JPS6018011B2 - 癌関連ポリペプチド抗原の検出法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は「単一特異性を示しそして異なる位置の多種多
様の人類に存在する、癌関連抗原を検出する問題に関す
る。

人瓶腫賜標本を投与した動物かち得られた血清中の腫咳
反応性抗体の存在を実証しようとする多くの試みがこれ
までなされてきた。

そのようなデモンストレーション（実証）が恒常的に再
現可能となったならば、それは、正常組織中には存在し
ない重要な抗原の人漣組織中における存在を示すであろ
うし、したがって新生物質生成の過程の性質のより良い
理解に到達せしめるであろう。糠疾患のより良い理解の
目的で単一特異性の溝関連抗原の存在を発見し、そして
何よりもそのような抗原の再現性ある単灘精製法を発見
する目的で人縄組織を研究した。絹腸および消化器系の
脇擬に関連した抗原の存在はゴールド等により示されて
いる（Ｊ。

ＥｘぬＭｅｄ．，１２１（１９６５）〜 ４３９〜４６
２、Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．，１２２（１９６５）も４
６７〜４８７参照）。これらの報告においては「上皮起
源のすべての既知の悪性腰湯の大部分のものに共通の人
癌関連抗原の存在を示すＢＢＪｏｒｋｌ皿ｄによる以前
の研究も参照されている（車ｎｔｅｍａｔ．〜ｃｈ．山
１ｅｒのとＡｐｐｌ．ｌｍｍｕ血１．，（ｉ９６６）８
〜１７９および（１９＄）１２「２４１参照）。フリー
マン等の米国特許第３６６３６８４号明細書は〜 いわ
ゆる「ＣＥＡ活性」を示す癌胎生期抗原を記鱗している
。しかしこの抗原は、本発明の抗原とは全く異なるもの
であり、このことは本明細警中で以後に詳細に示される
であろう。実際的なそして商業的に有用な抗原それ自体
ならびにそれの種種の樺性疾患とのそれの関連物の単離
はこれまでに達成されていない。

すなわち実際的なそして再現性ある方法による人癌関連
抗原の単離および特性決定はこれまで不可能であった。
そしてまた大規模な検査に適当な診断的手段による潜在
するかまたは頭性癖疾患に確患している人の血中の抗原
の存在を確定することまたはその存在を示すことさえも
不可能であった。診断用剤として動物抗血清中の種凝関
連抗原に特異的な抗体の存在を完全に利用する目的のた
めには、患者の血中に腫嬢抗原の存在を示す試験法が開
発されなくてはならない。

これまで提案された方法は、蓮疾患の存在に関して、あ
る種の診断をしようとする場合には不充分であることが
証明されている。本発明の主目的は、人瞳湯組織または
そのような抗原を含有する他の組織から出発して「漣関
連抗原を検出する方法を提供することである。

特許請求の範囲を含めて本明細蟹の開示においては、「
麓関連ポリベプチド抗原」なる表現は勺ＣＡＰＡと略記
される。本発明の他の目的および特徴的態様は、一般的
表現ならびに特定的実施例による本発明の以下の記載か
ら明白となるであろう。

ＣＡＰＮ唐性を有する物質は、本発明の方法によって解
剖からの窓性組織をホモゲナイズすることにより単機精
製されるが、その場合種種のタイプおよび位陣の理性細
綾が集められて蝿磯のプ…ルを形成される。

それに代る出発物質は〜人胎盤からの組織または生体内
の悪性細胞の培養物である（そのような培養の詳細につ
いてはＢ．ＢＪｏｒｋｌｕｎｄ等のＪ．Ｎａｔ．Ｃａｎ
ｃｅｒｌｎｓｔ．２６〜 ５３３〜５４５（１９６１）
〜ｒＡｎｔｉ鉾ｎｉｃｉｔｙｏｆＰｏｏｌｅｄ Ｈｕｎ
燈ｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｎｄＮｏｎｈａＩ
ＴｉＳＳ雌ｓｂｙ Ｃ〆ｏｉｍｍ皿ｏｌｏｇｉＣａ
ＩＴｅｃｈｎｉｑｕｅ ｍ、種場抗原の分布」参照）。
凍結状態である間に癌および正常組織を別別に約０℃の
温度を有する水と混合しもそして関係するＣＡＰＡの不
活性化を起すような過剰の摩擦熱を生じさせないような
方法でホモゲナイズする。この懸濁液の温度は約０℃以
上に上昇させるべきではない。液体ホモゲネートと固体
との縛られる冷混合物をｖ館質例えば中性脂肪を溶解し
うる有機溶媒例えばアセトンまたは酢酸エチルと約０℃
以下の温度で混合するが、この溶媒処理はなかんずくリ
ポィド性物質を除去することおよび抗原性基の露出性を
増加させることを目的としている。

固体分を混合物から適当には遠０分離により分離し「水
および溶媒層を捨てる。この温度は約４℃を越えるべき
ではない。回収された固体分を凍結乾燥し〜 そしてそ
の凍結乾燥した組織粉末をたとえばステンレススチール
ボールミルの中で低温好ましくは約０℃以下そして適当
には約一７０ｑｏ以下の温度で粉砕する。

この粉砕の結果、微細な灰褐色粉末が生成する。所望に
より、得られた粉末を塩溶液例えば食塩水で中性軸にお
いて低温適当には約０℃で抽出ししそして遠心後の上燈
液は捨てる。得られた沈殿を冷水に懸濁させｔその沈殿
を回収しそして凍結乾燥することができる。得られた粉
末は、約４℃において密閉ぴん中で何年も保存すること
ができる。前記ポリベブチド含有瞳糠および正常組織粉
末をアルカリ性恥の舷○で抽出する場合〜その抽出液は
中性または微アルカリ性対でＮａＣＩを添加すると濁っ
てくる。

この濁り‘ま、主として核醸の性質をもつ不純物の存在
による。食塩水処理した抽出液を遠Ｄした後にもすべて
の活性は透明な上燈液中に残留する。この上燈液を、酸
性ｐＨ適当には約４．８で等麗点沈殿させ、そして得ら
れた沈殿を約７．０のｐＨの水性燐酸緩衝溶液に溶解さ
せる。前記操作から得られた溶液を、１０×１ぴ〜２０
×１ぴ特に約１５×１ぴを包含するＭＷ範囲を有する化
合物の分別を可能ならしめるビーズ形の適当な分子ふる
い型のゲルでろ過し、このろ過ゲルをほぼ中性ｐＨのバ
ッファーで溶出し「 そして１０×１ぴ〜２０×１びの
特に約１５×１ぴのＭＷ分画を回収する。このゲルまた
はふるいは、ポリアクリルアミドゲル「交叉結合デキス
トランゲル、寒天およびアガロースゲルおよびこれらと
等価のゲルまたは分子ふるい例えばビオゲルＡ−５仇ｈ
（西独ビオラド。ラボラトリーズのアガロースゲルの藤
品名〜１００〜２００メッシュ、除去限界（ダルトン）
５０×１ぴ、分画範囲（ダルトン）１び〜５０×１ぴ、
大体のアガロース合童２％）またはセファローズが（ス
ヱーデン国ファルマシア・ファインケミカルズのアガロ
ースゲルの商品名、６０〜３００ミクロンのビーズ、分
函範囲１び〜２０×１び、大体のアガロース含量２％）
から選ぶことができる。そしてこのゲルは、約７．０の
ｐＨの適当な緩衝溶液例えば１：１０に希釈したゼーレ
ンセンのバッファー（１／１５Ｍの燐酸ナトリウムおよ
びカリウムに基つく緩衝溶液）で平衡化させる。このゲ
ルろ過に使用されるふるいまたはゲルの種類は臨界的で
はなく、そしてこれに関する唯一の要件はそれが上記に
確認した分子量範囲の内の化合物の分画を与えうるとい
うことだけである。本発明の目的に有用な他のゲルは、
．ビオゲルＡ−１５仇ｈ（ピオラド。ラボラトリーズ製
、１００〜２００メッシュ、除外限界（ダルトン）１５
０×１ぴ分画範囲（ダルトン）１ぴ〜＞１５０×１ぴ）
である。ゲル分画技術に関するそれ以上の詳細に関して
は、エイチ・デターマン著「ゲルクロマトグラフイー一
（スプリンガーフエアラーク社１９６７年版）を参照さ
れたい。このろ過に使用される溶出液は、約７の州の緩
衝溶液であり、そしてこの溶出液においては、抗原活性
は前記ＭＷ範囲を含有する分画中に見出される。前記分
画を回収する。前記ゲルろ過から沈殿させた活性分画を
、約７．０の解の適当なバッファー例えば１：１０に希
釈したゼーレンセンのバッファー中に溶解させ、そして
得られた溶液を弱いイオン交換性を有する弱イオン交換
体分子ふるい型のゲル例えばポリアクリルアミドゲル例
えばビオゲルＰ−２（以下に定義する）を充填したカラ
ムを通してろ過する。

このカラムは約７．０のｐＨの同様のバッファーで平衡
化させてある。抗原活性をを示す分画は、このカラムか
ら出てくる溶液の最初の分画であることが発見された、
この分画を回収する。前記ビオゲルＰ一２のクロマトグ
ラフィーから回収された分画をしＣＡＰＡのそれ以上の
精製のために開発された特別の操作にかける。

原則としては「この操作は次の段階を包含している。す
なわち蛋白質または複合蛋白質の混合物を、斑の等亀点
調節により沈殿させる。これにより得られた沈殿をここ
にある蛋白質混合物を考慮して選んだ適当なゲルと混合
する。得られた沈殿とゲルとの混合物を同一の等鷺点ｐ
Ｈすなわち前段階で蛋白質を沈殿させるべき蛋白質等電
点であるＰＨをもつ同一ゲル含有カラムの頂部におく。
次いでこのカラムを斑を徐徐に上昇または下降させつつ
溶出にかける。溶出液において回収されるべき単数また
は複数の分画は、所望の単数または複数の蛋白を含有す
るものである。本発明の方法は、いずれの特定の理論に
よっても拘束されるものではないが、蛋白混合物の分子
種の分離は次のように説明することができると信じられ
ている。

沈殿した蛋白質は溶液中で次次と蛋白質を連こぶイオン
の流れにさらされる。

種種の蛋白の可溶化に要する時間は、イオン強度「ｐ比
温度および流速に依存する。各各の溶解した蛋白質の分
散定数は、イオン勾配のそれより低いので、蛋白質は勾
配よりも速やかにゲル中に移行する。その結果として、
この蛋白質は再沈殿し、そして近づいてくるイオン前線
により再溶解されるまで静的（定常）状態にある。この
過程はそれ自体無限にくりかえされ、したがって互いに
わずかだけ異っている分子種同志の分離が行われる。ビ
オゲルＰ−２は、約２０００の分子量除去限界を有する
交叉結合したポリアクリルアミド（１００〜２００メッ
シュ）であるが、しかしこの除去限界は臨界的ではない
。

他の有用なゲルは交叉結合したデキストランゲル例えば
セフアデツクスＧ一２５であるが、これは約２５ ００
０の分子量除去限界を有している。しかしこの除去限界
は臨界的ではなし、Ｑ これらゲルは分子ふるいタイプ
のものであり通常ビーズ形で使用される。少くとも約２
ＱＯＱ〜３０００の分子量除去限界を有するそのような
ふるいタイプのゲルはいずれも満足に使用できる。本発
明により勾配溶出と組合わせたゲルろ過に適当な分子ふ
るいタイプのゲルの総説に関してはもゲロット著ｒニュ
Ｗヅゞイオケミカル。セパレーションズ」の「ゲルろ過
による蛋白〜べプチドおよびアミノ酸の分画一（バン・
ノルストランド社１９６４年版）を参照されたい。前記
クロマトグラフィーから回収された正常およびＣＡＰＡ
分画をｔ約５の斑で活性物質沈殿にかける。この沈殿を
回収しも約８．５のｐＨを有する承中に溶解させる母次
いでこの透明溶液のｐＨを蟻酸で酸性ｐＨ適当には約５
。０とする。

この処理は沈殿を生成させるＱ各沈殿を〜前述のよう
に約５．０の舟においてＨＣＯＯＨ−ＨＣＯＯＮＨ４で
平衡化した同様のゲルのスラリーと混合する■ これら
混合物協各各を前記のように平衡化させてあるゲ小カラ
ムの上におく。この沈殿の港出のためにはもこの場合に
は漸進的に減少するｐＨを有するｐＨ勾配が使用された
■適当なバッファー系はもＨＣＯＱ８−ＨＣＧＱＮ８４
おぷびＮＨ４ＨＣＱ３一Ｎ協である。

抗原活性はも最初のｐＨから約３のｐＨ範囲内の流世溶
液中に見出さねる。前記に同定されたｐＨ範囲内で回収
された流世分画は所望のＣＡＰＡを含有してお■〜 こ
れは凍結乾燥により回収しうる。

前記流出分画のＣＡＰＡの精子量を確定する目的でもこ
の分園を約３０のｐＨのＨＣＯＯＨ−ＨＣＯＯＮＨ４で
平衡化させたゲルカラム上でのる週にかけることができ
る。このゲルは鮒記に掲げたものから選ばれるがちピオ
ゲル晋一３■（ビオラド。ラボラトリーズからのポリア
タリルアミドゲルの商品名ｔｌｏｏ〜２００メッシュ「
除去限界（ダルトン）４０，０００分画範囲（ダルトシ
）２，５００〜４０，０００）およびセフアデツクスＧ
一体またはＧ−５Ｑ（フアルマシア。フアインケミカ池
ズのデキストランゲルに対する商品名も４Ｑ〜１２■お
よび５０〜１５Ｑミクロント分画範囲はそれぞれ３〜７
０８ ０００およびＸ〜３０９ ０００）がもこのろ過
を毎うのに特に適当なゲルである。約２２９〜約２３斑
風の範囲内の分光吸収ピーク波長を有しもそして約２０
，０００〜約２７８ ０００の分子量を有するＣＡＰＡ
の港出分園が回収される。ＣＡＰＡはろ過後に凍結乾燥
させることによりこの活性分画から回収することができ
る。

そして真空下に冷脂所では長時間保存することができる
。単機された物質は過蟻酸との処理により示されるよう
にも単一べブチド銭を茎にするポリベプチド‘とより藤
成されている。 このＣＡＰＡは塩基性反応を示し〜そ
して約１〜３円５の範囲内の柵には可溶性である。この
保護されていないポリベプチドは〜 中性ｐＨすなわち
約４．５以上のＰＨでは「非可逆的に変性する。この抗
原は吸湿性でありそれが湿気を吸収すると葵変し且つ不
３舌性化され「 そしてべとべとした状機となる。精製
されたＣＡＰＡは約２鎌が肌の波長で活性化されその間
約３５腕皿の波長の光を発光する蟻光性基を含有してい
る。

この蛍光（フルオレッセンス）ほＣＡＰＡの豊に比例Ｌ
〜 その単離操作の間にポＩＪべプチドの存在を判定す
る目的に使用しうる。このＣＡＰＡは〜約２２９〜約２
３紬ｍの範囲内の波長において分光ピーク吸収を示す。
更にそれは大なる凝集化額向を示しｈ滅菌のために使用
される通常のろ過媒体上ではろ過できない■ＣＡＰＡが
癌細胞壁から由来しているということが確認された。
その理由はｖＣＡＰ公を生きている動物体中に注射する
ことによね生成きねた抗体はも癌細胸をもそのような抗
体の影轡下においた場合には生体内における癌細胞の完
全な溶解または分解を超させるからである■前記のよう
にこのポリベブチドは２■ＱＯ■〜２再軒 ＱＯＯの範
囲内更に詳しくは約２傘＄０００の分子量を有している
。

分析によるとそれが炭水化物を全く含有していないこと
を示Ｌもそして分光光度測定はＣＡＰＡが核酸を全く含
有していないことを示す。酸化を行いまたは行なうこと
ないこアミノ酸分析機によってて実施した分析ばちビオ
ヂルぽ一３０またはその相当物上でのゲルろ過により推
定される分子量との一致を示す■単機されたＣＡＰＡは
も多くの用法例えば単一特異性抗体製造に診断目的にそ
Ｌて免疫学的方法にも免疫剤として有用な組成物中の活
性成分とＬて使用することができる野瀬関連ポリベプチ
ド抗原に関Ｌて単一特異性である抗体製造に関して新規
の方法が開発された。

前記のように保護されても、ないＣＡＰＡ鼻ふ中性ｐ理
で非可逆的に変性する。このことは、ＣＡＰＡの酸性溶
液を生存動物体内へ注射すると中性の体液にＣＡＰＡが
接触した場合、瞬間的にその変性を生ずることを意味し
ている。そのような変性を防ぐためには油乳剤が製造さ
れるが、その場合約２〜約３の範囲内のｐＨのＣＡＰＡ
の水性溶液が油棺にとりかこまれた封入相を構成してい
る。そのような油乳剤を生きている動物体に注射した場
合には、ＣＡＰＡの酸性水溶液は、それが中性の体液と
接触した場合にも、それを囲む油相により保護されてい
る。このようにしてＣＡＰＡはその生体内活性を保持し
、そして抗体産生細胞にまで運ばれることができる。中
性ｐ則こおいて試験管内（ィンビトロ）抗原活性を保持
する方法は、ＣＡＰＡを不活性蛋白例えば人または牛ア
ルブミンと鰭化させることにある。

そのような方法を利用することにより、中性ｐＨで漆性
であり且つその試験管内抗原活性を保持したコンプレッ
クスが形成される。縄診断に関しては、修正された血球
凝集阻害技術が開発された。

この技術は、その興味の対象の材料例えば患者血清「組
織、分泌物および例えば生検材料、外科標本、穿刺およ
び塗抹藤本を含む生きた動物体からの抽出物を検査する
ことにより、種種の癖進行段階におけるＣＡＰＡの存在
を測定することを可能ならしめる。この新規の修正した
血球凝集阻害技術は次の段階すなわち、ａ 連続希釈に
より検査に供する一連の材料の試料を製造すること、ｂ
前記試料の各各にＣＡＰＡに特異的な抗体を含有する
抗血清を前以つて決定した量で加えること、ｃ 培養後
、前記培養試料の各各に微粒状迫体に支持されたＣＡＰ
Ａを前以つて定めた蔓で加えること、ｄ ここに得られ
た一連の処理試料を、漸進的に減少する量の阻害を与え
るＣＡＰＡと、前以つて定めた量の前記抗体を含有する
抗血清との一連の対照試料と比較し、その後で前記対照
試料の各各に前以つて定めた量の同機の微粒状担体に支
持されたＣＡＰＡを加えること、およびｅ 前記一連の
試料と前記対照試料とを比較することにより検査材料中
のＣＡＰＡの量を確定することよりなる諸段階を包含す
る方法に存する。

本発明はまた生体内で活性な免疫剤として有用な組成物
をも提供するが、この組成物は本明細書中に定義されて
いるＣＡＰＡを薬理学的に許容しうる迫体と共に包含し
ている。

次の非限定的実施例によって本発明をここに更に詳細に
記載する。

例 １ 純粋抗原の単離 ほとんどの短組織が本発明の抗原を含有するということ
が示されて以来（ｌｎｔ．Ａｒｃｈ．ＡＩｌｅｒｇｙ３
６，１９１〜２０３（１９６９）参照）種々のタイプの
そして種々の部位からの癌組織が集められて、睦擬プー
ルが形成されている。

この場合このプールは次の器官（死体解剖）からの巨視
的に純粋な組織学的に証明された糠瞳組織からつくられ
たものであった。すなわち器官としては乳房「気管支、
盲腸、結腸、十二指腸、たんのう、腎臓、喉頭、肝臓、
肺、食道、卵巣、聡豚、前立腺、直腸、胃、子宮であっ
た。正常組織を多数の個体から集めて同種抗原、組織抗
原および個個の抗原のプールを確立した。死体解剖例を
使用し、そして腫場診断を組織学的に説明した。さらに
新鮮な腫嬢組織と生きている瞳湯細胞との免疫学的交叉
反応性の故に、関連する種場抗原がそのままであること
を確立した。可能な限りはすべての場合に無菌的な配慮
がなされた。死体解剖からの損種賜の組織および正常な
組織を隣接する組織からされいに別個に切除しそして２
〜３弧の立方体に切り、これを０℃で０．９％伍ＣＩで
血液のしみがなくなるまで洗った。

この洗った立方体を凍らせそして−２４ｑｏで保存した
。まだ凍った状態にあるうちに、この組織の立方体を凍
らせた組織１夕当りｌｏｗ【の比○と０℃において混合
し、回転ナイフを有する冷却したＭＳＥアトミックスー
ホモゲナィザー中で、１分ずつ３期間「半速」でホモゲ
ナイズした。この関係において懸濁液の温度は約０℃好
ましくは前記温度より少し低い温度に保たれるべきであ
ることが観察される。この冷ホモゲネートを冷却したｌ
ｏｏ０の‘のポリテンびんに注いだ。

‐２０ｑｏで４００私の懸濁液および４００の【のエチ
ルエテール（スエーデン国ボムルスクルトフアブリケン
・アクチェボラグ製の０．００２％ジフェニルアミン含
有のナルコシン添加エー７ル・蛇中性）を各々のばん中
で混合し「そして１２び分間一２℃でインターナショナ
ルＰＲ遠心振とう部品中で、３０皿ＰＭのモータ‐速度
で櫨押した。この混合物を５分間−２℃で１０００×Ｇ
で途心した。この段階の間には液体層は組織層とは混合
しない。ェチヱーテルと脂質とを捨て、そして第２の抽
出を６０分間行ない、つづいて５分間遠心し、そしてエ
ーテル‐脂質層の除去を行なった。最後に１０００×Ｇ
の遠心を−２℃で３０分間行ない「そして水層を除去し
たが、ただしこれにはいくらかのＣＡＰＡを含有してい
た。残存する不溶性物質はとっておいた。残存エチルエ
ーテルは５分間真空を適用することにより除去した。こ
の抗原性物質を０℃の５０私の比０に懸濁させ、５００
泌の注入びんに移し、そして一７０℃において硬く凍結
させた（ドライアイスおよびェタノ−ル）。

凍結乾燥は、テクスヴァク型式Ｗ凍結乾燥機中で制御温
度下に行なわれた。

この凍結乾燥した組織粉末をステンレススチールのボー
ルミル中で約一７０℃の温度で２時間４舵ＰＭで行なわ
れた。

この粉砕の結果、微細な灰褐色粉末が得られた。この粉
末を−２℃に予備冷却したエチルヱーテルで３０皿ＰＭ
のＰＲ‐２猿とう装置中で６０分間抽出し「 そして一
２℃で１０００ｘＧで３脱ふ間遠Ｄした。エーテル層を
除き、沈殿物を真空中で乾燥させた。生成した粗製の組
織粉末（ＣＴＰ）は密閉したびん中で４℃では認めるべ
き活性の低下なしに何年も保存することができる。ＣＴ
Ｐの５夕を滅菌氷塊を含有する５００の‘の食塩水中に
中性ｐＨで懸濁させた。

この懸濁液をＭＳＥアトミックス中で半速で１分間の３
期間ホモゲナィズした。この温度は０℃に保った。この
混合物をゆっくり鯛拝しつつ０℃に３０分間保った。１
００×Ｇで、０℃において４０分間遠心を行なった。

上燈液は捨てた。沈澄を５００の‘の冷蒸溜水に再度懸
濁させ、０℃で３ぴ分間ゆっくり燭拝した。

１０００×Ｇで０℃において４０分間遠心後ｔ その上
澄液を捨てた。

残存する沈殿を２５の‘の冷蒸溜水に懸濁させ、−？び
Ｃ（ドライアイスとエタノール）で凍結（シェルｍフリ
ーズ）させた。凍結乾燥すると洗液組織粉末（ＷＴＰ）
が得られたが「 これは４℃では密封びん中で何年も保
存できる。柵９．５におけるＣＡＰＡおよび正常ＷＴＰ
の水性抽出液をつくり、これを柵４．８で等随点沈殿さ
せそしてその沈殿物を１′１０の容積の軸９．５の水に
溶解させることにより１折音１こ濃縮した。

得られた濃縮物を速やかに聡〜１００℃の温度に加熱し
〜前記温度に５〜１０分保持することにより安定化させ
た。この熱処理は酵素を破壊させるものであり、これを
しないと酵素がＣＡＰＡを不活性化する。安定化させた
抽出物はｐＨ７４５の食塩水を添加すると残存する核酸
性の混入物の沈殿の故に濁ってきた。そのような残存混
入物を沈殿させるために、８．０の‘のＣＡＰＡと正常
水性抽出液とを別々に０．８私の１０％ＮａＣＩ溶液を
加えることにより沈殿させた。２７Ｇ０００×Ｇで０℃
において１時間遼心後「 その透明な上澄液をｐＨ４．
８で（０．１ＮＨＣＩまたは０．１ＮＨＣＯＯＨでｐＨ
を調整）等騒点沈殿させた。

この沈殿物をｐＨ７．０のＭノ１５０の燐酸バッファー
２〜３泌中に溶解させた。瞳濠および正常ＷＴＰに由来
する、ここに得られた溶液を２．５０蛾の内径および１
斑職の長さを有する冷却カラム中で６。

３の上／仇ノｈの流速でビオゲルＡ−５瓜ｈ（前記定義
のものである）を使って炉過した。

このゲルを「２％ｎ−ブタノールを有するＭ／１５０燐
酸バッファーｐＨ７．０で平衡化させ、そして同一バッ
ファーで溶出させた。各実験においては「５０〜１００
雌の蛋白総量を含有する４〜８泌の抽出液が使用された
。その抗原活性は〜瞳賜抽出物の流出液の中央分画中に
見出された。

全部で１６０〜１８０の【のこの分画の１．０の【区分
量を３倍に希釈し、そして２．０〜９．０の範囲の樋々
の餌値に調整した。５分間室温に置いた後に「 この試
料をキュベツトに移し、それらの５０仇血の光分散を９
び０の角度で測定した。

剛に対してプロツトした散乱強度はｐＨ４．８に最大値
を示した。この餌はこの分画の等軍点であった。この方
法はＣＡＰＡの精製に対する正確且つ必要な条件を決定
する目的に対して開発された新規の技術である。等蝿点
を判定するための通常の技術はべプチドが低濃度である
故にここでは使用できない。この活性な中央部分画の残
りの部分を」０．１ＮＨＣＩを使ってｐＨ４．８で沈殿
させた。

５分間３，８００×Ｇで０℃で遠心すると定量的収率の
活性度を生じた。

ＣＡＰＡのさらにそれ以上の精製を行なうために５本の
ピオゲルＡ−５０カラムからの沈殿させた活性な中央部
分画をｐＨ７．０のＭ／１５０の燐酸バッファー（２％
ｎ−ブタノール中のゼーレンセンのバッファー）中に溶
解させて最初の流出液の容積の５％とした。

８５の【中に１３０のｏの蛋白を含有するこの溶液を、
１／３５の直径／高さ比を有するビオゲルＰ一２カラム
（前記定義のもの）を通して３５Ｍ／〆／ｈの流速で炉
過した。

このカラムはＰＨ７．０のＭ／１５の燐酸バッファー（
２％ｎーブタ／ール中のゼーレンセンのバッファー）で
平衡化してあった。蛋白各１柵当り１０ｗ‘のペット容
積が許容された。最初の分画は活性であり、ｐＨ７．０
の溶出用バッファーでゲルから取り出され、一方不純物
はこの使用された低いイオン強度においてはゲル上に吸
着されていた。

活性物質を０．１Ｍ、ＨＣＯＯＨでＰＨ４．８で沈殿さ
せ、そして５分間０℃で３，８０めで遠心した。沈殿物
を８．５の‘の日２０に溶解し、そして０．１ＭＮ凡○
日でｐＨを８．５に調整した。この透明な溶液を０．１
ＭＨＣＯＯＨで３回ｐＨ４．８において再沈殿させ、同
じｐＨで遠心機中で洗い、そしてｐＨ８．５に溶解させ
た。ｎ−ブタノールの消失は、気一液クロマトグラフィ
ーにより追跡された。技終溶液はアンプル中で冷凍（シ
ェルフリーズ）および凍結乾燥して保存した。得られた
生成物は、乾燥したほとんど白色の粉末であり、この粉
末は真空の密封アンプル中で−２４ｑｏで保存された。
正常組織から由釆した相当する抽出物に関して同一の方
法が行なわれたが、活性は見出されなかつた。

前記クロマトグラフィー法により得られた生成物をさら
に精製するためには、ｐＨ勾配溶出法が開発された。

この方法は原則として次の諸段階からなる。すなわちそ
の活性成分に関して精製すべき蛋白混合物を柵を等蜜点
に調整することにより沈殿させる。この沈殿を適当なゲ
ル例えばセフアデックスＧ−２５（前に定義したとおり
である）またはビオゲルＰ−２（前記定義のとおりであ
る）と混合する。この混合物を同一等亀点軸で同一ゲル
含有のカラムの頂部にのせる。次いでこのカラムを一定
流速および温度で舟勾配溶出にかける。すなわちカラム
を連続的にまたは段階的に餌を上昇または減少させた媒
体で溶出する。この場合の勾配溶出は１５加ｏの凍結乾
燥したそして塩を含有しないＣＡＰＮ扮末および前項で
記載したようにして精製した正常抗原粉末を使用してこ
の場合には母を減少させつつ行なった。

この粉末を別々に日２０に溶解させ、そのｐＨを０．１
Ｎ、Ｎ凡○日で８５に調整した。この透明溶液のｐＨを
次いで０．１ＭＨＣＯＯＨで５．０にすると、沈殿が生
成した。各々の沈殿を０．０水位ＣＯＯ日および０．０
２ＭＨＣＯＯＮＨ４から調整されたｐＨ５．０とした水
性溶液で平衡化させたビオゲルＰ−２スラリー１０の‘
と混合した。これら混合物の各々を前記の様にして平衡
化させた１６欄の内径および１５仇舷の長さを有するシ
リコン処理カラムの１５肌ビオゲルＰ−２の上にのせた
。このゲルはガラスウールの小片により支持されていた
。母勾配がこの沈殿の溶出に対して使用された。

勾配液混合機（Ｕ１ｔｒｏｇＱｄ，ＬＫ母型）によって
沈殿を洗うためにｐＨは短時間の間約５に保たれた。次
いでその靴を徐々に２．８に下げた。最後にｐＨを９に
上げた。このバッファー系は、０．０２ＭＨＣＯＯＨ
一 日ＣＯＯＮＨ４ お よ び０．０２ＭＮ日日
Ｃ０３一ＮＨ３を含有しており、そして溶出は室温で行
なわれた。

流速は毎時カラム断面１塊当り２７．２叫に保たれた。
腫傷抽出液からの流出液を蛍光スペクトルにより分析し
た（２※ぬｍで活性化、発光蛍光は３５仇血）。

最初の軸と約３のｐＨの間で溶出された分画を以後の使
用のために回収した。凍結乾燥（リオフイラィズ）およ
び嫌縞乾固（フリーズドラィ）後この生成物は空気を除
去した後に密封アンプル中で−２４ｏｏで保存できた。
分子量を特性づけ、そしてその純度を確認するために、
その溶液の形の抗原性物質をｐＨ３．０の０．０２ＭＨ
ＣＯＯＨ一日ＣＯＯＮＨ４のバッファーで平衡化してあ
るピオゲルＰ−３０（前記定義のとおりである）を使用
して炉過した。

このｐＨ溶出ＣＡＰＡを同一バッファー少量に溶解させ
た。この流速は３．２５Ｍ／泳／ｈｒであり、集められ
た分画は１．２４泌を包含していた。活性分画は、２２
９〜２３桝ｍの波長に分光光度計上の吸収最大を示し、
そして２楓血で活性化させた場合には３５肌血に蛍光を
示した。典型的実験においては、シリコン処理したビオ
ゲルＰ−３０カラム（内径２．５４仇、長さ５０仇）上
で上記バッファー３．０の‘に溶解させた１０．４奴の
ＣＡＰＡは、物質および活性の完全回収を生じた。

溶出容積は〜松，０００〜２４ ０００の範囲内のＭＷ
に相当するものであった。これら分子量の数字はこの溶
出溶液を既知ＭＷの化合物例えばリボヌクレアーゼおよ
びインシュリンの溶出容積と比較することにより得られ
た。凍結乾間後、白色吸湿性粉末が得られたが、これは
冷所でそして光および酵素遮断下で保存することができ
る。この生成物の分析においては、炭水化物および核酸
は見出されない。アミノ酸分析機による分析はゲル炉過
により推定された分子量によく一致する。アミノ酸分析
は次のモル％を示すが、この数字は士５％の精度のもの
である。計算された分子量は２３２００土２，５００（
標準偏差）であった。アラニン
８６２アルギニン ４．
５７アスパラギン酸 １０．３９システイ
ン ０．９５グルタミン酸
１７。

０４グリシン ６．８７ヒス
チジン １．００イソロイシン
４．７５ロイシン
１０．４９リジン
３．６９メチオニン １，９
１フエニルアラニン ２．７５プロリン
３．７９セリン
７．７４スレオニン
５．９２チロシン
３．２１バリン ６，３
６このアミノ酸含量は、理論的窒素含量たる１６．２〜
１７．８％に相当する。

デュマ法による全窒素測定は１７．０±０．５％の値を
示す。過蟻酸での処理により示されるようにこのポリベ
プチドは単一べプチド鎖に基づいている。さらにこのポ
リベプチドはアルブメンとのコンプレックス形成により
保護されていない場合には約５以上のｐＨでは非可逆的
に変性する。例ｌａ 前記例１に記載したと正確に同じ方法で人胎盤組織から
ポリベプチドが製造された。

例ｌｂ ＣＡＰＡーアルブメンコンプレックスの製造例１で製造
されたＣＡＰＡの一区分蓬を蟻酸（例えば０．０９Ｍ、
ｐＨは２〜３の範囲内であるべきである）に溶解させた
。

透明な溶液が得られる。前記溶液にアルブメン粉末また
は前記蟻酸溶液と同一のｐＨのアルブメン溶液（ＣＡＰ
ＡＩ重量部当り２００重量部のアルブメン）を加えると
、ＣＡＰＡとアルブメンとの透明溶液が得られる。次い
でこの溶液のｐＨを「 それが約７．５に達するまで塩
基（例えば水酸化ナトリウムの水性溶液またはアンモニ
ア）を加えることにより徐々に増加させる。これＣＡＰ
Ａとアルブメンとをコンプレックスの形で含有する透明
溶液を生ずる。１２ＡタＣＡＰＡ／のを含有するこの溶
液は直接次に記載する診断方法に使用することができる
。

あるいはまたこのコンプレックスは凍結乾燥することに
より白色粉末の形で単機することができる。この粉末は
冷所（十４００）では長期間の間安定である。実験によ
ってＣＡＰべ唐性の最大の利用は、アルプメンのＣＡＰ
Ａに対する重量比が約２００：１に等しいかまたはそれ
以上の場合に得られるということが示されている。

例ｌｃ タンニンン酸処理および標織赤血球細胞の製造新鮮なめ
ん羊血液（１容量部）を滅菌したアルサーバー溶液（１
．２容量部）（アルサーバ−溶液は２５０夕のグルコー
ス、８０夕のクエン酸ナトリウム２水和物、４２夕のＮ
ａＣＩに水を加えて１０そとし、１０％クエン酸１水和
物でｐＨを６．１に調整することにより製造される）に
加える。

この混合物を遠心分離し、そして赤血球細胞をアルサー
バー溶液に１回そしてＰＨ６．８のバッファー溶液に２
回再懸濁させる。最後にこの赤血球細胞の懸濁液は餌６
．８のバッファー中に１び個細胞ノの‘の濃度のものと
する。前記のようにして製造された赤血球細胞懸濁液１
容量部を約１８ムタのタンニン酸／私を含有するｐＨ６
．８のバッファー溶液の１容量部に縄拝しつつ加える。

このようにしてタンニン酸処理した赤血球細胞を遠心し
、ｐＨ７．５のバッファーの２回再懸濁させる。最後に
この赤血球細胞をＰＨ？．５のバッファー中に１ぴ個細
胞／机の濃度に懸濁させる。前記例ｌｂで製造されたＣ
ＡＰＡコンプレックスの一区分量を、ｐＨ７．５のバッ
ファー溶液に溶解させて１の‘当り３ムタＣＡＰＡの濃
度とする（純粋ＣＡＰＡ基準で計算）。前記のようにし
て製造したタンニン酸処理赤血球細胞懸濁液の１容量部
を０℃で１０分間かけて１容量部のＣＡＰＡコンプレッ
クス溶液に滴下添加する。標識細胞を遠心分離し、安定
化作用量（１容量部当り１．２容量部）の不活化人血清
含有のｐＨ７．５のバッファー溶液に再懸濁させて１の
‘当り１．６×１ぴ個の標識細胞を含有する懸濁液を生
成させる。これら標識細胞は以下に示すように本発明の
診断方法に使用される。例 ロ 抗体の製造 本明細書にすでに記載したように、本発明のＣＡＰＡが
中性ｐＨでは非可逆的に変性するという事実から考えて
、このポリベプチドの非経腸的注射は抗体産生を生じな
いであろうと考えられた。

兎を使用して行なった実験はこれを確認した。そしてア
ルプメンとのコンプレックスにしたボリベプチドを兎に
注射した後には抗体産生は起らないことが発見された。
血球凝集反応はすべて陰性であつた。このポリベプチド
を活性な状態で抗体産生細胞中に移行することを可能な
らしめるためにはこのポリベプチドを約３以下のｐＨの
溶液（０．０２ｈ、ＨＣＯＯＨ、ｐＨ２．８）中に保持
し、この溶液を油中に乳化させて保護油層により囲まれ
た極めて小さな小滴を生成させることが必要である。

この乳剤の注射は、満足すべき量の抗体産生を生じた。
これは赤血球細胞をＣＡＰＡで標識した血球凝集反応に
おいてＣＡＰＡと特異的に反応した。免疫剤の製造 プールした人癖瞳擬から製造した純粋な ＣＡＰＡ８１６払夕をｐＨ２．８の０．０２Ｍ、ＨＣＯ
ＯＨの１．０Ｍに溶解させた。

得られた溶液に同時に乳化を行なわせつつ１．０の土の
アジュバント油（デイフコ社からの市販品）を滴下添加
した。この乳化は注射用注射筒を使って泡立てクリーム
と同じコンシステンシ−を有する均一な白色乳剤を形成
するまでその混合物を注射筒中に吸入および押し出しを
行なって達成した。前許浮Ｌ剤の１滴を氷水中で試験し
てそれが分離して浮きそしてそのままに蟹つているとい
うことを確認した。得られた半液体状乳剤を鬼の皮下お
よび筋肉内注射に使用した。５匹の兎の免疫 第１回の注射にはいわゆるコンブリートアジュバントを
使用し、そして以後の注射にはいわゆるインコンブリー
トアジュバントを使用した０一値を確立するために、５
匹の兎それぞれから最初に血液を取った後で、全部で４
雌ムタの乳化ＣＡＰＡ（ｐＨ２．８）をそれぞれの右お
よび左側に皮下注射した。

１０日間かくで更に３回注射を行なったが最初のものは
各々の後脚に筋肉内投与されそして第２および第３回目
のものはそれぞれ両腹側および両背側に皮下投与された
。

注射部位の選定は、局所リンパ管の到達部位を利用する
目的で行なわれた。各々の兎は、乳剤の形のＣＡＰＡの
合計約１．６奴を与えられた。最後の注射から１４日後
および２４日後に血液試験試料を取り、これをＣＡＰＡ
に対する特異抗体の存在に関する血球凝集分析にかけた
。最後の試料採取から２日後に最大量の血液を取出し、
これを糠菌ろ過し、そして滅菌管中に少基ずつ移し入れ
た血清の形で回収した。これらの管は冷時保存すること
ができ、この間特異性は保持された。例 ｍ 検出法 ａ 単一盲検法 血液試料はスェーデン国ェスキルスッナ所在中央病院か
ら得られたが、このうちの４２個は感染病診療室の患者
からであり、１個は外科診療室からのもの、２個は放射
線治療室からのもの、ｌｑ剛ま分娩後の女性からのもの
「１の固‘ま鷹帯血からのものであり、そして１川剛ま
妊娠３ケ月の妊娠女性からのものそして６個は妊娠６ケ
月の妊娠女性のものであった。

更に血液は２０人の１０ギの子供から得られ、そして年
とった健康な成人からの１の固の試料が私立診療所から
得られた。スェ−デン国ストックホルムの外科および医
療診療所からは、４４人の患者からの試料が得られた。
ェーケホスフ病院では４５人の患者から資料が得られ、
そしてスェーデン国ストックホルムのカロリンスカ・ス
ジュクフセットの外科診療所からは、外科治療に対して
入院させられている７２人の患者から血液試料が得られ
た。スエーデン国ストックホルムのカロリンスカ・スジ
ュクフセツトの供血部門は、平均年令３７．２年（ＳＤ
土１１．３年）の２０〜６７才の年令範囲の供血者から
の１１８個の試料を提供した。そして前記病院の臨床中
央実験室からはスェーデン国ストックホルムのラジウム
ヘメットの一般部門内で処置を受けている２９人の患者
およびその婦人科部門内の１２人の患者からの血清が得
られた。血液試料の総数は４３１個であった。エスキル
スッナからの１１１例に関しては臨床的研究が行なわれ
ており、そして明白に健康な関与者に対するもの以外は
、病歴記録が作られていた。ストックホルムの例に関し
ては、１０１例に関して患者の病歴記録の詳細な研究が
行なわれた。残りの分については悪性のもの以外の臨床
診断が手元にあり、そこにおいては悪性疾患の疑いはな
かつた。添加物を加えずに静脈血をワツセルマン管に移
し、そしてある場合には遠心手段により凝集物および血
球細胞を除去した後に実験室に移した。

血液分析は、変型血球凝集阻害技術によるＣＡＰＡの存
在を示すことに基づいている（徴量法）。

原則として次の方法が使用された。めん羊赤血球細胞で
吸収させた患者血清２５ムそを、リンブロＩＳ−Ｍ旧Ｃ
−９６希釈板中、８段階２倍希釈で滴下した。

次いで極限希釈（約１：２０００）の特異抗血清２５ム
夕を各凹部に加えた。２〆０で１粉ご間培養後前記例ｌ
ｃに示したようにしてタンニン処理しそして単機された
人アルブメン結合ＣＡＰＡで標議した約６００〜８００
万のめん羊赤血球細胞の懸濁液５０山夕を各凹部に加え
た（赤血球細胞１０針固あたり約２〜４山夕）。

他の微粒状担体例えばラテックス、ベントナィトおよび
コロジオンを赤血球細胞の代りに使用しうる。この反応
は煩斜させた鏡により、および１〜２℃で４〜２独特間
培養した後の標準系を使用して記録された。対照の目的
で次のものが使用された。Ｉ ＣＡＰＡで標議した赤血
球細胞プラス抗血清、２ 抗血清を加えていないＣＡＰ
Ａで標議した赤血球細胞、３ 患者血清プラス人アルブ
メンで標識した血球細胞、４ 患者血清および未処理血
球細胞、５ 一連のＣＡＰＮ標識血球細胞および抗体（
この場合阻害は段階的に減少する既知量のＣＡＰＡによ
り与えられる）。

使用された希釈液体は、プールした（すなわち多くの個
体から併せた）血球細胞の安定化のために、不活性化し
た中性人血清を含有していた。

ＣＡＰべ試薬はプ−ルした人競腰症組織から製造され、
前記のように、ゲルろ過、斑勾配溶世、ビオゲルＰ一３
０によるろ過およびアルブメンとのコンプレックス生成
により精製された。

抗血清としては、正常組織およびプールした人血清によ
り吸収された１９６２王１１月１９日からの馬抗へラ細
胞が使用された。免疫は、平たいガラスぴんの中で２０
％の不活性化人血清を含有するイーグル培地中で生成さ
せたへラ細胞の洗練分画を使用して行なわれた。この細
胞はＥＤＴＡで収獲され、途Ｄこれそして水で３回洗練
されたものであった。患者血清中のＣＡＰＡの存在下に
、中和された馬抗体はボリベプチドで穣識した血球細胞
を加えた場合にも凝集は起さない。

０〜６の漸進的スコアによって記録が行なわれたが、こ
こに０は阻害が起らなかったことを示しそして６は最大
凝集阻害を示している。

このスコアと血清１凧‘中のＣＡＰＡの濃度との関係は
、中性血清中のＣＡＰＡの前以つて測定した量の希釈物
で鮫正して得られた表１から読み取られる。表１ スコアおよびＣＡＰＡの鮫正 スコア 〃タＣＡＰＡ／私 ０ ミ０．０３ １ ０．Ｍ一 ０．０８ ２ ０．０９一 ０．１２ ３ ０．１３− ０．２４ ４ ０．２５− ０．４９ ５ ０．５０− ０．９９ ６ ＞１．０ この記録は患者の健康状態に対する知識なしにつくられ
た。

研究に供した材料は次の表２にみられるような群に分け
られた。表２ 総括的スコア０〜６おょび平均スコア側おょび標準偏差
くＳＤ）にょる異なる個体群からの４３１の血清中のＣ
ＡＰＡの存在１２．姑娠女性 １２ ２ ２
１６ ０．３８±０．７２１３．分娩後の女性 ８
１ １ １０ ０．４０±０．９７この結
果から最大のスコアは「一次癌および転移」（局所）お
よび「拡大した癌」よりなる群および「新生児」（膿帯
血）群に関して得られるということが明白である。

低いスコアは供血者から得られる。

中間に位置するものは「未処直一次癌」の群および「完
全には処臆されていない癌」の群により占められる。供
血者のものとほぼ等しいスコアが「完全に除去された漣
」の群中に見出される。すべての群中のＣＡＰＡに関す
る平均値を組様式に比較し、これを次の表３に示す。

表 ３ ９種の固体カテゴリーの血清中のＣＡＰＡの存在に対す
るスコア間の差の線肩十的有意性ａ）カテゴリー番号の
間の差の有意性ｂ）ａ）差の有意性試験は として定義される概略の正規分布変数Ｚによりなされる
。

ｂ）Ｚ＞１．９６の場合、差の有意性はたであり、これ
は０．０１＜Ｐ＜０．０５を意味する。Ｚ＞２．６の場
合、差の有意性は××であり、これは＜０．００１＜Ｐ
＜０．０１を意味する。Ｚ＞３．５の場合、差の有意性
は安夫兼であり、これはＰ＜０．００１を意味する。ｃ
）この群は１１個の陽性試験を包含するが、このうち８
個は疑いはあるがしかし証明されているい癌に関するも
のである。前記の表から「「転移した一次榛」に関して
「ならぴにｒ拡大した癌」に対しては〜新生児に対する
例外を除いたすべての他の群に比べて、有意により高い
平均スコアが存在しているということが明らかである（
表２をも参照）。

「完全には処置されていない漣」の群ならびに「未処置
一次癌」の群に対しては「その平均スコアは最初に掲げ
た二つのその以外のすべての群に比べもそして「漣以外
の他の悪性疾患」に比べて有意により高い。この後者に
相対的にかその差は有意である（０．０１くＰく０。０
５）。

群５〜９は「 ７と９との間の有意差に対するもの以外
は相互有意差を示さない。この差は１と４との間のスコ
アを示す例の中には〜真のかくされた癌の例が存在しう
るという事実により説明することができる。階帯血中の
陽性の指示はある蟹の注目亀こ値する。

ＣＡＰＡが胎盤に由来するかどうかを確認するために〜
そのような組織の一片を抽出した。ｐＨ７−５の緩衝化
した生理的ＮａＣＩ溶液１脇【あたり３００の９の蟹の
凍結胎盤を０ゆでホモゲナィズし〜 １０００十Ｇで３
０分間０℃において三角形にのびた管中で（マルカム）
遠心した。前記の血球凝集技術によりこの上燈液におけ
るＣＡＰＡの存在を試験した。得られた阻害反応や血球
細胞に加えられた純粋なＣＡＰＡの非特異的不活性化に
より起されたものである可能性を除去するために、各記
録後に前記血球細胞を振とうしトそしてＣＡＰＡに特異
的な抗体の標準量を加えた。抗原不活性化はいかなる場
合にも示されなかった。対照物質として、異なる起源の
人糠組織からのおよび異なる位置から生成された抗原粉
末の抽出液を使用した。その結果は多数の個体からの２
鏡蚤の胎盤のうちのすべてが例外なしに有意量のＣＡＰ
Ａを含有しても、ることを示した。２６個の胎盤に対す
る平均数値（幾何的）は〜緑組織１夕あたり２９７土８
仏夕（０．０３％）であった上記の研究から明らかなよ
うに本発明のＣＡＰＡが胎盤中で合成されるものである
から「そして胎盤中に含有される遺伝子はまた同一卵鯛
砲から由釆した個体中にもまた存在するに違いないので
あるからｔＣＡＰＡを生成させる可能性および能力は正
常な現象であるとも、うことになる。

一般にはこの能力は抑制されて〜、る。その理由は正常
細胞は測定しうる題のＣＡＰＡは含有しないからである
。しかし癌細胞においては、細胞内および細胞周辺にお
けるＣＡＰＡの有意な存在により特性づけられるこの能
力の活性化が起っている。胎盤の栄養芽層細胞と癌細胞
との間の抗原性的なそしてある程度は機能的な類似性お
よびその個体の他の細胞に関しての相違は糠疾患が個有
の性質の制御変化に由釆するものであるという観点と共
存しうるように思われる。実験的結果の統計的分析は、
癌の診断の存在と増大したＣＡＰＮ蝿度との間に高度に
有意の相関関係があることを示している（泣くＱＱＱ重
）。

同一のことは同一年令群中における考えられる樋擬塊の
大きさと増加したＣＡＰＡ濃度との間の関係に対しても
真実である。増大したＣＡＰＡの濃度は癌の広範囲の種
々の部位に関して発見されている。タイプおよび位置に
無関係に糠腰擬はＣＡＰＡを含有していることが発見さ
れた。その観点から〜前記ＣＡＰ叫ぶすべての既知のタ
イプの濁すなわち上皮性由来の悪性種湯に共通であるよ
うに思われるＱＱ 二重盲検法 前記の結論の確実性を更に証明するために「蝦も厳格に
制御された条件下にも二重盲検法が行なわれた。

記号を付した血液試料をスューテン国ェルキルスッナ所
在の中央病院の種々の部門から得た。この場合患者血清
のＣＡＰＡ水準の定量的測定が行なわれた。この二重盲
検法の結果ならびに前記の単一質検法の結果が次表４〜
８蔓こ要約されている。

その表においては表４は検査した個体の総数および溝診
断を示した個体数を示す。表５はその平均年令およびそ
の偏差と共に異なる群の個体数を示している。表６は検
査したすべての患者からの血清中のＣＡＰＡの存在を示
す。表７はと０．１５払夕／仇【血清のＣＡＰＡ濃度を
有する個体の％を示すが「表５の９，１０および１２の
群は除去してある。表８は表５の１〜３群に対する腫湯
の位置に関連したＣＡＰＡの存在を示す。位置番号は本
明細書中に参考として包含される「ＣａｎｃｅｒＩｎｃ
ｉｄｅｎｃｅ ｉｎＳｗｅｄｅｎｌ９銃」を参照して示
されても、る表４ 表 ５ 異なる群の個体数および平均年令およびその偏差表 ６
９３４例の個体からの血清中のＣＡＰＡの存在表７０．
１５のＣＡＰＡ濃度を示した個体の％く表５の９，１０
および１２群は除外されている。

表 ８ 第１−３群の種傷の位置に関連したＣＡＰＡの存在１．
転移のある癌 ２．転位症状のない未処理癌及び完全
に処置されているい癌 ３．完全に除去され た癌 ×） にａｎｃｅｒＩｎｃｉｄｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｗｅ
ｄｅｎｌ９６８」による。

この二重盲検法検査により得られたデータの完全な統計
学的解析は、これまた縄診断の存在と増加したＣＡＰ心
濃度との間に高度に有意な相関関係があることを示す（
Ｐく０．００１）。この一重盲検法検査はまた同一年令
群中における考えられる腰傷塊の大きさと〜増加したＣ
ＡＰ〜濃度との間の関連性をも確証する（Ｐ＜０。００
１）。

このＣＡＰＡの増加した血清水準は２ｑ固の異つたタイ
プおよび位置の癌に関連した発見されている。すなわち
二重盲検法検定はこの新規の発見の確実性とそれらの実
際的有用性を完全に確証する。本開示の冒頭部分で米国
特許第３６６３秘４号明細書開示の抗原が明らかに本発
明の抗原とは異なっていることを示した。

従来技術の抗原と本発明の抗原との差を示すために以下
に抗原単機方法および抗原特性の両方に関していくつか
の特性的相違についての詳細な検索を示す。要約のため
に本発明の癌関連ポリベプチド抗原と診断用試験の簡単
な定義を次に示す。ＣＡＰＡのＮｒ鰯 へラ細胞（１９５２宅の癌の例から由釆したもの）を試
験管内で生育させる。

これらの細胞を抗原源として使用する。収獲した細胞を
馬に注射すると〜特異抗体の生成を生じ〜これを蟻擬〜
血遼も胎盤等の中の抗原を同定するのに使用する。この
後者の抗原は同一の免疫学的反応部位（へう抗原に比べ
て）を有していなくてはならないし〜そして事実有して
いるのであるがもしかしこれは勿論天然状態で存在して
いる場合には他の点で異っていることができる。診断川
謎験の姓 試験管内（ィンビトロ）におけるへラ細胞培養からの抗
原を使用して馬に抗体を産生させるＱ不要の抗体を吸収
させた後に「 この馬血清を種擬（または胎盤またはへ
ラまたはＨＥＰ−２またはデトロイト６の培養細胞）か
ら取出した抗原で標議した赤血球細胞の凝集に使用する
。

これはィシジケーター系である。未知の試料が抗原活性
を含有している場合には〜それは抗体と干渉して凝冬を
阻害する。種々の修正したものおよび相当するものが当
業者には明白でありもそして本発明の精神から逸脱する
ことなしにト本発明の方法および生成物に対してそれら
を行うことが可能であろう。

以下に本発明の要旨ならびに実施の態様の具体例を列記
するが、これらはいずれも特許法第６発寒の３にいう発
明の実施に包含されるものである。

１ 下記諸段階すなわち ‘ａ’約０℃以下の温度の液体中でＣＡＰＡ含有物質を
ホモゲナィズし〜‘ｂ｝ 前記段隅ａ｝力）ら得られた
液状ホモゲネートと固体分との混合物から固体を分離し
「‘ｃ）前記固体分をアルカリ性水溶液で抽出し、‘ｄ
｝ 段階‘ｃ’かち得られた抽出液を１０×１び〜２０
×１び特に総ｉ５×１ぴを含む分子量範囲を有する化合
物の分画を可能ならしめるビーズ形の分子ふるいタイプ
の炉過用ゲル上で炉過し〜このゲルを藩出しそして１０
×１び〜１５×１ぴの分画等に約１５×１ぴの分画を回
収し、【ｅ｝ 段階【ｄ｝力・ら得た分画を弱イオン交
換体上のクロマトグラフィーにかけてその上に不純物を
吸着させそして前記交換体から出てくる最初の分画を回
収し、的 前記の最初の分画を等電点沈澱にかけ、（ｇ
） 得られた沈澱を分子ふるいタイプのゲルと混合し且
つ前記ゲルをｐＨ勾配溶出にかけ〜そして〜（ぬ） ｐ
Ｈを減少させつつ約３のＰＨまでの「 その中に２２９
〜２３如ｍに分光吸収ピーク波長を有しそして約２０，
０００〜２７７０００の範囲内の分子量を有するＣＡＰ
Ａを含有する分画を回収する諸段階を包含する癌関連ポ
リベプチド抗原（ＣＡＰＡ）の単機方法。

２ ｐＨ勾配溶出から得られた分画を、ゲルカラム上で
のゲル炉過にかけそして滋９〜２乳紅ｍの分光吸収ピー
ク波長および約２０，０００〜２７，０００の範囲内の
分子量を有する抗原の溶出分画を回収する勺前記第１項
記載の方法。

３ 段階‘ａめ）ら得られたホモゲネートを〜段階｛ｂ
｝の前に〜冷時有機溶媒処理にかけるト前記第１項記磯
の方法。

４ 使用される溶媒がエチルエーテルであるト前記第３
項記載の方法。

５ ホモゲナィズ操作が約０℃以下の温度の水中で行わ
れる、前記第１項論駁の方法。

６ 段階【ｂめ）ら得られた固体分を凍結乾燥し、次い
で袷時スチールボールミル中で粉砕する〜節記第１項記
載の方法。

７ 粉砕が低温で行われる、前記第６項記載の方法。

８ 粉砕が処理材料の水点以下の温度で行われる、前記
第６項記載の方法。

９ 粉砕が約一７ぴ０の温度で行われる、前記第６項記
載の方法。

１０ 段階‘小こおいての炉過が、ポリアクリルアミド
ゲル、交叉結合ヂキストランゲル、寒天およびアガロー
スゲルよりなる群から選ばれそして約７の恥の燐酸バッ
ファーで平衡化させたゲル上で行われる、前記第１項記
載の方法。

１１ 段階‘ｅにおいてクロマトグラフィーが中性母の
弱イオン交換体のカラム上で行われる、前記第１項記載
の方法。

１２ クロマトグラフィーが中性ｐＨのカラムの形であ
る弱イオン交換体のポリアクリルアミドゲル上で行われ
る、前記第１１項記載の方法。

１３ 段階（ｇ）においてボリアクリルアミドゲル、交
叉結合デキストランゲル、寒天及びアガ。

ースゲルよりなる群から選ばれたゲルが使用される、前
記第１項記載の方法。１４ 前記ゲル炉週がポリアクリ
ルアミドゲルおよび交叉結合デキストランゲルよりなる
群より選ばれたゲル上で行われる、前記第２項記載の方
法。

１５ 段階‘ｃ｝から得られた水性抽出液を約９５〜約
１００ｑｏの範囲内の温度への急速な加熱に付して酵素
を破壊させる、前記第１項記載の方法。

１６ 前記水性抽出液を速やかに約９８〜１００ｑｏの
範囲内の温度に加熱し、この温度に約５〜１０分間保持
する、前記第１３頁記載の方法。

１７ 抗原含有物質をまだ凍結状態にあるうちに約０℃
以下の温度の水中でホモゲナイズし、縛られたホモゲネ
ートをエチルエーテルおよびアセトンよりなる群から選
んだ溶媒処理に付し、得られた液体ホモゲネートと団体
分の混合物から固体分を分離し、得られた固体分を凍結
乾燥させそしてこれをスチールポールミル中で処理され
る物質の氷点以下の温度で粉砕し、得られた固体をアル
カリ性水性溶液で抽出し、遠心後にその上燈液体を約９
５〜約１００午Ｃの範囲内の温度への急速な加熱に約５
〜ＩＱ分間付して酵素を破壊し、この加熱上燈液を水性
塩化ナトリウム溶液で処理して混入物を沈澱させ、そし
てその上燈液体を回収し、得られた液体を約１０，００
０〜少くとも２０×１びの分画範囲を有しそして約ｐＨ
７．０の燐酸バッファーで平衡化させたビーズ形の分子
ふるいタイプのゲルを充填した袷カラムで炉過しそして
その溶出液の中央部の分画を回収し、前記中央部分画を
約ｐＨ７．０の燐酸バッファーで平衡させた弱イオン交
換体分子ふるいタイプのゲルで充填したカラム上でのク
ロマトグラフィーにかけ、そしてこのカラムから出てく
る液体の第一の分画を回収し、前記の第一の分画を約ｐ
Ｈ５の等母点沈澱にかけそして得られた沈澱を少くとも
約２０００の分子量除去限界を有ししかも約柑５のＨＣ
ＯＯＨ一日ＣＯＯＮ比で平衡化させた分子ふるいタイプ
のゲルと混合し、この得られた混合物を同様に平衡化さ
せた同一ゲルを充填したカラムの上におき、このカラム
をＰＨ勾配溶出し、そしてｐＨを減少させつつ約ｐＨ３
までに溶出された２２９‐２縦肌の分光吸収ピーク波長
および２３，２００±２，５００（Ｓ．Ｄ．）の分子量
を有するＣＡＰＡ含有分画を回収することを包含する、
ＣＡＰＡの製造方法。

１８ ２３ ２００±２，５００（Ｓ．Ｄ．）の分子量
を有しそして約２２鮒皿〜約２３仇ｍの範囲内の波長に
分光ピーク吸収を示しそして過蟻酸での処理により示さ
れるように単一べプチド鎖に基づいており、そしてアル
ブメンとのコンプレックス生成により保護されていない
場合には約５を越えたｐＨでは非可逆的に変性する、糠
関連ポリベプチド抗原（ＣＡＰＡ）。

１９ ボリベプチドが次に示すようなモル％のアミノ酸
すなわちアラニン ８．
６２アルギニン ４．５７ア
スパラギン酸 １０．３９システイン
０．９５グルタミン酸
１７．０４グリシン
６．８７ヒスチジン
１．００イソロイシン ４．
７５ロイシン １０．４９
リジン ３．６９メチ
オニン １．９１フエニルアラ
ニン ２．７５プロリン
３７９セＩＪン
７４７４スレオニン
５９２チロシン
３４２１バリン ６３
６を含有している、前記第ｌａ真記載のＣＡＰへ２０
約２校がｍの波長で励起された場合に約３５仇血の蛍光
を発光する蛍光性基を含有する、前記第１焔記載の肌へ
２１ 次の段階すなわち、ａ）約３以下の賄の前記第１
８頁記載のＣＡＰＡの水性溶液を製造し、ｂ）段階ａ）
から得られた溶液がそれを囲む油相により保護されてい
るような包囲された相である油乳剤を製造し「 ｃ）前
記油乳剤を生きている動物体中に注射してそれにより乳
剤により挺持されるＣＡＰＡが「抗体産生細胞に移送さ
れる、ＣＡＰＡに関して単一特異性抗体の製造方法。

２２ 段階ｂ）でフロィンドのアジュバントが油乳剤製
造に対して使用される、前記第２１簿記滋の方法。

２３ 段階ａ）で水性溶液が酸性化剤として弱酸を使用
して約３以下のｐＨで製造される、前記第２１項記載の
方法。

２４ 使用される弱酸が蟻酸である、前記第２３頁記載
の方法。

２５ 血清、組織、分泌物および検査される動物生体か
らの抽出物よりなる群から選ばれた材料を検査すること
により癌進行の種種の段階におけるＣＡＰＡの存在を判
定するにあたり〜次の段階すなわちａ）連続希釈により
一連の前記材料の試料を調製し、ｂ）前記試料の各各に
その抗原に特異的な抗体を含有する抗血清の予定された
量を加え、ｃ）培養後に前記培養試料の各各に、予定量
の微粒子状担体により支持された安定化した（コンプレ
ックス化した）ＣＡＰＡを加え、ｄ）ここに得られた一
連の処理試料を阻害を与える安定化された（コンプレッ
クス化した）既知の漸進的に減少する量のＣＡＰＡと予
定された童の前記抗体含有抗血清の対照試料と比較し「
その後で前記対照試料の各各に微粒状坦体により支持さ
れた予定された量のＣＡＰＡを加え、そしてｃ）前記の
一連の試料と前記対照試料とを比較することにより前記
の生きた動物体の材料中のＣＡＰＡの塁を確定して癌の
存在およびその進行段階を示すことを包含する方法。

２６ 前記材料が患者血清である、前記第２８頁記載の
方法。

２７ 前記の抗原含有材料が人胎盤からの組織である「
前記第１項記載の方法。

２８ 前記の抗原含有材料が人腫擬組織である、前記第
１項記載の方法。

２９ 前記の抗原含有材料が試験管内で生育させた競性
細胞の培養物である、前記第１項記載の方法。

３０ 前記材料が生検材料、外科的標本、穿刺および塗
抹標本である、前記第２８頁記載の方法。

３１ 使用されるポリベプチド抗原が前記第１８頁記載
のものである、前記第２５頁記載の方法。

３２ 段階ａ）の前記材料をめん羊赤血球細胞、ラテツ
クス、ベントナイトおよびコロジオンよりなる群から選
んだ微粒状担体に吸収させられている、前記第２９頁記
載の方法。

３３ 段階ｃ）で使用される血球細胞がめん羊赤血球細
胞である、前記第２８頁記載の方法。

３４ 段階ｂ）で使用される抗血清がＣＡＰＡ含有物質
で免疫した動物から導かれたものである、前記第２５頁
記載の方法。

３５ 免疫した動物が馬及び兎よりなる群から選ばれる
、前記第３平真読教の方法。

３６ 薬理学的に許容しうる担体と共に活性成分として
のＣＡＰＡを含有している、免疫剤として有用な組成物
。

３７ 約３より低い軸のＣＡＰＡ含有水性溶液が被封入
相を構成しその周りを囲む油相により保護されている油
乳剤を含有する、前記第３８頁記載の組成物。

．３８ 油乳剤がフロインド
のアジュバンドを基質としている〜前記第３６頁記載の
組成物。

３９ ＣＡＰＡ及びそれと混合物の状態の安定化作用蟹
のアルブメンを包含する組成物。

４０ アルブメンのＣＡＰＡ‘こ対する比が少くとも童
麹で２００：１である、前記第３９項記載の組成物。

４１ 醸溶液中でＣＡＰＡとアルブメンとを混合し、そ
してその溶液のｐＨを上昇させてこれらの成分間に相互
作用を起させることを包含する〜ＣＡＰＡーアルブメン
組成物を製造する方法。

４２ 更にこの紙成物を凍結乾燥する段階をも包含する
「前記第４１項記載の方法。

４３ アルブメン−安定化ＣＡＰＡで標識した微粒状物
質を包含する、診断用組成物。

４４ 微粒状物質がタンニン酸処理した赤血球、ラテツ
クス、ベントナイトおよびコロジオンよりなる群から選
ばれる、前記第４３頁記載の診断用組成物。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 血清、組織、分泌物および検定される動物生体から
   の抽出物よりなる群から選ばれた材料を検査することに
   より癌進行の種々の段階におけるＣＡＰＡ（癌関連ポリ
   ペプチド抗原）すなわち、約３．０ｐＨのＨＣＯＯＨ−
   ＨＣＯＯＮＨ＿４で平衡化されたゲルカラム（該ゲルは
   １００〜２００メツシユの粒子サイズ、４０，０００の
   除外限界（ダルトン）および２，５００ないし４０，０
   ００の分画範囲（ダルトン）を有するポリアクリルアミ
   ドゲルである）上で濾過される場合に２０，０００ない
   し２７，０００の分子量を有する癌関連ポリペプチド抗
   原（このポリペプチドは２２９ないし２３３ｎｍの範囲
   内の波長において分光ピーク吸収を有し、過蟻酸による
   処理によつて示されるごとく単一ポリペプチド鎖に基づ
   いており、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、
   フエニルアラニンおよびチロシンを必須構成成分として
   含有し、ヘラ細胞により産生されそして正常組織および
   ヒト血清により吸収される抗血清と単一特異的に反応し
   、前記抗原はアルブメンとのコンプレツクスにより保護
   されていない場合には約５を超えるｐＨにおいて非可逆
   的に変性する）の存在を検出するにあたり、次の段階す
   なわち、（ａ）連続希釈により一連の前記材料の試料を
   調製し、（ｂ）前記試料の各々に前記抗原に対して特異
   的な抗体を含有する抗血清の所定の量を加え、（ｃ）培
   養後に前記培養試料の各々に微粒子状担体により支持さ
   れた所定量の安定化した（コンプレツクス化した）ＣＡ
   ＰＡを加え、（ｄ）ここに得られた一連の処理試料を阻
   害を与える安定化された（コンプレツクス化した）既知
   の漸進的に減少する量のＣＡＰＡと所定の量の前記抗体
   含有抗血清の対照試料と比較し、その後で前記対照試料
   の各々に微細状担体により支持された所定の量のＣＡＰ
   Ａを加え、そして（ｅ）前記の一連の試料と前記対照試
   料とを比較することにより前記の生きた動物体の材料中
   のＣＡＰＡの量を確定することを包含する方法。