JPH0367048B2 - - Google Patents
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- JPH0367048B2 JPH0367048B2 JP58211419A JP21141983A JPH0367048B2 JP H0367048 B2 JPH0367048 B2 JP H0367048B2 JP 58211419 A JP58211419 A JP 58211419A JP 21141983 A JP21141983 A JP 21141983A JP H0367048 B2 JPH0367048 B2 JP H0367048B2
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、クレブシエラ属（Klebsiella）に属
する微生物を培養して得られる多糖体を活性成分
とする抗腫瘍剤に関する。 最近、我国において植物及び微生物の生産する
多糖体の抗腫瘍活性に関する研究が相次いで報告
されており、特に、担子菌類の熱水抽出物や培養
生産物から採取される多糖体の抗腫瘍活性につい
て極めて多数の研究報告がなされており、それら
のうちには抗癌剤として実用化されているものも
ある。 而して、これらの抗癌剤はいずれも宿主を介し
ての間接的な抗腫瘍作用であると推定されている
が、しかし、これらの抗癌剤は実験的な移植癌、
特に同種の腫瘍には有効ではあるけれども、同系
の腫瘍や自家癌にはあまり有効でないことが確認
されている。 本発明者は、微生物が生産する多糖体の抗腫瘍
活性についての研究過程においてクレブシエラ属
（Klebsiella）に属する莢膜を有する微生物が生
産する莢膜多糖体が免疫学的に抗原性を有するこ
とに着目し、該莢膜多糖体の抗腫瘍活性について
検討した結果、クレブシエラ属に属するクレブシ
エラ・セロタイプＫ−56菌株が生産する莢膜多糖
体が従来の多糖体ではあまり効果がないとされて
いた同系腫瘍に対しても優れた抗腫瘍効果を示す
ことの知見を得て、本発明をなすに至つた。 本発明は、クレブシエラ・セロタイプ
（Klebsiella Serotype）Ｋ−56菌株が菌体外に生
産する多糖体を活性成分とする、同系腫瘍に対し
ても優れた抗腫瘍活性を示す抗腫瘍剤の提供を目
的とする。 以下本発明について詳しく説明する。 本発明に係る多糖類は、クレブシエラ・セロタ
イプＫ−56菌株を培養し、菌体外に産生される次
の性質をもつ多糖体を活性成分とする抗腫瘍剤で
ある。 (1) 平均分子量105〜106（ゲル濾過法による） (2) 構成糖がラムノース、ガラクトース、グルコ
ース及びピルビン酸よりなり、その構成比率が
ラムノース：ガラクトース：グルコース：ピル
ビン酸＝１：３：１：１である (3) 超遠心または電気泳動によつて単一のピーク
またはバンドを示す。 本発明で利用する微生物であるクレブシエラ・
セロタイプＫ−56菌株は、微工研菌寄第7208号
（FERM Ｐ−7208）の番号で工業技術院微生物
工業研究所に受託されており、下記のとおりの菌
学的性質を有する。 なお、上記菌株の形態学的性状及び生理学的性
質は、ペプトン５ｇ、肉エキス3g、食塩１ｇ及
び精製水１から成る栄養培地を基本培地として
用い、特記しない限り好気的条件下で生育を行な
つて観察した結果を示したものである。 クレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株の菌学的性
質 (1) 形態学的性状 上記基本培地１に寒天15ｇを加えた栄養寒
天培地を用いた。 グラム染色陰性、桿状で平均0.8×2.0〜2.5μ
の大きさを有し、運動性がなく、胞子形成がな
く莢膜を形成する。 (2) 各種培地における生育状態 上記栄養寒天培地での嫌気培養により生育
良好。 上記培地の寒天平至培地での生育良好、平
板上の集落は正円状で隆起しており、湿潤で
均質な正縁を有し、粘稠性でかつ光沢を有す
る。色素の生成なし。 前記基本培地からなる液体培地での生育良
好、濁りを生じ、菌膜の形成なし、沈澱を生
ずるも妨地の着色みられず。 マツコンキイ（MacConkey）培地及び
CVT培地での生育はいずれも良好。 キングＡ培地及びキングＢ培地での生育は
いずれも良好、水溶性色素を産生しない。 PEA培地では生育せず。 上記栄養培地に馬脱せんい血液を加えた培
地では溶血性を示さない。 (3) 生理学的性質 (1) 生育温度範囲：10〜42℃に生育し、５℃及
び46℃には生育しない。 (2) 生育可能なNaCl濃度範囲：０〜６％に生
育し、７％には生育しない。 (3) ゼラチンの液化 陰性 (4) ゼラチンの分解 陰性 (5) デンプンの加水分解 陰性 (6) キチン加水分解 陰性 (7) カゼインの加水分解 陰性 (8) パープルミルクに対する反応 凝固、 ペプトン化 (9) リトマスミルクに対する反応 凝固、 ペプトン化 (10) ブドウ糖の酸化（OFテスト） Ｆ型 (11) 糖の分解性 下記に示すとおり。 糖 酸産生 ガス生産 Ｄ−グルコース ＋ ＋ Ｄ−マンノース ＋ ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ ＋ Ｄ−キシロース ＋ ＋ Ｌ−アラビノース ＋ ＋ Ｄ−フラクトース ＋ ＋ シヨ糖 ＋ ＋ ラクトース ＋ − デンプン ＋ − グリセロール ＋ ＋ マニトール ＋ ＋ イノシトール ＋ ＋ セロビオース ＋ ＋ ズルシツト ＋ ＋ (12) 硝酸塩還元能 陰性 (13) 硫化水素の産生 陰性 (14) MR反応 陽性 (15) VP反応 陽性 (16) インドールの生成 陰性 (17) IPA反応 陽性 (18) チトクロームオキシダーゼ反応 陰性 (19) カタラーゼ反応 陽性 (20) クエン酸塩の利用 陽性 (21) 酒石酸から酸の酸生 陽性 (22) 尿素分解能 陽性 (23) アルギニンのアルカリ化 陰性 (24) オルニチン脱炭酸能 陰性 (25) リジン脱炭酸能 陽性 (26) プテリジンコンパウンドＯ／129に対す
る感受性 陽性 (27) その他の抗生物質及び抗菌性 物質に対する感受性 下記に示すとおり。 薬剤の種類 感受性 ベニシリン − カナマイシン ＋ テトラサイクリン ＋ クロラムフエニコール ＋ エリスロマイシン − コリスチン ＋ スルフイソキサゾール ＋ ノボビオシン ＋ リンコマインシ − セフアロリジン ＋ (28) マロン酸塩の利用 陽性 (29) フエニルアラニンデアミナーゼ 陰性 以上に示したクレブシエラ・セロタイプＫ−56
菌株の菌学的性質は、バージマニユアル第８版
（Bergey's Manual of Determinative Bacterio
−logy，eightth edition）、並びにコーワンの医
学細菌同定の手引き第２版（Cowan and Steel's
manual for the indentification of medical be
−cteria、2nd edition by S.T.Cowan，
Cambridge Univ.Press，1974）におけるクレブ
シエラ属（Genus Klebsiella）の項の菌学的性質
と一致しており、特に、Klebsiella pneumoniae
の形態学的及び生化学的性状と近似していること
から、本発明で利用する上記Ｋ−56菌株は
Klebsiella pneumoniaeに属すると同定される。 本発明に係る抗腫瘍剤の活性成分である多糖体
は、クレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株を下記
に示す手順で培養することにより産生される。 クレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株の培養に
よる多糖体の産生 上記菌株の培養には通常の細菌の培養法が適用
し得る。すなわち、振とう培養又は静置培養で行
ない、培養に用いられる培地は該菌株が利用し得
る栄養源を含有するものであれば、合成培地、半
合成培地並びに天然培地でよい。培地の組成に
は、例えば炭素源としてはＤ−グルコース、Ｄ−
フラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロー
ス、マニトール、グリセリン、もしくはシヨ糖等
が、窒素源としては肉エキス、ペプトン、カザミ
ノ酸、酵母エキス、硫酸アンモニウムあるいは尿
素等が用いられる。また、無機塩類としては、
Na、Ｋ、Mg、Ca、Zn、Fe等の硫酸塩、硝酸
塩、塩化物、炭酸塩又はリン酸塩等が必要に応じ
て用いられる。なお、必要に応じて消泡剤を培地
に添加し得る。 培養条件としては、好気的条件下に培養するの
が一般的に有利であり、培養温度は30〜35℃が好
ましい。また、培地のPHは中性附近が好ましい。 培養期間は培地の組成、培養温度等により変動
するが、一般に３〜５日間程度でよく、培養終了
時に目的の多糖体の培養物中に蓄積される。 上述のようにして産生された多糖体は下記手順
に従つて単離して精製する。 多糖体の単離及び精製 液体振とう培養の場合には、培養により蓄積さ
れた多糖体は主に培養液中に含有されているの
で、遠心分離又は濾過により菌体を除いた後、濾
液から多糖体を単離し、一方静置培養（寒天で固
めた培地使用）の場合には多糖体は培地表面上に
生育した菌体と混在しているので、この菌塊を集
め１％フエノール水溶液に懸濁させ一夜より撹拌
した後、上記と同様の手順で遠心分離又は濾過に
より菌体を除去し、得られる上清液から単離す
る。 次に、このようにして単離した多糖体は、アセ
トン、エタノール又はメタノール等の水可溶性有
機溶媒を用いた分別沈澱法によりそれに混在して
いる低分子物質を除去し、得られる沈澱物を水に
溶かしたものにセチルトリメチルアンモニウムブ
ロミドのような第４級アンモニウム塩を加えて生
成する沈澱物を集める。ついで、この沈澱物に塩
化ナトリウムや塩化カリウム糖の水溶液を加えて
溶解し、得られる溶液にアセトン、エタノール又
はメタノール等の水可溶性有機溶媒を２〜３倍量
添加し、生成した沈澱物を採取し、該沈澱物を水
に溶かした後透析により脱塩した後、凍結乾燥す
ることにより、精製された多糖体が得られる。 次に、上述のようにして得られた多糖体の理化
学的性質を示す。 多糖体の理化学的性質 (1) 形状 白色の粉末体であつて、無味、無臭である。 (2) 均一性 超遠心分析で単一ピークを示すとともに、セ
ルロースアセテート膜を用いた電気泳動分析で
もアルシアンブルーに染まる単一バンドを示す
ことから、均一性は高いといえる。 (3) 分子量 セフアロース2B及び4Bカラムクロマトグラ
フイ−分析による測定ではゲル濾過的には105
〜106の平均分子量を示すものと推定される。 (4) 融点 明確な融点を示さず、300℃附近で分解して
褐変する。 (5) 溶解性 水に溶解して高粘稠性を示す。 (6) 呈色反応 アンスロン反応 陽性 モーリツシユ反応 陽性 システイン硫酸反応 陽性 銅フオーリン反応 陰性 カルバゾール硫酸反応 陰性 ニンヒドリン反応（4N−HClで100℃、４時間
加水分解後） 陰性 エルソンモルガン反応（4N−HClで100℃、４
時間加水分解後） 陰性 以上の呈色反応からみて、本多糖体はアミノ
糖以外の糖質から成つており、ウロン酸及びア
ミノ酸（又はペプチド並びにタンパク）を含有
していないと解し得る。 (7) 旋光度 0.43％水溶液について旋光度を測定し、比旋
光度［α］24 589を求めると＋79°を示す。 (8) 赤外線吸収スペクトル KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは
添付の第１図に示すとおりである。 (9) 紫外線吸収スペクトル 水溶液についての紫外線吸収スペクトルは添
付の第２図に示すとおりである。 (10) 核磁気共鳴（NMR）スペクトル 本多糖体をD20に溶解して凍結乾燥すること
を３回繰返し行なつてD20置換をした後、２％
濃度になるようにD20に溶解したものについて
1H−NMR分析を行つた。その結果、
5.24ppm（H2個）、4.92ppm（H2個）、4.72ppm
（H1個）、1.43ppm（H3個）、1.27ppm（H3個）
にそれぞれピークが得られ、1.43ppmはピルビ
ン酸のCH3に基づくピーク、1.27ppmはラムノ
ースのCH3に基づくピークと同定された。他の
ピークはそれぞれ構成単糖のアノメリツクプロ
トンに基づくものと推定されるので、構成単糖
は５個と推定される。 (11) 糖質部分の構成糖 本多糖体の試料を2M−TFA（トリフルオロ
酢酸）を用いて100℃で１夜加水分解した後、
常法によりアルデイトールアセテート化を行な
つてガスクロマトグラフイ−分析に付したとこ
ろ、ラムノース、ガラクトース及びグルコース
が検出された。 また、ラムノース：ガラクトース：グルコー
スの組成比が１：３：１であることは上記核磁
気共鳴スペクトルで得られた結果と一致する。 因に、上述したような性状を示す本多糖体の
化学構造はY.M.CHOY等により下記のように
提案されている。 ［Y.M.CHOY and G.G.S.DUTTON：
“Structure of the Capsular Polysaccharide
of klebsiella Ｋ−type56”CAN.J.CHEM.
VOL.51.3021〜3026（1973）］。 (12)他の構成糖分 本多糖体の試料を上記（11）に記載したと同
様の手順で加水分解したものを、酢酸エチル：
酢酸：ギ酸：水＝18：３：１：４の組成比のも
のを展開溶媒として用いてペーパークロマトグ
ラフイー分析を行なつたところ、０−フエニレ
ンジアミン処理により紫外線照射下で螢光を発
するスポツトとしてピルビン酸が同定された。
ピルビン酸の存在は上記(10)に記載の核磁気共鳴
スペクトルの結果からも認められ、その含有比
はラムノース：ガラクトース：グルコース：ピ
ルビン酸＝１：３：１：１であつた。 次に、本多糖体の生理活性について述べる。 本多糖体の生理活性 (1) 急性毒性又は亜急性毒性 本多糖体のマウスに対する急性毒性又は亜急
性毒性を試験した結果は表１及び表２に示すと
おりである。
する微生物を培養して得られる多糖体を活性成分
とする抗腫瘍剤に関する。 最近、我国において植物及び微生物の生産する
多糖体の抗腫瘍活性に関する研究が相次いで報告
されており、特に、担子菌類の熱水抽出物や培養
生産物から採取される多糖体の抗腫瘍活性につい
て極めて多数の研究報告がなされており、それら
のうちには抗癌剤として実用化されているものも
ある。 而して、これらの抗癌剤はいずれも宿主を介し
ての間接的な抗腫瘍作用であると推定されている
が、しかし、これらの抗癌剤は実験的な移植癌、
特に同種の腫瘍には有効ではあるけれども、同系
の腫瘍や自家癌にはあまり有効でないことが確認
されている。 本発明者は、微生物が生産する多糖体の抗腫瘍
活性についての研究過程においてクレブシエラ属
（Klebsiella）に属する莢膜を有する微生物が生
産する莢膜多糖体が免疫学的に抗原性を有するこ
とに着目し、該莢膜多糖体の抗腫瘍活性について
検討した結果、クレブシエラ属に属するクレブシ
エラ・セロタイプＫ−56菌株が生産する莢膜多糖
体が従来の多糖体ではあまり効果がないとされて
いた同系腫瘍に対しても優れた抗腫瘍効果を示す
ことの知見を得て、本発明をなすに至つた。 本発明は、クレブシエラ・セロタイプ
（Klebsiella Serotype）Ｋ−56菌株が菌体外に生
産する多糖体を活性成分とする、同系腫瘍に対し
ても優れた抗腫瘍活性を示す抗腫瘍剤の提供を目
的とする。 以下本発明について詳しく説明する。 本発明に係る多糖類は、クレブシエラ・セロタ
イプＫ−56菌株を培養し、菌体外に産生される次
の性質をもつ多糖体を活性成分とする抗腫瘍剤で
ある。 (1) 平均分子量105〜106（ゲル濾過法による） (2) 構成糖がラムノース、ガラクトース、グルコ
ース及びピルビン酸よりなり、その構成比率が
ラムノース：ガラクトース：グルコース：ピル
ビン酸＝１：３：１：１である (3) 超遠心または電気泳動によつて単一のピーク
またはバンドを示す。 本発明で利用する微生物であるクレブシエラ・
セロタイプＫ−56菌株は、微工研菌寄第7208号
（FERM Ｐ−7208）の番号で工業技術院微生物
工業研究所に受託されており、下記のとおりの菌
学的性質を有する。 なお、上記菌株の形態学的性状及び生理学的性
質は、ペプトン５ｇ、肉エキス3g、食塩１ｇ及
び精製水１から成る栄養培地を基本培地として
用い、特記しない限り好気的条件下で生育を行な
つて観察した結果を示したものである。 クレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株の菌学的性
質 (1) 形態学的性状 上記基本培地１に寒天15ｇを加えた栄養寒
天培地を用いた。 グラム染色陰性、桿状で平均0.8×2.0〜2.5μ
の大きさを有し、運動性がなく、胞子形成がな
く莢膜を形成する。 (2) 各種培地における生育状態 上記栄養寒天培地での嫌気培養により生育
良好。 上記培地の寒天平至培地での生育良好、平
板上の集落は正円状で隆起しており、湿潤で
均質な正縁を有し、粘稠性でかつ光沢を有す
る。色素の生成なし。 前記基本培地からなる液体培地での生育良
好、濁りを生じ、菌膜の形成なし、沈澱を生
ずるも妨地の着色みられず。 マツコンキイ（MacConkey）培地及び
CVT培地での生育はいずれも良好。 キングＡ培地及びキングＢ培地での生育は
いずれも良好、水溶性色素を産生しない。 PEA培地では生育せず。 上記栄養培地に馬脱せんい血液を加えた培
地では溶血性を示さない。 (3) 生理学的性質 (1) 生育温度範囲：10〜42℃に生育し、５℃及
び46℃には生育しない。 (2) 生育可能なNaCl濃度範囲：０〜６％に生
育し、７％には生育しない。 (3) ゼラチンの液化 陰性 (4) ゼラチンの分解 陰性 (5) デンプンの加水分解 陰性 (6) キチン加水分解 陰性 (7) カゼインの加水分解 陰性 (8) パープルミルクに対する反応 凝固、 ペプトン化 (9) リトマスミルクに対する反応 凝固、 ペプトン化 (10) ブドウ糖の酸化（OFテスト） Ｆ型 (11) 糖の分解性 下記に示すとおり。 糖 酸産生 ガス生産 Ｄ−グルコース ＋ ＋ Ｄ−マンノース ＋ ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ ＋ Ｄ−キシロース ＋ ＋ Ｌ−アラビノース ＋ ＋ Ｄ−フラクトース ＋ ＋ シヨ糖 ＋ ＋ ラクトース ＋ − デンプン ＋ − グリセロール ＋ ＋ マニトール ＋ ＋ イノシトール ＋ ＋ セロビオース ＋ ＋ ズルシツト ＋ ＋ (12) 硝酸塩還元能 陰性 (13) 硫化水素の産生 陰性 (14) MR反応 陽性 (15) VP反応 陽性 (16) インドールの生成 陰性 (17) IPA反応 陽性 (18) チトクロームオキシダーゼ反応 陰性 (19) カタラーゼ反応 陽性 (20) クエン酸塩の利用 陽性 (21) 酒石酸から酸の酸生 陽性 (22) 尿素分解能 陽性 (23) アルギニンのアルカリ化 陰性 (24) オルニチン脱炭酸能 陰性 (25) リジン脱炭酸能 陽性 (26) プテリジンコンパウンドＯ／129に対す
る感受性 陽性 (27) その他の抗生物質及び抗菌性 物質に対する感受性 下記に示すとおり。 薬剤の種類 感受性 ベニシリン − カナマイシン ＋ テトラサイクリン ＋ クロラムフエニコール ＋ エリスロマイシン − コリスチン ＋ スルフイソキサゾール ＋ ノボビオシン ＋ リンコマインシ − セフアロリジン ＋ (28) マロン酸塩の利用 陽性 (29) フエニルアラニンデアミナーゼ 陰性 以上に示したクレブシエラ・セロタイプＫ−56
菌株の菌学的性質は、バージマニユアル第８版
（Bergey's Manual of Determinative Bacterio
−logy，eightth edition）、並びにコーワンの医
学細菌同定の手引き第２版（Cowan and Steel's
manual for the indentification of medical be
−cteria、2nd edition by S.T.Cowan，
Cambridge Univ.Press，1974）におけるクレブ
シエラ属（Genus Klebsiella）の項の菌学的性質
と一致しており、特に、Klebsiella pneumoniae
の形態学的及び生化学的性状と近似していること
から、本発明で利用する上記Ｋ−56菌株は
Klebsiella pneumoniaeに属すると同定される。 本発明に係る抗腫瘍剤の活性成分である多糖体
は、クレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株を下記
に示す手順で培養することにより産生される。 クレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株の培養に
よる多糖体の産生 上記菌株の培養には通常の細菌の培養法が適用
し得る。すなわち、振とう培養又は静置培養で行
ない、培養に用いられる培地は該菌株が利用し得
る栄養源を含有するものであれば、合成培地、半
合成培地並びに天然培地でよい。培地の組成に
は、例えば炭素源としてはＤ−グルコース、Ｄ−
フラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロー
ス、マニトール、グリセリン、もしくはシヨ糖等
が、窒素源としては肉エキス、ペプトン、カザミ
ノ酸、酵母エキス、硫酸アンモニウムあるいは尿
素等が用いられる。また、無機塩類としては、
Na、Ｋ、Mg、Ca、Zn、Fe等の硫酸塩、硝酸
塩、塩化物、炭酸塩又はリン酸塩等が必要に応じ
て用いられる。なお、必要に応じて消泡剤を培地
に添加し得る。 培養条件としては、好気的条件下に培養するの
が一般的に有利であり、培養温度は30〜35℃が好
ましい。また、培地のPHは中性附近が好ましい。 培養期間は培地の組成、培養温度等により変動
するが、一般に３〜５日間程度でよく、培養終了
時に目的の多糖体の培養物中に蓄積される。 上述のようにして産生された多糖体は下記手順
に従つて単離して精製する。 多糖体の単離及び精製 液体振とう培養の場合には、培養により蓄積さ
れた多糖体は主に培養液中に含有されているの
で、遠心分離又は濾過により菌体を除いた後、濾
液から多糖体を単離し、一方静置培養（寒天で固
めた培地使用）の場合には多糖体は培地表面上に
生育した菌体と混在しているので、この菌塊を集
め１％フエノール水溶液に懸濁させ一夜より撹拌
した後、上記と同様の手順で遠心分離又は濾過に
より菌体を除去し、得られる上清液から単離す
る。 次に、このようにして単離した多糖体は、アセ
トン、エタノール又はメタノール等の水可溶性有
機溶媒を用いた分別沈澱法によりそれに混在して
いる低分子物質を除去し、得られる沈澱物を水に
溶かしたものにセチルトリメチルアンモニウムブ
ロミドのような第４級アンモニウム塩を加えて生
成する沈澱物を集める。ついで、この沈澱物に塩
化ナトリウムや塩化カリウム糖の水溶液を加えて
溶解し、得られる溶液にアセトン、エタノール又
はメタノール等の水可溶性有機溶媒を２〜３倍量
添加し、生成した沈澱物を採取し、該沈澱物を水
に溶かした後透析により脱塩した後、凍結乾燥す
ることにより、精製された多糖体が得られる。 次に、上述のようにして得られた多糖体の理化
学的性質を示す。 多糖体の理化学的性質 (1) 形状 白色の粉末体であつて、無味、無臭である。 (2) 均一性 超遠心分析で単一ピークを示すとともに、セ
ルロースアセテート膜を用いた電気泳動分析で
もアルシアンブルーに染まる単一バンドを示す
ことから、均一性は高いといえる。 (3) 分子量 セフアロース2B及び4Bカラムクロマトグラ
フイ−分析による測定ではゲル濾過的には105
〜106の平均分子量を示すものと推定される。 (4) 融点 明確な融点を示さず、300℃附近で分解して
褐変する。 (5) 溶解性 水に溶解して高粘稠性を示す。 (6) 呈色反応 アンスロン反応 陽性 モーリツシユ反応 陽性 システイン硫酸反応 陽性 銅フオーリン反応 陰性 カルバゾール硫酸反応 陰性 ニンヒドリン反応（4N−HClで100℃、４時間
加水分解後） 陰性 エルソンモルガン反応（4N−HClで100℃、４
時間加水分解後） 陰性 以上の呈色反応からみて、本多糖体はアミノ
糖以外の糖質から成つており、ウロン酸及びア
ミノ酸（又はペプチド並びにタンパク）を含有
していないと解し得る。 (7) 旋光度 0.43％水溶液について旋光度を測定し、比旋
光度［α］24 589を求めると＋79°を示す。 (8) 赤外線吸収スペクトル KBr錠剤法による赤外線吸収スペクトルは
添付の第１図に示すとおりである。 (9) 紫外線吸収スペクトル 水溶液についての紫外線吸収スペクトルは添
付の第２図に示すとおりである。 (10) 核磁気共鳴（NMR）スペクトル 本多糖体をD20に溶解して凍結乾燥すること
を３回繰返し行なつてD20置換をした後、２％
濃度になるようにD20に溶解したものについて
1H−NMR分析を行つた。その結果、
5.24ppm（H2個）、4.92ppm（H2個）、4.72ppm
（H1個）、1.43ppm（H3個）、1.27ppm（H3個）
にそれぞれピークが得られ、1.43ppmはピルビ
ン酸のCH3に基づくピーク、1.27ppmはラムノ
ースのCH3に基づくピークと同定された。他の
ピークはそれぞれ構成単糖のアノメリツクプロ
トンに基づくものと推定されるので、構成単糖
は５個と推定される。 (11) 糖質部分の構成糖 本多糖体の試料を2M−TFA（トリフルオロ
酢酸）を用いて100℃で１夜加水分解した後、
常法によりアルデイトールアセテート化を行な
つてガスクロマトグラフイ−分析に付したとこ
ろ、ラムノース、ガラクトース及びグルコース
が検出された。 また、ラムノース：ガラクトース：グルコー
スの組成比が１：３：１であることは上記核磁
気共鳴スペクトルで得られた結果と一致する。 因に、上述したような性状を示す本多糖体の
化学構造はY.M.CHOY等により下記のように
提案されている。 ［Y.M.CHOY and G.G.S.DUTTON：
“Structure of the Capsular Polysaccharide
of klebsiella Ｋ−type56”CAN.J.CHEM.
VOL.51.3021〜3026（1973）］。 (12)他の構成糖分 本多糖体の試料を上記（11）に記載したと同
様の手順で加水分解したものを、酢酸エチル：
酢酸：ギ酸：水＝18：３：１：４の組成比のも
のを展開溶媒として用いてペーパークロマトグ
ラフイー分析を行なつたところ、０−フエニレ
ンジアミン処理により紫外線照射下で螢光を発
するスポツトとしてピルビン酸が同定された。
ピルビン酸の存在は上記(10)に記載の核磁気共鳴
スペクトルの結果からも認められ、その含有比
はラムノース：ガラクトース：グルコース：ピ
ルビン酸＝１：３：１：１であつた。 次に、本多糖体の生理活性について述べる。 本多糖体の生理活性 (1) 急性毒性又は亜急性毒性 本多糖体のマウスに対する急性毒性又は亜急
性毒性を試験した結果は表１及び表２に示すと
おりである。
【表】
【表】
(2) 抗腫瘍活性
下記に示す実験例１乃至３に基づいて本多糖
体の抗腫瘍活性を判定した。 実験１ ddYマウス（平均体重19ｇ、５週令の雄、１群
５匹）の腹側部皮下に、ICR−マウスの腹腔内で
継代培養したSarcoma−180細胞を５×106個移植
し、翌日より生理食塩水に溶解した各種濃度の多
糖体試料を腹腔内に１日１回の割合で５日間連続
投与し、上記移植の７日目に発生した腫瘍重量を
測定し、対照に対する腫瘍の増殖抑制率を測定し
た。なお、他の１群には対照薬剤としてマイトマ
イシンＣ（MMC）の６mg／Kgを投与した。結果
は表３に示すとおりである。
体の抗腫瘍活性を判定した。 実験１ ddYマウス（平均体重19ｇ、５週令の雄、１群
５匹）の腹側部皮下に、ICR−マウスの腹腔内で
継代培養したSarcoma−180細胞を５×106個移植
し、翌日より生理食塩水に溶解した各種濃度の多
糖体試料を腹腔内に１日１回の割合で５日間連続
投与し、上記移植の７日目に発生した腫瘍重量を
測定し、対照に対する腫瘍の増殖抑制率を測定し
た。なお、他の１群には対照薬剤としてマイトマ
イシンＣ（MMC）の６mg／Kgを投与した。結果
は表３に示すとおりである。
【表】
表３にみられるように、本多糖体の投与群では
マイトマイシンＣに比較して体重変化も少なく、
腫瘍阻止率も優れている。 実験２ BALB／Ｃマウス（平均体重20ｇ、５週令の
雄、１群５匹）の背部皮下に、BALB／Ｃマウ
スの腹腔内で継代培養したMeth−Ａ腫瘍細胞を
２×105個移植し、移植後３日目及び106日目に生
理食塩水に溶解した各種濃度の多糖体試料を上記
腫瘍内に投与し、移植から26日経過後の腫瘍重量
を測定した。結果は表４に示すとおりである。
マイトマイシンＣに比較して体重変化も少なく、
腫瘍阻止率も優れている。 実験２ BALB／Ｃマウス（平均体重20ｇ、５週令の
雄、１群５匹）の背部皮下に、BALB／Ｃマウ
スの腹腔内で継代培養したMeth−Ａ腫瘍細胞を
２×105個移植し、移植後３日目及び106日目に生
理食塩水に溶解した各種濃度の多糖体試料を上記
腫瘍内に投与し、移植から26日経過後の腫瘍重量
を測定した。結果は表４に示すとおりである。
【表】
な式に基づいて求めた。
実験３ CDF1マウス（平均体重20ｇ、５週令の雄、雌
の各６匹を１群とした）の腹腔内に、Ｐ−388白
血病細胞を１×106個移植し、移植の翌日より１
日１回の割合で９日間、生理食塩水に溶解した各
種濃度の多糖体試料を腹腔内に投与し、非投与群
（対照）に対する生命延長率（延命率）を測定し
た。 結果は表５に示すとおりである。 なお、比較として市販の多糖体抗癌剤であるク
レスチン（呉羽化学工業(株)製商品名）を上記と同
様にして250mg／Kgを投与して延命率を測定した
結果を併せて表５に示した。
実験３ CDF1マウス（平均体重20ｇ、５週令の雄、雌
の各６匹を１群とした）の腹腔内に、Ｐ−388白
血病細胞を１×106個移植し、移植の翌日より１
日１回の割合で９日間、生理食塩水に溶解した各
種濃度の多糖体試料を腹腔内に投与し、非投与群
（対照）に対する生命延長率（延命率）を測定し
た。 結果は表５に示すとおりである。 なお、比較として市販の多糖体抗癌剤であるク
レスチン（呉羽化学工業(株)製商品名）を上記と同
様にして250mg／Kgを投与して延命率を測定した
結果を併せて表５に示した。
【表】
表５にみられるように、従来の多糖体抗癌剤で
は結果がみられないＰ−388白血病細胞に対して
も本発明に係る多糖体は有効である。 本発明の抗腫瘍剤の有効投与量は、その活性成
分である多糖体として一般的には１mg／Kg／日〜
100mg／Kg／日であり、また、抗腫瘍剤の製剤化
は、本多糖体を公知の手法によつて錠剤、果粒
剤、散剤、カプセル剤並びに注射形態の液剤等に
することにより行ない得る。 これらは経口的あるいは注射（静注、動注、筋
肉注）として投与される。 以下に実施例に示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 多糖体の調整 ペプトン0.5wt％、肉エキス0.3wt％、シヨ糖
3wt％及び食塩0.1wt％を含有する液体培地を試
験管（18×180mm）４本にそれぞれ分注し、120℃
で15分間オートクレーブ中で滅菌した後、該各液
体培地にクレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株
（FERMP−7208）を接種し、35％で24時間振と
う培養を行なつた。 別に、ペプトン0.5wt％、肉エキス0.3wt％、シ
ヨ糖3wt％、食塩0.1wt％及び寒天1.5wt％を含有
する寒天培地を300mlの三角フラスコ４本にそれ
ぞれ250ml宛分注し、120℃で15分間オートクレー
ブ中で滅菌した後、これを予め滅菌してあるバツ
ト（アルミ製、縦18cm、横26cm、深さ2.5cm）に
注入し、放冷して調製した寒天板培地の各々に上
記培養により得られた培養物を接種して該培地上
に拡げ、35℃で３日間培養を行なつた。 培養終了後、寒天平板培地上に生成した粘質物
をかき集め、これを１％フエノール水溶液に懸濁
させ、１日撹拌を行なつた後、この懸濁液を遠心
分離（30000r.p.m.3時間）して菌体を除去し、得
られた上清液にエタノールを４倍量加えて太い糸
状の沈澱物を得た。この沈澱物をガラス棒にから
ませて採取した後、脱イオン水に溶解し、この溶
液に5wt％のセチルトリメチルアンモニウムブロ
ミドを加えながらガラス棒で撹拌した。この撹拌
によりガラス棒に堅くまつわるように沈澱が生ず
るので、これをかき集めて4M−NaCl水溶液に溶
解し、冷室で２日間撹拌した後、３倍量のエタノ
ールを加え、生じた沈澱を脱イオン水に溶かし
た。得られた溶液を流水中で２日間透析し、つい
で凍結乾燥して白色粉末の多糖体を得た。収量は
寒天培地１当り約１ｇであつた。 多糖体のMethA腫瘍に対する活性 上述のようにして得られた多糖体のMethA腫
瘍に対する活性試験を下記により行なつた。 試験動物としてBACB／Ｃマウス（〓体重20
ｇ）の５匹／群を用い、該マウスの背部皮下に
Meth−Ａ腫瘍細胞を２×105個それぞれ移植した
後３日目及び10日目に多糖体を10mg／Kg並びに
100mg／Kgを腫瘍内にそれぞれ投与した。結果は
下記のとおりである。 投与量 腫瘍増殖阻止率（％） 完治数 10mg／Kg 96 ３／５ 100mg／Kg 76 ３／５ なお、対照として、多糖体に代えて生理食塩水
を投与した。 実施例 ２ 多糖体の調製 バクトペプトン0.5wt％、バクト肉エキス0.3wt
％及び食塩0.2wt％を含有する液体培地を200ml容
三角フラスコ５本にそれぞれ125ml宛分注し、121
℃で15分間オートクレーブ中で滅菌した後、該各
液体培地にクレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株
（FERM Ｐ−7208）を接種し、37℃で６時間振
とう培養を行なつた。 別に、シヨ糖3wt％、食塩0.2wt％、酵母エキ
ス0.2wt％、K2HPO40.1wt％、
MgSO47H2O0.02wt％、CaCO30.01wt％及びバク
ト寒天1.5wt％を含有する寒天培地を４容三角
フラスコ５本にそれぞれ2.5宛分注し、121℃で
15分間オートクレーブ中で滅菌した後、これを予
め滅菌してあるバツト（縦50cm、横70cm、深さ５
cm）に注入し、放冷して調製した寒天平板培地の
各々に上記培養により得られた培養物を接種して
該培地上に拡げ、37℃で３日間培養を行なつた。 培養終了後、寒天平板培地に生じた粘質物をか
き集め、１％フエノール水溶液に懸濁させ、１日
撹拌を行つた後、この懸濁液を遠心分離
（30000r.p.m.5時間）して菌体を除去し、得られ
た上清液にエタノール：メタノール（19：１）混
液を３倍量加え、生成する沈澱物をガラス棒にか
らませて採取した。 このようにして得られた沈澱物を脱イオン水２
に溶解した後、この溶液に10wt％のセチルト
リメチルアンモニウムブロミドを加えながらガラ
ス棒で撹拌した。この撹拌によりガラス棒に堅く
まつわるように沈澱が生ずるので、これをかき集
めて4M−NaCl溶液１に溶解し、この溶液を３
倍量のエタノール：メタノール（19：１）混液中
に注ぎ、生成する沈澱物を遠心分離（3000r.p.
m.20分）により採取した。得られた沈澱物を2.5
の水に溶かし、流水中で３日間透析を行ない、
ついで凍結乾燥して白色粉末の多糖体を得た。収
量は培地１当り約１ｇであつた。 多糖体のマウス白血病Ｐ−388に対する活性 上述のようにして得られた多糖体のマウス白血
病Ｐ−388に体する活性試験を下記により行なつ
た。 試験動物としてCDF1マウス（〓体重20ｇ）の
６匹／群を用い、該マウスにＰ−388細胞を１×
106腹腔内移植し、移植の翌日より１日１回の割
合で５日間、生理食塩水に溶解した多糖体を50
mg／Kg、25mg／Kg並びに12.5mg／Kgの投与量でそ
れぞれ腹腔内に投与して延命率を調べた。結果は
下記に示すとおりである。 投与量 延命率（Ｔ／Ｃ％） 50mg／Kg 124 25mg／Kg 118 12.5mg／Kg 127 なお、生理食塩水のみを投与した対照群では平
均生存日数は11日であつた。 実施例 ２ 製剤の調製 実施例１によつて得られた多糖類0.1ｇに乳糖
１ｇを混合し、圧搾成型にして錠剤を得た。この
錠剤は病状によつて異なるが通常成人は１日当り
１〜10錠を一日３回に分けて経口的に投与する。
は結果がみられないＰ−388白血病細胞に対して
も本発明に係る多糖体は有効である。 本発明の抗腫瘍剤の有効投与量は、その活性成
分である多糖体として一般的には１mg／Kg／日〜
100mg／Kg／日であり、また、抗腫瘍剤の製剤化
は、本多糖体を公知の手法によつて錠剤、果粒
剤、散剤、カプセル剤並びに注射形態の液剤等に
することにより行ない得る。 これらは経口的あるいは注射（静注、動注、筋
肉注）として投与される。 以下に実施例に示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 多糖体の調整 ペプトン0.5wt％、肉エキス0.3wt％、シヨ糖
3wt％及び食塩0.1wt％を含有する液体培地を試
験管（18×180mm）４本にそれぞれ分注し、120℃
で15分間オートクレーブ中で滅菌した後、該各液
体培地にクレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株
（FERMP−7208）を接種し、35％で24時間振と
う培養を行なつた。 別に、ペプトン0.5wt％、肉エキス0.3wt％、シ
ヨ糖3wt％、食塩0.1wt％及び寒天1.5wt％を含有
する寒天培地を300mlの三角フラスコ４本にそれ
ぞれ250ml宛分注し、120℃で15分間オートクレー
ブ中で滅菌した後、これを予め滅菌してあるバツ
ト（アルミ製、縦18cm、横26cm、深さ2.5cm）に
注入し、放冷して調製した寒天板培地の各々に上
記培養により得られた培養物を接種して該培地上
に拡げ、35℃で３日間培養を行なつた。 培養終了後、寒天平板培地上に生成した粘質物
をかき集め、これを１％フエノール水溶液に懸濁
させ、１日撹拌を行なつた後、この懸濁液を遠心
分離（30000r.p.m.3時間）して菌体を除去し、得
られた上清液にエタノールを４倍量加えて太い糸
状の沈澱物を得た。この沈澱物をガラス棒にから
ませて採取した後、脱イオン水に溶解し、この溶
液に5wt％のセチルトリメチルアンモニウムブロ
ミドを加えながらガラス棒で撹拌した。この撹拌
によりガラス棒に堅くまつわるように沈澱が生ず
るので、これをかき集めて4M−NaCl水溶液に溶
解し、冷室で２日間撹拌した後、３倍量のエタノ
ールを加え、生じた沈澱を脱イオン水に溶かし
た。得られた溶液を流水中で２日間透析し、つい
で凍結乾燥して白色粉末の多糖体を得た。収量は
寒天培地１当り約１ｇであつた。 多糖体のMethA腫瘍に対する活性 上述のようにして得られた多糖体のMethA腫
瘍に対する活性試験を下記により行なつた。 試験動物としてBACB／Ｃマウス（〓体重20
ｇ）の５匹／群を用い、該マウスの背部皮下に
Meth−Ａ腫瘍細胞を２×105個それぞれ移植した
後３日目及び10日目に多糖体を10mg／Kg並びに
100mg／Kgを腫瘍内にそれぞれ投与した。結果は
下記のとおりである。 投与量 腫瘍増殖阻止率（％） 完治数 10mg／Kg 96 ３／５ 100mg／Kg 76 ３／５ なお、対照として、多糖体に代えて生理食塩水
を投与した。 実施例 ２ 多糖体の調製 バクトペプトン0.5wt％、バクト肉エキス0.3wt
％及び食塩0.2wt％を含有する液体培地を200ml容
三角フラスコ５本にそれぞれ125ml宛分注し、121
℃で15分間オートクレーブ中で滅菌した後、該各
液体培地にクレブシエラ・セロタイプＫ−56菌株
（FERM Ｐ−7208）を接種し、37℃で６時間振
とう培養を行なつた。 別に、シヨ糖3wt％、食塩0.2wt％、酵母エキ
ス0.2wt％、K2HPO40.1wt％、
MgSO47H2O0.02wt％、CaCO30.01wt％及びバク
ト寒天1.5wt％を含有する寒天培地を４容三角
フラスコ５本にそれぞれ2.5宛分注し、121℃で
15分間オートクレーブ中で滅菌した後、これを予
め滅菌してあるバツト（縦50cm、横70cm、深さ５
cm）に注入し、放冷して調製した寒天平板培地の
各々に上記培養により得られた培養物を接種して
該培地上に拡げ、37℃で３日間培養を行なつた。 培養終了後、寒天平板培地に生じた粘質物をか
き集め、１％フエノール水溶液に懸濁させ、１日
撹拌を行つた後、この懸濁液を遠心分離
（30000r.p.m.5時間）して菌体を除去し、得られ
た上清液にエタノール：メタノール（19：１）混
液を３倍量加え、生成する沈澱物をガラス棒にか
らませて採取した。 このようにして得られた沈澱物を脱イオン水２
に溶解した後、この溶液に10wt％のセチルト
リメチルアンモニウムブロミドを加えながらガラ
ス棒で撹拌した。この撹拌によりガラス棒に堅く
まつわるように沈澱が生ずるので、これをかき集
めて4M−NaCl溶液１に溶解し、この溶液を３
倍量のエタノール：メタノール（19：１）混液中
に注ぎ、生成する沈澱物を遠心分離（3000r.p.
m.20分）により採取した。得られた沈澱物を2.5
の水に溶かし、流水中で３日間透析を行ない、
ついで凍結乾燥して白色粉末の多糖体を得た。収
量は培地１当り約１ｇであつた。 多糖体のマウス白血病Ｐ−388に対する活性 上述のようにして得られた多糖体のマウス白血
病Ｐ−388に体する活性試験を下記により行なつ
た。 試験動物としてCDF1マウス（〓体重20ｇ）の
６匹／群を用い、該マウスにＰ−388細胞を１×
106腹腔内移植し、移植の翌日より１日１回の割
合で５日間、生理食塩水に溶解した多糖体を50
mg／Kg、25mg／Kg並びに12.5mg／Kgの投与量でそ
れぞれ腹腔内に投与して延命率を調べた。結果は
下記に示すとおりである。 投与量 延命率（Ｔ／Ｃ％） 50mg／Kg 124 25mg／Kg 118 12.5mg／Kg 127 なお、生理食塩水のみを投与した対照群では平
均生存日数は11日であつた。 実施例 ２ 製剤の調製 実施例１によつて得られた多糖類0.1ｇに乳糖
１ｇを混合し、圧搾成型にして錠剤を得た。この
錠剤は病状によつて異なるが通常成人は１日当り
１〜10錠を一日３回に分けて経口的に投与する。
添付の第１図は、本発明に係る多糖体の赤外線
吸収スペクトルを示し、第２図は上記多糖体の紫
外線吸収スペクトルを示す。
吸収スペクトルを示し、第２図は上記多糖体の紫
外線吸収スペクトルを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ クレブシエラ（Klebsiella）属に属するクレ
ブシエラ・セロタイプ（Klebsiella Serotype）
Ｋ−56菌株を培養し、菌体外に分泌される次の理
化学的性質をもつ多糖類を有効成分とする抗腫瘍
剤。 (1) 平均分子量105〜106（ゲル濾過法による） (2) 構成糖がラムノース、ガラクトース、グルコ
ース及びピルビン酸よりなり、その構成比率が
ラムノース：ガラクトース：グルコース：ピル
ビン酸＝１：３：１：１である (3) 超遠心または電気泳動によつて単一のピーク
またはバンドを示す。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58211419A JPS60104017A (ja) | 1983-11-10 | 1983-11-10 | 抗腫瘍剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58211419A JPS60104017A (ja) | 1983-11-10 | 1983-11-10 | 抗腫瘍剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60104017A JPS60104017A (ja) | 1985-06-08 |
| JPH0367048B2 true JPH0367048B2 (ja) | 1991-10-21 |
Family
ID=16605640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58211419A Granted JPS60104017A (ja) | 1983-11-10 | 1983-11-10 | 抗腫瘍剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60104017A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0775490A4 (en) * | 1995-06-05 | 1998-06-03 | Tayca Corp | Immunopotentiator |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5714533A (en) * | 1980-06-29 | 1982-01-25 | Koutaku Hayashi | Preparation for immunochemical therapy, prevention of drug resistance and anticancer |
| JPS59172423A (ja) * | 1983-03-22 | 1984-09-29 | Nobuo Kato | 細菌由来の抗悪性腫瘍剤 |
-
1983
- 1983-11-10 JP JP58211419A patent/JPS60104017A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60104017A (ja) | 1985-06-08 |
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