JPH0878B2

JPH0878B2 - 体液成分の測定方法

Info

Publication number: JPH0878B2
Application number: JP1147000A
Authority: JP
Inventors: 由嗣佐方; 寿郎花田; 亮介松田; 好之松田
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1989-06-09
Filing date: 1989-06-09
Publication date: 1996-01-10
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: ES2090100T3; DE69028247T2; DE69028247D1; EP0402094B1; EP0402094A3; CA2018166A1; ATE141955T1; EP0402094A2; US5384248A; CA2018166C; JPH0310696A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、被酸化性呈色試薬を用いた酵素法による体
液成分の測定法に関する。更に詳しくは、体液中に共存
するビリルビン、ヘモグロビン等の妨害物質の影響を回
避した酵素法（被酸化性呈色試薬を用いた）による基質
又は酵素活性の測定法に関する。

［発明の背景］生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定する
ことは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾
患の診断、病体の解明、治療経過の判定を行う上で、必
須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロー
ル、尿酸、グルコース、トリグリセリド、リン脂質、コ
リン、クレアチン、クレアチニン、胆汁酸、モノアミン
オキシダーゼなどを始め非常に多種類の体液成分の測定
法が開発されており、疾病の診断上役立っていることは
周知のとおりである。

現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外の
ものである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素
を用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質と
なるべき化合物を用いて夫々酵素反応を行い、これによ
る生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素
法”が広く普及している。なかでも、過酸化水素生成酵
素、例えば、酸化酵素（オキシダーゼ）を作用させて目
的成分或は目的成分から導かれた物質に相当する過酸化
水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及び発色成
分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その
呈色を比色定量することにより目的成分量を求める方法
が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加しつつあ
る。例えば、コレステロール−コレステロールオキシダ
ーゼ、トリグリセリド−リポプロテインリパーゼ−グリ
セロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなどの組み合
わせで発生する過酸化水素を、ペルオキシダーゼ、被酸
化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色の吸光度
を測定することにより目的成分量を求める方法である。

しかしながら、これら被酸化性呈色試薬を用いた酵素
法による体液成分の測定法は、試料中に共存する生体内
還元物質、例えばアスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグ
ロビン等の還元作用による影響を受けやすく、測定値に
負の誤差を生じることがしばしばあった。また、ヘモグ
ロビン、ビリルビン等の色素は、測定波長によっては誤
差の原因になるし、更には、これら色素自身の吸収が光
及び測定試薬中の成分等により測定中に経時的に変化
し、測定結果に影響を与えることも一般によく知られて
いる通りである。そこで、これら妨害物質を除くため種
々の方法がこれまでに提案され、検討されている。

これら妨害物質のうち、アスコルビン酸に関しては、
その分解方法として、アスコルビン酸酸化酵素を用いる
方法（特公昭56−39198号公報）、ヨウ素酸若しくはそ
の塩又は過ヨウ素酸若しくはその塩を用いる方法（特開
昭56−109595号公報，特開昭56−151358号公報，特開昭
56−107161号公報）、及び銅イオンを用いる方法（特開
昭60−262599号公報）などが開示されており、反応が温
和な条件で行えるアスコルビン酸酸化酵素による方法が
最も広く普及している。この方法は、アスコルビン酸酸
化酵素が酵素であるが故の固有の問題点、即ち熱安定性
及び貯蔵安定性の問題はあるものの、実用上、殆ど影響
のない測定系が組み立てられており、更なる改良に対す
る希求は比較的少ない。

一方、ビリルビンの影響回避方法としては、銅イオン
を用いる方法（特開昭60−262599号公報），フェロシア
ン化合物を用いる方法（Clin.Chem.,26（２）,227（198
0））及びビリルビンオキシダーゼを用いる方法等が開
示されているが、測定試薬の保存安定性、測定系の使用
酵素等への阻害などの問題点があり、未だ満足すべき方
法は確立されていない。また、ヘモグロビンの影響回避
方法としては、チオ尿素を用いる方法（特開昭62−2485
00号公報）等が開示されているが、チオ尿素は強い還元
剤であり、酸化還元反応を利用する測定系への適用には
あまりにも問題が多い。

［発明の目的］本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、
被酸化性呈色試薬を用いた酵素法による体液成分の測定
におけるビリルビン、ヘモグロビンの影響回避方法と、
これら妨害物質の影響を回避した体液成分の測定方法を
提供することを目的とする。

［発明の構成］本発明は、測定対象物質に、対応する酸化酵素を作用
させ、或は酵素反応により生成した物質に対応する酸化
酵素を作用させ、生成する過酸化水素を被酸化性呈色試
薬を用いて光学的に測定することにより体液中の基質又
は酵素活性を測定する方法（但し、リポ蛋白質のHDL−
フラクションの存在下にLDL−フラクションのコレステ
ロールを動力学的に特異的に測定する方法を除く。）に
おいて、体液中に共存するヘモグロビン又は／及びビリ
ルビンの影響を回避する目的で、測定系にカチオン性界
面活性剤又は／及び両性界面活性剤を共存させることを
特徴とする体液中の基質又は酵素活性の測定方法であ
る。

即ち、本発明者らは、被酸化性呈色試薬を用いた酵素
法による体液成分の測定法において、体液中に存在する
ビリルビン及びヘモグロビンの影響を回避すべく鋭意研
究を行った結果、測定系にカチオン性界面活性剤又は／
及び両性界面活性剤を存在させることにより、その目的
を達成しうることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。ここで、被酸化性呈色試薬を用いた酵素法による体
液成分の測定法とは、酸化酵素を作用させて目的成分或
は目的成分から導かれた物質に相当する過酸化水素を生
成させ、これをペルオキシダーゼ、及び被酸化性呈色試
薬を用いて発色系に導き、その呈色を比色定量すること
により目的とする体液成分量を求める方法のことであ
る。

本発明で用いられるカチオン性界面活性剤又は両性界
面活性剤は本発明の目的を達成しうるものであれば何れ
にてもよいが、例えばカチオン性界面活性剤としては、
下記一般式［Ｉ］から一般式［VII］で表わされる化合
物が代表的なものとして挙げられる。

［式中、R¹,R²は夫々独立して水素原子、炭素数１〜22
の直鎖状若しくは分枝状の、飽和又は不飽和のアルキル
基、フェニル基、置換フェニル基（置換基は、炭素数１
〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭素数１〜
５のアルコキシ基又はハロゲン原子）、アラルキル基
（例えばベンジル基、フェネチル基等）、置換アラルキ
ル基（置換基は、炭素数１〜12の直鎖状若しくは分枝状
のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基又はハロゲ
ン原子）、又は炭素数５又は６のシクロアルキル基を表
わし、アルキル基以下の官能基はその水素原子の一つが
水酸基又はアミノ基で置換されていてもよい。R³,R⁴は
夫々独立して水素原子、炭素数１〜４の直鎖状若しくは
分枝状のアルキル基，フェニル基又はトリル基を表わ
し、アルキル基以下の官能基はその水素原子の一つが水
酸基又はアミノ基で置換されていてもよい。X¹は酸素原
子、イオウ原子、−Ｎ（CH₃）−、−CO−、−CONH−、
−NHCO−、−COO−、−OCO−、−SO₂NH−、−NHSO₂−、
−SO₃−、−OSO₂−又は−OSO₃−を表わし、Ｙは一価の
アニオン（例えば塩素，臭素，ヨウ素等のハロゲン原子
のアニオン、酢酸，乳酸，硫酸，モノメチル硫酸等の共
役塩基）を表わす。また、ｊは１から３の整数を表わ
し、ｋは０から25の整数を表わす。但し、R¹,R²,R³,R⁴
が共に水素原子であり、かつ、ｋが０である場合、及び
X¹が，−CO−，−CONH−，−COO−，−SO₂NH−，−SO₃
−又は−OSO₂−であってR¹が水素原子である場合を除
く。］（式中、X²は酸素原子、イオウ原子、−Ｎ（CH₃）−、
−CO−、−CONH−、−NHCO−、−COO−、−OCO−、−SO
₂NH−、NHSO₂−、−SO₃−、−OSO₂−又は−OSO₃−を表
わし、ｍは１から３の整数を表わし、R¹,R²,R³,R⁴,X¹,Y
及びｊは前記と同じ。但し、X¹が，−CO−，−CONH−，
−COO−，−SO₂NH−，−SO₃−又は−OSO₂−であってR¹
が水素原子である場合を除く。）（式中、当該窒素原子を含んで成る５又は６員の飽和複素環又は
その縮合環を表わし、R⁵は水素原子、炭素数１〜４の直
鎖状若しくは分枝状のアルキル基，フェニル基又はトリ
ル基を表わし、アルキル基以下の官能基はその水素原子
の一つが水酸基又はアミノ基で置換されていてもよく、
R¹,R²,R³,R⁴及びＹは前記と同じ。）（式中、当該窒素原子を含んで成る５又は６員の不飽和複素環又
はその縮合環を表わし、R¹,R²,R³,R⁴,X¹,Y,j及びｋは前
記と同じ。）（式中、R¹,R²,R³,R⁴及びＹは前記と同じ。但し、R¹,
R²,R³及びR⁴の１又は２以上が水素原子である場合を除
く。）（式中、当該リン原子を含んで成る５又は６員の飽和複素環を表
わし、R¹,R²,R³及びＹは前記と同じ。但し、R¹及びR²の
１又は２が水素原子である場合を除く。）（式中、R¹,R²,R³及びＹは前記と同じ。但し、R¹,R²,R³
の１又は２以上が水素原子である場合を除く。）また、両性界面活性剤としては下記一般式［VIII］か
ら［XII］で表わされる化合物がその代表的なものとし
て挙げられる。

（式中、R¹,R²,R³は前記と同じ。但し、R¹,R²,R³の１又
は２以上が水素原子である場合を除く。）［式中、R⁶は水素原子、炭素数１〜22の直鎖状若しくは
分枝状の、飽和又は不飽和のアルキル基、フェニル基、
置換フェニル基（置換基は、炭素数１〜12の直鎖状若し
くは分枝状のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基
又はハロゲン原子）、アラルキル基（例えばベンジル
基，フェネチル基等）、置換アラルキル基（置換基は、
炭素数１〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、炭
素数１〜５のアルコキシ基又はハロゲン原子）、又は炭
素数５又は６のシクロアルキル基を表わし、アルキル基
以下の官能基はその水素原子の一つが水酸基又はアミノ
基で置換されていてもよい。n,pは夫々独立して０から
３の整数を表わし、R¹,R²,R³,X²及びｊは前記と同
じ。）（式中、R¹,R²,R³,R⁶,X¹,X²,j,m及びｎは前記と同
じ。）（式中、当該窒素原子を含んで成る５又は６員の飽和複素環又は
その縮合環を表わし、R¹,R²,R³,R⁴,R⁶,X¹,j及びｎは前
記と同じ。）（式中、X³は低級アルキレン基又はフェニレン基を表わ
し、R¹,R²,R³,X²,j及びｎは前記と同じ。）一般式［Ｉ］で表わされる化合物の具体例としては、
例えばラウリルアミン，ステアリルアミン，ラウリルス
テアリルアミン，［２−（パルミチルカルボニルオキ
シ）エチル］ジメチルアミン，（ポリオキシエチレン）
ラウリルアミン，ラウリルメチルアニリン等の一級〜三
級アミンの塩酸塩，酢酸塩，乳酸塩等、臭化セチルトリ
メチルアンモニウム，臭化ミリスチルトリメチルアンモ
ニウム，塩化ベンジルデシルジメチルアンモニウム，塩
化（４−ラウリル−２−メチルベンジル）トリメチルア
ンモニウム，臭化ラウリルジメチル［２−（４−ｔ−オ
クチルフェニル）エチル］アンモニウム，塩化（ラウリ
ルチオメチル）トリメチルアンモニウム，塩化ベンジル
ジエチル−［２−（パルミチルカルボニルアミノ）エチ
ル］アンモニウム，塩化ベンジルジメチル−［３−（イ
ソプロピルスルホニルアミノ）プロピル］アンモニウ
ム，臭化２−（デシルメチルアミノ）エチルトリメチル
アンモニウム，塩化ベンジルジメチル［（４−ｔ−オク
チルフェニル）ポリオキシエチレン］アンモニウム等の
四級アンモニウム塩が挙げられる。一般式［II］で表わ
される化合物の具体例としては、例えば塩酸ビス（ヒド
ロキシエチル）−（ステアロイルアミノメチルカルボニ
ルオキシ）エチルアミン，塩化（ラウロイルオキシエチ
ルアミノカルボニル）メチルトリメチルアンモニウム，
沃化［２−（４−ｔ−オクチルフェノキシ）エトキシ］
メチルトリメチルアンモニウム等が挙げらる。一般式
［III］で表わされる化合物の具体例としては、例えば
塩酸２−［（４−ｔ−オクチルフェノキシ）エトキシ］
エチルモルホリン，塩化ベンジル−２−［（４−ｔ−オ
クチルフェノキシ）エトキシ］エチルピペラジニウム，
塩酸２−ヘプタデシル−４−イソプロピル−4,5−ジヒ
ドロイミダゾール，塩化１−ベンジル−１−ヒドロキシ
エチル−２−トリデシル−4,5−ジヒドロイミダゾリウ
ム等が挙げられる。一般式［IV］で表わされる化合物の
具体例としては、例えば塩化ラウリルピリジニウム，塩
化ラウリルイソキノリニウム，塩化パルミチルオキシメ
チルピリジニウム，塩化2,3−ジフェニル−５−ウンデ
シルテトラゾリウム等が挙げられる。一般式［Ｖ］で表
わされる化合物の具体例としては、例えば臭化ラウリル
トリメチルホスホニウム，塩化ラウリル（トリ−ｐ−ト
リル）ホスホニウム等が挙げられる。一般式［VI］で表
わされる化合物の具体例としては、例えば臭化ラウリル
フェニルシクロテトラメチレンホスホニウム等が挙げら
れる。一般式［VII］で表わされる化合物の具体例とし
ては、例えばメチル硫酸ベンジルラウリルメチルスルホ
ニウム，メチル硫酸エチルパルミチルメチルスルホニウ
ム等が挙げられる。一般式［VIII］で表わされる化合物
の具体例としては、例えばラウリルジメチルアミンオキ
シド等が挙げられる。一般式［IX］で表わされる化合物
の具体例としては、例えばN,N−ビス（オクチルアミノ
エチル）グリシン,N−ラウリルアラニン，ラウリル−N,
N,N−トリメチル−α−ベタイン,N−ステアリルオキシ
メチル−N,N−ジメチルベタイン,N−ラウリルチオメチ
ル−N,N−ジメチルベタイン等が挙げられる。一般式
［Ｘ］で表わされる化合物の具体例としては、例えばＮ
−（ラウリルチオエトキシ）メチル−N,N−ジメチルベ
タイン等が挙げられる。一般式［XI］で表わされる化合
物の具体例としては、例えばＮ−カルボキシメチル−Ｎ
−（ステアリルオキシメチル）ピペリジニウムベタイ
ン,2−ラウリル−１−カルボキシメチル−１−（２−ヒ
ドロキエチル）イミダゾリウムベタイン等が挙げられ
る。一般式［XII］で表わされる化合物の具体例として
は、例えばＮ−パルミチルスルホタウリン,4−（パルミ
チルアミノメチル）ベンゼンスルホン酸等が挙げられ
る。しかしながら、これらの具体例は単はる例示であっ
て本発明に係るカチオン性及び両性界面活性剤はこれら
に限定されるものでないことは言うまでもない。これら
カチオン性又は／及び両性界面活性剤は通常、試料中0.
001〜10％の濃度で、好ましくは0.01〜３％の濃度で用
いられ、夫々単独で用いても、二種以上を組み合わせて
用いても任意である。

また、従来、妨害物質の影響を回避するために使用さ
れてきた物質、例えば、ビリルビンの影響を回避するた
めの銅イオン，フェロシアン化合物等を併用しても差し
支えない。

本発明の方法により測定可能な体液成分としては、例
えばコレステロール（但し、LDL−フラクション中のコ
レステロールのみを測定対象とする場合を除く。）、尿
酸、グルコース、トリグリセリド、リン脂質、コリン、
クレアチン、クレアチニン、胆汁酸、乳酸、遊離脂肪酸
又はピルビン酸等の基質や、例えばモノアミンオキシダ
ーゼ、グアナーゼ、コリンエステラーゼ等の酵素等が挙
げられるが、特にこれらに限定されるものではなく、酵
素反応により生成する過酸化水素を定量することによっ
て測定が可能な体液成分は全て測定可能である。

本発明の測定法は、体液中に共存する測定妨害物質の
影響を回避する目的で測定系にカチオン性界面活性剤又
は／及び両性界面活性剤を存在させる（通常は測定試液
中に添加する）以外は被酸化性呈色試薬を用いる自体公
知の酵素法（酵素反応により生成する過酸化水素を被酸
化性呈色試薬を用いて光学的に測定することにより目的
とする体液成分量を求める）による体液成分の測定法に
準じてこれを行えば足りる。

本発明の方法による体液成分の定量において、過酸化
水素を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキ
シダーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに
酵素反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使
用量は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の体液成分の
測定法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選
択すればよい。

本発明の測定法に於いて使用される被酸化性呈色試薬
としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば
何れにてもよいが、例えば４−アミノアンチピリンとフ
ェノール系，ナフトール系若しくはアニリン系化合物の
組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒド
ラゾンとアニリン系化合物の組み合わせ、2,2′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン
酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニルア
ミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾー
ル誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体又はｏ−フェニ
レンジアミン誘導体等を挙げることができる。４−アミ
ノアンチピリンと組み合わされるフェノール系化合物の
具体例としては、例えばフェノール,p−クロロフェノー
ル又は2,4−ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフト
ール系化合物の具体例としては、例えば１−ナフトー
ル,1−ナフトール−２−スルホン酸又は１−ナフトール
−２−カルボン酸等が挙げられ、また、４−アミノアン
チピリン又は３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒド
ラゾンと組み合わされるアニリン系化合物の具体例とし
ては、例えばアニリン,N,N−ジエチルアニリン,N−エチ
ル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン,N
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−3,5−ジメトキシアニリン又はＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン等が挙げられる。また、トリフェニルメタン系ロイ
コ色素の具体例としては、例えばロイコマラカイトグリ
ーン，ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２−スル
ホフェニルメタン又はビス（ｐ−ジエチルアミノフェニ
ル）−3,4−ジスルホプロポキシフェニルメタン・ジナ
トリウム塩等が挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具
体例としては、例えばビス［４−ジ（２−ブトキシエチ
ル）アミノ−２−メチルフェニル］アミン又はN,N−ビ
ス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ′
−ｐ−トルエンスルホニル尿素等が挙げられ、また、ロ
イコメチレンブルー誘導体の具体例としては、例えば10
−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−3,7−ビス
（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩又は
10−［３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニ
ルメチルアミノカルボニル］−3,7−ビス（ジメチルア
ミノ）フェノチアジン等が挙げられる。更に、ベンジジ
ン誘導体の具体例としては、例えばベンジジン,o−トリ
ジン,o−ジアニシジン,3,3′−ジアミノベンジジン又は
3,3′,5,5′−テトラアミノベンジジン等が挙げられ、
トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、例え
ば２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカ
ルバモイル−4,5−ビス（４−ジエチルアミノフェニ
ル）イミダゾール又は２−（３−メトキシ−４−ジエチ
ルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−4,
5−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）
イミダゾール等が挙げられる。

また、本発明において用いられるペルオキシダーゼと
しては、その起源、由来に特に限定はなく、植物、動
物、、微生物起源のペルオキシダーゼ又はペルオキシダ
ーゼ様物質が、一種若しくは二種以上組み合わせて用い
られる。被酸化性呈色試薬及びペルオキシダーゼの使用
量は目的に応じて適宜定められ、特に限定されない。

本発明による体液成分の定量は、通常、pH4.0〜10.
0、より好ましくはpH6.0〜8.0で実施される。用いられ
る緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、
炭酸塩、トリス緩衝剤、グッド（Good′ｓ）緩衝剤等が
挙げられるが、特にこれらに限定されない。なお、カチ
オン性界面活性剤又は／及び両性界面活性剤と検体成分
とにより濁り等が生じた場合には、非イオン性界面活性
剤（例えばトリトンＸ−100（ローム＆ハース社商品
名）等）や糖類等を添加して、これを防止しても差し支
えない。

以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例によ
り何ら制約を受けるものではない。

［実施例］実施例1.総コレステロールの定量（測定試液１）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−3,5−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩を200
mg/l、コレステロールエステラーゼを2700U/l、ポリオ
キシエチレンノニルフェノールエーテルを1.2g/lの濃度
になるように、50mM MES（２−（Ｎ−モルホリノ）エタ
ンスルホン酸）−水酸化ナトリウム緩衝液に溶解し、こ
れにカチオン性界面活性剤である臭化セチルトリメチル
アンモニウム（以下「CTMA」と略記する。）を夫々0.01
％,0.025％,0.05％となるように添加した。

（測定試液２）４−アミノアンチピリンを820g/l、ペルオキシダーゼ
を6000U/l、コレステロールオキシダーゼを2000U/l及び
ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテルを1.2g/l
の濃度になるように、50mM MES（２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸）−水酸化ナトリウム緩衝液に溶
解した。

（試料液）プール血清にジタウロビリルビンを0,10,20,30,40mg/dl
になるように添加したものを試料液とした。

（測定方法）試料液３μｌに測定試液1300μｌを加え、37℃で５分間
加温後、更に測定試液2100μｌを加えて同温度で５分間
加温した後、600nmの吸光度から700nmの吸光度を差し引
いた吸光度差Esを求めた。一方、精製水及びコレステロ
ール標準液（コレステロール200mg/dl含有）を用いて同
様の操作を行い、盲検値E_BL及び標準液吸光度E_STDを測
定した。

次式に従いプール血清中の総コレステロール濃度を算
出した。

総コレステロール濃度（mg/dl）＝｛（E_S−E_BL）÷（E_STD−E_BL）｝×200 比較例1. 実施例１において、測定試液１からCTMAを除いた以外
は実施例１と全く同様の測定試液を用い、実施例１と同
じ試料液について実施例１と全く同様の測定方法により
測定を行い、実施例１と全く同様にしてプール血清中の
総コレステロール濃度を算出した。

実施例１及び比較例１の測定結果を表１に示す。

表１から明らかな如く、本発明に係るカチオン性界面
活性剤CTMA存在下に測定を行った実施例１の値はCTMA不
存在下の比較例１のそれに比べてジタウロビリルビンの
影響が明らかに低減されており、CTMAの濃度が高くなる
につれてその効果もより顕著になっていることが判る。

実施例2.総コレステロールの定量実施例１において、測定試液１からCTMAを除き、代わ
りに測定試液２にCTMAを0.03％,0.075％,0.15％,0.20％
又は0.30％となるように添加し、それ以外は実施例１と
全く同様にして測定を行い、プール血清中の総コレステ
ロール濃度を算出した。

実施例２の測定結果を比較例１の測定結果と共に表２
に示す。

表２から明らかな如く、実施例２で得られた値はいず
れも比較例１に比べてジタウロビリルビンの影響が明ら
かに低減されており、実施例１と同様に、CTMAの濃度が
高くなるにつれてその効果が顕著になっていることが判
る。このことから測定試液１又は測定試液２のいずれに
CTMAを添加して使用しても有効であることが判る。

実施例3.総コレステロールの定量実施例２において、CTMAの代わりに両性界面活性剤で
あるアンヒトール20N（花王（株）商品名，主成分；ラ
ウリルジメチルアミンオキシド）を測定試液２に0.3％,
0.6％,1.0％,3.0％,5.0％となるように添加し、それ以
外は実施例２と全く同様にして測定を行い、プール血清
中の総コレステロール濃度を算出した。

比較例2. 実施例３において、測定試液２からアンヒトール20N
を除いた以外は実施例３と全く同様にして測定を行い、
プール血清中のコテステロール濃度を算出した。

実施例３及び比較例２の測定結果を表３に示す。

表３から明らかな如く、実施例３で得られた値はいず
れも比較例２に比べ、ジタウロビリルビンの影響が明ら
かに低減されており、その効果はアンヒトール20Nの濃
度が高くなるにつれて顕著になっていることが判る。

実施例4.総コレステロールの定量（測定試液１）実施例１と同じ。

（測定試液２）実施例１と同じ。

（試料液）ビリルビン（和光純薬工業（株）製）を0.1N水酸化ナ
トリウムで溶解した後、0.1N塩酸を加えてpHを8.0に調
整した溶液をプール血清にビリルビンが0,10,20,30,40m
g/dlになるように添加したものを試料液とした。

（測定方法）実施例１と同じ。

比較例3. 実施例４において、測定試液１からCTMAを除いた以外
は実施例４と全く同様にして測定を行い、プール血清中
の総コレステロール濃度を算出した。

実施例４及び比較例３の測定結果を表４に示す。

表４から明らかな如く、実施例４で得られた値はいずれ
も比較例３に比べてビリルビンの影響が低減されてお
り、本発明に係るカチオン性界面活性剤は遊離のビリル
ビンに対しても有効であることが判る。

実施例5.尿酸の定量（測定試液１）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−ｍ−トルイジンを283mg/l、ペルオキシダーゼ
を3000U/l及びトリトンＸ−405を100mg/lの濃度になる
ように、80mMリン酸緩衝液に溶解し、これにカチオン性
界面活性剤である臭化ミリスチルトリメチルアンモニウ
ムとトリトンＸ−100を夫々0.1％となるように添加し
た。

（測定試液２）４−アミノアンチピリンを610mg/l、ウリカーゼを660
U/l、トリトンＸ−405を100mg/lの濃度になるように、8
0mMリン酸緩衝液に溶解した。

（試料液）プール血清にジタウロビリルビンを0,10,20,30,40mg/
dlになるように添加したものを試料液とした。

（測定方法）試料液10μｌに測定試液１ 300μｌを加え、37℃で
５分間加温後、更に測定試液２ 150μｌを加えて同温
度で５分間加温した後、570nmの吸光度から700nmの吸光
度を差し引いた吸光度差E_Sを求めた。

一方、精製水及び尿酸標準液（尿酸10mg/dl含有）を
用いて同様の操作を行い、盲検値E_BL及び標準液吸光度E
_STDを測定した。

次式に従いプール血清中の尿酸濃度を算出した。

尿酸濃度（mg/dl）＝｛（E_S−E_BL）÷（E_STD−E_BL）｝×100 比較例4. 実施例５において、測定試液１から臭化ミルスチルト
リメチルアンモニウム及びトリトンＸ−100を除いた以
外は実施例５と全く同様にして測定を行い、プール血清
中の尿酸濃度を算出した。

実施例５及び比較例４の測定結果を表５に示す。

表５から明らかな如く、実施例５で得られた値はいず
れも比較例５に比べてジタウロビリルビンの影響が明ら
かに低減されており、本発明の測定法は尿酸の定量にお
いても有効であることが判る。

実施例6.尿酸の定量（測定試液１）実施例５と同じ。

（測定試液２）実施例５と同じ。

（試料液）粉末ビリルビン（和光純薬工業（株）製）を0.1N水酸
化ナトリウムで溶解した後、0.1N塩酸を加えてpHを8.0
に調整した溶液をプール血清にビリルビンが0,10,20,3
0,40mg/dlになるように添加したものを測定試液とし
た。

比較例5. 実施例５において、試料液にジタウロビリルビンの代
わりに遊離のビリルビンを添加した以外は比較例４と同
様の操作を行い、プール血清中の尿酸濃度を算出した。

実施例６及び比較例５の測定結果を表６に示す。

表６から明らかな如く、実施例６で得られた値はいず
れも比較例５に比べてビリルビンの影響が低減されてお
り、本発明に係るカチオン性界面活性剤は遊離のビリル
ビンに対しても有効であることが判る。

実施例7.尿酸の定量（測定試液１）実施例５において測定試液１に臭化ミリスチルトリメ
チルアンモニウム及びトリトンＸ−100を夫々0.1％とな
るように添加する代わりにアンヒトール20Nを0.3％とな
るように添加した。

（測定試液２）実施例５と同じ。

（試料液）プール血清に溶血液（自家調製）をヘモグロビン濃度
が0,100,200,300,400,500,1000mg/dlになるように添加
した。

（測定方法）実施例５と同じ。

比較例6. 実施例７において、測定試液１からアンヒトール20N
を除いた以外は実施例７と全く同様にして測定を行い、
プール血清中の尿酸濃度を算出した。

実施例７及び比較例６の測定結果を表７に示す。

表７から明らかな如く、実施例７で得られた値は比較
例６に比べてヘモグロビンの影響が少なく、本発明に係
る両性界面活性剤はヘモグロビンに対しても有効である
ことが判る。

実施例8.遊離コレステロールの定量（測定試液１）実施例２における測定試液１からコレステロールエス
テラーゼを除いたものを測定試液１とした。

（測定試液２）実施例２の測定試液２に於いて、コレステロールオキ
シダーゼ濃度2000U/lを200U/lとし、CTMA濃度を0.03％
としたものを測定試液２とした。

（試料液）以下の４種の試料液を調製した。

（１）プール血清にジタウロビリルビン及びヘモグロビ
ンのいずれをも添加しなかった。

（２）プール血清にジタウロビリルビンを40mg/dlにな
るように添加した。

（３）プール血清にヘモグロビンを500mg/dlになるよう
に添加した。

（４）プール血清にジタウロビリルビン及びヘモグロビ
ンを夫々40mg/dl及び500mg/dlとなるように添加した。

（測定方法）試料液の使用量を３μｌから６μｌに変更し、更にコ
レステロール標準液をコレステロール200mg/dl含有のも
のから100mg/dl含有のものに変更した以外は実施例２と
同様の方法により測定を行い、次式に従いプール血清中
の遊離コレステロール濃度を算出した。

遊離コレステロール濃度（mg/dl）＝｛（E_S−E_BL）÷（E_STD−E_BL）｝×100 比較例7. 実施例８において、測定試薬２からCTMAを除いた以外
は実施例８と全く同様にして測定を行い、プール血清中
の遊離コレステロール濃度を算出した。

実施例８及び比較例７の測定結果を表８に示す。

表８から明らかな如く、本発明に係るカチオン性界面
活性剤CTMAを測定試液に添加して測定した実施例８の値
はCTMA無添加の比較例７の場合の値に比べ、ジタウロビ
リルビン，ヘモグロビンの影響が大きく低減されてお
り、本発明の方法は遊離コレステロールの定量において
も有効であることが判る。

実施例9.総コレステロールの定量実施例１において、測定試液１を下記の如く変更した
以外は実施例１と全く同様にして測定を行い、プール血
清中の総コレステロール濃度を算出した。

（測定試液１）Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−3,5−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩を200
mg/l、コレステロールエステラーゼを2700U/l、ポリオ
キシエチレンノニルフェニルエーテルを1.2g/l、フェロ
シアン化カリウムを1mg/lの濃度になるように、50mM PI
PES（ピペラジン−N,N′−ビス（２−エタンスルホン
酸））−水酸化ナトリウム緩衝液に溶解し、これに両性
界面活性剤であるアンヒトール20Nを夫々0.1％,0.3％,
0.5％となるように添加した。

比較例8. 実施例９において、測定試液１からアンヒトール20N
を除いた以外は実施例９と全く同様にして測定を行い、
プール血清中の総コレステロール濃度を算出した。

比較例9. 実施例９において、測定試液１からフェロシアン化カ
リウム及びアンヒトール20Nを除いた以外は実施例９と
全く同様にして測定を行い、プール血清中の総コレステ
ロール濃度を算出した。

実施例９及び比較例8,9の測定結果を表９に示す。

表９から明らかな如く、実施例９で得られた値は比較
例８に比べ、ジタウロビリルビンの影響が明らかに低減
されており、本発明の方法は、従来のビリルビン影響回
避方法と併用してもその効果を発揮し得ることが判る。

［発明の効果］本発明は、体液成分の測定において体液中に共存する
ビリルビン、ヘモグロビン等の測定妨害物質の影響を回
避し、より正確な測定を可能にした点に顕著な効果を奏
するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｑ 1/62 6807−4Ｂ // Ｃ１２Ｑ 1/28 6807−4Ｂ (72)発明者松田好之兵庫県尼崎市高田町６番１号和光純薬工業株式会社大阪研究本部内 (56)参考文献特開昭53−3890（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−165800（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定対象物質に、対応する酸化酵素を作用
させ、或は酵素反応により生成した物質に対応する酸化
酵素を作用させ、生成する過酸化水素を被酸化性呈色試
薬を用いて光学的に測定することにより体液中の基質又
は酵素活性を測定する方法（但し、リポ蛋白質のHDL−
フラクションの存在下にLDL−フラクションのコレステ
ロールを動力学的に特異的に測定する方法を除く。）に
おいて、体液中に共存するヘモグロビン又は／及びビリ
ルビンの影響を回避する目的で、測定系にカオチン性界
面活性剤又は／及び両性界面活性剤を共存させることを
特徴とする体液中の基質又は酵素活性の測定方法。
【請求項２】測定対象となる基質がコレステロール（但
し、LDL−フラクション中のコレステロールのみを測定
対象とする場合を除く。）、尿酸、グルコース、トリグ
リセリド、リン脂質、コリン、クレアチン、クレアチニ
ン、胆汁酸、乳酸、遊離脂肪酸又はビルピン酸である請
求項１に記載の測定方法。
【請求項３】測定対象となる酵素がモノアミンオキシダ
ーゼ、グアナーゼ又はコリンエステラーゼである請求項
１に記載の測定方法。
【請求項４】使用する被酸化性呈色試薬が４−アミノア
ンチピリンとフェノール系，ナフトール系若しくはアニ
リン系化合物の組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチ
アゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物の組み合わ
せ、2,2′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色
素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリ
アリルイミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導
体又はｏ−フェニレンジアミン誘導体である請求項１〜
３のいずれかに記載の測定方法。