，１３１４８ １００１，８６１７７ ５ｍｙｓ　の走査速度を結合、非結合実験に対して用い
た。 表から明らかなように、ピーク電流と濃度との間の直線
関係は結合反応に対して存在する。しかし、このような
関係は非結合反応には明らかでない。これは多分、この
反応によって生成した極めて小さいピーク電流の評価に
エラーがあったためであろう（図面参照）。 ・（ｊ）化合物■の電気化学的に結合したグルコース見 手　順 １０％（ｖ：ｖ）のＤＭＦを含むホスフェート緩衝液ｐ
Ｈ７，１に調製した化合物団の１００Ｉｔλ（貯蔵溶液
の２００μ！試料に、５０μ）のホスフェート緩衝液ま
たは５０μｌの稀釈していないウサギ抗血清（免疫学的
技術）を添加して、稀釈した。この溶液から１５０μノ
を２５０μノの緩衝液および５０μｌの１Ｍグルコース
溶液を含む０．５ｍｌの電気化学セルに置いた。 非結合反応のり、Ｏ，サイクリックボルタムダラムを、
５　ｍＶｓ−’の走査速度を用いて記録した。その後、
３ｍ９１ｍ／のグルコースオキシダーゼ溶液５０μノを
添加し、溶液をアルゴンで脱気し、フェリジニウムイオ
ンからの７エロセンの酵素接触再生のポルタムグラムを
記録した。最終の化合物ｍの濃度は２４μＭであった。 さらに、等濃度のテオフィリンと化合物用、お−・・・
よび化合物■の１０倍の濃度のテオフィリンを含有する
試料を調製した。両者の場合、結合および非結合ポルタ
モグラムを記録した。 最後に、テオフィリン（２４０／ｊＭ）および化合物■
（２４μＭ）を室温で１５分間稀釈していないウサギ抗
血清５０ｐｌを用いて装置した後、試料を除去し、ボル
タモダラムをグルコースオキシダーゼの存在または不在
で記録した。 結　果 化合物遊の２４μＭ溶液の非結合サイクリックボルタモ
ダラムは】電子レドックス剤の期待された挙動を示した
（　Ｅｙ、−１９５ｍＶ　、Ｅｐ−６０ｍＶ　。 １ｐ−２５μＡ）。溶液にグルコースオキシダーゼを添
加すると、先に略述したポルタモ７グラムの変化を生じ
た。ピークは見られず、大鷲の触媒電流（０，３μＡ）
が酸化電位で流れた。 化合物■をウサギ抗血清で前装置した場合、ボルタモダ
ラムは可逆挙動を示さず、わずかに２４０ｍｙに陽極ピ
ークを示し、低減電位ではピークを示さなかった。この
ピークは抗血清自身に既知の、成分を含むために示され
たものである。グルコースオキシダーゼを添加すると、
触媒電流はＪ、８められず、実際に、ポルタモグラムは
非結合反応のものと同一であった。化合物■は完全に抗
体に結合していたので、金電極での電子移動反応に加わ
ることができずグルコースオキシダーゼに対してメディ
エータとして作用することができなかった。 前記濃度で化合物■の溶液にフリーのテオフィリンを添
加しても、グルコースオキシダーゼの存在および不在で
は、フェロセン−薬剤コンジュゲートの電気化学挙動に
はいかなる効果も示さなかった。テオフィリン（２４０
μＭ）および化合物■（２４μＭ）をウサギ抗血清を用
いて前装置すると、これを記録したポルタモグラムは、
化合物■が電極で電子移動反応にフリーに加わり、グル
コースオキシダーゼに対してメディエータとして働くこ
とができることを明らかにした。実際に、生成した触媒
電流（０，８μＡ）はテオフィリンと抗血清の不在で得
られたものと同一であった。これは、完全に抗体に結合
し従って酵素結合反応に・加わることができるフリーの
化合物■を溶液中に生成するテオフィリンを示しており
、従って、血清中のテオフィリンの検定に対し基礎を置
く。 この検定のひとつの形態として代りに、（空間位置また
は物理的状態によって）少なくともコンジュゲートを抗
体から分離し、グルコースオキシダーゼをグルコースか
ら分離するように、テオフィリン／フェロセンフンシュ
ゲート、テオフィリン抗体、グルコースオキシダーゼ、
グルコースを活性電極に置く乾燥ス）　ＩＪツブを含む
。上記構成要素は本発明の１例である。未知のテオフィ
リンレベルを含む生物液を添加すると、競合結合反応が
上述のように起り、電流が下がり、上述のように測定の
ための検定が進行する。 好ましい構造は、抗体の結合位置に対して、一方では７
エロセン／テオフイリンコンジユゲートと他方では検定
すべきテオフィリンとの間の競合結合反応を生じる。こ
のために次の手順を行った。 （Ａ）　未知量のテオフィリンを用いる。 （Ｂ）　コンジュゲートをこれと混合する。 、（０）　ｃＡ）および（Ｂ）の混合物を過剰のグルコ
ースに添加する（センサ電極、例えば２〜８個の電極系
における金電極の存在するグルコースオキシダーゼ系）
。 の）触媒電流を測定する。 （ト））　既知量の抗体を添加し、テオフィリンとコン
ジュゲートとの間で競合結合反応を生じる。 （Ｆ）［流における低下、または低下率を測定する。

【図面の簡単な説明】

第１＋２＋８ａ〜３０，４および５図は本発明による検
定法を図式的に示した図であり、第４゜２図は未改質酵
素に対する標準曲線を示すグラフであり、第６図は薬剤
および薬剤／メ、ディエータコンジュゲートの抗原性を
比較したグラフである。 １・・・抗原　２・・・抗体 ３・・・抗原結合位置　４・・・抗原／抗体複合体５・
・・７リーな結合位置 ６・・・メディエータ結合抗原 ７・・・メディエータ　８・・・抗原 ９・・・フェロセン結合抗原 ・１１・・・容器　１２・・・抗体 １２ａ・・・抗原　１５・・・グルコースオキシダーゼ
１６・・・フェロセン　１７・・・参照電極１８・・・
電子移動電極　１９・・・電流ライン２０川アンチリガ
ンド　Ｅ・・・電極 ２２・・・メディエータ ＧＯＤ・・・グルコースオキシダーゼ Ｆ・・・フェロセンメディエータ Ｄ・・・ＤＮＡフラグメント Ｌ・・・リンカ−グループ Ｒ・・・電気化学的に活性な物質 Ｓ・・・基質 ＥＮＺ・・・酵素。 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ＋ｊヲＩ＝ｔ　Ｆ、、　３ｃ。 ＦＩＧ、４゜ （ＧＢ）■８３３３６５１ ■１９８４年１月１９日■イギリス （ＧＢ）■８４０１３９９ ＠　１９８４年２月２９日Φイギリス （ＧＢ）［有］８４０５２６２ ■１９８４年２月２９日■イギリス （Ｇ　Ｂ　）＠８４０５２６３ ４１４− 手　続　補　正　書（方式） 昭和５９年８月３日 特許庁長官　志　賀　半数 １、事件の表示 昭和５９年特許願　第　９０８３１号 ２、発明の名称　、 特異結合剤を使用する検定方法 ４、代理人 手　続　補　正　書 昭和５９年８月３日 特許庁長官　志　賀　半数 １、事件の表示 昭和５９年特許願第　９０８３１号 ２、発明の名称 特異結合剤を使用する検定方法 ４、代理人 ５、補正の対象　明細書の「発明の詳細な説明」の欄１
、明細書第６７頁第１行の「第５表」を「第５図」に訂
正する。 ２、同第８１頁第１４行のｒ　２　ＦｅＤ　＋　２　Ａ
ｔ）　−２ＡｂＦ８ＤＪを「Ｆｅｐ　＋　Ａｂ　＊　Ａ
ｂＦｅＤ　Ｊに訂正する。 ８、同第８１頁第１５行のｒ　２ＦｅＤ＋２Ｄ＋２Ａｂ
−ＡｂＦｅＤ＋　７１ｂＤ　−１−Ｄ　＋　ＦｅＤ　Ｊ
を削除する。 ４、同第８１頁第１６行（７）　ｒＦｅＤ＋Ｄ＋Ａｂ−
ＡｂＦｅＤ＋ＤＪをｒ　ＦｅＤ＋Ｄ＋Ａｂ　ｄ　ＡｂＦ
ｅＤ＋Ｄ　Ｊに訂正する。 ５、同第９０頁第１１〜１３行の「フェロセン・・・決
定した。」を「免疫技術−二抗体酵素免疫学１０的検定
キツトを用いてフエロセンテオフイリンコンジュゲー）
＋１１および■を検定して抗原特性をめた。」に訂正す
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌ　（ａ）　リガンドおよびアンチリガンドを含む反応
   性種の間の少くとも１個の特異結合反応段階を、酵素が
   触媒的に活性であるレベルの基質に電気化学的に結合し
   ている酵素／メディエータ系と関連させて、前記結合反
   応が前記酵素／メディエータ糸の少くとも１個の成分の
   電気化学的アベイラビリティに影響を与えるように行い
   、次いで （ｂＪ　Ｍ配電気化学的アベイラビリティに及ぼす作用
   を検出または測定して信号を得、この信号から前記反応
   性種の存在または分量をめることを特徴とする検定方法
   。 ２　前記特異結合反応を溶液中で行わせる特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ＆　前記特異結合反応を固体表面で行わせる特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 表　測定すべきリガンド種の未知量と、前記リガンド種
   に対するアンチリガンド種であって１、それ自体が前記
   メディエータ化合物と化学的に結合しており、その結合
   状態においてのみ酵素／基質反応からの電荷移動に利用
   できる前記アンチリガンド種の過剰であることが分・・
   つている既知量とを特異結合反応させて、これによって
   生ずる過剰量の未結合メディエータ／アンチリガンド種
   の電気化学的活性によって前記リガンド種の分量を測定
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ａ（ａ）（１）　検定すべきリガンドを含有する試料と
   、過剰であることが分っている既知量のアンチリガンド
   とを混合し、この際１１記アンチリガンド上のリガンド
   結合性位置のある部分を７リーなままとし、 （＋＋＋　生成した混合物と、メディエータ化合物と化
   学的に結合しているリガンドの過剰であることが分って
   いる既知量とを混合して、前記フリーなリガンド結合性
   位置のすべてを占有させ、若干のりガンド結合メディエ
   ータを電気化学的に利用できる状態のままとじ４ （ｂ）　酵素とこれに対する基質とを液体混合物中で混
   合し； （Ｃ）　前記酵素／基質混合物と工程１ａ）からの前記
   混合物とを接触させ、次いで （ｄ〕　生成した混合物とセンサ電極とを接触させ、か
   くして前記センサ電極に移動する電荷が利用可能な未結
   合のリガンド結合メディエータ量によって変動し、従っ
   て最初のりガント量の偏差が許容される ことを特徴とする均一酵素免疫検定方法。 氏　前記メディエータが７エロセンである特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 ７、　前記フェロセンがカルボキシルフェロセンである
   特許請求の範囲第６項記載の方法。 ＆　前記基質／酵素系をグルコース／グルコースオキシ
   ダーゼおよびグルコース／グルコースデヒドロゲナーゼ
   から選定する特許請求の範囲第４〜６項のいずれか一つ
   の項に記載の方法。 （１）（ａ）未知量の検定ずべきリガンド棟Ｘと（ｂ）
   ある分量の種Ｘ−Ｅ　（ただし、Ｘは酵素活性を破壊す
   ることなく酵素Ｅと化学的に結合している）とを溶液中
   で混合し、（１１）　この混合物をセンサ電極の存在下
   に前記酵素に対する基質Ｓ　Ｉｇよびメディエータ化合
   物Ｍと接触させて、酵素的に触媒作用が行われる反応に
   依存して測定電荷を前記センサ１！極に移動し、 ｑ１リ　アンチリガンドＡを前記溶液と接触ぎせて次の
   反応式１および■： で表わざ、れる競走平衝結合反応を生起させて、前記酵
   素的に活性な種Ｘ−Ｅの部分を酵素的に不活性な種Ａ−
   Ｘ−Ｅに転化させ、これにより反応程度および電極にお
   ける測定電荷を変え、次いで （φ　電荷の減少または減少速度から被検体Ｘの濃度を
   測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 Ｎｏ、（１）　（ａ　）未知量の検定すべきリガンド種
   Ｘと（ｂ）ある分量の種Ｘ−Ｍ　（ただし、Ｘはメディ
   エータ活性を破壊することなくメディエータＭと化学的
   に結合している）とを溶液中で混合し、 （１１）　この混合物をセンサ１！極の存在下に基質Ｓ
   およびこれに対して触媒的に活性な酵素Ｅと接触させて
   、酵素的に触媒作用が行われる反応に依存して電荷を測
   定のために前記センサ電極に移動し、 （ｎｉｌ　アンチリガンドＡを前記溶液と接触させて次
   の反応式１および■： で表わされる競走平衝結合反応を生起させて、前記種Ｘ
   −Ｍの部分を不活性棹Ａ−Ｘ−Ｍに転化させ、これによ
   り反応程度および電極における測定電荷を変え、次いで （１ｖ）′ａＬ荷の減少または減少速度からリガンド僚
   検体Ｘの濃度を測定する ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ＩＬ（ａ）　被検体Ｘと酵素Ｅとを共有結合させて酵素
   的に活性な種Ｘ−Ｅを生成し； （ｂ）　この酵素的活性種Ｘ−Ｅと適当な反応性１．・
   リガンドＡとを反応させて特異結合位置が完全に占有さ
   れている酵素的に不活性な釉Ａ−Ｘ−Ｅを生成し； （Ｃ）　この酵素的不活性種Ａ−Ｘ−Ｅを検定すべき種
   Ｘと接触させて種Ｘとの競走特異結合反応を生起させ、
   次式： ％式％ で表わされる平衝を達成させて、前記種Ｘ−Ｅの全量か
   ら前記検定すべきＮ（Ｘの分量を測定できるようにし；
   次いで （Ｉ：ｉ］　この混合物をＸ−Ｅに対する基質と接触さ
   せ、この結果生ずる酵素的に触媒作用が行われる反応か
   らセンサ電極にメディエータ化合物によって電荷を移動
   させて存在する酵素的活性種Ｘ、−Ｂの全景を測定し、
   この測定結果から種Ｘの分量をめる ことを特徴とする種Ｘに対する免疫検定方法。 １λ　前記メディエータがフェロセンである特許請求の
   範囲第９項記載の方法。 １＆前記７エロセンがカルボキシル７エロセンである特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４　前記基質／酵素系をグルコース／グルコースオキ
   シダーゼおよびグルコース／グルコースデヒドロゲナー
   ゼから選定する特許請求の範囲第９〜１１項のいずれか
   一つの項に記載の方法。 １５、前記メディエータおよび前記酵素の少くとも一方
   を核酸プローブ配列に化学的に結合させて、調査すべき
   一重鎖核酸物質中のターゲット配列に対する前記核酸プ
   ローブ配列の特異結合が、酵素基質の存在下にセンサ電
   極によって検出されるように前記化学的に結合している
   種の電気化学的アベイラビリティイ０こ影響を及ぼし、
   これにより前記ターゲット配列の存在を検出可能にする
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １ａ（ａｌ　調査すべき一重鎖核酸物質を所定のターゲ
   ット配列に対して供給し； （ｂ）　前記ターゲット配列に相補的な核酸配列を有す
   るプローブ物質を選定し； （０）次の８種の処理： 中　前記プｐ−１と酵素とを結合させ、この酵素結合プ
   ローブを、前記酵素に対する基質およびメディエータの
   両者を含有する清液に添加する処理、 （１１］　前記プローブとメディエータとを化学的に結
   合させ、このメディエータ結合プローブを、基質および
   前記基質に対する酵素の両者を含有する溶液に添加する
   処理、および （ｉ！ｉＪ　ｎｔＪ記プローブをメディエータ／酵素の
   組合せと化学的に結合させ、このようにして変性したプ
   ロー１を、前記酵素に対する基質を含有する溶液に添加
   する処理か・′らなる群から選定した１種の処理を選択
   ゛じ２て行ない； （山　前記化学的に結合したプローブ配列を含有する溶
   液をセンサ電極と接触させて、前記酵素が触媒作用を行
   う基質反応から前記。 ′４号極に前記メディエータによって電荷を移動させ、
   次いで、 （ｅ）　前記溶液を前記−重鎖物質と接触させて酵素、
   メディエータま゛たはこれらの組合せのアベイラビリテ
   ィに影響を及ぼす前記プ・彎−プと前記ターゲットとの
   特異結合反応を電荷移動量の変化によって表示する ことを特徴とする核酸物質中のターゲット配列の検出方
   法。 １７　前記メディエータをリンカ−グループにょつてプ
   ローブ配列に間接的に結合させ、前記リンカ−グループ
   に反応性である物質を電極上に存在だせかつ前記プロー
   ブ配列に結合させて’ｍｍ雷電流変化を生じさせる特許
   請求の＠回漕１５項記載の方法。 １８、前記メディエータが７エロセンである特許請求の
   範囲第１５〜１７項のいずれが一つの項に記載の方法。 １９、前記フェロセンがカルボキシル７エロセンである
   特＆ｆ’ｌ−請求の範囲第１５〜１７項のいずれか一つ
   の項に記載の方法。 ２０、前記基質／酵素糸をグルコース／グルコースオキ
   シダーゼおよびグルコース／グルコースデヒドロゲナー
   ゼから選定する特許請求の範囲第１５〜１７項のいずれ
   力）一つの項。こ記載の方法。 ２Ｌ　検定すべきリガンドを適当な表面上に固定し、次
   いで酵素に化学的に結合している適当なアンチリガンド
   の過剰量と特異結合反応させ、しかる後にこの過剰量を
   除去し、前記固走化酵素に対する基質を添加し、次いで
   メディエータおよびセンサＩＩ極と接触させて、前記電
   極に移動する電荷が存在する酵素量に比例するようにす
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ｔａ（ａ）　検定すべきリガンドを適当な表面におい
   て固定し、 （ｂ）　前記リガンドを、酵素と化学的に結合している
   アンチリガンドからなる酵素活性種の過剰量と接触させ
   て固定化リガンドとの特異結合反応を行わせ、前記検定
   すべきリガンドの分量に相当する分量の固定化酵素的活
   性種を生成し； （０）　過剰量の非固定化化学的結合酵素／アンチリガ
   ンドを除去し、次いで （（１）　前記固定化酵素をこの酵素に対する基質およ
   び電荷移動性メディエータと接触させて、前記メディエ
   ータと接触している電極が前記固定化ｕ紫の分量に相当
   する電荷を信号として検出し、これから検定すべきリガ
   ンドの最初の分量をめることを特徴とす・る不均一酵素
   結合検出方法。 ε＆　前記メディエータが７エロセンである特許請求の
   範囲第２２項記載の方法。 ２４前記７エロセンがカルボキシルフェロセンである特
   許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２＆　前記基質／酵素系をグルコース／グルコースオキ
   シダーゼおよびグルコース／グルコースデヒドロゲナー
   ゼから選定する特許請求の範囲第２１〜２８項のいずれ
   か−っの項Ｇこ記載の方法。 ２ａ　前記特異結合反応をセンサ電極の表面で行わせて
   少くとも部分的に前記表面を封鎖するかあるいは前記表
   面の特性を変えて、前記特異結合反応の存在または程度
   を検出電荷における減少の存在または減少量によって測
   定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２７、（ａ）　検定すべきリガンドを含有する液体媒質
   を選定し； （ｂ）　前記液体媒質に、酵素と酵素が触媒作用をする
   反応を行うことができる既知量の基質１を添加し； （０）前記液体媒質を、（１）前記検定すべきリガンド
   と特異結合反応することができるアンチリガンドと、（
   １１）前記酵素と、（ｍ　）メディエータ化合物との組
   合せを表面に有するセンサ電極と接触させ、このように
   して前記酵素が触媒的に活性である場合に前記酵素から
   前記電極に電荷を移動させて信号を出し、次いで （ｄ）　前記信号と前記リガンドの存在しない場合に受
   けた信号とを比較し、存在する前記リガンドの分量を、
   前記特異結合反応によって生ずる前記電極表面における
   封鎖状態または形態上の変化の関数として存在す４前応
   覧翼λへＱ外仄斂※求めることを特徴とする免疫検定方
   法。 ２１Ｌ　前記メディエータが７エロセンである特許請求
   の範囲第２６項記載の方法。 ｇｏ、前記フェロセンがカルボキシルフェロセンである
   特許請求の範囲第２７項記載の方法。 Ｂｏ、前記基質／酵素系をグルコース／グルコースオキ
   シダーゼおよびグルコース／グルコースデヒドロゲナー
   ゼから選定する特許請求の範囲第２６〜２８項のいずれ
   か一つの項に記載の方法。 ８１　前記酵素と前記メディエータとを一緒に化学的に
   結合させる特許請求の範囲第１〜８項のいずれか←ブの
   項に記載の方法。 Ｂ＆　化合物の混合物中に存在する選定したリガンド種
   の存在を測定するに当り、 １）前記リガンド種とアンチリガンドとを反応させてリ
   ガンド／アンチリガンド複合体を生成し、 １１）酵素が触媒作用を行う反応を行わせ、この際この
   反応の速度は前記複合体の生成量に相当し、次いで １１１）前記酵素と電子移動メディエータとからなる混
   合物を、導電性表面を有する電極に曝して、前記電子移
   動メディエータが前記電極表面と前記酵素との間に前記
   酵素が触媒作用を行う反応の速度に相当する速度で電子
   を移動できるようにすることにより前記酵素が触媒作用
   を行う反応の速度を電気化学的に検出する ことを特徴とする選定したリガンド種の存在の測定方法
   。 ８＆　化学的に結合しているメディエータ被検体コンジ
   ュゲートがＦＯＯＨ，−テオフィリンである特許請求の
   範ＦＩ！Ｉ第１Ｏ項記載の方法。 ８４　電極表面において（ａ）リガンド種とメディエー
   タとのフンジュゲー）、（ｂ）これに対するアンチリガ
   ンド、（０）酵素基質および（ｄ）前記基質に対して触
   媒的に活性である酵素が支持されていて、空間的配置ま
   たは物理的状態によって少くとも前記コンジュゲートが
   前記アンチリガンドから分離されかつ前記酵素がその基
   質から分離されている構造を有することを特徴とする電
   極。 ８乙　特許請求の範囲第８４項記載の電極と未知量の検
   定すべきリガンド種を含有する媒質とを接触ぎせ、前記
   電極から受けた信号または信号の変化を測定して前記未
   知量をめる検定方法。