JPS60180593A - 酵母におけるヒトα‐１‐抗トリプシンの表現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、酵母におけるヒトα−１−抗トリプシンをコ
ードっけするヌクレオチド配列からなる組換えＤＮＡ分
子の調製方法に関する。

発明の背景 ヒトα−１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）は、血清および
種々の他の体液中に存在するα−１−グロブリンである
。肝臓で合成された際、ｈＡＡＴは、約５０，０００〜
５５，０００ダルトンの分子量を有する糖タンパク質で
ある。ｈＡＡＴにより阻害されるタンパク質分解酵素に
は、トリプシン、キモトリプシン、膵臓エラスターゼ、
皮屑コラゲナーゼ、レニンおよびウロキナーゼ、ならび
に多形核リンパ球のプロテアーゼが含まれる。遺伝的に
獲得されたヒトにおけるＩＩＡＡ−１７欠失は、種々の
病状、特に気腫および肝臓疾患を伴なう。例えば、モー
ス、ニュー・イングリッシュ・ジャーナル・オフ・メジ
シン（Ｍｏｒｓｅ、　Ｎ、Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　
）　２９９　（１９）　１０４５〜１０４８　（１９７
８）および２９９　（２０）　１０９９〜１１０５（１
９７’８）；　トービンら、アーカイブス・オフ・イン
ターナショナル・メジシン（Ｔｏｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、
。

Ａｒｃｈ、　Ｉｎｔ、　Ｍｅｄ、　）　１４３　（７）
　１３４２〜１３４８　（１９８２）；なら唱こカール
ら、ネイチャー（Ｃａｒｒｅｌｌｅｔ　ａｌ　、　Ｎａ
ｔｕｒｅ）　２９８（５８７２）　３２９〜３３４（１
９８２）参照。

エラスターゼは、肺組織を破壊するプロテイナーゼであ
る。未確認であるが、その作用により気腫が起こりうる
。ガデツクら、アメリカン・レビュー・オフ・レスパラ
トリー　ディシーズ（Ｇａｄｅｋｅｔ　ａＬ　Ａｍ、　
Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ、　）　ｉ２７　：　
５４５〜５４６（１９８３）およびゲラスラーら、アメ
リカン。

レビュー・オフ・レスパラトリー・ディシーズ（Ｇｌａ
ｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　、　Ａｍ、Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐ
ｉｒ、　Ｄｉｓ　、　）　１２７　：５４７〜５５３（
１９８３）は、例えば、気腫の治療において、ｈＡＡＴ
が、医療上有用であることを示している。

その医療上の有用性のために、ｈＡＡＴを大量に生産す
る技術が研究されてきた。従来、かかる技術では、′ｈ
ＡＡＴを血清から精製することを要する。

例えば、：Ｉ−７う（Ｃｏａｎ　ｅｔ　ａｌ　）の米国
特許第４゜３７９．０８７号参照。

ジエネテイツク・エンジニアリング・ニューズ（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ　）　２
　（６）　：　２９　（１９８２）およびドラッグ・コ
スメテイック・インダスト　リ　−（Ｄｒｕｇ　Ｃｏｓ
ｍｅｔ　、　Ｉｎｄ、）　１３１　（５）　：　３２　
〜３６（１９８２）においてはｈＡＡＴが酵母、サツカ
ロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において表現されたと報告して
いる。

カワサキら、［ザ・モレキュラ・バイオロジー・オフ・
イーストＪ　（Ｋａｗａｓａｋｉ、　ｅｔ　ａｌ、　”
　ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　
Ｙｅａｓｔ”、　Ａｕｇｕｓ　ｔ　１６〜２１゜１９８
３　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　）は、ｈＡＡＴが、リン酸トリオー
ス・イソメラーゼ・プロモーターから酵母において表現
されたと報告している。

ボＬ／７ら（Ｂｏｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ　）のベルギー
国特許第８９５．９６１号は、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ　
Ｉサイト中にクローン化したヒト肝臓細胞由来のｐｏｌ
ｙＡ−ＲＮＡから逆転写された１、４キロ塩基対（ｋｂ
）のＣＤ　Ｎ、Ａフラグメントからなるプラスミド、ｐ
　Ｕ　Ｌ　Ｂ１５２３上のイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ　
）におけるＩＩＡＡＴのクローニングを開示している。

ポレンらは、ＣＤＮＡフラグメントは、天然の翻訳開始
コドンを含むｈＡＡＴ遺伝子全体からなることを開示し
ている。

ロングら、ストラフチャー・アンド・オーガニゼイショ
ン・オフ・ジーンズＩ　（Ｌｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、。

５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　Ｉ。

Ａｂｓｔｒｕｃｔ　Ｎｏ、２５　（１９８３）　）は、
ｈＡＡＴ　のクローニングおよび配列決定を報告してい
る。

酵母および／またはイー・コリにおけるＤＮＡフラグメ
ントのクローニングおよび／または表現に関して、種々
のベクターが公知であり、かつ入手可能である。フロー
チら、ジーン（Ｂｒｏａｃｈ　ｅｔａｌ、Ｇｅｎｅ　８
：１２１〜１３３（１９７９））　は、イー・コリー酵
母シャトルベクターであるＹＥＰ１３が、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
　ＡＴＣＣ）に寄託番号３７１１５号で寄託されている
と報告している。クラビールら、プロシーデイングズ・
オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシ
ズ・オフ・ザ・ユナイテッド・ステイン・オフ・アメリ
カ（Ｃｒａｂｅｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８　：　５０２
６〜５０３０　（１９８１））は、プラスミドｐＹｅ　
Ｕｒａ　３　Ａｒｇ　３　ｉｃ　ツいて報告している。

ボイヤーら、ジー７　（Ｂｏｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

Ｇｅｎｅ　２　：　７５　（１９７７）　）は、ＡＴＣ
Ｃに寄託番号３７０１７で寄託されているイー・コリプ
ラスミドｐＢＲ３２２について報告している。

発明の要約 本発明は、その１つの態様において、ヒトα−１−抗ト
リプシン（ｈＡＡＴ）をコードづけするヌクレオチド配
列および酵母におけるｈＡＡＴ配列の転写を行なうこと
ができる調節部からなる組換えＤＮＡ分子を提供す°る
ものである。その具体例において、該調節部は、酵母Ａ
ｒｇ３遺伝子および／または、プレｈＡＡＴまたは成熟
ｈＡＡＴをコードづけするｈＡＡＴ配列由来のものであ
る。

他の態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分
子で形質転換された微生物を提供するものである。

さらに別の態様においては、本発明は、例えばＡｒｇ３
プロモーターおよび転写ターミネータ一部からなり、コ
ードづけ配列の挿入および表現のためのプロモーターお
よびターミネータ一部間に制限エンドヌクレアーゼサイ
トを有するｈＡＡＴを表現するのに用いることができる
酵母プラスミド表現ベクターである。

第１図は、Ａｒｇ３遺伝子を担うＰＲＩＴ１０７４９の
構造を示すフローシート、第２図は、中間プラスミドで
あるｐＲＩ　Ｔ１０７７２および１ｏ７７３の構造を示
すフローシート、第３図は、Ａｒｇ３調節部およびｈＡ
ＡＴヌクレオチド配列を有するｐＲＩＴ１０７８２の構
造を示すフローシート、第４図は、中間プラスミドであ
るＰＲＩＴ１０７７９の構造を示すフローシートである
。

発明の詳細 な説明の組換えＤＮＡ分子において、ｈＡＡＴコードづ
け配列は、酵母プロモーターにより促進される。この目
的のためにＡｒｇ３プロモータ一部が有用であることが
判明した。Ａｒｇ３プロモーター′は、クラビールら、
プロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンス・オフ・ザ・ユナイテッド　ステ
ィッ・オフ・アメリカ（Ｃｒａｂｅｅｌ　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）７８　：５０２６〜５０３０（１９８１）ｉｃ
より記載されているプラスミドである、ｐＹｅ　Ｕｒａ
　３　Ａｒｇ　３から誘導することができる。Ａｒｇ３
遺伝子は、そのＨｉｎｄ　ｍフラグメント上に担持され
る。Ａｒｇ３構造遺伝子は、オルニチン°カルバモイル
・トランスフェラーゼ（ＯＣＴ）をフードづける。プロ
モータ一部は、Ｘｈｏ　■−Ｈ１ｎｃ　ＩＩｌフラグメ
ント上で都合良く単離することができ、該Ｈｉｎｃ　■
は、Ａｒｇ３ＡＴＧの約２ヌクレオチド下流である。Ａ
ｒｇ３転写ターミネータ−を有する領域は、Ｈａｅ　１
ｌ−Ｈｉ　ｎｄ■フラグメント上で都合よく単離するこ
とができる。該転写ターミネータ−（ｔ【）は、転写を
安定させると考えられる。

ｂＡＡＴ：ｌ−ドづけ配列を担うＤＮＡフラグメントは
、ボレンら（Ｂｏｌｌｅｎ　ｅｔ　’ａｌ　）のベルギ
ー国特許第８９５，９６１号に記載されている様な公知
の技法により、全ヒト肝臓メツセンジャーＲＮＡ（ｍ　
ＲＮ　Ａ　）より得ることができる。典型的な方法では
、ｐｏｌｙＡ−ＲＮＡ、即ちｍ　ＲＮ　Ａを回収するた
めに、全肝［ＲＮＡを、オリゴ（ｄ【〕−セルロースカ
ラムに通す。全ｍ　ＲＮ　Ａを、大きさによって分画し
、約１４から１５５のｍＲＮＡを含有するフラクション
をスクロース密度勾配により集める。補助ＤＮＡ（ｃＤ
ＮＡ）は、逆転写酵素で処理すること　・により、ｉｎ
　ｖｉｔｒｏ　で該フラクションから逆転写により調製
される。１重鎖ｃＤＮＡは、ポリメラーゼで処理するこ
とにより２本鎖ＤＮＡになる。ＣＤＮＡの不均質集団は
、たとえばＳ１ヌクレアーゼ等で平滑末端化され、１１
００塩基対（ｂｐ）またはそれ以上のフラクションに分
画単離される。

単離されたフラクションはクローン化され、ｈＡＡＴヌ
クレオチド配列を獲得したことを確認する表現をするこ
とができる。ボレンら（Ｂｏｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ　）
は、単離したフラクションの３′末端をＧ末端にし、こ
れらをｐＢＲ３２２のＰｓｔエ　サイトにクローン化さ
せた。ｈＡＡＴ配列を担うＰＢＲ３２２誘導体をＰＵＬ
Ｂ１５２３　と同定した。

ライヒトら、ネイチャー（Ｌｅｉｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ　
、　Ｎａｔｕｒｅ）２９７　：６５５〜６５９（１９８
２）により開示されている如く、成熟ｈＡＡＴのはじめ
の３つのアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸お
よびプロリンである。従って、ＢａｍＨＩサイトは、次
に示すように、グルタミン酸およびアスパラギン酸に対
するコドンの間に位置する。

ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＣ Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

このように、成熟ｈＡＡＴのコードづけ配列は、ＰＩＴ
ＬＢ１５２３のＰｓｔ　エフラグメントのようなプレ６
ＡＡＴ　をコードづける配列をＢａｍＨＩて制限するこ
とにより、得ることができ、この際、もちろん該ｈＡＡ
ＴはＮ末端グルタミン酸が欠如している。

Ｎ末端グルタミン酸が欠如した成熟ｈＡＡＴは、天然の
成熟１１ＡＡＴと同様の作用を有すると考えられるため
、この差異は許容できるものである。

Ａｒｇ３プロモータ一部およびｈＡＡＴ遺伝子からなる
組換えＤＮＡ分子は、例えばプラスミドなどのベクター
となり得る。かかるベクターは、Ａｒｇ３プロモーター
−ｂＡＡＴ配列融合体を、例えば複製の２μプラスミド
源などのような複製部と結紮することにより組立てられ
る。かかるベクターは、気腫および他のｈＡＡＴ欠失に
関連した症状の治療に関して、ｈＡＡＴを産生ずるため
に用いられる。

これらのベクターに含まれるＡｒｇ３部は、サブクロー
ニング、あるいは、該部分または実質的に同じ部分、即
ち、１つまたは数個の塩基の添加、欠失または置換によ
って異なるが、作用の点からは、本質的に変化しない部
分の再構築により、他のベクターにおいて用いることが
できる。ｈＡＡＴに対するコードづけ配列を担う本発明
のプラスミドの特に好ましい具体例としては、ｐＲＩＴ
１０７８２およびＰＲＩＴ１０７８７が挙げられる。

Ａｒｇ３プロモーターおよび転写ターミネータ一部から
なる表現ベクターは、公に入手可能な材料を用いて公知
の方法により調製することができる。

本発明のプラスミド表現ベクターの具体的な例としては
、ｐＲＩＴ１０７７２、ＰＲＩＴ１０７７４　およびＰ
ＲＩＴ１０７７９が挙げられる。これらのプラスミドお
よびその池水発明の詳細を、以下の実施例でさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。全ての実施例において、酵母の形質転換は、ヒンネ
ンら、プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オフ・サイエンス・オフ・ザ・ユナイテッド
・スティン・オフ・アメリカ（Ｈｉｎｎｅｌ　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　７５　：　１９２９
〜１９３３（１９７８）の記載と実質的に同様に実施し
、イー・コリの形質転換は、「モレキュラ・クローニン
グ」、マニアテイスら（”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ　、、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、　ＮｅｗＹｏｒｋ）（１９８２）、ＰＰ２４９〜
２５１の記載と実質的に同様にして実施した。全ての実
施例は、市販の酵素および試薬を用いて実質的に販売社
の指示に従って、公に入手可能な出発物質を用いて実施
した。

実施例 実施例１ 中間プラスミドＰＲＩＴ１０７７４ ＰＲＩＴ１０７７４は、Ａｒｇ３遺伝子遺伝子由来上フ
ロモータ一部転写ターミネータ−（【（）部、ならびに
その間にＢａｍＨｌサイトを有する酵母−イー・コリシ
ャトルベクターである。該プラスミドは、転写開始コド
ン（ＡＴＧ）ををさない。これは、次の様にして調製さ
れる。

（へｐＭｃ２００ ｐＹｅ　Ｕｒａ　３　Ａｒｇ　３をＨｉｎｄｌ［で消化
すルコとにより、Ａｒｇ３遺伝子を特定する３　３００
　ｂｐの酵母ＤＮＡフラグメントを得る。プラスミドｐ
ＹｅＵｒａ３　Ａｒｇ　３は、クラビールら、プロシー
ディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ
・サイエンス・オフ・ザ・ユナイテッド・スティッ・オ
フ・アメリカ（Ｃｒａｂｅｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）７８　：５０２６（１９
８１）により記載されている。３３００　ｂｐの該フラ
グメントは、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄ■サイトにクロー
ン化され、イー・コ１ＪＫ１２株ＭＭ２９４に形質転換
される。形質転換体を、アンピシリン培地上で選択し、
テトラサイクリン耐性についてスクリーニングする。

形質転換コロニーは、Ｂｉｎｄｌｌｌ　サイトに挿入を
有するｐＢＲ３２２からなるプラスミドＰＭＣ２００を
含有することが判明している。Ａｒｇ３ＡＴＧの２塩基
対下流（３′）は、Ｈｉｎｃ［サイトである。第２図お
よび第４図参照。プラスミドＰＭＣ２００は、ブダペス
ト条約に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャーコレ
クシｍｌ　７　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、　Ｍａｒｙｌａｎｄ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）　ニ、寄託番号３９１３０で寄託されて
いる。

（Ｂ）　ｐ　ＲＩ　Ｔ　１０７４９ （第１図参照）精ｐ　Ｍ　Ｃ２００を）ｌｉｎｅｌＪで
消化し、１０％アクリルアミドゲル上で電気泳動に付す
。Ａｒｇ３調節部を含有する１　９４０　ｂｐのフラグ
メントを、電気溶出およびエタノール沈殿によりゲルか
ら回収する。約４μ７のフラグメントを０．２単位のＢ
ａ１３１エキソヌクレアーゼで、３０℃にて、１〜３秒
間、１２．５　ｒｎ　Ｍ　Ｍｇ　Ｃｔ　２．１２．５ｍ
ＭＣａ　Ｃ１２，２００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭエチレ
ンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）および２００’ｍＭ
　）ロメタミン−ＨＣ／を含有する緩衝液（ｐｔ−１ｓ
、ｏ　）　１００　ｔｉｌ中でインキュベートする。処
理したＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈殿
させる。１μｖずつを、デオキシヌクレオチド玉リン酸
の存在下、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュ
ベートして、１本鎖の末端を修復し、次いで、ＥｃｏＲ
Ｉエンドヌクレアーゼで消化する。この方法により、Ｂ
ａ１３１による切除によって、種々の長さのＤＮＡフラ
グメントが産生される。各フラグメントは、一端に固定
ＥｃｏＲＩ延長部および平滑末端で、もとのＨｉｎｃｌ
［サイトおよびＡｒｇ　３　ＡＴＧから離れたところに
位置する他端を有する。Ａｒｇ３調節部を含有する約１
４８０　ｂｐのフラグメントを、７．５％アクリルアミ
ドゲル上での電気泳動、次いて電気溶出およびエタノー
ル沈殿により単離する。このカットバックした調節部は
、ＯＴＣアミノ酸配列配列さない蛋白質の合成を起こす
転写を促進できるので好ましいものである。

反応の第２段階において、ｐ　Ｍ　Ｃ２００をＸｂａＩ
で消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌク
レオチド三リン酸とともにインキュベートすることによ
り、１本鎖の５′末端をうめるかまたは平滑末端にする
。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ　て消化し、Ｘｂａ　Ｉサイ
トの３′位に位置する酵母ＤＮＡ配列およびｐ　Ｂ　Ｒ
３２２配列を含有する約５７００　ｂｐのＥｃｏ　ＲＩ
−Ｔ４　／Ｘｂａ　ｌ：の犬７７グメントを、電気泳動
、電気溶出およびエタノール沈殿で精製する。

このフラグメントを１４８０　ｂｐのプロモーター含有
フラグメントと混合し、結紮する。

該結盟混合物を、イー・コＩＪＫ１２ＭＭ２９４株のコ
ンピテント細胞を形質転換するのに用いる。

形質転換細胞をアンピシリン寒天上で選択する。

プラスミドＤＮＡを、形質転換細胞コロニーから、ビル
ンボイムら、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｄｉ
ｒ’ｕｂｏｉｍ　ｅＬ　ａｌ　、、　Ｎｕｃｌ　、　Ａ
ｃ１ｄ、’　Ｒｅｓ、）　７　：１５１３（’１９７９
）　により記載された方法と実質的に同様にして単離し
、ＸｂａＪで消化することにより、Ｘｂａ■サイトの存
在についてスクリーニングする。Ｘｂａ■サイトは、反
応の第２段階で得たフラグメント上のうめられたＸｂａ
　：［が、３’Ｔ残基で終結する第１段階からの別のフ
ラグメントと結紮し、新しい位置においてＸｂａＩ認識
配列ｒｃＴＡｃｉ’が修復されるようなプラスミドにの
み存在する。

ｐＭｃ２００酵母ＤＮＡ挿入において、もとの１４ｉｎ
ｃ■サイトのヌクレオチド９個上流のＸｂａ：［サイト
を有するプラスミドは、ＰＲＩＴ１０７４９と同定され
た。言い換えれば、プロモーターは、ＨｉｎｃｌＩサイ
トの５′側方向の約１３個のヌクレオチドが欠失し、Ｔ
残基で終結するようになっているｐＹｅＵｒａ　３　Ａ
ｒｇ　３由来のＨｉ　ｎｄ　ｌ［−Ｈｉ　ｎｃ　■７　
ラグメント上に担持される。欠失したヌクレオチドは、
Ａｒｇ３ＡＴＧを含有する。Ｔ残基はうめられたＸｂａ
■サイトと融合し、該サイトの下流には、別のＯＣＴ配
列および転写ターミネータ−がある。

ＰＲＩＴ１０７４９のサンプルを、ＢｓｔＥＩＩ　オよ
びＸｂａ　■の組合せで消化する。欠失したＡｒｇ３調
節部の大きさは、同様にＢｓｔＥｌｌおよびＸｂａＩで
消化したｐＭｃ２００との比較、およびフックスら、ジ
ー７　（Ｆｕｃｈｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ）　４
　：　ｌ　（１９７８）により記載されている公知のフ
ァージｐｈｊＸ１７４ＤＮＡのフラグメントの分子量を
参照して、約２１０ｂｐと判断される。プラスミドＰＲ
ＩＴ１０７４９は、ブダペスト条約に基き、アメリカン
・タイプ。

カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ
　１’ｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、）に寄託番号３９１３３で寄託されている
。

（ＱＰＲＩＴ１０７７２ （第２図参照）プラスミドｐＲＩＴ１０７４９をＢａｍ
Ｈ工およびＸｂａ　工制限エンドヌクレアーゼで消化す
る。得られた最大のフラグメント（５５６０ｂｐ）を１
％アガロース中で電気泳動させ、次いでゲルからＤＮＡ
を電気溶出させることにより精製する。

１本鎖をうめるために、１μＶずつを、デオキシリボヌ
クレオチド三リン酸の存在下で、］”４ＤＮＡポリメラ
ーゼで処理し、１”４ＤＮＡＩＪガーゼの存在下に１６
℃にて１６時間インキュベートすることにより環化させ
る。この調製物は、イー・コリＭＭ２９．４をアンピシ
リン耐性に形質転換するのに用いる。Ａｒｇ３プロモー
タ一部に隣接するＢａｍＨエサイトを有するプラスミド
を含有することが判明している形質転換体の１つを選択
する。このブー）スミド、ｐＲＩＴ−１０７７２Ｘｂａ
　Ｉ−ＢａｍＨＩをｐＲＩＴ１０７７２と称する。

（Ｄ）ＰＲＩＴ１０７７３ （第２図参照）プラスミドｐＲＩ　”Ｉ’ｌ　０７７２
をＢａｍＨｉおよびＳａｌ：［で消化し、再び最大のフ
ラグメン）（５２５０ｂｐ）を、電気泳動に続いて電気
溶出することにより精製する。並行して、プラスミドｐ
　Ｍ　Ｃ２００をＨａｅｌ［およびＨｉｎｄｌｌｌで消
化し、Ａｒｇ３遺伝子の転写終止部を含有する１　３０
０　ｂｐのフラグメントを１０％アクリルアミドゲル上
で電気泳動に付し、続いて電気溶出をすることにより精
製する。

ＢａｍＨＩ−５ａｌ　Ｉフラグメント１００　ｎ？およ
び２ＭＣ２００の１−１ａｅ　ｌ［−Ｈｉ　ｎｄ　■７
ラグメント１００　ｎ９を混合し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼとインキユベートシ、５′延長部をうめ、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼて、１６℃にて１６時間で結紮する。該混合
物を、イー・コリＭＭ　２９４をアンピシリン耐性に形
質転換するのに用いる。数個の形質転換体のプラスミド
を分析し、そのうち、Ｈａｅ　ｌ［−Ｈｌｎｄ　ｌｌｌ
フラグメントの挿入が正しい配向にあるｐＲＩＴ１０７
７３を保持する。プラスミドＰＲＩＴ１０７７３は、Ａ
ｒｇ３プロモーターおよび転写終止部の間、即ちＢａｍ
１［およびＳａｌ　Ｉサイトの融合サイト、およびＨｉ
ｎｄｌ［−５ａｌ　工結合でのＢｉｎｄｌ［サイトに、
ＢａｍＨ■サイトを有する。このプラスミドにおいて、
外来性遺伝子の表現に不要な大部分のＡｒｇ３コードづ
け部を除去しである。ＢａｍＨＩサイトの付近の配列は
、ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＴＡ
Ｇ’ＧＡＴＣＣテする。

（Ｅ）ＹＥｐ　１３△Ｈｉｎｄｌ［ ベクターＹＥｐ１３は、イー・コリーサツカロミセス・
セレビシェ・シャトルベクターである。これは、ブロー
チら、ジー７　（ＢｒｏａｃＪｔ　ｅｔ　ａｌ　、、　
Ｇｅｎｅ）８　：　１２ｉ（１９７９）により記載され
ており、ＡＴＣＣより寄託番号３７１１５で、入手可能
である。

Ｈｉｎｄｌの小フラグメントを、プラスミドがら、Ｈｉ
ｎｄｌｌＩで消化することにより切断し、該プラスミド
を再結紮し、単一のＨｉｎｄｌ［サイトを含有する誘導
体プラスミドであるＹＥｐ１３１−１ｉｎｃＪ　Ｉｌｌ
を調製する。

（Ｆ）ＰＲＩＴ１０７８８ イー・コリー酵母シャトルベクターＹｅｐ１３△Ｈｉｎ
ｄｌｌＩのＸｈｏｌ：およびＢａｍＨＪサイトを、以下
の方法で除去する。プラスミドを１３ａｍｌ（■で処理
する。５′延長部を、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼでうめ
、ＤＮＡをＴ４ＤＮＡＵガーゼで再環化させ、イー・コ
ｌＪＭＭ２９４の形質転換に用いる。形質転換細胞の１
つから回収したプラスミドを、制限酵素をＸｂｏ：［に
する以外は、前記と同様にして処理する。

ベクターｐ　ＲＩ　Ｔ　１０７８８が得られる。

（Ｇ）ＰＲＩＴ１０７７４ Ａｒｇ３調節要素を含有するＰＲＩＴ１０７７３由来の
２７５０　ｂｐのＨｉｎｄｉ７ラグメントを、１％アガ
ロース上で電気泳動に付し、次いで電気溶出することに
より精製し、再環化を防止するため、Ｈｉｎｄｌ［およ
びリン酸アルカリで処理したｐＲＩＴ１０７８８と結紮
する。イー・コｌＪＭＭ２９４の形質転換後、表現ベク
ターｐＲＩＴ１０７７４が得られる（第３図参照）。

、このベクターは、イー・コリおよび酵母双方において
複製でき、特異的なりａｍＨ：［サイトを有し、該サイ
トにおいては、翻訳開始コドンを含有する外来性コード
づけ配列を挿入することができる。

前記の操作の結果、これは、Ａｒｇ３ｔｔを担うｐＹｅ
Ｕｒａ　３　Ａｒｇ　３のＨｉｎｄ　ｌＩ　−Ｘｂａ　
ｉ　７ラグメントからなる。

実施例２ ＰＲＩＴ１０７７４におけるプレｈ　ＡＡＴ（第３図参
照）プラスミドｐＵＬＢ１５２３は、５′末端に１４　
ｂｐ、３′末端に約１００　ｂｐの、オリゴｄＣ／オリ
ゴｄＧホモポリマー延長部により、プラスミドｐＢＲ３
２２のｔ’ｓｔ■サイトにクローン化された非二ノード
づけ配列を含め、ｈＡＡＴｃＤＮＡ　を含有スる。この
プラスミドは、エイ・ボレン博士（Ｄｒ、　Ａ、Ｂｏｌ
ｌｅｎ　）より入手し、ヘルギー国特許第８９５．９６
１号に記載されている。ＰＵＬＢ１５２３の１４ｏｏｂ
ｐ挿入部を、Ｐｓｔ工で切断後、７％アクリルアミドゲ
ル上での電気泳動に続いて電気溶出することにより精製
する。プレ・ｈＡＡＴのＡＴＧ開始コドンの上流の不要
なヌクレオチドを除去するため、該フラグメントｌＯ／
ｌｙをエキソヌクレアーゼＢａ１３１で処理する。Ｔ４
−ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、得られた調製物１
５０　ｎｆを、予めＢａｍ　ｌ−１：［および”ｌ−４
ＤＮＡポリメラーゼで処理したプラスミドＰＲＩＴ１０
７７４　４５０ｎｙと混合する。混合物をＴ４ＤＮＡＩ
Ｊガーゼとともに１６℃にて１６時間インキュベートし
、イー・コリをアンピシリン耐性に形質転換するのに用
いる。

数個の形質転換体のプラスミドを、ｈＡＡＴＤＮＡ配列
の配向に関して分析する。挿入部が表現に関して正しい
配向にあるプラスミド、ＰＲＩＴ１０７８２゜１０７８
３．１０７８９．１０７９０および１０７９１を選択し
、サツカロミセス・セレビシェＩｃ１６９７ｄ株【こ形
質転換し、ロイシン独立コロニーを選択する。

ＩＣ１６７９６株（ａｒｇＪ、　１ｅｕ２−１　）は、
アルギニン・ブラディトローフである。これは、ブダペ
スト条約に基づいて、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　）　＋Ｃ１寄
託番号２０６３１で寄託されている。ｐ　ＲＩ　Ｔ　１
０７８２におけるＡｒｇ　３　Ｌ　ｈＡＡＴ結合テノ配
列は、マキサム・ギルバートの方法により決定すると、
本質的に以下の通りである。

ＴＣＧＡＣＡ墾　ＣＣＧ　ＴＣＴ　３’本質的にとは、
実質的に分子の活性を変えることなく、実際の配列が、
ｌまたは数個の塩基が異っていたり、自然にまたは意図
的に、ｌまたは数個の塩基が置換される可能性があるこ
とを意味する。

実施例３ ｐＲＩＴ１０７８２の表現 （へ抽出物 株を、４μｙ　／ｍｅのアルギニンを捕捉したイースト
・ナイトロジエン・ベース培地中で、光学密度が６２０
　ｎｍにおいて０．５〜０，６に達するまで増殖させる
。３５０　ｍｅの培養液由来の細胞を、５０００ｙ＋ｃ
て５分間遠心分離して回収し、１００ｍＭトロメタミ７
−ＨＣ／　（ｐＨ７，４）、１００　ｍＭ　ＥＤＴＡ１
２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ
）、０．３％トリトンＸ、１００　５＋＋＋ｔ’に再懸
濁させる。該細胞を、１２．０００ＰＳｊ　（８１，７
ＭＰａ）　のフレンチプレッシャー・セルに２回通して
破壊し、フレンチ・プレスで崩壊させる。抽出物を次い
で１０．０００　ｒＰｍにて４０分間遠心分離し、フォ
ーリン法（濃度を３　ｒｎｇ／ｍｅに調整）を用いて上
清のタンパク質濃度を検査する。

（Ｂ）抽出液における１１ＡＡＴの免疫学的検出酵母エ
キスを、以下の様に、増強サンドイッチ酵素結合免疫吸
着剤分析により分析する。ジエチルアミンエチレン（Ｄ
ＥＡＥ）−精製ヤギ抗ｈＡＡＴ（免疫）由来ＩｇＧフラ
クションのｐｌ−１８のリン酸緩衝液食塩水（Ｐ　Ｂ　
Ｓ　）中溶液（８ｔｔｙ／ｍｅ）１００ｔｔｔを４℃に
て一夜、１００μｌ／孔の、ｈＡＡＴ標阜物または酵母
エキスのリン酸緩衝液（ＰＨ８）、１％の牛血清アルブ
ミンおよび１０％の馬血清（ＰＢＳ−ＢＡ−Ｈ５）中希
析液とともにインキュベートスル。

０．１％ツイーン８０を含有するＰＢＳ（ｐＨ８）で数
回洗浄した後、マウス抗ｈＡＡＴ血清のＰＢＳ−ＢＡＳ
−Ｈ５中１／３０００　希釈液を添加し、４℃にて一夜
インキユベートする。数回洗浄した後、結合したマウス
抗体を、ペルオキシダーゼでラベルしたヤギ抗マウス免
疫グロブリン（１μｙ　／ｍｅ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　−ＢＡ−
Ｈ５中溶液、０．１％ツイーン８０）により室温にて４
時間反応させ、酵素の色素産生性基質として（０，４■
オルトフエニレンジアミンおよび０．２〜／ｄ過酸化尿
素の０．１　Ｍ　Ｕン酸緩衝液ｐＨ５中溶液）オサリバ
ンら、メリーズ・イン・エンザイモロジ−（０８ｕｌｌ
ｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　）　７３　：　１４７（１９８１）　
により記載されているのと実質的に同様な基質を用いて
検出する。吸光度ハ、ダイナチック（ＤｙｒｎＬｅｃｈ
　）　ＡＭ　１２０マイクロエライザ・オートマチック
・リーダーで、４９５　ｎｍにおいて読みとる。〔へり
オンら、バイオサイエンス・レボ−７（１（ｅｒｉｏｎ
　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　）　３　：　
３８１〜３８８　（１９８３）　）。

ＰＲＩＴ１０７８２を担う酵母株は、最大量の抗トリプ
シン状物質を産生ずることが判叩した。以下の第１表を
参照。

第１表　種々のプラスミドを担うＩＣ１６９７ｄ株×総
タンパク質３ｎＩ／ｌｌ１１！に調整実施例４ 株におけるｈＡＡＴ表現の形質化 ＩＣ１６９７ｄ　（ＰＲＩＴ１０７８２）およびＩＣ１
６９７ｄ（ｐＲＩＴ１０７８３） （Ａ）抽出液 ＩＱ’ｍｌ’培養液由来の酵母ペレットを、以下の様に
、沸騰ドデシル硫酸す）　ＩＪウム（ＳＤＳ）中で溶菌
させる。該ペレットを、０．５艷のＳＤＳ試料緩衝液（
５０ｍＭトロメタミ７−ＨＣｚＳｐＨ７，５；　ＳＤＳ
、１％；β−メルカプトエタノール、１％；およびグリ
セロール、１０％）、０．３％トリトンＸ１００中に再
懸濁させ、１００℃にて３分間煮沸する。次いで抽出液
を１０，００　Ｑ　ｒｐｍｌこて１０分間遠心分離する
。これらの試料は、そのままゲル分析に用いることがで
きる。数例において、該抽出液を２容の氷酢酸および最
終濃度５５ｍＭの酢酸マグネシウムで、４℃にて１時間
処理する。１０．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離した
後、上清を１０容のアセトン（−２０℃）で処理すると
、タンパク質が沈殿する。これを１０．００　Ｏｒｐｍ
にて遠心分離し、ペレットを乾燥し、ＳＤＳゲル電気電
気用動用当な緩衝液に再懸濁する。

（Ｂ）エレクトロ・プロツテイング ラエムリ、ネイチャー（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　）２２７　：６８０〜６８５（１９７０）によ
り記載されてｌ、）るのと実質的に同様にして、ＳＤＳ
の存在丁にポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なう。

ＦＡ）で得られたＳＤＳポリアクリルアミドゲルスラブ
を４０−の蒸留水で２回、５ＱｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）で２０分間ずつ３回簡単に洗浄する。同じ緩
衝液中、１０ポル）、０．８アンペアにて２時間、ニト
ロセルロースのシート上で移動を行なう。

（ｑニトロセルロース・プロット上での免疫検出前記（
Ｂｌで得られたニトロセルロースのシートを０．１％ツ
イーン８０．１０％馬血清および１％牛血清アルブミン
を含有するｐＨ７，５のＰＢＳ、１７衝液で飽和させ、
室温にて４時間放置する。その後、該シートを、０．１
％ツイーン８０を含むｐＨ７，５のＰＢＳ緩衝液で２０
分間ずつ３回洗浄腰マウス抗ｈＡＡＴ血清（１／１００
０希釈液）を捕捉した飽和緩衝液２５−で、室温にて一
夜インキユベートする。

０．１％ツイーン８０を含有するｐＨ７，５のＰＢＳ緩
衝液４　Ｑ　ｍｅで５回、約２時間で該シートを洗浄し
、次いで１０μｔｙ／ｍｅのペルオキシダーゼでラベル
したヤギ抗マウス血清（ＣＡＭ−ＰＯＤ）を含有するＰ
ＢＳ−ツイーン緩衝液２５ｍ１中、室温にて４時間イン
キュベートする。次に、該シートをＰＢＳ−ツイーン緩
衝液で約２時間洗浄する（５回、４　ｏ　ｍｅ　）。ニ
トロセルロースシートを、２５分間、色素産生性基質（
１０■ジアミノベンジジンおよび１００μｌ過酸化尿素
（１０％）の５０　＋ｄ　０．１　Ｍトロメタミン緩衝
液（ｐＨ７，６）中溶液）中で処理することをこより、
免疫検出を行なう。最後に該シートを、蒸留水で洗浄す
る。５５．５３、および４４キロダルトンの生成物が、
ｐ　ＲＩ　Ｔ　１０７８２株由来の抽出液中に、免疫検
出された。サイズは、分子量標準品の移動に基いた検量
曲線より決定する。該標準品は、酵母エキスと同じゲル
分析に付す。

実施例５ ＩＣ１６９７ｄ株（ｐＲＩＴ１０７８２）により産生さ
れるｈＡＡＴの抗体認識 一定量のｈＡＡＴを含有するＩＣ１６９７ｄ（ｐＲＩＴ
１０７８２）の酵母エキスを、増強サンドイッチ酵素結
合免疫吸着剤分析をこおいて同量の天然のｈ　ＡＡ”１
と比較する。ヤギ抗ｂＡＡＴ　ＩｇＧを、血漿由来のｈ
ＡＡＴに対して生じる単りローン性抗ｈＡＡＴ抗体にか
える以外は、前記と同様の方法で行なう。へりオンら（
）（ｅｒｉｏｎ　ｅｔ　ａｌ　）のベルギー国特許第８
９６．５４３号を参照。結果を第２表に示す。

実施例６ 中間プラスミドＰＲＩＴ１０７７９ プラスミドｐＲ，ｌＴ１０７７９は、プロモータ一部お
よびＡｒｇ３遺伝子由来の（１部、ならびにその間（（
Ｉ　ＢａｍＨ■サイトを有する、イー・コリー酵母シャ
トルベクターである。該プラスミドは、翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）を担う。これを以下の採にして調製した。第
４区目こ示す。

プラスミドｐＭｃ２００をＨｉｎｃＪＪサイトで消化し
、Ａｒｇ３プロモーターを含有する１　９４０　ｂｐの
フラグメントを、７％アクリルアミドケル中で電気泳動
し、次いて電気溶出することにより精製する。Ａｒｇ　
３　Ａ　Ｔ　Ｇの下流の２個のヌクレオチドを除去する
ために、該フラグメント６μ７をエクソヌクレアーゼＢ
ａ１３１で処理する。全ての１本鎖を修復するためｔこ
］４・ＤＮＡポリメラーゼで処理し、Ｘｈｏｌ：で消化
した後、得られたフラグメント（長さが約７５０　ｂｐ
て、Ｂａ１３１消化の程度に応じて、一方に固定Ｘｈｏ
Ｊ末端を有し、他方に平滑末端を有する）の混合物を、
７％アクリルアミドゲル上での電気泳動および電気溶出
により精製する。

並行して、プラスミドｐＲＩＴ１０７７４を、連続的に
、Ｂａｍ１−ＩＩ、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ（平滑末
端のＢａｍＨＩ鎖）およびＸｈｏｌで処理する。得られ
た１２，３５０ｂｐのフラグメントを、０．８％アガロ
ース中での電気泳動および電気溶出により精ａする。こ
のフラグメント２００　ｎｙをＢａ１３１処理フラグメ
ント１００　ｎｆと混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで結
紮する。該混合物は、イー・コＩＪＭＭ２９４をアンピ
シリン耐性に形質転換するの４こ用いられる。

数個の形質転換細胞のプラスミドを正しい位置、即ち、
Ａｒｇ３開始コドンに隣接する位置でのＢａｍＨ■サイ
トの存在に関して分析する。これらの操作の結果、プロ
モータ一部は、ｐＹｅ　Ｕｒａ　３　Ａｒｇ　３におけ
るＨｉｎｃｌｌｌの上流が、約１３個ではなく、２個の
ヌクレオチドを欠失している以外は、ＰｋＩＴ１０７４
９由来のプラスミドにおいてと同様である。Ａｒｇ３ｔ
ｔは、Ａｒｇ３ｔｔを担うｐＹｅ　Ｕｒａ　３　Ａｒｇ
３の１−１ａ　ｅ　ｌ［７１−１ｉ　ｎｄ　ｉｌｌフラ
グメント上にある。選択されたプラスミドｐＲＩＴ１０
７７９のＢａｍＨＩサイトにおける配列は、実質的に以
下のとおりである。

５’　ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴ１７ＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴ
ＴＡＣＣ捜没　ＧＡＴ　ＣＣＣＣＡＧ　３’このプラス
ミドは、イー・コリおよび酵母の両方で複製でき、開始
コドンを有さない外来性コードづけ配列を、ＢａｍＨｆ
１およびマンビーン・ヌクレアーゼのようなヌクレアー
ゼで処理した後、またはＮｃｏＩおよびＴ４−ＤＮＡポ
リメラーゼなどのポリメラーゼで処理した後、挿入する
ことができる２個の特異的制限サイ）　（ＢａｍＨＩお
よびＮｃｏＩ）を有する。

実施例７ ＰＲ１１’１０７７９ｉこおけるＩＩＡＡＴｈＡＡＴコ
ードづけ配列は、成熟タンパク質の第２アミノ酸に対す
るコドンと重複するＢａｍＨＩサイトを含有する〔ライ
ヒトら、ネイチャー（Ｌｅｉｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ　、　
Ｎａｔｕｒｅ　）　２９７　：　６５５〜６５９　（１
９８２）参照〕。　このサイトの解読フレームは、プラ
スミドｐ　ＲＩ　ＴＮｏ　７９９におけるのと同様であ
る。

これらのＢａｍ）ｌ■サイトを組み換えることにより、
該解読フレームは、タンパク質の酵母における表現が、
第１アミノ酸がグルタミン酸ではなく、メチオニンであ
る以外はｈＡＡＴ　と同一のまま保持される。ＢａｍＨ
Ｉサイトは、プラスミドｐ　ＲＩ　Ｔ１０７８２におい
て特異的であり、以下の組み立てよりなる。

ＰＲＩＴ１０７８２をＸｈｏｌ：およびＢａｍＦｌｌで
消化し、最大（１３，７００ｂｐ　）のフラグメントを
１％アガロースゲルから精製する。並行して、ｐＲＩＴ
１０７７９を同一の酵素で消化し、Ａｒｇ３プロモータ
ーを含有する最小（７５０ｂＰ）のフラグメントをアク
リルアミドゲルから精製する。１３７００ｂｐのフラグ
メント３００　ｎ！を７５Ｑｂｐ　のフラグメン）１０
０ｎＰと混合する。該混合物をＴ４　ＤＮＡリガーゼで
処理し、ＭＭ２９４をアンピシリン耐性に形質転換する
のに用いる。ｈ、ＡＡＴの表現について正しい構造を有
する組み換えプラスミド、ｐＲ１１’１０７８７　は、
該形質転換細胞の１つから得られる。Ａｒｇ　３−ｈＡ
ＡＴ結合での配列は、マキサム・ギルバート法により、
実質的に以下の様に決定された。

５’　にＣＣＡＴＣＡＡＣ１ｍＴＡＣＡ（、ＴＣＧｒ１
７ＡＣ唖ＧＡＴ　ＣＣＣＣＡＧ　３’実施例８ ｐＲＩＴ１０７８７の表現 実質的に前記と同様にして、酵母ＩＣ１６９７ｄ株をＰ
ＲＩＴ１０７８７で形質転換し、Ｎ−末端メチオニンを
有する成熟ｈＡＡＴを表現することが判明した。

実施例９ 酵母において産生されるｈＡＡＴの生物学的活性微量分
析におけるトリプシンに対するヒトｈ　ＡＡＴの抑制能
力は、酵母エキスにおける活性の尺度とみなされる。微
量分析では、鎖状１ｉ　ＡＡＴ調製物またはクローンｐ
　ＲＩ　Ｔ　１０７７４、ｐＲＩＴ１０７８２およびρ
ＲＩ　Ｔ　１０７８７由来の抽出物のいずれかの存在下
で、トリプシンにより色素産生性基質を開裂する。分析
は以下の様にして行なう。９６個の孔のポリスチレンミ
クロテストプレートを、まず１時間１％牛血清アルブミ
ン溶液とともにインキュベートし、次いで蒸留水でよく
洗浄する。種々の濃度（７）ｈＡＡＴを一定量のトリプ
シンと、２０分間３７°口こて、最終的に２００μ！容
の反応溶液（反応緩衝液は０．１　Ｍ　）　０　メタ−
７８Ｃ／、　ＰＨ８，２：　０．１５Ｍ△ ＮａＣ４；　０．ＯＬＭ　ＥＤＴＡおよび０．５％ボリ
エｆレンゲリコール６０００からなる）中でインキュベ
ートする。試料を徐々に室温に冷却し、次いで色素産生
性基質（Ｓ２４４４（Ｌ−ピログルタミル−グリシル−
Ｌアルギニン、Ｐ−ニトロアニリド塩酸塩、Ｋａｂｖｉ
　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉａ　−５ｗｅｄｅｎ　）の０．０
０３Ｍ水性溶液２０μｌ）にさらす。室温で５分間静置
後、５０％酢酸５０μｌで反応を停止する。ミクロエリ
ザオートマチックリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＡＭ１
２０）で、４０００ｍでの吸光度を読みとる。トリプシ
ンおよびｈＡＡＴ両方に関して校正曲線をめる。分析す
る酵母エキスを、順次反応緩衝液中に稀釈する。

結果を、以下の第３表に示す。

第３表　酵母におけるｈＡＡ’Ｔの表現および活性（−
）：活性なし；　（＋）　：中程度の活性（少なくとも
分子の１０％が活性を示す）　；　（＋＋＋）　：高活
性（少なくとも３０％の分子が生物学的に活性である）
分析は、ｈＡＡＴの抑制因子を含有している可能性のあ
る酵母エキスに関して行なうので、活性に関するデータ
は、定性的な値だけである。

プレｈＡＡＴ産生細胞においては、著しい活性はみられ
なかった。しかし、クローンＰＲＩＴ１０７８７におい
て産生された成熟ｈＡＡＴは、活性を示し、ペプチダー
ゼ欠乏酵母株における最適活性である。

標準活性曲線と比較すると、酵母産生成熟ｈＡＡＴは、
少なくとも３０％活性であると考えられる。

プレｈＡＡＴは、公知の成熟ｈＡＡＴ調製法により開裂
することができる。

実施例１０ 酵母産生ｈＡＡＴの分子形質化 酵母において産生されたｈＡＡＴ分子の同定を確認する
ため、ＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、
ＰＲＩＴ１０７７４、ｐＲＩＴ１０７８２およびＰＲＩ
Ｔ１０７８７クローン由来の酵母エキスに関して実施す
る。分離したタンパク質を次いでニトロセルロースのシ
ート上に電気的に吸着させ、今度は、これを、マウス抗
ｈＡＡＴ血清、ＧＡＭ−ＰＯＤおよび適当な色素産生性
基質で処理する。プラスミドｐＲＩＴ１０７８７は、公
知の成熟非グリコジル化ｈＡＡＴの分子量と一致して、
４４，０００ダルトンの分子量を有する１個のポリペプ
チド合成に用いられる。プレプロティンをコードづけす
るプラスミドＰＲＩＴ１０７８２は、ｉ）処理ｈＡＡＴ
となりうる４４．０００ダルトン以下の種；　ｉｉ）プ
レプロティンに対応する４７，０００ダルトンの分子（
成熟タンパク質および２４個のアミノ酸からなるそのペ
プチド）；および１ｉｉ）部分的にグルコシル化１１Ａ
Ａ”ｌ−と一致し得る５　０，０００および５３，００
０ダルトン以上の種の数個のポリペプチドの酵母におけ
る合成をする。

以上のように、本発明の好ましい具体例を詳細に記載し
たが、本発明は、前記の構造に限定されるものではなく
、むしろ本発明の精神を逸脱しないあらゆる修正も、本
発明に含まれるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ａｒｇ　３遺伝子を担つＰＲＩ−１−１０７
４９の構造を示すフローシート、第２図は、中間プラス
ミドであるＰｋＩＴ１０７７２および１ｏ７７３の構造
を示すフローシート、第３図は、Ａｒｇ３調節部および
ｈＡＡＴヌクレオチド配列を有するｐＲＩＴ１０７８２
の構造を示すフローシート、第４１Ｎ’ｌ（、中間プラ
スミドであるＰＲＩ−［１０７７９の構造を示すフロー
シートである。 、Ｔ−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒトα−１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ−）をコー
   ドづけするヌクレオチド配列、および酵母においてｂＡ
   ＡＴ配列の転写を行なうことができる調節部からなるこ
   とを特徴とする組換えＤＮＡ分子。 （２）調節部が、酵母Ａｒｇ３プロモーターからなる前
   記第（１）項の分子。 ｉ３）　ｂ　ＡＡＴヌクレオチド配列が、成熟ｈＡＡ−
   ｒをコードつけする前記第（１）項または第（２）項の
   分子。 （４）プロモータ一部がＡｒｇ３ＡＴＧを含まず、調節
   部が、さらにＡｒｇ３転写ターミネータ−を有する前記
   第（２）項の分子。 （５１ｈＡＡ’ｌ−配列か、プレＪＩＡＡＴの前駆体部
   に対応する２４個のコドンを担う１３７０　ｂｐのＰｓ
   ｔフラグメントである前記第（４）項の分子。 （６）プロモーターｈＡＡＴ配列の結合か、実質的に以
   下の様である前記第（５）項の分子。 ５’　ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＡＣ：ＡＣＴＣＧＴ
   ＣＧＡＣＡＡＴＧ　ＣＣＧ　ＴＣＴ　３’（７１Ａｒｇ
   ３調節部および実質的に、ＰＲＩＴ１０７８２に含まれ
   るｈＡＡＴコードづけ配列を有する前記第（５）項の分
   子。 （８）プロモータ一部がＡｒｇ３ＡＴＧを含み、調節部
   がさらにＡｒｇ３転写ターミネータ−からなる前記第（
   ２）項の分子。 （９１ｈＡＡＴ配列が、５′末端が成熟ｈＡＡＴの第２
   アミノ酸で始まり、Ａｒｇ　３　ＡＴＧの下流に直接に
   挿入されたＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ　エフラグメントである
   前記第（８）項の分子。 （１０）プロモーターｈＡＡＴ配列結合が、実質的に以
   下の様である前記第（８）項の分子。 ５　ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴｒＡ
   ＣＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＣＣＣＣＡＧ　３’（１１１実質
   的にｐ　ＲＩ　Ｔ　１０８７８　ニ含まれるＡｒｇ３ｈ
   ＡＡＴ　コードづけ配列を有する前記第（９）項の分チ
   ０ （１り前記第（１）項から第（１１）項いずれ１つの分
   子により形質転換された微生物。 α３１Ａｒｇ３プロモーターおよび転写ターミネータ一
   部からなり、コードづけ配列の挿入および表現に対する
   プロモーターおよびターミネータ一部間ニ制限エンドヌ
   クレアーゼサイトを有する酵母プラスミド表現ベクター
   。 圓実質的にｐｇｘ’ｒ１０７７３に含まれるＡｒｇ３部
   を担う前記第（１３）項のベクター。 （１５）実質的にＰＲ１’ｒ１０７７４に含まれるＡｒ
   ｇ　３部を担う前記第（１３）項のベクター。 （１６）実質的にｐＲＩＴ１０７７９に含まれるＡｒｇ
   ａ部を担う前記第（１３）項のベクター。 （１７１ヒト−α−１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）をコ
   ードつけるヌクレオチド配列を、酵母におけるｈＡＡＴ
   配列の転写を行なうことができる調節部に結紮すること
   からなることを特徴とする組み換えＤＮＡ分子の調製方
   法。 （１８）調節部が、酵母Ａｒｇ３プロモーターからなる
   前記第（１７）項の方法。 Ｑ９１ｈＡＡＴヌクレオチド配列が、成熟ｈＡＡＴをコ
   ードづける前記第（１η項または（１８）項の方法。 （２０）プロモータ一部がＡｒｇ３ＡＴＧを含まず、調
   節部がさらにＡｒｇ３転写ターミネータ−からなる前記
   第０８）項の方法。 ＋２１）　ｈＡＡＴ配列が、プレ！ＩＡＡＴの前駆体部
   に対応する２４個のコドンを担う１３７０　ｂｐのＰｉ
   ｔ　■フラグメントである前記第（２０）項の方法。 （社）プロモーターｈＡＡＴ配列結合が、実質的に以下
   の様である前記第の）項の方法。 ５　ＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＴ
   ＡＧＧＡＴＣＧＧ　ＡＣＡＧＴＧ　ＡＡｌ”ＣＧＡＣＡ
   舐　ＣＣＧ　ＴＣＩ−３’（２３１Ａｒｇ３調節部およ
   び実質的にＰＲＩＴ１０７８２に含まれたｈＡＡ］’コ
   ードづけ配列を有する前記第？Ｉ）項の方法。 （財）プロモータ一部がＡｒｇ３ＡＴＧを含み、調節部
   がさらにＡｒｇ３転写ターミネータ−からなる前記第０
   ８）項の方法。 （２５）ｈＡＡＴ配列が、５′末端が成熟ｈＡＡＴの第
   ２アミノ酸で始まり、Ａｒｇ　３　ＡＴＧの下流に直接
   挿入されたＢａｍＨＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉフラグメントであ
   る前記第（２４）項の方法。 （２６＋プロモ一ターｂＡＡＴ配列結合が実質的に次の
   とおりである前記第（２４＋項の方法。 ５’　ＣＣＣＡＴＣ：ＡＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣ’１−Ｃ
   ＧＴｒＡＣＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＣＣＣＣＡＧ　３（２７
   ）実質的１ｃｐＲＩＴ１０７８７に含まれるＡｒｇ３ｈ
   ＡＡＴコートつけ配列を、分子が有する前記第（２５）
   項の方法。 （支））前記第０η項から第（２７１項いずれか１つの
   分子を、酵母細胞中に導入することからなることを特徴
   とする微生物を形質転換する方法。 （２９）コードつけ配列の挿入および表現のために、プ
   ロモーターおよびターミネータ−間に、制限エンドヌク
   レアーゼサイトを導入することからなることを特徴とす
   る、Ａｒｇ３プロモーターおよび転写ターミネータ一部
   からなる酵母プラスミド表現ベクターの調製方法。 （３０ベクターが、実質的にｐＲＩＴ１０７７３に含ま
   れるようなＡｒｇ３部を有する前記第（２９）項の方法
   。 （３１）ベクターが、実質的にＰＲＩＴ１０７７４に含
   まれるようなＡｒｇ３部を有する前記第１９＋項の方法
   。 （３２）ベクターが、実質的にｐ　ＲＩ　Ｔ　１０７７
   ９に含まれるようなＡｒｇ３部を有する前記第（２９）
   項の方法。