JPS5838150B2 - カリクレインの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、カリクレインの精製方法に関するものである
。

更に詳細には、本発明は、哨乳動物臓器より得られるカ
リクレインを簡単に且つ大量に高純度に精製する方法に
関するものである。

一般に、カリクレインは動物生体内各所で生産される一
種の蛋白分解酵素として知られている。

カリクレインは血漿中のキニノーゲンから活性ペプチド
、キニンを特異的かつ、すみやかに遊離させるキニン遊
離酵素としての活性を有しているが、循環器系疾患の治
療剤として有効であることが分って注目されるに至って
いる。

そして、医薬としてのカリクレインの需要は、近年増加
の一途をたどり、特に高純度カリクレインの安価にして
多量生産が切望されるようになった。

しかしながら、カリクレインは、給源として動物臓器を
原料とするため、共存する異種蛋白質が非常に多く、高
純度カリクレインを得るのはきわめて困難である。

従来のカリクレインの精製方法としては、硫安塩析、溶
媒沈澱、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交
換クロマト、ケル済過等の組合せを行う方法、高価な試
薬であるインヒビターを用いるアフイニテイークロマト
を行う方法等があるが、これらいづれの方法においても
、精製されたカリクレインを安価にして、かつ、多量生
産する工業的方法としては確立されていないＯ 本発明者らは、より簡単な方法で効率的なカリクレイン
の精製方法を求めて研究したところ、一般式ＣＨｓ （
ＣＨ２ ） ｎ ＮＨ２ （ただし、ｎ＝ｉ〜９）で
表わされる化合物を水不溶性担体に結合させたＣＨｓ
（ ＣＨ２ ） ｎ−水不溶性担体結合物（アルキルー
水不溶性担体）に、カリクレインが特異的に吸着し、か
つ容易に溶離されることを認め、安価にして高純度なカ
リクレインを得ることに成功し、本発明を完成したもの
である。

本発明においては、まず、一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＮ
Ｈ２（ただし、ｎは１〜９を示す）で表わされるアルキ
ルアミンを水不溶性担体に結合させて ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ一水不溶性担体結合物（ただし、ｎ
は１〜９を示す）が調製される。

ここに用いるアルキルアミンとしては、メチルアミン、
エチルアミン、プロビルアミン、ブチルアミン、ペンチ
ルアミン、ヘキシルアミン、ヘプチルアミン、オクチル
アミン、ノニルアミンがあげられる。

また、水不溶性担体としては、不活性で疎であり、不溶
性であり、しかも親水性であるような不溶性担体でなけ
ればならず、例えば、アガロース（登録商標セファロー
ス：ファルマシアファインケミカル社製）、デキストラ
ン（登録商標セファデツクス：ファルマシア・ファイン
ケミカル社製）、セルロース・パウダー、ポリアクリル
アマイドゲル（登録商標バイオゲル：バイオラド社製）
などが用いられる。

結合反応は、まず、水不溶性担体をプロムシアン、過ヨ
ウ素酸ナトｌ）ウムなどで活性化し、これにアルキルア
ミンを添カロした緩衝液を添カ目することによって達威
される。

ここにＣＨ３（ＣＨ２）ｎ水不溶性担体結合物（ただし
、ｎは１〜９を示す）が得られる。

ここに得られるＣＨ３（ ＣＨ２ ） ｎ 一水不溶
性担体結合物に任意のｐＨ１好ましくはｐＨ ４． ５
〜６においてカリクレイン含有液を接触させ、カリクレ
インを吸着させる。

ここで、カリクレインのみがＣＨ３（ＣＨ２）ｎ −
水不溶性担体結合物に吸着され、カリクレイン含有液に
は普通含まれているキニナーゼは全く吸着されずに流下
してしまうので、一回の吸着操作だけでキニナーゼを含
まない高純度カリクレインを得ることができるものであ
る。

カリクレインを吸着した担体結合物は、任意のｐＨ１好
ましくはｐＨ ４． ５〜６で０． ２ Ｍ以上の食塩
などの電解質を含む溶液もしくは、ｎ−プロパノールな
どの疎水性化合物を含む溶液にてカリクレインを溶離せ
しめることができる。

カリクレイン含有液に含まれるキニナーゼは、この吸着
担体に全く吸着されず、この精製方法によれば１回の操
作でキニナーゼを含まない高純度カリクレインを得るこ
とが出来る。

なお本発明の試験例及び実施例において用いた活性測定
法は次の通りである。

１，カリクレインの生理活性 守屋等の方法〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リ−（Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，），５８巻、２０１頁（１
９５６年）〕に従って行った。

２．プロテアーゼ活性 クニツツ（Ｋｕｎｉｔｚ）の方法〔ザ・ジャーナル・オ
ブ・ゼネラル・フイジオロジ−（Ｊ．Ｇｅｎ ．Ｐｈｙ
ｓ ｉｏｌ ， ）、３０巻、２９１頁（１９４７年）
〕に準じてカゼイン分解活性をプロテアーゼ活性とした
。

３．キニナーゼ活性 合成ブラジキニンを基質として、３０′Ｃ１２５分反応
し残存ブラジキニン量によるモルモット回腸の収縮から
分解されたブラジキニン量を求め、キニナーゼ活性とし
ｎｇ ＢＫ ｄｅｃｏｍｐ．ｍｉｎ／ＫＵで値を表示し
た。

次に本発明の試験例及び実施例を示す。

試験例 ｌ パンクレアチンを水に懸濁させ、４８℃、１時間水抽出
後、アセトン分画を行い、これを水に溶解し、ｐＨを５
．０に調整し、生じた沈澱を除いてカリクレイン含有液
を得た。

一方、セファロース４Ｂをプロムシアンで活性化し、こ
れに ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＮＨ２ （ｎ＝１〜９）のそれぞれ
を共有結合させてアルキルーセファロース〔ＣＨ３（Ｃ
Ｈ２）ｎ−セファロース（ｎ＝１〜９）〕を得、これを
カラムに充填し、ｐＨ５．０の２０ｍ■詐酸緩衝液で平
衡化する。

これに、上記カリクレイン含有液を通液し、ｐＨ５．０
の２０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄後、０．２ＭＮａＣｌを含
む同緩衝液および０． ５ Ｍ ＮａＣｌｌを含む同緩
衝液で溶出を行った。

この結果を表１に示す。表１から明らかなように、いず
れの吸着担体にもカリクレインは吸着され、塩濃度を変
化させることによって溶出されることが認められる。

同様な結果がｐＨ４．０ ， ８．０などいづれのｐＨ
においても得られるが、ｐＨ８．０付近は、共存するプ
ロテアーゼであるトリプシンなどの作用最適ｐＨであり
、カリクレインが、これらプロテアーゼにより分解・失
活してしまうので、あまり好ましいｐＨではない。

又、ｐＨ４．０付近においては、カリクレインの安定性
が悪く徐々に失活してゆく。

従って、プロテアーゼが作用し難く、又、カリクレイン
の安定性も良いｐＨ ５． ０付近で行うのが最も好ま
しい。

試験例 ２ 試験例１と同様にしてセファロースにヘキシルアミン〔
ＣＨ３（ＣＨ２），ＮＨ２〕を共有結合させ、ヘキシル
ーセファロース〔ＣＨ３（ＣＨ２），−セファロース〕
を得、これをカラムに充填し、ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢
酸緩衝液で平衡化する。

これに試験例１と同様にして得たカリクレイン含有液を
通液し、５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ５．０の２０ｒｎ
Ｍ酢酸緩衝液で洗浄後２０％エタノールあるいはｎ−プ
ロパノールを含む同緩衝液、４０％エタノールあるいは
ｎ−プロパノールを含む同緩衝液、ついで、０．２ＭＮ
ａＣｌｊを含み、４０％エタノールあるいはｎ−プロパ
ノールを含んだｐＨ ５． ０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で
溶出を行った。

この結果を表２に示す。表２に示す如く、カリクレイン
は、エタノールでは溶出されないが、ｎ−プロパノール
により溶出されることが認められる。

又、試験例ｌと異なりｎ−プロパノーノレを添刀目する
ことにより、ＮａＣｌ濃度が０． ２ Ｍでカリクレイ
ンが溶出されてくる。

これは添加したｎ−プロパノールによりカリクレインと
吸着担体との間の疎水結合力が弱められたために、カリ
クレインが溶出され易くなったものと考えられ、エタノ
ールで溶出されないのは炭素鎖がｎ−プロパノールに比
較して短かいために、そのような作用が弱いためと考え
られる。

このように食塩などにより塩濃度を高めるだけでなく、
ｎ−プロパノールのような疎水性化合物を緩衝液に添加
することによってもカリクレインを溶出することが出来
ることがわかる。

実施例 １ セルロース・パウダーを過ヨウ素ナトリウムで活性化し
、これにヘキシルアミン〔ＣＨ３（ＣＨ２）５ＮＨ２〕
を共有結合させてヘキシルーセルロース（ＣＨａ （Ｃ
Ｈ２）５ーセルロース〕を得、５００ｍｌをカラムに充
填し、ｐＨ ５． ０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化す
る。

一方、豚膵臓脱脂粉末２．５ｋｇを２５１！の水に懸濁
させ、４８℃、１時間熱水抽出後、アセトン３５〜５５
％の分画沈降を行い、得られる沈澱を水に溶解後、６Ｎ
−酢酸にてｐＨ ５． ０とし生じる濁りを口過してカ
リクレイン含有液４．１を得た。

このカリクレイン含有液を上記へキシルーセルロースに
通液し、カリクレインを吸着させ、２００ｍＭのＮ ａ
Ｃ ｌｊを含ｍＨ ５． ０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で
洗浄後、５００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ ５．０の２
０ｍＭ酢酸緩衝液で該吸着体からカリクレインを溶出し
、溶出液２．５ｌを得た。

この溶出液を脱塩・濃縮後、凍結乾燥を行い、精製カリ
クレイン２．３ｇを得た。

精製カリクレインの生理活性を測定したところ８０Ｋｕ
，勾であり、キニナーゼ活性は、７．０ｎｇＢＫｄｅｃ
ｏｍｐ． ／ｍｉ ｎ／Ｋｕであった。

実施例 ２ 豚生膵臓１０ｋｇをミンチ後１０ｌの水に懸濁させ４８
℃、１時間抽出後、エチルアルコール２０〜７０％にて
分画沈降を行い、得られる沈澱を水に溶解後６Ｎ一酢酸
にてｐＨ ５． ０とし生じる濁りを口過しカリクレイ
ン含有液６ｌを得た。

一方試験例１と同様にしてプチルーセファロース〔ＣＨ
３（ＣＨ２）３−セファロース〕を得、５００Ｍをカラ
ムに充填し、ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化
する。

上記カリクレイン含有液を該カラムに通液し、２００ｍ
ＭＮａＣｌｊを含むｐＨ ５．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液
で洗浄後、５ ０ ０ｍＭ ＮａＣ／ｌを含むｐＨ ５
． ０の２０ｍＭ酢酸緩衝液でカリクレインを溶出し、
溶出液２．５ｌを得た。

溶出液を脱塩濃縮後、凍結乾燥を行い精製カリクレイン
２．１．９を得た。

精製カリクレインの生理活性を測定したところ８５Ｋｕ
／１ｎ？であり、キニナーゼ活性は１ ０ｎｇ ＢＫ
ｄｅｃｏｍｐ．／ｍｉｎ／］Ｋｕであった。

実施例 ３ 豚膵臓脱脂粉末１ｋｇを１０ｌの水に懸濁させ、６Ｎ−
酢酸でｐＨ ５． ０とし４℃、３時間抽出した後、抽
出残渣を口過によって除き、抽出液１０７を得た。

一方セルロース・パウダーを過ヨウ素酸ナトリウムで活
性化し、オクチルアミン〔ＣＨ３（ＣＨ２）７ＮＨ２〕
を共有結合させオクチルーセルロース（ＣＨ３（ Ｃ
Ｈ２）？セルロース〕を得、４００ｍ！！をカラムに充
填し、ｐＨ ５． ０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化す
る。

該カラムに上記カリクレイン含有液を通液し、−カリク
レインを吸着させるｏ２００ｍＭのＮａ Ｃｌｌを含む
ｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄後、５００ｍＭ
のＮａＣｉｌを含むｐＨ ５． ０の２０ｒｒＭ！＃−
酸緩衝液で溶出し、溶出液２ｌを得た。

溶出液を脱塩濃縮後、凍結乾燥を行い、精製カリクレイ
ン１．０ｇを得た。

精製カリクレインの生理活性は８０ＫＬＩ／■であり、
キニナーゼ活性は６．５ｎｇ ＢＫ ｄｅｃｏｍｐ，／
ｍｉｎ／Ｋｕであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＮＨ２（ただし、ｎ
   は１〜９を示す） で表わされるアルキルアミンを水不溶性担体に結合させ
   た ＣＨ３（ＣＨ２）ｎ−水不溶性担体結合物（ただし、ｎ
   は１〜９を示す） に、カリクレイン含有液を接触せしめ、カリクレインを
   特異的に吸着せしめ、しかる後、吸着したカリクレイン
   を溶離せしめることを特徴とするカリクレインの精製法
   。