JPS60184400A - 新規な発色試薬 - Google Patents

新規な発色試薬

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JPS60184400A
JPS60184400A JP59040031A JP4003184A JPS60184400A JP S60184400 A JPS60184400 A JP S60184400A JP 59040031 A JP59040031 A JP 59040031A JP 4003184 A JP4003184 A JP 4003184A JP S60184400 A JPS60184400 A JP S60184400A
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新谷　昭法
Satoru Okajima
岡島　悟
Toshiro Hanada
寿郎 花田
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は下記一般式［Ｉ） ２ 〔式中、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ３，Ｒ４は低級アルキル基を表
わし、夫々同じであっても異っていても良く、Ｘ、。
Ｘ２はどちらも一〇（ＣＨ２）ｎＳ０８Ｍ（但し、Ｍは
水素又はアルカリ金属イオン又はＮＨ↓を示し、ｎは２
〜４の整数を示す。〕を示すか、又はどちらか一方が一
〇（ＣＨ２）ｎ８０８Ｍ（但し、Ｍ、ｎは前記と同じ）
を示し、他方が水素を示す。〕で表わされる新規　２− なトリフェニルメタン誘導体、並びにこれを発色成分と
して用いる生体中の微量成分の定量方法に関する。
血液や尿などの体液成分を測定することは、その変動が
疾病と大きく関連しているため、疾患の診断、病態の解
明、治療経過の判定を行なう上で、必須のものとなって
いる。例えば、血液中のコレステロール、トリグリセラ
イド、グルコース、尿酸、モノアミンオキシダーゼ、胆
汁酸などを始め、非常に多種類の微量成分の測定法が開
発されており、疾病の診断上役立っていることは周知の
通りである。これら微量成分の中には、モノアミンオキ
シダーゼや胆汁酸のように、正常血清中には極く微量し
か含まれていないものもある。
現在、血清成分の測定法としては、目的成分に特異的に
作用する酵素を用いて酵素反応を行ない、これによる生
成物を測定して目的成分量をめる、いわゆる°′酵素法
”が一般に広く普及している。
なかでも、Ｈ２Ｏ２生成酵素、例えば、オキシダーゼを
働かせて目的成分に相当するＨＱ０２を生成させ、これ
をペルオキシダーゼ、及び発色成分である被酸化性呈色
試薬を用いて発色系に導き、これを比色定量することに
より目的成分量をめる方法が、被酸化性呈色試薬の開発
と相まって増加しつつある。例エバ、コレステロール−
コレステロールオキシダーゼ、グルコース−グルコース
オキシダーゼ、トリグリセライド−リボプロティンリパ
ーゼ−グリセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼな
どの組合せで発生するＨ２Ｏ。を、ペルオキシダーゼ、
被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色の吸
光度を測定することにより目的成分量をめる方法である
。血清中のこれらの成分濃度は、当然のことながら成分
の種類により異なるため、酵素反応により生成する１１
２０２量もさまざまである。従って、夫々目的に応じた
感度の被酸化性呈色試薬が開発され、使用されており、
例えば、コレステロール、トリグリセライド、グルコー
ス、尿酸等の測定に於ては、４−アミノアンチピリンと
、フェノール系化合物又はＮ、Ｎ−ジアルキルアニリン
系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬が一般に用いら
れる。５ 一方、モノアミンオキシダーゼは、モノアミン化合物に
作用して、Ｈ２Ｏ２とアルデヒドとを生成させる酵素で
あるが、血清中の濃度が超微量であるため、生成するＨ
２Ｏ２も超微量であり、これを定量するには、上記の如
き組合せの被酸化性呈色試薬では感度不足であり、より
高感度の被酸化性呈色試薬が必要とされている。現在、
高感度の被酸化性呈色試薬としてロイコメチレンブルー
誘導体を用いる測定法が開発され、商品化されているが
、しかしながら、このロイコ色素は、溶液状態での安定
性に問題があり、これを含む発色試液は、保存中に徐々
に着色が進行してくるという欠点を有している。
また他に、同様の目的で、本発明と同じトリフェニルメ
タン系ロイコ色素であるロイコクリスタルバイオレット
やロイコマラカイトグリーン等も、高感度被酸化性呈色
試薬として研究されているが、これらはいずれも中性付
近では水に難溶であり、所望の濃度に溶解することが困
難な為、微量成分□　−′５− の測定には適さない。
また、この欠点を改良したロイコ色素として、ビス（４
−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフェニルメタ
ン（以後、ＢＳＰＭと略称する。）が提案されている（
特開昭５６−２６１９９号公報）が、これとして水に対
する溶解性は必ずしも充分であるとはいえない。
本発明者らは、かかる状況に鑑み、中性付近での水に対
する溶解性に優れ、且つ水溶液が長時間安定であり、ま
た発色の感度が高く、呈色が安定であり、更には、ヘモ
グロビン、ビリルビン等の血清成分の影響を回避する為
、より長波長側に吸収を有する呈色を示す新規な発色試
薬をめて鋭意研究を重ねた結果、これらの条件を全て備
えた本発明の新規なトリフェニルメタン系ロイコ色素を
見出し、本発明を完成するに到った。
本発明は下記一般式〔Ｉ〕 Ｒ１＼＋ｃＨ＋Ｎ／８ 、、、Ｎ　ＣＤ ＼Ｒ４ 〔９「ｘ　。
　６− 〔式中、Ｒ，、Ｒ２，Ｒ８，Ｒ４は低級アルキル基を表
わし、夫々同じであっても異っていても良く、Ｘ、。
Ｘ２はどちらも−０（ＣＩ］２〕ｎＳ０３Ｍ（但し、Ｍ
は水素子 又はアルカリ金属イオン又はＮＨ４を示し、ｎは２〜４
の整数を示す。）を示すか、又はどちらか一方が一〇（
Ｃ■１２）ｎＳ０３Ｍ（但し、Ｍ　、　ｎは前記と同じ
）を示し、他方が水素を示す。〕で表わされる新規なト
リフェニルメタン誘導体、並びにこれを発色成分として
用いる生体中の微量成分の定量方法の発明である。
本発明のトリフェニルメタン系ロイコ色素ハ、公知のト
リフェニルメタン系ロイコ色素であるロイコマラカイト
グリーン、ロイコクリスタルバイオレット等の欠点であ
る中性付近での水に対する溶解性を改善する目的で、本
発明者らが新たに創造したものであり、可溶基として−
０（ＣＨ２）。８０８Ｍ（Ｍ　、　ｎは前記と同じ。）
なる基を導入した点に大きな特徴を有する。
即ち、前記ＢＳＰＭは、トリフェニルメタン系ロイコ色
素の水に対する溶解性を改善する目的で、ベンゼン核に
スルホン基を１つ導入したトリフェニルメタン誘導体で
あるが、ｐ）１７．２に於ける溶解度が０．５ｍＭと未
だ中性付近での水に対する溶解性が充分であるとはいえ
ず、また、ベンゼン核にスルホン基を２つ導入したビス
（４−ジエチルアミノフェニル）−２，４−ジスルホフ
ェニルメタンの場合は、水に対する溶解性は明らかに改
善されるが、酸化還元電位が高い為、）（２０，、−Ｐ
ＯＤ　（ペルオキシダーゼ）系では酸化されず、呈色し
ない。従って、酵素を用いてＲ２０゜を生成させ、これ
を発色系に導くことにより、目的成分の測定を行なう体
液成分の測定法には、この化合物は使用し得ない。
これに対し、本発明のトリフェニルメタン誘導体は、−
０（ＣＨ２）ｎＳ０８Ｍ　（Ｍ　、　ｎは前記と同じ。
）で表わされる基が１つついたもの、例えば、ビス（４
−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノフェニル）−４−ソジウムス
ルホブロポキシフェニルメタン（以後、ＢＳｐｒｏＰＭ
と略称する。）でも、中性付近（ｐＨ７，２）での水に
対する溶解度が前記ＢＳＰＭの１０倍の５ｍＭであり、
２つついたもの、例えば、ビス（４−Ｎ。
−８＝ Ｎ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジソジウムス
ルホプロポキシフェニルメタン（以後、ＢＳも、　Ｏ（
ＣＨ２）ｎ　ＳＯａＭ　（Ｍ　ｓ　ｎは前記と同じ。）
で表わされる基が２つついた本発明のトリフェニルメタ
ン誘導体は、極めて意外なことに、スルホン基がベンゼ
ン核に直接２つついたトリフェニルメタン誘導体の場合
と異なり、Ｈ２Ｏ２−ＰＯＤ系での酸化呈色が極めて良
好であり、所期の目的に充分使用し得る。
本発明のロイコ色素は、溶液状態で出極めて安定であり
、従来のロイコメチレンブルー誘導体の水溶液が、室温
では数時間で使用不能となるのに対し、本発明のロイコ
色素の水溶液は、２４時間保存後も何ら変化を受けず、
発色成分として充分測定に使用し得る。
本発明のロイコ色素は、その発色感度がいずれもｇｏ、
ｏｏｏ以上と高く、また一様に長波長側、即ち６００〜
７００ｎｍにλｍａｘを有しているため、ヘモグロ　− ビン、ビリルビン等の妨害を受けにくい。
また、本発明色素による呈色は極めて安定であり、褪色
は殆んど詔められない。
一般式〔Ｉ〕で表わされる本発明のトリフェニルメタン
誘導体に於て、Ｒ５−Ｒ４はメチル、エチル、プロピル
等の低級アルキル基を表わし、夫々同じ＋＋十 Ｋ　、Ｌｉ　等のアルカリ金属イオン又はＮ馬であり、
ｎは２，３又は４である。
本発明のトリフェニルメタン誘導体ハ、一般に下記の方
法により製造することができる。
即ち、例えば１３ＳｄｉｐｒｏＰＭの場合、プロトカテ
キュアルデヒドとプロパンサルトンヲ、メチルセロソル
ブ、エチルセロソルブ等の有機溶媒中、苛性ソーダ、ナ
トリウムアルコラード等のアルカリ存在下に加熱反応さ
せ、反応後は冷却、晶析、溶媒注入、Ｐ取、洗浄等、通
常の後処理操作を行ない、要すればカラムクロマトグラ
フィ等により精製して、３，４−ジソジウムスルホブロ
ポキシベンズ１０− アルデヒドを得、次いで、これとジエチルアミンとをメ
チルセロソルブ、エチルセロソルブ等の有機溶媒中、塩
化亜鉛等の触媒の存在下に加熱反応させた後常法により
後処理を行ない、カラムクロマトグラフィ等により精製
して目的物を得ることができる。
本発明のトリフェニルメタン誘導体は、血液や尿などの
体液成分の酵素法（Ｈ２０２生成系）による測定に、極
めて有効に用いることができる。
一般に、トリフェニルメタン系の被酸化性呈色試薬（ト
リフェニルメタン系ロイコ色素）は、尿酸及びタンパク
により呈色阻害を受けるが、本発明者らは、本発明方法
の実施に際して、この内の尿酸の影響はウリカーゼを共
存させることにより回避でき（この場合、尿酸はＨ２０
□の生成を伴わずに分解できる。）、また、タンパクの
影響は特定の界面活性剤や金属キレートの添加によって
回避できることを見出し、本発明方法を確立した。
即ち、本発明のロイコ色素は、酸やタンパクを含む血清
や尿などの体液中の化学的成分の酵素法（Ｈ２Ｏ。生成
系）による測定に於いても、全く支障なく使用できる。
本発明のトリフェニルメタン系ロイコ色素を発色成分と
して用いた酵素法（Ｈ，、Ｏ，、生成系）による測定に
於て、測定可能な体液中の化学的成分としては、例えば
グルコース、遊離コレステロール、総コレステロール、
　ＨＤＴ、　（高比重りボタンバク）−コレステロール
、ＬＤＬ　（低比重リポタンパク）−コレステロール、
トリグリセライド、リン脂質、尿酸、モノアミンオキシ
ダーゼ等、従来酵素法（Ｈ２０２生成系）で測定されて
いる項目はすベテ挙げられる。（但し、尿酸については
、あらかじめ尿酸にウリカーゼを作用させてＨ２Ｏ２を
生成させた後、本発明の試薬をペルオキシダーゼと共に
添加し、呈色させる必要がある。）が、就中、モノアミ
ンオキシダーゼ等、体液中に極く微量しか含まれていな
い成分の測定に特に適している。
タンパクの影響を除く界面活性剤としては、例エハエマ
ールＮＣ（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ
ル硫酸エステル、花王アトラス社商品名）、サンノール
６０５Ｄ（ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エ
ステル、ライオン油脂（株）商品名）などが用いられ、
金属キレートとしては、Ｆｅ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ　、　
Ｎ１（ＩＩ）−ＢＤＴＡなどが用いられる。
本発明の方法を、血清について実施する場合は、本発明
に係るトリフェニルメタン系被酸化性呈色試薬の濃度は
０．９１ｍＭ以上であれば使用可能であるが、通常は０
．０２〜０．３ｍＭの濃度が好ましく用いられる。
尿酸の影響を回避する為に用いるウリカーゼの濃度は、
一般に５０Ｕ／を以上であればよいが、通常は１００〜
５００　Ｕ／ｌの範囲が好ましく用いられる。
また、タンパクの影響を除く為に用いる界面活性剤は０
．０５〜ＩＯ％の範囲が、また金属キレートの場合は０
．０１〜０．５％の範囲が好ましく用いられる。
呈色液の液性は、通常ｐ）（＝＝５〜９であればよいが
、酵素反応に適した液性であるｐＨ−６〜８が、呈色及
び安定性の面からもより好ましい。
本発明は、生体試料、特に血液や尿などの体液１３− 中の微量成分の酵素法（Ｈ２０２生成系）による測定に
於て有効な発色成分と、それを用いる測定法を提供する
ものであり、モノアミンオキシダーゼ、遊離コレステロ
ール等のより微量な成分の測定に特に適しており、斯業
に貢献するところ甚だ大なるものである。
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れらに限定されるものでない。
実施例１．　’　８８　ｄｉｐｒｏ　ＰＭの合成（１）
３．４−ジソジウムスルホブロポキシベンズアルデヒド
の合成 プロトカテキュアルデヒド２７．６ｆｆ　（０，２ｍｏ
ｔ）をメタノール２００ｍｔに溶解し、これに２８％ナ
トリウムメチラー）　９２．４９　（０，４８ｍｏＡ　
）を加えて濃縮乾固する。メチルセロソルブ４００ｍｔ
を加えて攪拌溶解し、これにプロパンサルトン５８．８
　ｔ　（０，４８ｍｏｔ）をメチルセロソルブ５０ｍＡ
に溶解した液を９５〜１００℃で滴下し、滴下後回温度
で１時間攪拌反応する。冷却後アセトンを加えて結晶を
分散し、ｒ取する。乾燥して粗品８８グ（収率１０３２
％）を得１４− る。これをカラムクロマトグラフィ（ＯＤ８逆相カラム
、２０％メタノール（ｉｎ　ＡＣ’ＯＨ５％））により
精製して結晶４３．５ｆ（通算収率５１．０％）を得る
。ＴＬＣ−０−Ｒ）、１１９０〜１２２０（−ｓｏ＝、
φ−０−Ｒ）、１６７０ｃｒｎ−’　（−ＣＨｏ　）。
（Ｉ＋）ビス（４−Ｎ　、Ｎ−ジエチルアミノフェニル
）−３，４−ジソジウムスルホプロポキシフェニルアル
デヒド７．０　ｆ　（１６，４ｍｍｏｔ）　、　Ｎ　、
　Ｎ−ジエチルアニリン７．３　ｆ　（４９，２ｍｍｏ
ｔ）及び塩化亜鉛４．５ｔをメチルセロソルブ１４０　
ｍｔＶｃ懸’／’１４させた後、内温１２５℃で２８時
間加熱反応させる。反応後、生成した水分を留去し、ジ
メチルスルホキシド３００ｍｔを加えて反応物を溶解さ
せた後、不溶物をＰ失する。ｒ液に酢酸エチル１，７０
０ｍｔｉ加えて結晶析出させ、これをｆ取し、この結晶
を水１５ｍｔに溶解する。これをカラムクロマトグラフ
ィ（担体■ Ｗａｋｏｇｅｌ　Ｃ−２００）で精製した後、溶離液を
留去し、水に溶解して脱色濾過し、濃縮後アセトンを加
えて結晶化させ、これをｒ取して目的とする微青色結晶
２６８１Ｆ（収率２３２％）を得る。
〔元素分析値〕
ＨＣＮ 理論値ｃ％）　６．２７　５６．０８　３．９６実測値
（％）’　６．４６　５６．０６　４．１４ＵＶ（０，
ＩＭ）リス緩衝液、ｐ）ｌ＝７．５　）　：λｍａｘ（
ε）＝６２０ｎｍ（１６６，３００）。
【′、） 工Ｒ（ＫＢｒ）ニジ＝ｌＯ２０〜１０３０（−８０３、
φ−０−Ｒ）、１１８０〜１２００（−ｓｏ’ｇ、φ−
０−Ｒ）、１３８０（−Ｎ（Ｃ２Ｈ６）２）、２９５０
ｃｒｎ−’　（−Ｃ２Ｈ，）。
実施例２．　ＢＳ　ｐｒｏ　ＰＭの合成ｐ−ヒドロキシ
ベンズアルデヒドとプロパンサルトンとから実施例１の
（１）と同様にして得られた４−ソジウムスルホブロボ
キシベンズアルデヒド２５２を使用し、実施例１の（１
１）に準じて、塩化亜鉛２４グの存在下、メチルセロソ
ルブ５０ｍｔ中、Ｎ。
Ｎ−ジエチルアニリン３４グと反応させ、実施例１の（
１１）と同様に処理してビス（４−Ｎ、Ｎ−ジエチルア
ミノフェニル）−４−ソジウムスルホブロボキシフェニ
ルメタン（ＢＳ　ｐｒｏ　ＰＭ　）の淡青色結晶０７ｆ
（収率１３６％）を得る。
〔元素分析値〕
ＨＣＮ 理論値（％）　７．１９　６５．９１　５．１２実測値
（％）　７．３３　．６５，９４　５．２８ＵＶ（ｏＩ
Ｍ）リス緩衝液、ｐＨ＝７．５　）　：λｍａｘ（ｇ）
＝６２０ｎｍ（１２１，８００）。
実施例３．　血清モノアミンオキシダーゼの活性測定 ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０　）に、基質とし
てアリルアミン１５　ｍＭを用い、ウリカーゼ２００　
Ｕ／ｌ。
ＢＳ　ｄｉｐｒｏ　ＰＭ　０．０３　ｍＭ　、　ｘ　ｖ
−ルＮＣ（花王アトラス社商品名）５％の濃度になるよ
うに溶解し、基質発へとする。
ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム８．９ｍＭの水
溶液を調製し、反応停止液とする。
血清５０μｔをとり、基質発色試液３ｍｔを加え、３７
℃の恒温槽中、３０分加温後、反応停止液５０μｔを加
えて混和した後、試薬ブランクを対照として波長６２０
皿に於ける吸光度を測定する。
シグマ社製牛山来モノアミンオキシダーゼを用いて、５
工則／ｚ、ｔＯＩ則ｌ、２０Ｉ嚇ｔの標準液を調製し、
これを用いて血清と同様に操作して吸光度を測定し、検
量線を作成する。第１図に検量線を示す。
検量線から試料中のモノアミンオキシダーゼ活性をめる
。
参考例１ 〔緩衝液〕 アリルアミン３０　ｍＭ　、フェノール０．５３ｍＭ及
び界面活性剤を含む、４５ｍＭのｐＨ＝６．７５のグツ
ド緩衝液計調製する。
〔第１試液〕 リポプロティンリパーゼ１７０　ｕｎｉｔ、アスコルビ
ン酸オキシダーゼ４２５　ｕｎｉｔ　、ペルオキシダー
ゼ２５５ｕｎｉｔ及び安定化剤を前記緩衝液８５ｍｔで
溶解し、第１試液とする。
〔第２試液〕 １８− １Ｏ−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−シメチルアミ
ノー１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ　）　７．３μ
ｍｏｌｅ及び安定化剤を前記緩衝液８５ｍｔで溶解し、
第２試液とする。
用時、第１試液と第２試液を等容量混合して、発色試液
とする。
ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム８．９ｍＭの水
溶液を調製し、反応停止液とする。
発色試液３．０　ｍｌをとり、３７℃恒温槽中で約５分
間予備加温後、これに血清５０μｔを加え、３７℃で３
０分間加温する。反応停止液５０μｔを加えて混和した
後、水を対照として波長６６０　ｒ＋ｍに於ける吸光度
（Ｅｓ　）を測定する。
血清の代りに、夫々モノアミンオキシダーゼ標準液（実
施例３．で用いたもの）５０μｔ、精製水５０μｔを用
いて、上記操作と同様に操１作して得た吸光度をＥｓｔ
ｄ、　Ｅｎとし、次式よりモノアミンオキシダーゼ活性
値を算出する。
１９− ×標準酵素単位 第１表に、実施例３．と参考例１に於ける発色試液保存
（１５℃で保存）による試薬ブランクの変化を示す。
第１表 第１表に示す、とおり、参考例１の場合、発色試液の保
存中に、試薬の着色が増し、試薬ブランクが経時的に上
昇するため、発色試液は用時調製の必要があるが、本発
明に於ける発色試液は、２４時間後も何ら変化がみられ
ない。
第２表に、実施例３及び参考例１による測定結果の比較
を示す。
第２表 第２表に示されるように、実施例３の値と、参考例１．
の値とはよい相関を示し、その間に有意差は認められな
い。（γ＝ｏ、Ｈ７） 実施例４　血清中の遊離コレステロールの定量０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐ）Ｔ＝７．０）に、ＢＳｄｉｐｒ。
ＰＭ　０．０５　ｍＭ　、ウリカーゼ３００Ｕ／７．：
Ｉレスチロールオキシダーゼ１００　Ｕ／ｌ　、ペルオ
キシダーゼ３０００　Ｕ／ｌ　、　）　リ　ト　ン　Ｘ
−１０００，１５％、　エ　マ　−　ルＮＣ０，０５％
の濃度になるように溶解し、発色試液と一２１＝ する。
血清１０μｔをとり、発色試液３ｍｔを加え、３７℃の
恒温槽中、１０分間加温後、試薬ブランクを対照として
波長６２０　ｎｍに於ける吸光度を測定する。
別に、コレステロールを各々２５，５０，１００゜１５
０．２００■／ｄｔの濃度になるように調製したコレス
テロール標準液を用いて、血清と同様に操作して吸光度
を測定し、検量線を作成する。第２図に検量線を示す。
検量線から血清中のコレステロール濃度をめる。
参考例２　血清中の遊離コレステロールの定量０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）に、４−アミノアンチ
ピリン００１％、フェノール０．１％、コレステロール
オキシダーゼ１００　Ｕ／ｌ　、ペルオキシダーゼ３０
００　Ｕ／４　）リ　トンＸ−１０００，１％の濃度に
なるように溶解し、発色試液とする。
血清５０μｔをとり、発色試液３　ｍｌを加え、３７℃
恒温槽中、１０分間加湿後、試薬ブランクを対照２２− として波長５０５　ｎｍに於ける吸光度を測定する。
別にコレステロール標準液（実施例４で用いたもの）を
用いて、上記操作と同じ操作で呈色させ吸光度を測定し
て作成した検量線から、血清中のコレステロール濃度を
める。第２図に検量線を示す。
第３表に、実姉例４及び参考例２による測定結果の比較
を示す。
第３表 ＊１：　「ウリカーゼ無し」は、実姉例４の発色試液組
成のうち、ウリカーゼを削除した発色試液を調製し、実
施例４に従い測定を行なったものである。
＊２：「尿酸値」は、Ｕｒｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｂ−Ｔｅｓ
ｔ　ｗａｋｏ　（和光純薬工業（株）製）を用いて測定
した尿酸濃度を示す。
実施例４と参考例２の測定値間の有意差の有無を、を検
定を用いて調べたところ、有意水準５％で、両側定値間
に差は認められなかった。「ウリカーゼ無し」の場合は
、血清中の尿酸量により測定値は大幅な低値を示し、尿
酸による負の影響が明らかである。
実施例５．　過酸化水素の定量 ００５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝　７．０　）に、ＢＳｄ
ｉｐｒ。
ＰＭ　０．０５　ｍＭ　、ペルオキシダーゼ３０００　
Ｕ／ｌ　、）リドンｘ−ｔｏｏ　０．０５％の濃度にな
るように溶解し、発色試液とする。
Ｈ２Ｏ２１〜６０ｐｐｍを含む試料２０１１ｔをとり、
発色試液３ｍＡを加え、３７℃恒温槽中、１０分間加温
後、試薬ブランクを対照として波長６２０ｎｍＫ於ける
吸光度を測定する。
別に、過酸化水素を各々１５，３０，４５，６０ｐｐｍ
の濃度になるように調製した過酸化水素標準液を用いて
、試料と同様に操作して吸光度を測定し、検量線を作成
する。第３図に検量線を示す。
検量線から、試料中の過酸化水素濃度をめる。
実姉例６　過酸化水素の定量 ００５Ｍリン酸緩衝液（ｐ）（＝７．Ｑ）に、ＢＳ　ｐ
ｒｏＰＭｏ、　０５　ｍＭ　、　ペルオキシダーゼ３０
００Ｕ／ｌ、）リドンＸ−１０００，０５％の濃度にな
るように溶解し、発色試液とする。
実施例５と同様にして、試料の吸光度を測定し、別に過
酸化水素標準液（実施例５に用いたもの）を用いて作成
した検量線から、試料中の過酸化水素濃度をめる。
第４図に検量線を示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例３に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各モノアミンオキシダーゼ活性（ＩＵ２５− ／１）について得られた吸光度（ＯＤ）を、ｌｌ軸に沿
ってプロットした点を結んだものである。 第２図は、実姉例４及び参考例２に於て得られた検量線
（ト→は実施例４の検量線を、Ｘ−Ｘは参考例２の検量
線を示す。）を表わし、横軸の各コレステロール濃度（
ｍｙ／ｄｉ　）について得られた吸光度（ＯＤ）を、縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第３図は、実施例５に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各過酸化水素濃度（ｐｐｍ　）について得られた吸
光度（ＯＤ　）を、縦軸に沿ってプロットした点を結ん
だものである。 第４図は、実姉例６に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各過酸化水素濃度（ｐｐｍ　）について得られた吸
光度（ＯＤ）を、縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 ２６一 手続補正書 昭和Ｃ７年Ｓ月　ｅ日 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 連絡先　特許ｉｌ！（東京）　置　０３−２７０−８５
７１４、補正命令の日付 ５、　補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、及び発明の詳細な説明の
欄。 ６、補正の内容 （］）　特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （２）　明細書２頁９行目から１３行目にかけて、及び
６頁１８行目以降に記載の を、 と補正する。 以　上 ２− 別　紙 ２、特許請求の範囲 （１）式 〔式中、Ｒ，、Ｒ２，Ｒ，、Ｒ４は低級アルキル基を表
わし、夫々同じであっても異っていても良く、Ｘｌ。 Ｘ２はどちらも一〇　（ＣＨ２）　ｎ　Ｓｏ　３Ｍ　（
但し、Ｍは水素又はアルカリ金属イオン又はＮＨ：を示
し、ｎは２〜４の整数を示す。）を示すか、又はどちら
か一方が一〇（ＣＨ２）ｎ８０３Ｍ　（但し、Ｍ　、　
ｎは前記と同じ）を示し、他方が水素を示す。］で表わ
されるトリフェニルメタン誘導体。 （２）測定する目的成分に特異的に作用する酵素を作用
させて目的成分に対応する量の酸化性物質を生成せしめ
、これにペルオキシダーゼと発色成分を加えて反応させ
、その酸化呈色を比色定量することにより目的成分の含
有量をめる生体中の微量成分の定量方法に於て、発色成
分として特許請求の範囲第１項記載のトリフェニルメタ
ン誘導体を用いることを特徴とする生体中の微量成分の
定量方法。 以　上 手続補正書 特許庁長官　殿 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
５、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄及び発明の詳細な説明の欄
。 ６、補正の内容 （１）特許請求の範囲の欄を別紙の通り補正する。 （２）明細書３頁２行目から３行目にかけて記載の「生
体中の微量成分の定量方法に関する。」ヲ「過酸化水素
の定量法に関する。」と補正する。 （３）明細書７頁９行目から１０行目にかけて記載の［
生体中の微量成分の定量方法の発明である。」を「過酸
化水素の定量法の発明である。」と補正する。 以上 ＝２− 別　紙 ２、特許請求の範囲 （１）式 〔式中、Ｒ１、Ｌ　、　Ｒ３、Ｒ，は低級アルキル基を
表わし、夫々同じであっても異っていても良＜　、Ｘ、
　。 Ｘ２はどちらも一〇　（ＣＨ，）ｎｓｏ、Ｍ　（但し、
Ｍは水素又はアルカリ金属イオン又はＮＨ，を示し、ｎ
は２〜４の整数を示す。）を示すが、又はどちらか一方
が一〇　（ＣＨ２）ｎｓＯ，Ｍ　（但し、Ｍ、ｎは前記
と同じ）を示し、他方が水素を示す。〕で表わされるト
リフェニルメタン誘導体。 （２）式 〔式中、Ｒ＋　、　Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４は低級アルキル基
を表又はアルカリ金属イオン又はＮＨ？を示し、ｎは２
じ）を示し、他方が水素を示す。〕で表わされるる過酸
化水素の定量法。 （４）過酸化水素が、酵素反応により生成する過酸化水
素である特許請求の範囲第２項又は第３項に記載の過酸
化水素の定量法。 法。 （６）生体試料中の微量成分の定量が、基質、又は酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用さ−５− 手続補正書 特許庁長官　殿 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
５　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６　補正の内容 （１）明細書１１頁１行目に記載の「ジエチルアミン」
をｒ　Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン」と補正する。 以上 手続補正書 ｌ　事件の表示 開弁ぢ９非脣諺瀬第住ｏｏ３１考 ２　発明の名称 新坂ｑ跪灸試黍 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許課（東京）　置　０３−２７０−８５７１
臼　粕 ５　補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄。 ６　補正の内容 （１）明細書１７頁１５行目に記載の１５係」の次ニ１
、ペルオキシダーゼ３０００ＸＪ／ｌ」をカロ人−Ｊ−
ル。 以上 ２− ５６７一

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）式 〔式中、Ｒ５，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４は低級アルキル基を表
    わし、夫々同じであっても異っていても良く、Ｘ、。 Ｘ２はどちらも一〇　（ＣＨ２）　ｎ　ＳＯａＭ　（但
    し、Ｍは水素子 又はアルカリ金属イオン又はＮＨ４を示し、ｎは２〜４
    の整数を示す。）を示すか、又はどちらか一方が一〇（
    ＣＨ２）ｎ８０３Ｍ（但し、Ｍ　、　ｎは前記と同じ）
    を示し、他方が水素を示す。〕で表わされるトリフェニ
    ルメタン誘導体。
  2. （２）測定する目的成分に特異的に作用する酵素を作用
    させて目的成分に対応する量の酸化性物質全生成せしめ
    、これにペルオキシダーゼと発色成分を加えて反応させ
    、その酸化呈色を比色定量することにより目的成分の含
    有量をめる生体中の微量成分の定量方法に於て、発色成
    分として特許請求の範囲第１項記載のトリフェニルメタ
    ン誘導体を用いることを特徴とする生体中の微量成分の
    定量方法。
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