JPS60173465A - 新規なアフイニテイクロマトグラフイ用吸着体 - Google Patents

新規なアフイニテイクロマトグラフイ用吸着体

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JPS60173465A
JPS60173465A JP59029935A JP2993584A JPS60173465A JP S60173465 A JPS60173465 A JP S60173465A JP 59029935 A JP59029935 A JP 59029935A JP 2993584 A JP2993584 A JP 2993584A JP S60173465 A JPS60173465 A JP S60173465A
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田井　晰
Hiroshi Ozaki
宏 尾崎
Tsutomu Masuda
勉 増田
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なアフィニティクロマトグラフィ用吸着体
に関する。
更に詳しくは、活性化された担体に、α−位以外にもア
ミン基を有するし一文はＤ−α−アミノ酸を、そのα−
位以外のアミ７基を介して固定化した、遊離のα−アミ
ン基及び遊離のカルボキシル基の両基ｉ　１Ｊガツトと
して持ち合わせそいる、新規なアフィニティクロマトグ
ラフィ用吸着体及びその製法、並ひにこれを用いるセリ
／トランスヒドロキシメチラーゼの精製方法に関する。
近年、蛋白質の精製法の−として、アフィニティクロマ
トグラフィを利用する方法が一般に広く行なわれており
、その為のアフィニティクロマトグラフィ用吸着体が各
種開発され、実用化されている。
ｔ／ｃ、アフィニティクロマトグラフィを利用する酵素
の精製法に於ては、担体にアミノ酸を固定化した吸着体
が用いられている例も多い。
然しなから、これら従来から知られているアミノ酸全固
定化した吸着体は、いずれもアミノ酸のアミ７基又はカ
ルボキシル基のどちらか一方が固定化により塞がれてお
り、また、α−位以外にも官能基金もつα−アミノ酸を
固定化したものでもα−アミン基又はカルボキシル基の
一方がエステル、アミド等の形になっていで、遊離の形
では存在していないか、或いはこれらのいずれかの官能
基を・通じて担体と結合されており、遊離のα−アミン
基及び遊離のカルボキシル基の両基′ｆｆ：２つながら
りカ／ドとして持ち合わせるような吸着体は、これ１で
に全く認められなかった。
本発明者らは、アミノ酸を基質とする酵素を精製するた
めの、より一般的なアフィニティクロマトグラフィ用吸
着体を開発すべく、その為には、α−アミノ酸の特徴で
あるα−位炭素に於ける立体構造を有効に利用すること
がＴ１しいとの着想から、α−アミン基とカルボキシル
基とがいずれも遊離の状態で存在するような吸着体を調
製する必要があると考え、鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成するに到った。
本発明のアフィニティクロマトグラフィ用吸着体は、活
性化された担体を用い、α−位以外にもアミン基を有す
るＬ−又はＤ−α−アミノ酸を、そのα−位以外のアミ
ン基金介して固定化させたものであり、遊離のα−アミ
ノ基及び遊離のカルボキシル基の両基ｉ−ＩＪガ７トと
して持ち合わせている為、アミノ酸を基質とする酵素（
特にピリドキサール酵素）に対してのアフィニティクロ
マトグラフィに特に有効に用いられ、酵素の分離、精製
等に、その利用範囲は極めて広い。捷だ、本発明の吸着
体を用いたアフィニティクロマトグラフィは、α−アミ
ノ酸のα−位の立体構造を利用するアフィニティクロマ
トグラフィであるため、α−アミノ酸とし又Ｌ−アミノ
酸とＤ−アミノ酸のいずれかを用いることにより、夫々
、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸を基質とする酵素を、
選択的に分離することができる点に大きな特徴を有する
。
このように、α−位炭素に結合したアミン基とカルボキ
シル基が２つとも遊離状態で存在している吸着体は、こ
れまでに未だ知られておらず、本発明者らが初めて作り
出したものである。
本発明に用い得る担体としては、セルロース。
アガロース、デキストラ／、ポリアクリルアミド。
多孔性ガラス等のアフィニテイクロマトグラフイに於て
通常用いられている担体は、いずれも例外なく用いられ
るが、中でもアガロースが最もよく用いられる。アガロ
ース系担体の具体的商品としては、七フ７ｏ−ス（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社）、バイオゲルＡ　（ＢＩＯ−ＲＡＤ
社）等があり、テキストラフ系のものとしては、セファ
デックス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）。
七フアクリルｉ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ポリアクリ
ルアミド系のものとしては、工／ザフイノクスＰ（和光
紬薬■）、バイオゲルＰ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等
が夫々市販されているが、これらに限定されるものでは
ない。寸た、これら担体の活性化法は種々あり、特１（
限定されるものではないが、例えば、アガロ−ス系担体
の場合には、ＣＮＢｒによる活性化が最も一般的でよく
用いられる。捷だ、活性化アガロ−。
スとしては他にエポキシ活性化アカロース等もあるが、
同様に本発明に於て用い得ることはいうまでもない。
本発明に用いるα−位以外にもアミン基を有するα−ア
ミノ酸としては、例えば、リジン、オルニチノ、アルギ
ニ／、ｐ−アミンフェニルアラニン、α・ω−ジアミノ
カプロン酸、ω−クリシルリジン等のＤ体及びＬ体アミ
ノ酸今が挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。
本発明の吸着体の調製法は、例えば、α−位以外にもア
ミン基を有するα−アミノ酸としてＬ　−リ／／又はＤ
　−’Ｊリジン用い、活性化された担体としてＣＮＢｒ
活性化アカロースを用いた場合を例にして示すと下記の
とおりである。
即ち、Ｌ−’（又はＤ−）ＩＪリジン、塩基性炭酸銅、
又は塩化第二銅、硫酸第二銅の如き銅の鉱酸塩等と、弱
塩基性下、撹拌反応させて銅錯体とし、これｆＣＮＢｒ
活性化アガロースと、室温下（要すれば冷却下）、１〜
１０時間（要すれば一昼＆）振とう又は撹拌して反応さ
せ、次いで、未反応の銅イオン及びＬ−（又はＤ−）’
ＩＪジノを洗浄除去した後、ＥＤＴＡ　（エチレンジア
ミン四酢酸）水溶液等の脱銅イオン剤で洗浄することに
より゛、銅イオンを除き、要すれば、未反応のＣＮＢ　
ｒを除く為に、エタノールアミン水溶液等で洗浄し、目
的物を得ることができる。
本発明の吸着体は、通常０〜１０℃の低温で保存するこ
とが望ましい。
本発明の吸着体に於て、固定化されるα−アミノ酸の量
は、その吸着体の使用目的によって異なるが、通常、担
体である膨潤ゲル１ｒｎｌ当り、１〜１０μ−である。
本発明の吸着体は、一般に、アミノ酸を基質とする酵素
の分離、Ｎ製に幅広く利用され得るが、特にピリドキサ
ール酵素、例えば、Ｄ−アスパラギン酸オキシダーゼ、
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、リジンデヒドロゲナーゼ、
グリシ／アセチルトランスフェラーゼ、セリントランス
ヒドロキシメチラーゼ、セリンアセチルトランスフェラ
ーゼ、パリ７デカルポキシラーゼ、グルタミノ酸テカル
ボキシラーゼ、グルタミン酸・ピルビン酸トラノスアミ
ナーゼ（ＧＰＴ　）　。
グルタミン酸・オキザロ酢酸トラノスアミナーゼ（ＧＯ
Ｔ　）等に対してのアフィニティクロマトクラフィに特
に効果的に用い得ることが期待できる。
例えば、ピリドキサール酵素の−であり、生体内のアミ
ノ酸代謝、即ち＋　ｖｌすｙ：　ｘグリシノに重要す位
ｔｉｔ　ｋ　占める、セリントランスヒドロキシメチラ
ーゼの精製に関しては、これまでに、ラット肝からの抽
出より７エ程を経て、その比活性ｆ　Ｊ、６００倍まで
高めた（収率４％）という報告があるが（Ｐａ１ｅｋａ
ｒ　、　ＡＧ、ｅｔａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、　、　２４８　（４）　３１５８〜１１６７　
（１９７３）　）　、本発明の吸着体、即ち、Ｌ−リジ
ンをそのω−位のアミノ基でアガロースに′固定化した
吸着体（前記り一吸着体）を用いた精製法では、５工程
で比活性全４，８００倍まで高めることができる（収率
９４％）。
従来法及び不法についての精製順序及び収率を下記に示
す。
（ｉ）従来法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　Ｌ
４Ｊ１．１１５８　（１９７３））ラット肝抽出（比活
性９．８５　ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）→硫安分画→熱処理→
硫安分画→ＤＥＡＥセルロースカラム→セファデックス
Ｇ　−１５０カラム→ＤＥＡＥセルロースカラム（比活
性１５，５００　ｕｎｉｔｓ／ｍｇ、収率４％）（１１
）不法（前記り一吸着体使用） ラット肝抽出（比活性２．５５　ｕｎｉｔｓ／ｍｉ７　
）→熱処理→硫安分画→ＤＥＡＥセルロースカラム→本
発明のアフィニティ力ラム（比活性１２，２２９　ｕｎ
ｉｔｓ／ｍｇ、収率９４％） 尚、上記実験は、ラット肝由来のセリントランスヒドロ
キンメチラーゼに関して行なったものであるが、本発明
のアフィニティクロマトグラフィ用吸着体は、ラット肝
に限らず、如何なる動植物由来のセリントランスヒドロ
キシメチラーゼの精製にも用い得ることはいう捷でもな
い。
斯くの如く、Ｌ−リジンをそのω−位のアミン基で固定
化した本発明の吸着体は、セリントランスヒドロキシメ
チラーゼを特異的に認識（アフィニティ、吸着）するが
、一本、Ｄ−リジンをそのω−位のアミ７基で固定化し
た本発明の吸着体は本酵素に対し全くアフィニティを示
さない。このことは、本酵素の精製過程で、Ｌ−吸着体
のリガンドが、立体構造をも含めて本酵素の活性中心と
相互作用していることを示唆しており、本酵素の活性中
心を特異的に認識する効果的なアフィニティクロマトグ
ラフィであることを明確に示していらず、本発明の吸着
体を用い壬高度に精製した各種酵素は、要すれは、各種
マ）　ＩＪノクスに固定化させるなどして、アミノ酸合
成、ペプチド合成等の工業的分野や、肝機能検査等の臨
床検査の分野などに幅広く、且つ効果的に利用すること
が可能である。
以上述べたとおり、本発明は、新規で、且つ棲めて不用
なアフィニティクロマトグランイ用吸着体ケ提供するも
のであり、斯業に貢献するところ極めて大なるものであ
る。
以下に実施例を挙ける。
実施例Ｉ Ｌ−リン／塩酸１：！７２．６　ｍｇ　、塩化銅（）ｌ
）　２６．９　ｉ？　、炭酸水素ナトリウム１．２６　
ｆ　、　Ｊ。Ｎ水酸化す（・リウム８ｍｅｆフラスコに
入れ、０．５　Ｎ塩化ナトリウム水溶液を加えて全敗ｆ
　１００　ｍｌとし、撹拌して溶解させる。次いで、こ
れにＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア
・ジャパン■）　３　ｙ　２加ｉ　、　水を加えて全量
ｉ１５０ｍｌ！とじた後、室温下、５時間振とつする（
　ｐＨ８，０６）。反応後、未反応の銅イオン（１１）
及びＬ−リ／ノが検出されなくなるまで、水及び塩化ナ
トリウム水溶液で交互に洗浄する。（洗浄液の全敗は、
各５００ｍ１となる。）未反応原料ケ除いた後、０．０
１　Ｎ　−ＥＤＴＡ水溶液（全敗２５０ｍ１）で洗浄す
ることにより、銅イオンを脱離させる。全洗液中の銅イ
オンｔｋ定量することにより、相体に固定化されたＬ　
−ＩＪジ／の量を知ることができる。（２〜４μｍｏｌ
　／　ｍｅ　）脱銅イオノ後、５％エタノールアミン水
溶液（全敗２５０　ｍｅ　）で充分洗浄して、未反応の
ＣＮＢ　ｒ全除去する。水及び０．５　Ｎ塩化ナト’Ｊ
ウム水溶液で交互に洗浄して（洗浄液の全敗は、各５０
０ｍ１となる。）、目的とするＬ−’Ｊ／ノ固定化吸着
体（遊離のα−アミ７基及び遊離のカルボキシル基の両
基を、夫々リカ／１・とじて有する）　２９６　ｙ　２
得る。（Ｌ−吸着体）。生成物は１〜８℃で冷蔵保存す
る。
実施例２ 実施例１に於て、Ｌ　−ＩＪ　／ノ塩酸塩７２．６　ｍ
ｑを用　・いる代りに、Ｄ　−ｌ）　／ノ塩酸塩７２．
６　ｍｑを用いる以外は実施例１と全く同様にして、Ｄ
　−ｌ）　／ノ固定化吸着体２９６７を得る。（Ｄ−吸
着体〕。
実施例３　セリノドリンスヒドロキシメチラーゼの精製 ラット肝及びトウモロコン発芽体より調製したセリノド
ランスヒドロキシメチラーゼの粗酵素液を用い、実施例
１及び実施例２で夫々得られたＬ−吸着体及びＤ−吸着
体を用いて、アフィニティクロマトグラフィを行なう。
結果を第１図及び第２図に示す。
第１図及び第２図から明らかな如く、ｐＨ５，７〜７５
の１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したＤ−吸着体、及び
ｐＨ７，２以上で平衡化したし一吸着体は、ラット肝及
びトウモロコシ発芽体の本酵素に対しアフィニテ′イ全
示さないが（第１図及び第２図の　ＩＣ（ａ）　、　（
ｄ）　、　（ｅ）　、　（ｆ）　、　ｐＨ５，７−６，
８で平衡化したＬ−吸着体は、ラット肝及びトウモロコ
シ発芽体の本酵素全特異的に吸着する（第１図及び第２
図の（ｂ）。
（Ｃ））。
Ｄ−吸着体→いかなるｐＨでもアフィニティなし。１５
（タンパク、酵素活性−溶出ピーク 同じ） 溶出は、ラット肝の本酵素の場合は０．２　Ｍ　ＫＣｌ
　２０を含むリン酸緩衝液を、捷だ、トウモロコン発芽
体の本酵素の」場合はｏ、ｏｓ　ＭＫＣＩを含むす／醒
緩衝液を夫々使用。
尚、活性が存在するフラクシヨンについては、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドケル電気泳動がら、純粋なものに精
製されていることが確められた。
これらの実験結果から明らかな如く、ラット肝。
トウモロコン発芽体のいずれのセリ／トランスヒドロキ
シメチラーゼも、Ｌ−吸着体に対しては相互作用するが
、Ｄ−吸着体とは相互作用はせず、このことは、本酵素
の精製に於ては、■、−吸着体を用いることか必須条件
であることを示している。
【図面の簡単な説明】
第１図及び第２図は、夫々ラット肝及びトウモロコシ発
芽体から調製１〜だセリ／トランスヒドロキシメチラー
ゼの、Ｌ−吸着体、及びＤ−吸着体を用いた場合のアフ
ィニティクロマトグラフィを示し、（ａ）　、　（ｂ）
　、　（Ｃ）はＬ−吸着体を用いた場合の、捷た（ｄ）
　、　（ｅ）　、　（ｆ）はＤ−吸着体を用いた場合の
ものであり、（ａ）及び（ｄ）はｐＨ７，３の、（ｂ）
及び（ｅ）はｐＨ６，８の、（ｃ）及び（ｆ）はｐＨ６
，４の１０ｍＷＩす／酸緩衝液で夫々平衡化したときの
ものて、溶離液は、第１図の（ｂ）及び（ｃ）の場合は
、０．２　ＭＫｃｔｆ含むｐＨ６，８及びｐＨ６４の１
０＋ｙ＋Ｍリン酸緩衝液（イオン強１度４　＝　０．２
１）であり、第２図の（ｂ）及び（ｃ）の場合は、０．
０５　ＭＫＣｌを含むｐＨ６，８及びｐＨ６，４の１０
ｍＭリン酸緩衝液（μ：？−００６）を使用している。 寸だ、横１＃１１はフラツフＥ　ノ”ｔ　ｙ　バー　（
２，１ｍｅ　／フラクション）を示し、縦軸Ｃ−４９は
２８０　ｎｍに於ける吸光度を示し、←−４は酵素活性
値（ｕｎｉｔ）を示す。但し、上記酵素活性値（ｕｎｉ
ｔ）は、】分間にｌ　ｎｍｏｔのアセトアルテヒト’を
生成さぜるに要する酵素量ヲ］ユニットとした。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 手続補正書 ｌ　事件の表示 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　ＴＥ［，０３−２７０−８５
７１５補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄及び発明の詳細な説明の欄
。 ６、　補正の内容 （１）特許請求の範囲を別紙の通り補正する。 （２）明細書１０頁５行目に記載の「一本、」゛を「一
方、」と補正する。 （３）明細書１３頁１０行目から１１行目にかけて記載
の１（第１図及び第２図の（ａ）　、　（ｄ）　、　（
ｅ）　、　（ｆ）　、　ｊを［（第１図及び第２図の（
ａ）　、　（ｄ）　、　（ｅ）　、　（ｆ）　）、」と
補正する。 以上　゛ 別　紙 ２、特許請求の範囲 （１）活性化された担体に、Ｌ−又はＤ−α−アミノ酸
をα−位のアミノ基、カルボキシル基以外の置換基を介
して固定化して成る、α−アミノ基及びカルボキシル基
をそれぞれ遊離の状態で有する、アフィニティクロマト
グラフィ用吸着体。 （２）　α−位以外にもアミン基を有するし−又はＤ−
α−アミノ酸を銅の錯体とすることにより、そのα−位
の反応性を抑え、α−位以外のアミン基により活性化担
体と結合させ、次いて銅イオンティクロマトグラフィ用
吸着体の製法。 る、アフィニティクロマトグラフィ用吸着体を用いる、
セリントランスヒドロキシメチラーゼの精製方法。 以上

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　活性化された担体に、Ｌ−又はＤ−α−アミノ
    ＃をα−位のアミン基、カルボキシル基以外の置換基を
    介して固定化して成る、α−アミノ基及びカルボキシル
    基をそれぞれ遊離の状態で有する、アフィニテイクロマ
    トグラフイ用吸着体。
  2. （２）　α−位以外にもアミン基を有するし−又はＤ−
    α−アミノ酸を銅の錯体とすることにより、そのα−位
    の反応性を抑え、α−位以外のアミノ基により活性化担
    体と結合させ、次いで銅イオンを除くことから成る、特
    許請求の範囲第１項記載のアフィニティクロマトグラフ
    イ用吸着体の製法。
  3. （３）　特許請求の範囲第１項記載のアフィニティクロ
    マトグラフィ用吸着体を用いる、セリ／トランスヒドロ
    キシメチラーゼの精製方法。
JP59029935A 1984-02-20 1984-02-20 新規なアフイニテイクロマトグラフイ用吸着体 Granted JPS60173465A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104399283A (zh) * 2014-12-04 2015-03-11 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的制备方法
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