JPS60188076A - 高度好熱菌の形質転換法 - Google Patents
高度好熱菌の形質転換法Info
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- JPS60188076A JPS60188076A JP59044895A JP4489584A JPS60188076A JP S60188076 A JPS60188076 A JP S60188076A JP 59044895 A JP59044895 A JP 59044895A JP 4489584 A JP4489584 A JP 4489584A JP S60188076 A JPS60188076 A JP S60188076A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はサーマス属菌のデオキシリポ核ｍ＜以下ｒＤＮ
ＡＪという。）による形質転換法に関するものである。
ＡＪという。）による形質転換法に関するものである。
サーマス属細菌は生育上ｌｌ１Ｉ！温度が７５℃以上に
存在する高度好熱菌に属し、グラムｌ！ｉ性、中性イ」
近に生育する細菌である。そして高温下に生育するとい
う特性から、その存する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶
媒性等の性質においてとりわけ優れている事が知られて
いる。
存在する高度好熱菌に属し、グラムｌ！ｉ性、中性イ」
近に生育する細菌である。そして高温下に生育するとい
う特性から、その存する酵素、生体成分が耐熱性、耐溶
媒性等の性質においてとりわけ優れている事が知られて
いる。
従って本菌群の生産する耐熱性酵素の直接的な利用は勿
論の事、本菌群の耐熱性生体機能を多角的に利用し、耐
熱性、耐溶媒性、安定性に富んだバイオリアクターの創
製が考えられている。また、本菌群は中性付近で生育す
るという特性を有する好熱性細菌であるので、醗酵生産
にも適した菌群であり、冷却コスト、蒸留コストの節減
、雑菌ｌ′Ｉｊ染の回避等の点で有用である高温醗酵の
宿主株としても期待を集めている。此の様な応用的観点
及び耐ダ九機構の解明という基礎学問的側面からも、本
望１゛Ｃ。
論の事、本菌群の耐熱性生体機能を多角的に利用し、耐
熱性、耐溶媒性、安定性に富んだバイオリアクターの創
製が考えられている。また、本菌群は中性付近で生育す
るという特性を有する好熱性細菌であるので、醗酵生産
にも適した菌群であり、冷却コスト、蒸留コストの節減
、雑菌ｌ′Ｉｊ染の回避等の点で有用である高温醗酵の
宿主株としても期待を集めている。此の様な応用的観点
及び耐ダ九機構の解明という基礎学問的側面からも、本
望１゛Ｃ。
二ノ部ける宿主・ヘククー系の開発が望まれている。
１宿主ヘクター系は、遺伝学的取扱いに適し、形質転換
が可能な宿よと釘主内で自律的に複製し選択マーカーを
有するヘククーとの３．１１合ね−Ｉ！において構成さ
れるものである。
が可能な宿よと釘主内で自律的に複製し選択マーカーを
有するヘククーとの３．１１合ね−Ｉ！において構成さ
れるものである。
しかしながら本菌群における遺伝学的研究は殆ど行われ
ておらず、超伏学的取扱いの基礎となる変異株等もごく
僅がしか得られ一ζいなかった。
ておらず、超伏学的取扱いの基礎となる変異株等もごく
僅がしか得られ一ζいなかった。
また、ヘクターとして利用が考えられるプラスミ１、Ｉ
ＪＮＡについても、サーマス属では数種のプラスミド力
＜ｎ告されているものの、それらはすべて薬剤耐性等の
マーカーを持たないクリプテイックなプラスミドである
ため、それらを菌体内に導入するための形質転換条件の
検討ができないという問題があった。
ＪＮＡについても、サーマス属では数種のプラスミド力
＜ｎ告されているものの、それらはすべて薬剤耐性等の
マーカーを持たないクリプテイックなプラスミドである
ため、それらを菌体内に導入するための形質転換条件の
検討ができないという問題があった。
そこで、本発明者らは→ノーマス属菌がＤＮＡを取り込
む条件を倹、’１−１１’るために、プラスミドを持た
ず、最小合成培地に生育するなどの性質を持ち、遺伝子
操作の宿主候補として適当と考えられるリーマス・４ノ
一モフイラスＨＢ２７株からニトロソグアニジン処理に
より、アミノ酸要求株を数珠分離した。そして野生株染
色体ＤＮＡにより形質転換を試ゐたところ、意外にも他
の菌で行われているＣａＣ１，処理や、プロトプラスト
形成・再生等の面倒な操作なしに、４１に菌に染色体Ｄ
ＮＡを加え、短時間培養するだけで、いずれの要求株に
おいても、染色体と加えられたＤＮＡが組み換えをおこ
したためにアミノ酸を要求しなくなった形質→ｆ：ｐ体
が生菌数カたり１〜ｌＯ％の高い効率で得られることが
認められニア＝： ｊ’、ｒ記の株以外のリーマス属菌
についても、ストレプトマイシン剛性（以後Ｓｍ’と略
す）亥異株の染色体ＤＮＡにより同様に形質転換を試み
ると、効率よ（Ｓｍ’になった形質転換体が得られる事
を明らかにした。
む条件を倹、’１−１１’るために、プラスミドを持た
ず、最小合成培地に生育するなどの性質を持ち、遺伝子
操作の宿主候補として適当と考えられるリーマス・４ノ
一モフイラスＨＢ２７株からニトロソグアニジン処理に
より、アミノ酸要求株を数珠分離した。そして野生株染
色体ＤＮＡにより形質転換を試ゐたところ、意外にも他
の菌で行われているＣａＣ１，処理や、プロトプラスト
形成・再生等の面倒な操作なしに、４１に菌に染色体Ｄ
ＮＡを加え、短時間培養するだけで、いずれの要求株に
おいても、染色体と加えられたＤＮＡが組み換えをおこ
したためにアミノ酸を要求しなくなった形質→ｆ：ｐ体
が生菌数カたり１〜ｌＯ％の高い効率で得られることが
認められニア＝： ｊ’、ｒ記の株以外のリーマス属菌
についても、ストレプトマイシン剛性（以後Ｓｍ’と略
す）亥異株の染色体ＤＮＡにより同様に形質転換を試み
ると、効率よ（Ｓｍ’になった形質転換体が得られる事
を明らかにした。
またプラスミドについてもザーマス・勺−モフィラス１
ｌＢ８株山来のクリプテイックプラスミドｐＴＴ８ （
９゜７ｋｈｐ）のＤＮＡをプラスミドを１．５たないザ
ーマス属菌に加え、１時間培養するとプラスミドを持っ
た株が得られることがコロニーハイブリダイゼーション
法により６育認された。
ｌＢ８株山来のクリプテイックプラスミドｐＴＴ８ （
９゜７ｋｈｐ）のＤＮＡをプラスミドを１．５たないザ
ーマス属菌に加え、１時間培養するとプラスミドを持っ
た株が得られることがコロニーハイブリダイゼーション
法により６育認された。
本発明はこのような知見に基づいて完成されたものであ
る。
る。
すなわち、本発明はザーマス属菌を形質転換させるにあ
たり、核間とデオキシリボ核酸を接触さゼ培養すること
を特徴とするり゛−マス属菌の形質転換法に関するもの
である。
たり、核間とデオキシリボ核酸を接触さゼ培養すること
を特徴とするり゛−マス属菌の形質転換法に関するもの
である。
このように本発明は菌体とＤＮＡを単に接触させるだけ
で形質転換が容易に行われることをはしめて見出したも
ので、簡便かつ効率的な高度好熱菌の形質転換法として
工業的利用価値は大である。
で形質転換が容易に行われることをはしめて見出したも
ので、簡便かつ効率的な高度好熱菌の形質転換法として
工業的利用価値は大である。
以下、本発明をより具体的に詳述する。
本発明に供されうる代表的なザーマス属菌としては、サ
ーマス・サーｍｌライラス、４ノーマス・フラハス、サ
ーマス・カルドフイラス等の菌沫第１仔１示され、これ
らの菌株を常法により培養後、目的のＤＮＡと接触さ川
←とにより行われるか、通常は、菌体培養液にｌ）ＮΔ
を加えること二ノ により行われる。
ーマス・サーｍｌライラス、４ノーマス・フラハス、サ
ーマス・カルドフイラス等の菌沫第１仔１示され、これ
らの菌株を常法により培養後、目的のＤＮＡと接触さ川
←とにより行われるか、通常は、菌体培養液にｌ）ＮΔ
を加えること二ノ により行われる。
形質転換をさ・けるに際して菌の培養は、ザーマス培地
（ディン」 イーストエキストラフｌ−０，２％、ポリ
ペプトン（大五栄ａ）０．４％、ＮａＣ７！０．１％、
ｐＨ７，５）のような一般的なものでよく、Ｉ）ＮΔを
加える前も後も、特別な＆＋ｔｌ成の培地を使用する必
要がない。また、遅滞期、対数増殖１すｊ、静止ｉｌｌ
のいずれの菌にＤＮＡを加えても形質φｊ、挨効率はほ
とんど変わらない。温度は生育の良好な６０〜７５’Ｃ
（□ｌ近かのそ゛ましい。
（ディン」 イーストエキストラフｌ−０，２％、ポリ
ペプトン（大五栄ａ）０．４％、ＮａＣ７！０．１％、
ｐＨ７，５）のような一般的なものでよく、Ｉ）ＮΔを
加える前も後も、特別な＆＋ｔｌ成の培地を使用する必
要がない。また、遅滞期、対数増殖１すｊ、静止ｉｌｌ
のいずれの菌にＤＮＡを加えても形質φｊ、挨効率はほ
とんど変わらない。温度は生育の良好な６０〜７５’Ｃ
（□ｌ近かのそ゛ましい。
１）ＮΔを加えた後の項五時間は数分〜１時間でよく、
それ以上Ｊ１ζＳ貧しても生菌数に対する形質転換体の
割合は高くならない。
それ以上Ｊ１ζＳ貧しても生菌数に対する形質転換体の
割合は高くならない。
種々の微生物種のＤＮＡによる形質転換法において、特
定のｌ）ＮΔたけでな（ＤＮＡ一般が取り込まれること
を鑑み、本号−マス属菌の形質転換法は、栄養要求マー
カーやストレプトマイシンｌ１４性マーカーをもつ染色
体１） Ｎ Ａおよび、プラスミドｐＴＴ８のみに限定
されるものでなく、他のマーカーをもつサーマス属及び
異種の染色体ＤＮＡ、またザーマス属菌の中で自律的複
製できる他のプラスミド、さらには今後分陣あるいは作
成されることが考えられるマーカーを有するプラスミド
やファージドＡについても適用し得ることは言うまでも
ない。
定のｌ）ＮΔたけでな（ＤＮＡ一般が取り込まれること
を鑑み、本号−マス属菌の形質転換法は、栄養要求マー
カーやストレプトマイシンｌ１４性マーカーをもつ染色
体１） Ｎ Ａおよび、プラスミドｐＴＴ８のみに限定
されるものでなく、他のマーカーをもつサーマス属及び
異種の染色体ＤＮＡ、またザーマス属菌の中で自律的複
製できる他のプラスミド、さらには今後分陣あるいは作
成されることが考えられるマーカーを有するプラスミド
やファージドＡについても適用し得ることは言うまでも
ない。
・：！以−ｒ、実施例により本発明を具体的に詳述する
。
。
い実施例１
□：、＜、１１’ｐ）染色体１）Ｎへの調製サーマス・
ザーモフイラスＩ（８２７株（ＦｌシＲＭ Ｐ−７５０
２）ン。
ザーモフイラスＩ（８２７株（ＦｌシＲＭ Ｐ−７５０
２）ン。
２りのザーマスｌａ地（ディフコ・イーストエキストラ
クトトン（大五栄養）４ｇ．ＮａＣ７！ Ｉｇ、ニトリ
ロ三酢酸 ０．１ｇ、ＣａＳＯ，−７８２０ ０．０６
ｇ．ＭｇＳＯ，・７ＨｚＯ Ｏ．Ｉｇ、ＫＮＯ３ ０．
１ ０５ｇ．ＮａＮＯ３ ０．７ｇ− ＮａｚＨＰＯａ
０．１１ ｇ、ＦｃＣ４ｚ ０．３ｍｇ＋ＭｎＳＯａ
２．２ｍｇ．、ＺｎＳＯｎ ０．５＋ｎ＋ｒ、Ｈ ３
１３０ ３０、５■、ＣｕＳＯ− ０． ０ １ ６
ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４ ０．Ｏ ２５＋ｎ＋ｒＣｏＣｎ
ｚ’６Ｈｚ０ ０．０４６ｍｇを純水１１！に含み、ｐ
Ｈを７。５に調整したもの）に接種し、対数増殖期の終
わり近くで集菌し、約６ｇの湿菌体を得る。これをリゾ
チーム １２■をン容力・した［ｉｍ６の０．１５ＭＮ
ａｃＥ−０．ＩＭ ＥＤ′ＦΔ（ｐＨ８）に：詭濁し、
３７°Ｃで２０分間保温後、エタノール・ドライアイス
の冷媒中に入れてすみやかに凍らせる。５ Ｑｍ１２の
０．１’Ｍ）リス塩酸緩衝液（１９． ０１１ −４−
％ＳＤＳＯ．１ＭＮａＣ４を加え、かくはん後、上記緩
衝液で飽和させたフェノールを５６ｍβ加え、４℃で振
とう後、遠心し、上層を分取する。
クトトン（大五栄養）４ｇ．ＮａＣ７！ Ｉｇ、ニトリ
ロ三酢酸 ０．１ｇ、ＣａＳＯ，−７８２０ ０．０６
ｇ．ＭｇＳＯ，・７ＨｚＯ Ｏ．Ｉｇ、ＫＮＯ３ ０．
１ ０５ｇ．ＮａＮＯ３ ０．７ｇ− ＮａｚＨＰＯａ
０．１１ ｇ、ＦｃＣ４ｚ ０．３ｍｇ＋ＭｎＳＯａ
２．２ｍｇ．、ＺｎＳＯｎ ０．５＋ｎ＋ｒ、Ｈ ３
１３０ ３０、５■、ＣｕＳＯ− ０． ０ １ ６
ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４ ０．Ｏ ２５＋ｎ＋ｒＣｏＣｎ
ｚ’６Ｈｚ０ ０．０４６ｍｇを純水１１！に含み、ｐ
Ｈを７。５に調整したもの）に接種し、対数増殖期の終
わり近くで集菌し、約６ｇの湿菌体を得る。これをリゾ
チーム １２■をン容力・した［ｉｍ６の０．１５ＭＮ
ａｃＥ−０．ＩＭ ＥＤ′ＦΔ（ｐＨ８）に：詭濁し、
３７°Ｃで２０分間保温後、エタノール・ドライアイス
の冷媒中に入れてすみやかに凍らせる。５ Ｑｍ１２の
０．１’Ｍ）リス塩酸緩衝液（１９． ０１１ −４−
％ＳＤＳＯ．１ＭＮａＣ４を加え、かくはん後、上記緩
衝液で飽和させたフェノールを５６ｍβ加え、４℃で振
とう後、遠心し、上層を分取する。
これに２容の冷アルコールを加えて核酸画分を糸状沈澱
として回収し、？、１１．ｍｘのＯ．ｔｘｓｓｃ （０
．１５Ｍ ＮａＣ６−０．０１５Ｍ り４４シ酸ナトリ
ウｌ、）に硲かしたあと２ｍ７！のＩＦＩＸｓｓｃ：不
加え、■×４、：ｌ：ｊ４，Ｃにン容りた才［１）Ｎへ
？容’ｔ（ｌを得る。次にＲ Ｎ ａ ｓ ａ△ （ソ
ゲーｌ拐Ｘシコ）、ｄ表ｊａ ｓ ｃ Ｔ １（シグマ
社製）をそれぞれ５０ｔｒｇ／ｍ７！、３ ０ ＩＩ
Ｈ／ｍ９になるように加え３７°ｃ−Ｃ３０分間保温し
、ＲＮＡを分解したのし」記フェノール処理を繰り返し
、染色体１）Ｎへ溶／１′９．を行る。
として回収し、？、１１．ｍｘのＯ．ｔｘｓｓｃ （０
．１５Ｍ ＮａＣ６−０．０１５Ｍ り４４シ酸ナトリ
ウｌ、）に硲かしたあと２ｍ７！のＩＦＩＸｓｓｃ：不
加え、■×４、：ｌ：ｊ４，Ｃにン容りた才［１）Ｎへ
？容’ｔ（ｌを得る。次にＲ Ｎ ａ ｓ ａ△ （ソ
ゲーｌ拐Ｘシコ）、ｄ表ｊａ ｓ ｃ Ｔ １（シグマ
社製）をそれぞれ５０ｔｒｇ／ｍ７！、３ ０ ＩＩ
Ｈ／ｍ９になるように加え３７°ｃ−Ｃ３０分間保温し
、ＲＮＡを分解したのし」記フェノール処理を繰り返し
、染色体１）Ｎへ溶／１′９．を行る。
（２）染色体Ｉ）ＮΔによるアミノ酸要求株の形１′１
転換１）加えるＤＮＡ尾と形質転換体数の関係サーマス
・サーモフィラス１１ １３ ２ ７のプロリン要求（
ｐ ｒ ｏ −） ４１ｉ、サーマス・→ノーモフィラ
スｌｌｒ３２７ｐｒｏ− （ＦＥ＋でＭ Ｐ − ７
５０ ３ ）を１ ０＋ｎｌ！のザーマス培地に接種し
、７０゛Ｃで１５時間培養後、５ ０ ｐ ｅを新しく
１０ｍρのザーマス培地に接種し、７０°Ｃで９０分間
培養する。
転換１）加えるＤＮＡ尾と形質転換体数の関係サーマス
・サーモフィラス１１ １３ ２ ７のプロリン要求（
ｐ ｒ ｏ −） ４１ｉ、サーマス・→ノーモフィラ
スｌｌｒ３２７ｐｒｏ− （ＦＥ＋でＭ Ｐ − ７
５０ ３ ）を１ ０＋ｎｌ！のザーマス培地に接種し
、７０゛Ｃで１５時間培養後、５ ０ ｐ ｅを新しく
１０ｍρのザーマス培地に接種し、７０°Ｃで９０分間
培養する。
この培養液０．３６ｍ７！に、（１）で記した方法によ
り調製された勺−マス・勺−モフィラスＩ（ Ｂ ２
７野生株の染色体ＤＮＡをＤＮＡ含量かＩｎ８から１０
ｇｇになるようにＳＳＣで希釈したＩ） Ｎ Ａ ７容
ン夜 ４ ０ ＩＩ Ｒを加え、さらに７０°Ｃで１時
間培養した。これを生理食塩水（０．８．’＋％ＮａＣ
β）で適当に希釈後、プロリンを含まない最小合成寒天
培地４．１塗布し、７０℃で２日間培養後、生育してき
た、プロリンを要求しん（：なった形質転換体のコロニ
ーを計数した。これらの結果を第１表に示した。
り調製された勺−マス・勺−モフィラスＩ（ Ｂ ２
７野生株の染色体ＤＮＡをＤＮＡ含量かＩｎ８から１０
ｇｇになるようにＳＳＣで希釈したＩ） Ｎ Ａ ７容
ン夜 ４ ０ ＩＩ Ｒを加え、さらに７０°Ｃで１時
間培養した。これを生理食塩水（０．８．’＋％ＮａＣ
β）で適当に希釈後、プロリンを含まない最小合成寒天
培地４．１塗布し、７０℃で２日間培養後、生育してき
た、プロリンを要求しん（：なった形質転換体のコロニ
ーを計数した。これらの結果を第１表に示した。
なお、本菌株は、ザーマス・シーモフィラスＨ Ｂ ２
７ Ｔ Ｆ ｐ ｒ ｏ ’に′□１１１．オＭＰ−
７５゜８）よ、７寄託、わ、い、。
７ Ｔ Ｆ ｐ ｒ ｏ ’に′□１１１．オＭＰ−
７５゜８）よ、７寄託、わ、い、。
第１表
表から明らかなように、形質転換体数はＤＮＡ量に依存
しており、飽和量のＤＮＡを加えたときには、生菌数当
り１０〜１２％の形質転換菌が認められた。
しており、飽和量のＤＮＡを加えたときには、生菌数当
り１０〜１２％の形質転換菌が認められた。
なお最小合成寒天培地はシコ糖５１Ｔ−Ｋ２ＨＰ ０４
０．５ ｇ、ＫＨ２Ｐ Ｏｓ０．２５ｇ、ＮａＣｆｆ
２Ｈ１（ＮＨ４）ｗｓＯａ ２．５ｇ−ビオチン１０
０ ｔｔ ｇ、塩酸チアミン１ｍｇ、ＭｇＣ６ｚ・、６
Ｈｚ０ ０．１．−２５ｇ、−Ｃａ（Ｊ！ｚ’ ２Ｈｚ
０ ２５ｎ＋ｇＸＦｅＳＯａ・ＩＨｚｏ ６ｍｇ、Ｃｏ
Ｃｊ！ −６１１□０ ０． ’８ｍ８、ＮｉＣａｚ・
６０ｚ０ ２０ｐｇ、、ＮａＭｏ０ｚ ’２１１．０
１．２ｍｇ、ＶＯ３Ｏｓ・３ＨｚＯＯ，１ｍｇ、Ｍｎ（
１！、・４Ｈ２０持ＪＩＢｆｆ ＧＯ−１８８０７１３
（３）５ｍＬ＋、Ｚｎ５Ｏｎ・７ｔｊｚＯＧＯＩＩｇ、
ＣｕＳＯｓ・５ＨｚＯｌ ５７１１；よび寒天（半井化
学）１５ｇを純水ｌβに含め、ｐＨを７．０〜７．２、
Ｊ！ｉ！整したものを使用した。ナーマス・４ノーモフ
イラスＩＩ Ｂ ２７ ！ｕＥｔ、Ｉ′Ａ′Ｊｌ記培地
に生育するが、プロリン等のアミノ酸要求株は上記培地
−′求アミノ９５０Ｂ／Ｒを含んだものでないと生育で
きない。
０．５ ｇ、ＫＨ２Ｐ Ｏｓ０．２５ｇ、ＮａＣｆｆ
２Ｈ１（ＮＨ４）ｗｓＯａ ２．５ｇ−ビオチン１０
０ ｔｔ ｇ、塩酸チアミン１ｍｇ、ＭｇＣ６ｚ・、６
Ｈｚ０ ０．１．−２５ｇ、−Ｃａ（Ｊ！ｚ’ ２Ｈｚ
０ ２５ｎ＋ｇＸＦｅＳＯａ・ＩＨｚｏ ６ｍｇ、Ｃｏ
Ｃｊ！ −６１１□０ ０． ’８ｍ８、ＮｉＣａｚ・
６０ｚ０ ２０ｐｇ、、ＮａＭｏ０ｚ ’２１１．０
１．２ｍｇ、ＶＯ３Ｏｓ・３ＨｚＯＯ，１ｍｇ、Ｍｎ（
１！、・４Ｈ２０持ＪＩＢｆｆ ＧＯ−１８８０７１３
（３）５ｍＬ＋、Ｚｎ５Ｏｎ・７ｔｊｚＯＧＯＩＩｇ、
ＣｕＳＯｓ・５ＨｚＯｌ ５７１１；よび寒天（半井化
学）１５ｇを純水ｌβに含め、ｐＨを７．０〜７．２、
Ｊ！ｉ！整したものを使用した。ナーマス・４ノーモフ
イラスＩＩ Ｂ ２７ ！ｕＥｔ、Ｉ′Ａ′Ｊｌ記培地
に生育するが、プロリン等のアミノ酸要求株は上記培地
−′求アミノ９５０Ｂ／Ｒを含んだものでないと生育で
きない。
ｉｉ） ＤＮａ ｓ ｅ、 ＲＮａ ｓ ｅ、プロナー
ゼ処理したＤＮＡを用いた形質転換 Ｉ）とまったく同様の方法で形質転換を行ったが、ＤＮ
Ａは野生株染色体ＤＮＡをｌμｇにより、あらかしめ以
下のような処理をしたものを用い０行った。
ゼ処理したＤＮＡを用いた形質転換 Ｉ）とまったく同様の方法で形質転換を行ったが、ＤＮ
Ａは野生株染色体ＤＮＡをｌμｇにより、あらかしめ以
下のような処理をしたものを用い０行った。
１）Ｎａｓａ処理はＤＮＮｉ８ ｔｒｌにＤＮａｓｃｌ
（シグマ社製）とＭ ｇ Ｃ７！Ｚをそれぞれ、１Ｏｎ
ｇ／ｍβ、２０ｍＭになるように加え、３７℃で；１０
分間保温して行った。ＲＮａｓｅ処理、プロナーゼ処理
は、Ｄ Ｎ Ａ Ｌｆｊ？（１にＲＮａｓｅＡ（シグマ
社製）、 プロナーゼ（科研化学）をそれぞれ５０４ｇ
／ｍｆｆ１．２５０μｇ／ｍｆｆ１になるように力ｔ１
え３７°Ｃで３０分間保温して行った。以上の結果を第
２表に示す。
（シグマ社製）とＭ ｇ Ｃ７！Ｚをそれぞれ、１Ｏｎ
ｇ／ｍβ、２０ｍＭになるように加え、３７℃で；１０
分間保温して行った。ＲＮａｓｅ処理、プロナーゼ処理
は、Ｄ Ｎ Ａ Ｌｆｊ？（１にＲＮａｓｅＡ（シグマ
社製）、 プロナーゼ（科研化学）をそれぞれ５０４ｇ
／ｍｆｆ１．２５０μｇ／ｍｆｆ１になるように力ｔ１
え３７°Ｃで３０分間保温して行った。以上の結果を第
２表に示す。
（以下 余白）
第２表
１生菌１３ １．８ Ｘｌ０７Ｃｅｌｌｓ ／Ｓａｍｐ
ｌｅ表から明らかなように、ＤＮＡを分解するＤＮａｓ
Ｃ処理により、形質転換体は現れなくなるが、ＤＮＡに
作用しない、ＲＮａ ｓ ｅ処理、プロナーゼ処理では
無処理とくらべ、はとんど変化しなかった。
ｌｅ表から明らかなように、ＤＮＡを分解するＤＮａｓ
Ｃ処理により、形質転換体は現れなくなるが、ＤＮＡに
作用しない、ＲＮａ ｓ ｅ処理、プロナーゼ処理では
無処理とくらべ、はとんど変化しなかった。
山）ロイシン、リジン、メチオニン、トリプトファン各
要求株の形質中ｌ−１桑 ｉ）、ｉｉ）とまったく同様の方法により、ロイシン、
リジン、メチオニン、トリプトファンのそれぞれのアミ
ノ酸要求株を受容菌としてｌμｇの野生株染色体ＤＮＡ
を用いて形質転換を行った。
要求株の形質中ｌ−１桑 ｉ）、ｉｉ）とまったく同様の方法により、ロイシン、
リジン、メチオニン、トリプトファンのそれぞれのアミ
ノ酸要求株を受容菌としてｌμｇの野生株染色体ＤＮＡ
を用いて形質転換を行った。
これらの結果を第３表に示す。
（以下 余白）
第３表
１５株とも復すに変異は １０−６以下である。
実施例１−（２）において使用した受容菌株及び形質転
換体は倣／１−吻工業技（４・ｉ研究所に一！ｊ’ｌ：
Ｃされ、第４表に示す受託番号を有している。
換体は倣／１−吻工業技（４・ｉ研究所に一！ｊ’ｌ：
Ｃされ、第４表に示す受託番号を有している。
第４表
（３）Ｓｍ’株染色体ＤＮＡによる形質転換二ノー−マ
ス・サーモソイ：＞ス１目３２７５ｍ’株（ＦＥＲＭ
Ｉ）−７５１３：ば、元来ストレブトマ・ｆノンに感受
性のサーマス・サーモフィラス ＨＢ″・１２７’、株
より分九１１さ７１１２、染色体１）ＮＡの変異により
、ストレプトマイシン、ベラ１５１ ’ｌ Ｏμ８／ｎ
１β３むジ−マス１８地でも生育できるようになった変
異株である。この林より（１）と同様の方法により染色
体１）ＮＡを調製しノこ。
ス・サーモソイ：＞ス１目３２７５ｍ’株（ＦＥＲＭ
Ｉ）−７５１３：ば、元来ストレブトマ・ｆノンに感受
性のサーマス・サーモフィラス ＨＢ″・１２７’、株
より分九１１さ７１１２、染色体１）ＮＡの変異により
、ストレプトマイシン、ベラ１５１ ’ｌ Ｏμ８／ｎ
１β３むジ−マス１８地でも生育できるようになった変
異株である。この林より（１）と同様の方法により染色
体１）ＮＡを調製しノこ。
す゛−マス・す゛−工フィラスｏｎ２７ａ、サーマス・
フラハスΔ１゛６２株（ＦＥＩ？Ｍ Ｐ−７５１５）、
サーマス・カルドフィラスＧＫ２４株＜＋；ａシＲＭ
Ｐ−７５１７）をそれぞれ１’Ｏ＋＋／！のザーマス培
Ｉｌ！！ｌに接種し、７０ ’ＣテＩ ５ ｌ”＋１ｉ
ｉｌｌ市？ｌ−？つ。’ｃ レソｈ（Ｄ ＋３ ’ｍ’
／（ｋ ５０ μｍ ヲ新シイ１０ｍ／！のり゛−マス
＋、７５ ＋ １！！に接種し、９０分間培役し、その
（１，７２＋＋ｌにｎ：１記のＳｍ’株の染色体ＤＮＡ
８（１１！ （１，６μｇＤＮＡ）を加え、さらに２時
間培養した。培養液を適当に生理食塩水で界釈した後、
スＩ・レプトマイシン（５０／Ｊ ｇ／ｎｕ）を含む劃
−マス寒天培地に塗布し、７０℃で２０時間”６０２＆
、ストレプトマイシンに耐性になった形質転換体の二目
−に一を；ＩＶＪ、シた。以上の結果を第５表に示す。
フラハスΔ１゛６２株（ＦＥＩ？Ｍ Ｐ−７５１５）、
サーマス・カルドフィラスＧＫ２４株＜＋；ａシＲＭ
Ｐ−７５１７）をそれぞれ１’Ｏ＋＋／！のザーマス培
Ｉｌ！！ｌに接種し、７０ ’ＣテＩ ５ ｌ”＋１ｉ
ｉｌｌ市？ｌ−？つ。’ｃ レソｈ（Ｄ ＋３ ’ｍ’
／（ｋ ５０ μｍ ヲ新シイ１０ｍ／！のり゛−マス
＋、７５ ＋ １！！に接種し、９０分間培役し、その
（１，７２＋＋ｌにｎ：１記のＳｍ’株の染色体ＤＮＡ
８（１１！ （１，６μｇＤＮＡ）を加え、さらに２時
間培養した。培養液を適当に生理食塩水で界釈した後、
スＩ・レプトマイシン（５０／Ｊ ｇ／ｎｕ）を含む劃
−マス寒天培地に塗布し、７０℃で２０時間”６０２＆
、ストレプトマイシンに耐性になった形質転換体の二目
−に一を；ＩＶＪ、シた。以上の結果を第５表に示す。
（以上 仝白）
第５表
９自然６１１性株は１０−”以下である。
実施例］−（３）において使用した受容菌株及び形質転
換菌は徹イ１″’ｌ：ｇ」二業技術研究所Ｃ譚、託され
、第６表に示す寄託番号を有している。
換菌は徹イ１″’ｌ：ｇ」二業技術研究所Ｃ譚、託され
、第６表に示す寄託番号を有している。
第６表
”ＴＦＳｍ’とは形質転換によりＳｍｒになったことを
表す。
表す。
四ｒ℃！ト例２
： 、’ ””ｌ’（、１） ｐ ′ｒ′＋゛１３ブラ
スミＩ” Ｄ Ｎ Ａの分離・ ”ｌ ：ｐ、ＴＴ８プ
ラスミドはザーマス・サーモフィラス１１８８株（ＦＥ
ＲＭＩ／口τ）＋−’ｌ −７５１９）が保有するプラ
スミドである。このサーマス・サーモフィラス１４Ｂ８
株の生物学的に純粋な培養基から１００ｍρのザーマス
１：ＳＩＬ！！に接種し、７０°Ｃで１６〜１８時間振
盪培養する。この培養液を１１の勺−マスｌａ地に接種
し、７０℃で５時間培養する。菌体を遠心によって集め
、ＴＩＥＳ （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１ｌ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ。
スミＩ” Ｄ Ｎ Ａの分離・ ”ｌ ：ｐ、ＴＴ８プ
ラスミドはザーマス・サーモフィラス１１８８株（ＦＥ
ＲＭＩ／口τ）＋−’ｌ −７５１９）が保有するプラ
スミドである。このサーマス・サーモフィラス１４Ｂ８
株の生物学的に純粋な培養基から１００ｍρのザーマス
１：ＳＩＬ！！に接種し、７０°Ｃで１６〜１８時間振
盪培養する。この培養液を１１の勺−マスｌａ地に接種
し、７０℃で５時間培養する。菌体を遠心によって集め
、ＴＩＥＳ （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ１ｌ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ。
１０ｆ１ｍＭ Ｎ、１Ｃｐ ｐ１４７．５）で洗浄後閑
体湿重＝、 ４ ｇ当たり、１０ｍｌ＋の２５％ショ糖
含有ＴＥＳに）Ｕ濁する。リゾチー１．（１０ｍｇ／ｍ
７りを２ｍ／！、０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ （ｐｉ−１８
）を４ｍｐを加え、０゛Ｃで１０分間静置、続いｊ３７
°Ｃに１０分間保温する。この細胞混合ン夜に２ｒｈｅ
のゞ１−ｅ−ＳＱ Ｄ Ｓ、５ｍｎの５ＭＮａｃ＋＋を
力１１え４°Ｃに１５〜１８Ｈ，Ｓ間装置する。これを
２８００Ｏｒｐｍ、１時間の超遠心によってｍｒし１し
、−に１ｉｌｒ ヲｉｎる。この」二清にポリエチレン
グリコール ６０００を１０％（Ｗ／ Ｖ ）加え、２
〜３時間０’ｃに装置、２２００ｒｐｍ、２分の遠心ご
沈殿を得る。この沈殿を１５川ｐのＴＢＳに溶解し、Ｃ
ｓＣ１及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６
１〜１．６２に調整する。
体湿重＝、 ４ ｇ当たり、１０ｍｌ＋の２５％ショ糖
含有ＴＥＳに）Ｕ濁する。リゾチー１．（１０ｍｇ／ｍ
７りを２ｍ／！、０．２５Ｍ−ＥＤＴＡ （ｐｉ−１８
）を４ｍｐを加え、０゛Ｃで１０分間静置、続いｊ３７
°Ｃに１０分間保温する。この細胞混合ン夜に２ｒｈｅ
のゞ１−ｅ−ＳＱ Ｄ Ｓ、５ｍｎの５ＭＮａｃ＋＋を
力１１え４°Ｃに１５〜１８Ｈ，Ｓ間装置する。これを
２８００Ｏｒｐｍ、１時間の超遠心によってｍｒし１し
、−に１ｉｌｒ ヲｉｎる。この」二清にポリエチレン
グリコール ６０００を１０％（Ｗ／ Ｖ ）加え、２
〜３時間０’ｃに装置、２２００ｒｐｍ、２分の遠心ご
沈殿を得る。この沈殿を１５川ｐのＴＢＳに溶解し、Ｃ
ｓＣ１及びエチジウムブロマイドを加えて密度を１．６
１〜１．６２に調整する。
この試料を３８０００ｒｐｍで３０〜４０時間、平衡密
度勾配遠心する。
度勾配遠心する。
生じたシラスミＩ” Ｄ Ｎへのハンドを集め、イソア
ミルアルコールでエヂ！ｉ＞Ｉ：ｆムブロマイ１ごを除
去した後、Ｔ ＩミＮ（２０ｍＭＴｒ ｉ ５−Ｃｊ！
１ｍＭ！ｔ！ｌ）ｒΔ、２０ｍＭＮ、ＩＣ７りにｉ３を
斤することによってプラスミドｈｉン１’ｌ。
ミルアルコールでエヂ！ｉ＞Ｉ：ｆムブロマイ１ごを除
去した後、Ｔ ＩミＮ（２０ｍＭＴｒ ｉ ５−Ｃｊ！
１ｍＭ！ｔ！ｌ）ｒΔ、２０ｍＭＮ、ＩＣ７りにｉ３を
斤することによってプラスミドｈｉン１’ｌ。
１男１゛トられる。
ｄ （２）プラスミド′の導入（形質転換）元来はプラ
スミドを保有していないサーマス・す°−モフイラス
１１１つ２７ｐｒｏ−（ＦＥＲＭ Ｐ−７５０３）株の
一夜＋６ ｆＪ液５０μ４を］Ｏｍρのサーマス培地に
接種し、７０℃で９０分間培養後、その５０μＣに（１
）で記した方法により調製されたｐＴＴ８プラソ、ミｌ
” Ｉ） 、’Ｊ△２μｇを加え、７０°Ｃで１時間１
Δ■した。生理食塩水で適当に希釈しｆコのら４ノ°−
マス寒天培地に塗布し、７０°Ｃで１５時間培養すると
６×１０１′の生菌数があった。生育してきたコロニー
を無作意Ｇこ９００株えらＯζ、滅菌したようして４ノ
ーマス寒天培池にの−Ｕたメンブレンフィルクー（ミリ
７ｊミアＩＩＡＷＰ）にレプリカし、７０℃で１５時間
培養した。そのフィルターを用いて、アマ−ジャム・二
ツクトランスレーション４−ノＩに、Ｌす３２ｐで標識
したｐ′ＦＴ８プラスミドＤＮ八をソ°Ｉ＋−フ゛とじ
て、二ｌ Ｉ＋ −：’−−ハイブリダイゼーションを
常法により行った。
スミドを保有していないサーマス・す°−モフイラス
１１１つ２７ｐｒｏ−（ＦＥＲＭ Ｐ−７５０３）株の
一夜＋６ ｆＪ液５０μ４を］Ｏｍρのサーマス培地に
接種し、７０℃で９０分間培養後、その５０μＣに（１
）で記した方法により調製されたｐＴＴ８プラソ、ミｌ
” Ｉ） 、’Ｊ△２μｇを加え、７０°Ｃで１時間１
Δ■した。生理食塩水で適当に希釈しｆコのら４ノ°−
マス寒天培地に塗布し、７０°Ｃで１５時間培養すると
６×１０１′の生菌数があった。生育してきたコロニー
を無作意Ｇこ９００株えらＯζ、滅菌したようして４ノ
ーマス寒天培池にの−Ｕたメンブレンフィルクー（ミリ
７ｊミアＩＩＡＷＰ）にレプリカし、７０℃で１５時間
培養した。そのフィルターを用いて、アマ−ジャム・二
ツクトランスレーション４−ノＩに、Ｌす３２ｐで標識
したｐ′ＦＴ８プラスミドＤＮ八をソ°Ｉ＋−フ゛とじ
て、二ｌ Ｉ＋ −：’−−ハイブリダイゼーションを
常法により行った。
９００株のうち９株が標識したｐＴＴ８とハイブリダイ
ズした。、、ｌＩ′１゜ら９株より、（１）に記した方
法でシラスミＩを調製すると、すベーζｐＴＴ８と同一
の大きさのプラスミドを保有しており、制限酵素Ｇこ、
Ｌる切断パターンもすべて同一であることがアガロース
ゲル電気泳動により居卜された。また、９株ともプロリ
ン要求性のマーカーをもっており、受容菌由来である事
も確認された。
ズした。、、ｌＩ′１゜ら９株より、（１）に記した方
法でシラスミＩを調製すると、すベーζｐＴＴ８と同一
の大きさのプラスミドを保有しており、制限酵素Ｇこ、
Ｌる切断パターンもすべて同一であることがアガロース
ゲル電気泳動により居卜された。また、９株ともプロリ
ン要求性のマーカーをもっており、受容菌由来である事
も確認された。
以上のように、プラスミドをもっていなかったサーマス
・サーモフィラスｔｌ １３２７ ｐ ｒ Ｏ−株の６
Ｘ１０６の生菌数に対し、２μｇのｐＴＴＳプラスミド
Ｉ）Ｎ八により、１％の割合で、プラスミＦ ｐ Ｔ
Ｔ ８がｍ人された事が確認された。
・サーモフィラスｔｌ １３２７ ｐ ｒ Ｏ−株の６
Ｘ１０６の生菌数に対し、２μｇのｐＴＴＳプラスミド
Ｉ）Ｎ八により、１％の割合で、プラスミＦ ｐ Ｔ
Ｔ ８がｍ人された事が確認された。
なお プラスミドの導入されたサーマス・サーモフィラ
ス ［（Ｂ２７ｐｒｏ−／ｐＴＴ８は微生物工業技術研
究所に寄託されている。
ス ［（Ｂ２７ｐｒｏ−／ｐＴＴ８は微生物工業技術研
究所に寄託されている。
（ＦＥＩ？ＭＰ−７５２０＞
毛材ε行１ｉ正書（方式）
％式％
１、事件の表示 昭和５９年特許願第 ４４８９５ 号
２、発明の名称 高度（１１′り１５菌の形質転換法 ３、補正をする者 官庁出願 手続補正書 昭和５９年１０月２４日 ｌ、事件の表示 昭和５９年特許願第 ４４８９５ 号
２、発明の名称 高度好熱菌の形質転換法 ｉ（イ） 馬 ；Ｗ 、Ｃ ４、指定代理人 − 覆 ｍ： 翻 ７、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の個別
紙 正する。
２、発明の名称 高度（１１′り１５菌の形質転換法 ３、補正をする者 官庁出願 手続補正書 昭和５９年１０月２４日 ｌ、事件の表示 昭和５９年特許願第 ４４８９５ 号
２、発明の名称 高度好熱菌の形質転換法 ｉ（イ） 馬 ；Ｗ 、Ｃ ４、指定代理人 − 覆 ｍ： 翻 ７、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の個別
紙 正する。
］
Claims (1)
- サーマス属菌を形質転換するにあたり、該微生物とデオ
キシリポ核酸とを接触させ、培養することを特徴とする
サーマス属菌の形質転換法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044895A JPS60188076A (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | 高度好熱菌の形質転換法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044895A JPS60188076A (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | 高度好熱菌の形質転換法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188076A true JPS60188076A (ja) | 1985-09-25 |
| JPS6240000B2 JPS6240000B2 (ja) | 1987-08-26 |
Family
ID=12704213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044895A Granted JPS60188076A (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | 高度好熱菌の形質転換法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60188076A (ja) |
-
1984
- 1984-03-08 JP JP59044895A patent/JPS60188076A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6240000B2 (ja) | 1987-08-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |