JPS60181020A - 高粘性多糖体を有効成分とする抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はクレブシェラ属（旧ｅｂｓｉｅｌｌａ）に属す
る特定な菌株を培養して得られる多糖体を有効成分とす
る抗腫瘍剤に関する。

近年、植物及び微生物の生産する多糖体の生理活性に関
する研究報告が数多くなされており、特に、担子菌類の
熱水抽出物や培養生産物から分離、採取される多糖体の
うちには抗腫瘍剤として実用化されているものもある。

本発明者は、種々の微生物が生産する多糖体の抗腫瘍活
性についての研究の一環として、クレブシェラ属（Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ）に属する莢膜を有する微生物が生産
する莢膜多糖体の抗腫瘍活性について検討した結果、ク
レブシェラ　セロタイプ（■吐−虹旦Ｕ　鎖匹旦匹）に
属する公知菌株であるに、−４６株が生産する多糖体及
び該多糖体を化学修飾したものが抗腫瘍活性を示すこと
を見出し、本発明をなすに至った。

したがって、本発明はクレブシェラ　セロタイプに一４
６株が生産する多糖体を有効成分とする抗腫瘍剤を提供
することを目的とする。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明に係る抗腫瘍剤は、クレブシェラ　セロタイプに
一４６株を培養して得られる多糖体を有効成分とするこ
とを特徴とする。

本発明で利用する微生物であるクレブシェラセロタイプ
に一４６株は、微工研菌寄第７３７３号（ＦＥＲＭ、Ｐ
−７３７３）の番号で工業技術院微生物工業研究所に受
託されており、下記のとおりの菌学的性質を有する。

なお、上記菌株の形態学的性状及び生理学的性質は、特
記しない限りペプトン５ｇ、肉エキス３ｇ、食塩１ｇ及
び絹製水２から成る栄養培地を基本培地として用い、又
、特記しない限り好気的条件下で生育を行なりで観察し
た結果を示したものである。

タレブシエー　セロ　イブに−４６の　８・（１）形態
学的性状 上記基本培地１１に寒天１５ｇを加えた栄養寒天培地を
用いた。

ダラム染色陰性、桿状で平均０．８　Ｘ　Ｌ、６〜１．
８μの大きさを有し、運動性がなく、胞子形成がなく莢
膜を形成する。

（２）各種培地における生育状態 ■上記栄養寒天培地での嫌気培養により生育良好。

■上記培地の寒天平板培地での生育良好、平板上の集落
は正円状で隆起しており、湿潤で均質な止縁を有し、粘
稠性でかつ光沢を有する。

色素の生成なし。

■前記基本培地からなる液体培地での生育良好、濁りを
生し、菌膜の形成なし、沈澱を生ずるも培地の着色みら
れず。

■マツコンキイ　（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ　）培地及びＣ
ＶＴ培地での生育はいずれも良好であり、前者では赤褐
色のコロニーを、後者では紅色のコロニーを示す。

■キングＡ培地及びキングＢ培地での生育はいずれも良
好、水溶性色素を産生じない。

■ＰＥＡ培地では生育せず。

■上記栄養培地に馬脱せんい血液を加えた培地では溶血
性を示さない。

（３）生理学的性質 （１）ゼラチンの液化　陰性 （２）ゼラチンの分解　陰性 （３）デンプンの加水分解　陰性 （４）カゼインの加水分解　陰性 （５）リドマスミルクに対する反応　凝固リドマスを脱
色 （６）ブドウ糖の酸化（ＯＦテスト）Ｆ型（７）糖の分
解性　下記に示すとおり 糖　酸産生　ガス産生 Ｄ−グルコース　＋　−ト ロ−マンノース　４　＋ Ｄ−ガラクトース　＋　＋ Ｄ−キシロース　＋　＋ Ｌ−アラビノース　＋　＋ Ｄ−フラクトース　＋　＋ ショ糖　＋　＋ ラクトース　十　− デンプン　十　− グリセロール　＋　＋ マニトール　＋　＋ イノシトール　十　− セルビオース　＋　− ズルシット、−一 マルトース　＋　− ソルボース　−　− ７ドニツト　＋　＋ （８）硝酸塩還元能　陰性 （９）硫化水素の産生　陰性 （１０）ＭＲ反応　陽性 （１１）ＶＰ反応　陽性 （１２）インドールの生成　陰性 （１３）ＩＰＡ反応　陽性 （１４）チトクロームオキシダーゼ反応　陰性（１５）
カタラーゼ反応　陽性 （１６）クエン酸塩の利用　陽性 （１７）酒石酸から酸の酸化　陽性 （１８）尿素分解能　陽性 （１９）アルギニンのアルキル化　陰性（２０）オルニ
チン脱炭酸能　陰性 （２１）リジン脱炭酸能　陽性 （２２）マロン酸塩の利用　陽性 （２３）フェニルアラニン・デアシナーゼ　陰性（２４
）プテリジンコンパウンド　陽性０／１２９に対する感
受性 （２５）その他の抗生物質及び抗菌性物質に対する感受
性　下記に示すとおり 薬剤の種類　感受性 ペニシリン　− カナマイシン　＋ テトラザイクリン　＋ クロラムフェニコール　＋ エリスロマイシン　〜 コリスチン　＋ スルフイソキサゾール　＋ ノボビオシン　＋ リンコマイシン　− セファロリジン　＋ 以上に示クレブシェラ　セロタイプに一４６１株の菌学
的性質は、パージマニュアル第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒ＋＊１ｎａｔｉｖｅ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏ−１ｏｇｙ、ｅｉｇｈｔｔｈ　ｅｄ
ｉｔｉｏｎ）　、並びにコーワンの医学細菌同定の手引
き第２版（Ｃｏｗａｎ　ａｎｄ　Ｓｔｅｅ−Ｖｓｍａｎ
ｕａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃａｌ　ｈａ−ｃｔｅｒｉａ＋　２
ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓ、Ｔ、Ｃｏｗａｎ、　
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｔｌｎｉｖ、Ｐｒｅｓｓ＋　１９７
４）におけるクレブシェラ属（Ｇｅｎｕｓ旧ｅｂｓｉｅ
ｌｌａ）の項の菌学的性質と一致しており、特に、Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ　並■銭観との形態学的及び生化学的
性状と近似していることから、本発明で利用する上記に
一４６菌株はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅｒ。

■ｎｅｓに属すると同定されるが、上記パージマニュア
ル第８版ではクレブシェラ属を（１１Ｋ　、１徂犯曵１
２赳、（２）Ｋ、ｏｚａｅｎａｅ及び（３）Ｋ、ｒｈｉ
ｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓＯ）、　３種に分類してい
るので、パージマニュアル第８版の分類に基づくとＫｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ　匹剋鯰吐封と同定される。

本発明に係る抗腫瘍剤の活性成分である多糖体は、クレ
ブシェラ　セロタイプに一４６菌株を下記に示す手順で
培養することにより産生される。

上記菌株の培養には通常の細菌の培養法が通用し得る。

すなわち、振とう培養又は静置培養で行ない、培養に用
いられる培地は該菌株が利用し得る栄養源を含有するも
のであれば、合成培地、半合成培地並びに天然培地でよ
い。培地の組成には、例えば炭素源としては、Ｄ−グル
コース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マ
ンノース、ショ糖、マニトール、グリセリン等が、窒素
源としては肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキ
ス、硫酸アンモニウム、尿素、その他の有機又は無機の
窒素源が用いられる。また、無機塩類としてはＮａ。

Ｋ＋　Ｍｇ＋　Ｃａ、　Ｚｎ＋　Ｐｅ等の硫酸塩、硝酸
塩、塩化物、炭酸塩又はリン酸塩等が必要に応じて用い
られる。

なお、液体培養では必要に応じて消泡剤を培地に添加し
得る。

培養条件としては、好気的条件下に培養するのが一般的
に有利であり、培養温度は３０〜３７℃が好ましい。ま
た、培地のｐｉは中性付近が好ましい。　培養期間は培
地の組成、培養温度等により変動するが、一般に３〜５
日間程度でよく、培養終了時に目的の多糖体が培養物中
に蓄積される。

上述のようにして産生された多糖体は、通常の微生物の
培養物より多糖類を単離する方法により、下記手順に従
ってｌ！離して精製する。

魚糖体少重羨及ＬＬＭｊＪＩ 液体振とう培養の場合には、培養により蓄積された多糖
体は主に培養液中に含有されているので、遠心分離又は
濾過により菌体を除いた後、濾液から多糖体を単離し、
一方装置培養（寒天で固めた培地使用）の場合には多糖
体は培地表面上に生育した菌体と混在しているので、こ
の画境を集め１％フェノール水溶液に懸濁させ一夜よく
攪拌した後、上記と同様の手順で遠心分離又は濾過によ
り菌体を除去し、得られる上清液から単離する。

次に、このようにして単離した多糖体は、アセトン、エ
タノール又はメタノール等の水可溶性有機溶剤を用いた
分別沈澱法によりそれに混在している低分子物質を除去
し、得られる沈澱物を水に熔かしたものにセチルトリメ
デルアンモニウムプロミドのような第４級アンモニウム
塩を加えて生成する沈澱物を集める。ついで、この沈澱
物に塩化ナトリウムや塩化カリウム等の水溶液を加えて
溶解し、得られる溶液にアセトン、エタノール又はメタ
ノール等の水可溶性有機溶媒を２〜３倍量に熔かした後
透析により脱塩した後、凍結乾燥することにより、精製
された多糖体かえられる。

次に、上述のようにして得られた多糖体の理化学的性質
を示す。

の　・ （１１形状 白色の粉末状であって、無味、無臭である。

（２）均一性 超遠心分析で単一ピークを示すとともに、セルロースア
セテート膜を用いた電気泳動分析でもアルシアンブルー
に染まる単一バンドを示すことから、均一性は高いとい
える。

（３）分子量 セファロース２Ｂ及び４Ｂ力ラムクロマトグラフイー分
析による測定ではゲル濾過的には１０’〜１０６の平均
分子量を示すものと推定されるが、一般に多糖類のゲル
濾過による推定分子量は過大になるので、実際には更に
低い値と思われる。

（４）融点 明確な融点を示さず、３００℃付近で分解して褐変する
。

（５）熔解性 水に熔解して高粘稠性を示す。メタノール、エタノール
、アセトン、プロパツール、ｎ−ブタノール、酢酸エチ
ル、ヘキサン、ベンゼン、エーテル、クロロボルムには
溶解しない。

（６）呈色反応 アンスロン反応　陽性 フェノール硫酸反応　陽性 銅フォーリン反応　陰性 カルバゾール硫酸反応　陽性 ニンヒドリン反応　陰性 （４Ｎ−１１ｃＩで１００℃、４時間加水分解後）エル
シンモルガン反応　陰性 （４Ｎ−ＨＣＩで１００℃、４時間加水分解後）以上の
呈色反応からみて、本多糖体はアミノ糖以外の糖質から
成っており、タンパク（又はアミノ酸）を含有していな
いと解し得る。

（７）旋光度 ０．４３％水溶液について旋光度を測定し、比旋光度〔
α〕。をめると＋１１６°を示ず。

（８）赤外線吸収スペクトル ＫＢｒ錠剤法による赤外線吸収スペクトルは添付の第１
図に示すとおりである。

第１図にみられるように、１７４０ｃｍ−’付近のエス
テル結合並びに１７２５ｃｍ−’付近のＯ−アセチルエ
ステルなどはみられず、又１２６０ｃｍ−’付近の０−
アセチルエステルもみられない。

このことからアセチル基の存在は否定される。

なお、１６Ｇ７ｃ＋ｗ−’にはカルボキシル基に基づく
と思われる吸収がみられる。

（９）紫外線吸収スペクトル ０．２５％水溶液についての紫外線吸収スペクトルは添
付の第２図に示すとおりである。２５３ｎｍ付近に吸収
極大がみられる。

Ｑ０核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル 本多糖体を口、０に熔解して凍結乾燥することを３回繰
返し行なって０２０置換をした後、０２０に熔解したし
のについて’）ｌ−ＮＭＲ分析を行なった。又”Ｃ−Ｎ
ＭＲ分析も併せて行なった。

結果は下記に示すとおりである。

ｍ：に兄凡分析 化学シフト（ｐｐｍ　）プロトン数　単糖５．２９　１
　α−ｇ１ｃΔ ５．２０　１　α−ｇａ１ ５．０５　１　α−ｍａｎ ４．８８　２　β−ｇａｌ、β−ｍａｎ４．６２　１　
β−ｇｌｃ １．４７　３　ピルビン酸 慧旦二凡社且分梶 化学シフト　単糖 １０３．１６　β−ｇａ１ １００．７７　α−ｇｌｃＡ １００．１６　β−ｇｌｃ、β−ｍａｎ９７．１６　α
−ｍａｎ ９６．１６　α−ｇａ１ ２５．４７　ピルビン酸 ０１）構成糖の検索 本多糖体を構成する単糖について、通常の多糖体の構成
単糖検索法を用いて検索を行なったところ下記の構成を
示した６ ｍａｎ、　：ｇａｌ、　：ｇｌｃ、　：ｇｌｃ　Ａ＝２
　：　２　：　ｌ　：　１また、本多糖体の加水分解物
をペーパークロマト分析してＯ−フェニレンジアミン処
理により紫外線照射下で螢光を発するスポットとしてピ
ルビン酸が同定された。

叙上のような性状を有する本多糖体について、０ｋｕｔ
ａｎｉ　ｅｔ　ａｌは下記の化学構造を提案している。

（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８６
　（１９８０）　２５９−２７１　〕　。

−ｅ３）−α・ＤＧ１ｃｐ八・（＋）・α−Ｄ＆ｎ７（
）−６）α・Ｄ偽１７（１ｍ）−β・Ｄ＆ｌｐ（→次に
本多糖体の薬理活性について説明する。

本多糖体玖東埋活牲 ＋１）急性毒性 本多糖体のマウスに対する急性毒性を試験した結果は表
１に示すとおりである。

表１ マウスに対するＬＤｓ、値 注）ＣＤＦ＋マウスは平均体重２０ｇのもの６匹を１群
として用い、生理食塩水に熔解した試料を腹腔内に投与
して２４時間以内のしＤｓｏをめた。

（２）抗Ｉ！瘍活性 本多糖体の抗Ｉ！瘍活性を下記手順により試験した。な
お、多糖体は後記実施例１により開裂したものを用いた
。

ｉ　）　Ｓａｒｃｏｍａ−１８０固形腫瘍に対する活性
試験動物としてｄｄＹマウス♂を用い、マウス（体Ｊｉ
２０ｇ）に移植後１０日目のＳａｒｃｏｍａ−１８０腹
水腫瘍原液０．１＋ｗＪを平均体重３０ｇのマウス（１
群５匹）の背反下に移植した。この移植の翌日より本多
糖体を２５ｍｇ／ｋｇの投与量で１日１回の割合で５日
間、腫瘍移植部位に投与した結果、８０％の腫瘍増殖阻
止率を示し、５匹中２匹が完全治癒した。なお、効果の
判定は投与から１４日後の腫瘍重量を測定することによ
り行なった。

ｉｉ　）　Ｍｅｔｈ−Ａ　ｉｉ瘍に対する活性試験動物
としてＢＡＬＢ／Ｃマウスを用い、１群５匹から成るマ
ウス（平均体重２０ｇ）にＭｅ−ｔｈ−Ａ腫瘍細胞を皮
下に移植し、３日目より本多糖体を１０ｍｇ／ｋｇの投
与量で１８１回、隔日毎に８回腫瘍部位に投与した結果
、腫瘍増殖阻止率は９８．７％を示し、５匹中３匹が完
全治癒した。

なお、上記投与量を腹腔内にした場合は１０ｍｇ／ｋｇ
の投与量では腫瘍増殖阻止率は２０．６％にとどまった
が、１００ｍｇ／ｋｇの投与量では３４．６％の阻止率
になった。

また、Ｍｅｔｈ−Ａ腫瘍細胞を本多糖体と混合してＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスの皮下に移植し、移植後１８日同定発生
した腫瘍重量を測定した。その結果、本多糖体を０．２
５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与したものでは無効であった
が、２．５ｍｇ／ｋｇの投与量では７５．７％及び２５
ｍｇ／ｋｇの投与量では９１．５％のそれぞれの腫瘍増
殖阻止率を示した。しかも、２．５ｍｇ／ｋｇの投与量
では４匹中１匹が完全治癒し、２５ｍｇ／ｋｇの投与量
では完全治癒は４匹中２匹であった。

本発明は、上述したようにしてクレブシェラセロタイプ
に一４６株を利用して得られた多糖体を水素化ホウ素ナ
トリウムで化学修飾した形態のものを有効成分とする抗
腫瘍剤を包含する。

この化学修飾した多糖体は下記手順により調製し得る。

クレブシェラ　セロタイプに一４６株を培養して得られ
た多糖体を精製水に溶解し、この溶液に当量のメタ過ヨ
ウ素酸ナトリウムを冷暗所で加え、７２時間程度攪拌下
に反応させた後、エチレングリコールを加えて反応を停
止させる。ついで得られた反応混合液に水素化ホウ素ナ
トリウムを加え１夜室温下で還元し、種酢酸で中和して
透析を行なった後、凍結乾燥する。得られた粉末に０．
５Ｍ−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、２５℃で１
日反応させた後、凍結乾燥すると、上記多糖体から側鎖
末端グルコースが離脱した修飾された多糖体が得られる
。この修飾多糖体はさきに示した、培養により得られた
多糖体の化学構造との関係で下記のように示される。

一〇？□！￥ １０＼ Ｍｅ　Ｃ０２Ｈ 次に上述のようにして化学修飾しζ得られた多糖体の理
化学的性質を示す。

１′　の　蟇　・ 形状　均一性、分子量、融点、熔解性及び呈色反応は前
記培養により得られた多糖体と同様である。

（１）旋光度 ０．２％水溶液について旋光度を測定し、比旋光度〔α
〕、８ｇをめると＋１１１°を示す。

（２）赤外線吸収スペクトル ＫＢｒＢｒ法による赤外線吸収スペクＩ−ルは添付の第
３図に示すとおりである。

（３）紫外線吸収スペクトル ０．２％水溶液についての紫外線吸収スペクトルは添付
の第４図に示すとおりである。

（４）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル本多糖体を０２
０に熔解して凍結乾燥することを３回繰返し行なって０
２０置換をした後、０２０に溶解して’１」−Ｎ　Ｍ　
Ｒ分析と１″Ｃ−ＮＭＲ分析をそれぞれ行なった。

結果は下記に示すとおりである。。

■二ＮＭ且分捉 化学シフト（ｐｐＩＩｌ）プロトン数　単糖５．３３　
１　α−ｇｌｃＡ ５．２０　１　α−ｇａ１ ５．０９　１　（ｒ−ｍａｎ ４．８９　２　β−ｇａ＋、β−ｍａｎ１．５３　、３
　ピルビン酸 ２Ｓ二ＮＭＩ辷汰捉 化学シフト　単糖 １０３、１６　β−ｇａ１ １０１．１７　α−ｇｌｃＡ １００．１６　β−ｍａｎ ９７．０５　α−ｍａｎ ９５．９９　α−ｇａ１ ２５．５２　ピルビン酸 （５）構成糖の検索 本修飾多糖体を構成する単糖について、通常の多糖体の
構成糖検索法を用いて検索を行なったところ下記の構成
を示した。

ｍａｎ、　：ｇａｌ、　：ｇｌｃ　Ａ＝２　：　２　：
　１また、本多糖体の加水分解し、酢酸エチル：酢酸：
ギ酸：水＝１８：３：１：４の混合液を展開溶媒として
用いてペーパークロマト分析し、０−フェニレンジアミ
ン処理により紫外線照射下で螢光を発するスポットとし
てピルビン酸が同定された。なお、ピルビン酸の存在は
核磁気共鳴吸収スペクトルの結果からも認められ、その
含有割合は、マンノース：ガラクトース：グルクロン＠
：ピルビン酸−２＝２：１：ｌであった。

次に、本修飾多糖体の薬理活性について説明する。

オＪ」■１曵１団ト乱１ （１１急性毒性 本多糖体のマウスに対する急性毒性又は亜急性毒性を試
験した結果は表２に示すとおりである。

表２ 注）ＣＤＦ＋マウスは平均体重２０ｇで、９匹を１群と
してそれぞれ用いた。

（２）抗腫瘍活性 本多糖体の抗腫瘍活性を下記手順により試験した。なお
、多糖体は後記実施例３によりｇＩｌ製したものを用い
た。

ｉ　）　Ｓａｒｃｏｍａ−１８０固形Ｉ！瘍に対する活
性試験動物としてＩＣＲマウスを用い、ＩＣＲマウスの
腹腔内で継代培養した５ａｒｃｏＩＩＩａ〜１８０腫瘍
細胞３Ｘ１０’個を１群７匹から成るＩＣＲマウスの皮
下に移植し、その翌日より本多糖体を腹腔内に２ｍｇ／
ｋｇＸ　１０日投与したところ腫瘍増殖阻止率は４７％
であった。

なお、ｌ　ｍｇ／ｋｇｘ　１０日の投与量では上記阻止
率は１１％にとどまった。

ｉｉ）　Ｍｅｔｈ−ＡＩ！瘍に対する活性Ｍｅｔｈ−Ａ
腫瘍細胞の移植と同時に本多糖体をＢＡＬＢ／Ｃマウス
の皮下に投与し、移植から１８日同定発生した腫瘍重量
を測定して、腫瘍増殖阻止率を調べた。

なお、Ｍｅｔｈ−Ａ腫瘍細胞は２Ｘ１０”個を１群４匹
から成るマウスに移植し、本多糖体は１日当り０．２５
ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇの割合で投与した。

結果は下記に示すとおりである。

多糖体の投与量　腫瘍増殖阻止率（％）０、２５　ｍｇ
／ｋｇ　０ ２．５　１１℃ｇ／ｋｇ　６２ ２５　ｍｇ／ｋｇ　１００ 本発明に係る抗腫瘍剤の有効投与量は、その活性成分で
ある多糖体並びに修飾多糖体として、一般的には１ｍｇ
／ｋｇ／日〜１００ｎ＋ｇ／ｋｇ／日であり、また、抗
腫瘍剤の製剤化は、上記各多糖体を公知の手法によって
錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤並びに注射形態の液剤
等にすることにより行ない得る。

以下に実施例を示して本発明に係る多糖体及び修飾多糖
体の製造法を具体的に示す。

実施例中の％は特記しない限り重量％を示す。

実施例１ ペプトン０．５％、肉エキス０．３％、ショ糖３％及び
食塩０．１％の組成の培地を試験管（１８Ｘ　１８０ｍ
ｍ）４本に各１０ｍ１分注し、１２０℃で１５分間オー
トクレーブにより滅菌した後、その各々にタレプシエラ
　セロタイプに一４６菌株（微工研菌寄第７３７３号）
を接種し、３５℃で２４時間振とう培養を行なった。

別に、ペプトン０．５％、肉エキス０．３％、ショ糖３
％及び食塩０．１％及び寒天１．５％の組成の培地を３
００信！容三角フラスコ４本に各２５０ｍＪ分注し、１
２０℃で１５分間オートクレーブにより滅菌した後、そ
の各々にあらかじめ滅菌しであるバツト　（アルミ製　
縦１８ｃｍ、横２６ｃｍ、深さ３．５ｃｍ　）に注ぎ、
放冷後」−記培養物を各１枚のバット上の寒天培地に接
種して広げて、３５℃で３日間培養を行なった。培養終
了後、寒天平板上に生じた粘質物をかき集め、これを１
％フェノール水に懸濁し、１日攪拌を行なった後、遠心
分離（３０，００Ｏｒｐｍ、　３時間）により菌体を除
去して得られる上清流にエタノールを３倍量加えて沈澱
を生成させた。これをガラス棒にからませて採取した後
、脱イオン水に熔解してから、５％セチルトリメチルア
ンモニウムプロミドを加えながら、ガラス棒で攪拌する
とやがてガラス棒に堅くまつわりつく沈澱を生ずるので
これを集め、４Ｍ−ＮａＣＩ水溶液に熔かした。

この溶液を冷所で２日間攪拌した後、３倍量のエタノー
ルを加え、生じた沈澱を脱イオン水に溶がした。この溶
液を流水中で２日間透析し、凍結乾燥するごとにより、
目的の多糖体が白色粉末としてえられた。収量は寒天培
地１７！当り約５００ｍｇであった。

実施例２ バットペプトン０．５％、バット肉エキス０．３％及び
食塩０．２％の組成の培地を２（ｌｏｍ＃容三角フラス
コ５本に各１２５ｍ１分注し、１２１　℃で１５分間オ
ートクレーブにより滅菌した後、その各々にクレブシェ
ラ　セロタイプに一４６菌株＜’＊工研菌寄第７３７３
号）を接種し、３７℃で６時間振とう培養を行なった。

別に、ショ糖３％、食塩０．２％、酵母エキス０．２％
、ＫＪＰＯ吟０．１％、Ｍｇ５Ｏキ７１１２００．０２
％、ＣａＣ０１０，０１％及びバット寒天１．５％の組
成の培地を４１容三角フラスコ５本に各２．５１分注し
、１２１℃で１５分間オートクレーブにより滅菌した後
、その各々をあらかじめ滅菌しであるバラ）　（縮５０
ｃｍ。

横１０ｃｍ、深さ５ｃｍ　）に注ぎ、放冷後、上記培養
物を各１枚のバット中の寒天培地に接種して広げて、３
７℃で３日間培養を行なった。培養終了後、寒天平板上
に生じた粘質物をかき集め、これを１％フェノール水に
懸濁し、１日攪拌を行なった後、遠心分離（３０，００
Ｏｒｐｍ、　５時間）により菌体を除いて得られた上清
液にエタノール：メタノール混液を３倍量加えて、生ず
る沈澱物をガラス棒にからませて採取した。このように
して採取した沈澱物を、脱イオン水２１に熔解後、１０
％セチルトリメチルアンモニウムプロミドを加えながら
、ガラス棒で攪拌するとやがてガラス棒に堅くまわりつ
く沈澱を生ずるので、これを集め、４Ｍ−ＮａＣ１熔液
１ｅに溶かした。この溶液を３倍量のエタノール：メタ
ノール混液（１９：ｌ）中に注ぎ、生ずる沈澱物を遠心
分離（３０，００Ｏｒｐｍ、　２０分）により集め、２
．５１の水に熔かし、流水中で３日間透析し、凍結乾燥
することにより目的多糖体が白色粉末として得られた。

収量は培地１１当り約０．５ｇである。

実施例３ 実施例１で得られた多糖体を精製水に熔解し、これに等
量の０．１Ｍ−ＮａｌＯ＋　（メタ過コウ素酸ナトリウ
ム）を冷暗所で加え、７２時間攪拌下に反応させた。得
られた反応液１００ｍｎに対し、エチレンジ。

リコール５　ｍｌｌを加え２時間冷暗所で攪拌した後、
ＮａＢＨ４（水素化ホウ素ナトリウム）を糖５００ｍｇ
に対し１ｇ加え、−夜室温にて還元を行なった。つむ）
で得られた液を稀酢酸にて中和後、透析を行なって、凍
結乾燥をして粉末を得た。

この凍結乾燥粉末１００＋ｎｇに対し、０．５　Ｍ−Ｔ
　Ｆ　Ａ（トリフルオロ酢酸）２００ｍｌを加え、２５
℃Ｇこて１日反応後透析し、ついで凍結乾燥することＧ
こより修飾多糖体を得た。

収量は多糖体の約８０％である。

実施例４ 実施例２で得られた多糖体１ｇに対し、０．０５　Ｍメ
タ過ヨウ素酸ナトリウム１００ｍ＃を加え熔解し、冷暗
所（５℃）に４ｉ３間保って反応させた。反応終了後、
反応液にエチレングリコール１０ｍｊ！を加え、−日攪
拌した後、−夜温水中で透析した。得られた透析液に水
素化ホウ素すｌ・リウムＩｇを加え、−夜室温に保ち稀
酢酸で中和した後、流水中で透析し、凍結乾燥して白色
粉末９５０ｍｇ−ｔ−得た。

これに０．５　Ｍ、、Ｔ　Ｆ　Ａ　（）リフルオロ酢酸
）を２００１１加え、室温に一夜放置した後、流水中で
３日間透析し、凍結乾燥を行なって修飾多糖体粉末とし
て５２７ｍｇを得た。

次に、上述のようにして調製した多糖体の抗腫瘍活性に
ついて試験した結果を示す。

１　）　Ｓａｒｃｏｍｌｌ−１８０に対する抗ＩＩＩ瘍
活性ｄｄＹマウス（平均体重３０ｇ、雄１群５匹）の背
部皮下にｄｄＹマウス腹腔内で増殖させたＳａｒｃｏｍ
ａ−１８０細胞を５Ｘ１０’個移植し、翌日より生理食
塩水に溶解した多糖体を２５ｍｇ／ｋｇ、５日間連続で
腫瘍内に投与した。尚、対照には生理食塩水のみを投与
した。腫瘍移植後１４日目に解剖し、腫瘍重量を測定し
た。その結果投与群は対照と比較して８０％のｌ１ｆｆ
ｉ瘍増殖阻止が認められた。

腫瘍阻止率は下記の式によりめた。

−Ｔ 腫瘍阻止率（％）　＝　−ｘ　１００ Ｔ：投与群腫瘍重量 Ｃ：非投与群腫瘍重量 ２）　Ｍｅｔｈ−Ａに対する抗腫瘍活性ＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス（平均体重２０ｇ雄、１群５匹）の背部皮下にマウ
ス腹腔内で継代したＭｅｔｈ−Ａｌｌ！瘍細胞を２Ｘ１
０’個移植し、移植３日目より１日おきに生理食塩水に
溶解した多糖体を１０ｍｇ　／　ｋｇ、８回、１１瘍内
投与した。、尚、対照には生理食塩水のみを投与した。

腫瘍移植後２６日目に解剖し、腫瘍重量を測定した。投
与群は対照と比較し９８．７％の腫瘍増殖阻止率が認め
られた。

腫瘍増殖阻止率は上記１）と同様にしてめた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る多糖体の赤外線吸収スペクトルを
示し、第２図はその紫外線吸収スペクトルを示す。第３
図は、上記多糖体を修飾した多糖体の赤外線吸収スペク
トルを示し、第４図はその紫外線吸収スペクトルを示す
。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　クレブシェラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）に属
   するクレブシェラ　セロタイプ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
   　５ｅｒｏｔｙｐｅ　）Ｋ−４６株を培養して得られる
   多糖体を有効成分とする抗腫瘍剤。
2. （２）多糖体は、クレブシェラ　セロタイプに一４６株
   を、炭素源、窒素源及び無機塩類を含有する培地中で好
   気的条件下に、中性イ１近のｐｌで３０〜３７℃の温度
   において培養して得られる培養物から分離、採取される
   ものである特許請求の範囲第＋１）項記載の抗１１瘍剤
   。
3. （３）　クレブシェラ属に属するクレブシェラ　セロタ
   イプに一４６株を培養して１ｑられる多糖体を水素化ホ
   ウ素ナトリウムで化学修飾した多糖体を有効成分とする
   抗腫瘍剤。
4. （４）化学修飾した多糖体は、クレブシェラ　セロタイ
   プに一４６株を培養して得られた多糖体の水溶液に希薄
   なメタ過ヨウ素酸ナトリウムを作用させ、ついで水素化
   ホウ素ナトリウムで還元することにより得られるもので
   ある特許請求の範囲第（３）項記載の抗腫瘍剤。