CA1109012A - Procede de production d'une culture stable d'un microorganisme du genre lactobacillus - Google Patents
Procede de production d'une culture stable d'un microorganisme du genre lactobacillusInfo
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Abstract
B R E V E T D' I N V E N T I O N Procédé de production d'une culture stable d'un microorganisme du genre Lactobacillus Société dite : SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A. Inventeur : Martin Bryce SMILEY Abrégé descriptif Procédé de production d'une culture stable d'un microorganisme du genre Lactobacillus présentant au moins un élément génétique extrachromosomal stimulant d'une part son aptitude à produire de l'acide lactique à partir du lactose et contrôlant d'autre part son aptitude à métaboliser la N-acétyle-D-glucosamine. On cultive le microorganisme dans un milieu nutritif dont la source principale de carbone assimilable est constitué par la N-acétyle-D-glucosamine.
Description
~1~)9~12 La presente invention a pour objet un procede de produc-tion d'une culture stable d'un microorganisme du genre Lactobacillus présentant au moinsun el~ment génétlque extrachromosomal stimulant d'une part son àptitude a produire de l'acide lactique à partir du lactose et contrôlant d'autre part son aptitude à metaboliser la N-acetyle-D-glucosamine.
Un problème important de l'industrie des produits laitiers tels que les fromages et les yoghourtspar exemple reside dans l'instabilit~ des souches de microorganismes elev8s pour et utilisés dans la fabrication de ces produits, notamment les microorganismes producteurs de l'acide lactique a partir du lactose, par exemple les espèces du genre Lactobacillus. En effet, il est connu que l'aptitude des microorganismes dits lactiques à produire de l'acide lactique à partir du lactose, que l'on nommera également dans la suite de cet exposé "acti-vité" ou "capacite de production d'acide lactique", peut di-minuer avec le temps.
Certains sp~cialistes ont etudie le mecanisme de la pro-duction d'aclde lactique par le biais de la génétique. C'est ainsi que l'on sait maintenant qu'un plasmide est responsable de la fermentation du lactose par le Streptococcus lactis et que des plasmides peuvent être impliques dans le métabolisme du lactose de certains Lactobacilli.
Les plasmides sont des elements genetiques extrachromoso-maux ~ui se pr~sentent sous forme d'une molecule circulaire d'acide désoxyribonucléique (DNA) dont le poids equivaut à
quelques pour mille ou dizaines de pour mille du poids du chromosome du microorganisme.
Cependant, à moins qu'un plasmide soit entierement res-ponsable de la fermentation du lactose par un microorganisme, '-f cas auquel il suffit de cultiver le microorganisme dans le lait pour conserver son activite, l'état actuel des connais-..
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Un problème important de l'industrie des produits laitiers tels que les fromages et les yoghourtspar exemple reside dans l'instabilit~ des souches de microorganismes elev8s pour et utilisés dans la fabrication de ces produits, notamment les microorganismes producteurs de l'acide lactique a partir du lactose, par exemple les espèces du genre Lactobacillus. En effet, il est connu que l'aptitude des microorganismes dits lactiques à produire de l'acide lactique à partir du lactose, que l'on nommera également dans la suite de cet exposé "acti-vité" ou "capacite de production d'acide lactique", peut di-minuer avec le temps.
Certains sp~cialistes ont etudie le mecanisme de la pro-duction d'aclde lactique par le biais de la génétique. C'est ainsi que l'on sait maintenant qu'un plasmide est responsable de la fermentation du lactose par le Streptococcus lactis et que des plasmides peuvent être impliques dans le métabolisme du lactose de certains Lactobacilli.
Les plasmides sont des elements genetiques extrachromoso-maux ~ui se pr~sentent sous forme d'une molecule circulaire d'acide désoxyribonucléique (DNA) dont le poids equivaut à
quelques pour mille ou dizaines de pour mille du poids du chromosome du microorganisme.
Cependant, à moins qu'un plasmide soit entierement res-ponsable de la fermentation du lactose par un microorganisme, '-f cas auquel il suffit de cultiver le microorganisme dans le lait pour conserver son activite, l'état actuel des connais-..
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- 2 ~ 9012 sances ne peut guère être mis au service de l'industrie en matière de stabilité de l'activité des microorganismes lac-tiques.
On sait par ailleurs que differentes souches de la même espèce de microorganisme peuvent différer notablement quant a leur capacité de production d'acide lactique. C'est notam-ment vrai pour le microorganisme Lactobacillus helveticus sous-espace jugurti. Ce microorganisme est utilisé dans la fabrica-tion du Gruyère, de l'Emmenthal et du parmesan. En d'autres LO termes, ce serait tout sauf un exercice académique que de trouver une solution à cette disparité et de pouvoir garantir une activité maximum de chaque souche.
La présente invention donne une solution ~ ce problème.
Le procédé selon l'invention est caractérisé par le fait !S que l'on cultive le microorganisme dans un milieu nutritif dont la source principale de carbone assimilable est constituée parla N-acétyle-D-glucosamine.
Par l'expxession "source principale de carbone assimilable", on entend ici source déterminante, sans laquelle le microorga-'0 nisme ne pourrait pas se développer, ce qui n'exclut pas la présence d'autres sources "mineures" qui seraient ajout~esau milieu avec une source d'oligoéléments et de vitamines telle qu'un extrait de levure, par exemple.
, ~n a constaté en effet au cours d'une étude comparee ap-,'5 profondie des propriétés de deux souches d'une même espèce de Lactobacillus, en l'occurrence de Lactobacillus helveticus sous-espece jugurti, dont l'une avait une capacité de produc-tion d'acide lactique nettement plus forte que l'autre, que i cette forte capacité était due à la présence d'un plasmide de ¦ 13,17 kilobases (kb). Ce plasmide était absent chez la souche à faible capacité. On a découvert que ce plasmide ne contrôle pas l'aptitude de la souche ~ produire de l'acide lactique a partir du lactose mais qu'il stimule cette aptitude, eutrement . ~ ~ , . .. . - . . . . . . :
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dit qu'il contrôle un facteur stimulant la production d'acide lactique, cette production, stimulee ou non, forte ou faible étant contrôlée par des gênes situés sur le chromosome. On a découvert en outre que ce même plasmide contrôle enti~rement ; 5 l'aptitude du microorganisme à métaboliserla ~-acétyle-D-glu-cosamine. C'est ainsi que l'on a mis en évidence la raison pour laquelle les deux souches de la même espèce n'ont pas la même capacité de dégradation de l'acide lactique et que l'on a trouvé un moyen hautement utilisable pour l'industrie de cul-tiver et maintenir des souches stables à forte activit~ de ces microorganismes.
En effet, les plasmides sont susceptibles d'etre perdus lors de la division des cellules. D'une part la réplication des chromosomes n'est pas nécessairement accompagnee de la réplication des plasmides et d'autre part les plasmides issus de replications ne sont pas necessairement distribués en parts ' égales aux cellules issues de divisions cellulaires. Mais I si les cellules sont cultivées sur un milieu dont la source de carbone ne peut etre exploitée que grace au plasmide, les cel-i 20 lules sans plasmides ne seront pas viables et elles disparal-; tront à mesure au profit des cellules avec plasmide.
La mise en oeuvre du pr~sent procedé implique donc l'usage d'un microorganisme du genre Lactobacillus qui présente au moins un élément génétique extrachromosomal, autrement dit au moins un plasmide, stimulant d'une part son aptitude à pro-duire de l'acide lactique à partir du lactose et contr81ant d'autre part son aptitude à metaboliserla N-acetyle-D-gluco-samine. De preférence, le microorganisme est le Lactobacillus helveticus de la sous-espèce jugurti S 36-2 que l'on peut ob-(i 30 tenir à l'institut de microbiologie agronomique de l'univer-~ sit~ de Bologne en Italie.
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Le microorganisme peut etre maintenu ou conservé en le transférant chaque mois dans un milieu aqueux à 5 - 10 ~ en poids de matière sèche contenant une source adequate d'azote .
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_ 4 ~ 90 1 2 assimilable, des sels, des oligoéléments et des vitamines, ainsi que de la N-acétyle-D-glucosamine comme principale source de carbone assimilable, ce milieu ayant éte st~rilisé avant le transfert, par exemple par chauffage en autoclave durant 30 mn à 115C. Le milieu ensemencé peut être incube ~ une température favorable à la croissance du microorganisme, par exemple 40 -42C, jusqu'~ ce que sa densité optique corresponde à la demi-croissance logarithmique p.ex. Il peut être maintenu entre les transferts à une température $uffisamment basse pour que le L0 microorganisme ne se multip~e pas, par exemple 5 - 10C. Lors-qu'on désire produire une quantité de microorganisme néces-saire pour une fabrication industrielle de fromage ou de yog-hourt, par exemple, on peut partir des cultures ci-dessus, les cultiver et les transférer le nombre de fois nécessaire, trois à quatre fois par exemple, à une température favorable à leur croissance, dans le lait. Les transferts peuvent se faire à
raison de 0,5 a quelques %, de préférence 1 % en volume de la culture ~ transférer par rapport au volume du lait à inoculer.
L'exemple donné ci-après à titre d'illustration permettra de mieux comprendre la présente invention. Les pourcentages sont en poids.
EXEMPLE
':
D'une part, on cultive séparément deux souches de Lacto-bacillus helveticus sous-esp~ce jugurti, de Nos respectifs S 13 - 8 et S 36-2, obtenues auprès de l'institut de micro-biologie agronomique de l'université de Bologne en Italie, dans une suspension de 10 % de lait écr~me en poudre et 0,1 %
d'extrait de levure dans l'eau, la suspension ayant été sté-ri}isée en autoclave durant 30 mn à }15C. Apr~s une incuba-tion de 8 heures a 42C, la souche S 13-8 a produit 1,5 %
d'acide lactique dans la suspension et la souche S 36-2 en a produit 2,4 %.
D'autre part, on fait cro~tre la souche S 36-2 sur milieu : . : . . . - - - . . , ; - . . : . . : . :
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MRS (J.C. de Man, M. Rogosa et M.F. Sharpe, J. Appl. Bact. 23, 130 - 135 (1960))pour lactobacilles. On transfert des échan- :
tillons de cette culture en milieu MRS frais auquel on a ajouté -7~ug/ml d'acriflavine. On incube 24 h. On repique sur milieu MRS solidifié par addition de 1,5 % dlagar et l'on incube sous atmosphère d'hydrogène et de CO2. On isole des colonies indi-viduelles.
Ensuite, dans un milieu MRS modifié présentant la compo-sition suivante:
N-acétyle-D-glucosamine 10 g Polypeptone 10 g Extrait de levure 5 g Tween 80 * 1 ml K2HP04 2 g CH3COONar 3H20 Citrate biammonique 2 g MgSO4~ 7H20 0,2 g MnSO4, 4H20 0 05 g Eau distillée 1 litre * (polyoxyéthylèn~ sorbitan monooléate~
on cultive individuellement un certain nombre d'échantillons de la souche S 36-2 qui n'ont pas subi le traitement a l'acri-flavine et les colonies ci-dessus qui ont subi le traitement à l'acriflavine. On constate que environ 60 % de ces colonles sont incapables de cro;tre sur le milieu ci-dessus où laN-aCé-tyle-D-glucosamine est la source principale de carbone assimi-lable, alors que seulement 1 ~ des échantillons de référence n'en est pas capable. On vérifie en suspension aqueuse à 10 % -~ de lait écrémé en poudre et 0,1 % d'extrait de levure que les ,30 colonies qui ne sont pas capables de métaboliserla N-acétyle-D-glucosamine produisent en 8 heures des quantit~s d'acide lac-~l tique comprises entre 1,3 et 1,6 %, à savoir autant que la i souche S 13-8. Au contraire, les échantillons de r~férence ~' .
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ll()9Q12 sont pratiquement tous capables de cro;tre sur le milieu MRS
modifie et ils produisent en 8h 2,3 - 2,6 ~ d'acide lactique sur le milieu de lait écrémé en poudre et d'extrait de levure.
Cette propriéte demeure intacte tant que l'on cultive ou main-tien ces echantillons sur le milieu MRS modifi8.
On vérifie par des techniques appropriees d'hydrolyse, de separation par centrifugation sous gradient de densite de ClCs-bromure d'éthidium, et de microscopie ~lectronique, que c'est un plasmide de 13,17 kb, present dans la souche S 36-2, absent dans la souche S 13-8 et neutralisé dans la souche S 36-2 trai-tée à l'acriflavine, qui est responsable d'une part de l'élé-vation de la production d'acide lactique de environ 1,5 à en-viron 2,4 %, telle que déterminée ci-dessus, et d'autre part de la métabolisation de la N-acétyle-D-glucosamine.
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On sait par ailleurs que differentes souches de la même espèce de microorganisme peuvent différer notablement quant a leur capacité de production d'acide lactique. C'est notam-ment vrai pour le microorganisme Lactobacillus helveticus sous-espace jugurti. Ce microorganisme est utilisé dans la fabrica-tion du Gruyère, de l'Emmenthal et du parmesan. En d'autres LO termes, ce serait tout sauf un exercice académique que de trouver une solution à cette disparité et de pouvoir garantir une activité maximum de chaque souche.
La présente invention donne une solution ~ ce problème.
Le procédé selon l'invention est caractérisé par le fait !S que l'on cultive le microorganisme dans un milieu nutritif dont la source principale de carbone assimilable est constituée parla N-acétyle-D-glucosamine.
Par l'expxession "source principale de carbone assimilable", on entend ici source déterminante, sans laquelle le microorga-'0 nisme ne pourrait pas se développer, ce qui n'exclut pas la présence d'autres sources "mineures" qui seraient ajout~esau milieu avec une source d'oligoéléments et de vitamines telle qu'un extrait de levure, par exemple.
, ~n a constaté en effet au cours d'une étude comparee ap-,'5 profondie des propriétés de deux souches d'une même espèce de Lactobacillus, en l'occurrence de Lactobacillus helveticus sous-espece jugurti, dont l'une avait une capacité de produc-tion d'acide lactique nettement plus forte que l'autre, que i cette forte capacité était due à la présence d'un plasmide de ¦ 13,17 kilobases (kb). Ce plasmide était absent chez la souche à faible capacité. On a découvert que ce plasmide ne contrôle pas l'aptitude de la souche ~ produire de l'acide lactique a partir du lactose mais qu'il stimule cette aptitude, eutrement . ~ ~ , . .. . - . . . . . . :
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dit qu'il contrôle un facteur stimulant la production d'acide lactique, cette production, stimulee ou non, forte ou faible étant contrôlée par des gênes situés sur le chromosome. On a découvert en outre que ce même plasmide contrôle enti~rement ; 5 l'aptitude du microorganisme à métaboliserla ~-acétyle-D-glu-cosamine. C'est ainsi que l'on a mis en évidence la raison pour laquelle les deux souches de la même espèce n'ont pas la même capacité de dégradation de l'acide lactique et que l'on a trouvé un moyen hautement utilisable pour l'industrie de cul-tiver et maintenir des souches stables à forte activit~ de ces microorganismes.
En effet, les plasmides sont susceptibles d'etre perdus lors de la division des cellules. D'une part la réplication des chromosomes n'est pas nécessairement accompagnee de la réplication des plasmides et d'autre part les plasmides issus de replications ne sont pas necessairement distribués en parts ' égales aux cellules issues de divisions cellulaires. Mais I si les cellules sont cultivées sur un milieu dont la source de carbone ne peut etre exploitée que grace au plasmide, les cel-i 20 lules sans plasmides ne seront pas viables et elles disparal-; tront à mesure au profit des cellules avec plasmide.
La mise en oeuvre du pr~sent procedé implique donc l'usage d'un microorganisme du genre Lactobacillus qui présente au moins un élément génétique extrachromosomal, autrement dit au moins un plasmide, stimulant d'une part son aptitude à pro-duire de l'acide lactique à partir du lactose et contr81ant d'autre part son aptitude à metaboliserla N-acetyle-D-gluco-samine. De preférence, le microorganisme est le Lactobacillus helveticus de la sous-espèce jugurti S 36-2 que l'on peut ob-(i 30 tenir à l'institut de microbiologie agronomique de l'univer-~ sit~ de Bologne en Italie.
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_ 4 ~ 90 1 2 assimilable, des sels, des oligoéléments et des vitamines, ainsi que de la N-acétyle-D-glucosamine comme principale source de carbone assimilable, ce milieu ayant éte st~rilisé avant le transfert, par exemple par chauffage en autoclave durant 30 mn à 115C. Le milieu ensemencé peut être incube ~ une température favorable à la croissance du microorganisme, par exemple 40 -42C, jusqu'~ ce que sa densité optique corresponde à la demi-croissance logarithmique p.ex. Il peut être maintenu entre les transferts à une température $uffisamment basse pour que le L0 microorganisme ne se multip~e pas, par exemple 5 - 10C. Lors-qu'on désire produire une quantité de microorganisme néces-saire pour une fabrication industrielle de fromage ou de yog-hourt, par exemple, on peut partir des cultures ci-dessus, les cultiver et les transférer le nombre de fois nécessaire, trois à quatre fois par exemple, à une température favorable à leur croissance, dans le lait. Les transferts peuvent se faire à
raison de 0,5 a quelques %, de préférence 1 % en volume de la culture ~ transférer par rapport au volume du lait à inoculer.
L'exemple donné ci-après à titre d'illustration permettra de mieux comprendre la présente invention. Les pourcentages sont en poids.
EXEMPLE
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D'une part, on cultive séparément deux souches de Lacto-bacillus helveticus sous-esp~ce jugurti, de Nos respectifs S 13 - 8 et S 36-2, obtenues auprès de l'institut de micro-biologie agronomique de l'université de Bologne en Italie, dans une suspension de 10 % de lait écr~me en poudre et 0,1 %
d'extrait de levure dans l'eau, la suspension ayant été sté-ri}isée en autoclave durant 30 mn à }15C. Apr~s une incuba-tion de 8 heures a 42C, la souche S 13-8 a produit 1,5 %
d'acide lactique dans la suspension et la souche S 36-2 en a produit 2,4 %.
D'autre part, on fait cro~tre la souche S 36-2 sur milieu : . : . . . - - - . . , ; - . . : . . : . :
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MRS (J.C. de Man, M. Rogosa et M.F. Sharpe, J. Appl. Bact. 23, 130 - 135 (1960))pour lactobacilles. On transfert des échan- :
tillons de cette culture en milieu MRS frais auquel on a ajouté -7~ug/ml d'acriflavine. On incube 24 h. On repique sur milieu MRS solidifié par addition de 1,5 % dlagar et l'on incube sous atmosphère d'hydrogène et de CO2. On isole des colonies indi-viduelles.
Ensuite, dans un milieu MRS modifié présentant la compo-sition suivante:
N-acétyle-D-glucosamine 10 g Polypeptone 10 g Extrait de levure 5 g Tween 80 * 1 ml K2HP04 2 g CH3COONar 3H20 Citrate biammonique 2 g MgSO4~ 7H20 0,2 g MnSO4, 4H20 0 05 g Eau distillée 1 litre * (polyoxyéthylèn~ sorbitan monooléate~
on cultive individuellement un certain nombre d'échantillons de la souche S 36-2 qui n'ont pas subi le traitement a l'acri-flavine et les colonies ci-dessus qui ont subi le traitement à l'acriflavine. On constate que environ 60 % de ces colonles sont incapables de cro;tre sur le milieu ci-dessus où laN-aCé-tyle-D-glucosamine est la source principale de carbone assimi-lable, alors que seulement 1 ~ des échantillons de référence n'en est pas capable. On vérifie en suspension aqueuse à 10 % -~ de lait écrémé en poudre et 0,1 % d'extrait de levure que les ,30 colonies qui ne sont pas capables de métaboliserla N-acétyle-D-glucosamine produisent en 8 heures des quantit~s d'acide lac-~l tique comprises entre 1,3 et 1,6 %, à savoir autant que la i souche S 13-8. Au contraire, les échantillons de r~férence ~' .
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ll()9Q12 sont pratiquement tous capables de cro;tre sur le milieu MRS
modifie et ils produisent en 8h 2,3 - 2,6 ~ d'acide lactique sur le milieu de lait écrémé en poudre et d'extrait de levure.
Cette propriéte demeure intacte tant que l'on cultive ou main-tien ces echantillons sur le milieu MRS modifi8.
On vérifie par des techniques appropriees d'hydrolyse, de separation par centrifugation sous gradient de densite de ClCs-bromure d'éthidium, et de microscopie ~lectronique, que c'est un plasmide de 13,17 kb, present dans la souche S 36-2, absent dans la souche S 13-8 et neutralisé dans la souche S 36-2 trai-tée à l'acriflavine, qui est responsable d'une part de l'élé-vation de la production d'acide lactique de environ 1,5 à en-viron 2,4 %, telle que déterminée ci-dessus, et d'autre part de la métabolisation de la N-acétyle-D-glucosamine.
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Claims (2)
1. Procédé de production d'une culture stable d'un microorganisme du genre Lactobacillus présentant au moins un élément génétique extrachromosomal stimulant d'une part son aptitude à produire de l'acide lactique à partir du lactose et contrôlant d'autre part son aptitude à méta-boliser la N-acétyle-D-glucosamine, caractérisé par le fait que l'on cultive le microorganisme dans un mi-lieu nutritif dont la source principale de carbone assimi-lable est constituée parla N-acétyle-D-glucosamine.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme est le Lactobacillus helveticus de la sous-espèce jugurti de No S 36-2 de l'institut de micro-biologie agronomique de l'université de Bologne en Italie.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| CH286178A CH640568A5 (fr) | 1978-03-16 | 1978-03-16 | Procede de production ou maintien d'une culture stable d'un microorganisme du genre lactobacillus. |
| CH2861/78 | 1978-03-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA1109012A true CA1109012A (fr) | 1981-09-15 |
Family
ID=4243227
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA322,575A Expired CA1109012A (fr) | 1978-03-16 | 1979-03-01 | Procede de production d'une culture stable d'un microorganisme du genre lactobacillus |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4399220A (fr) |
| JP (1) | JPS54163885A (fr) |
| AU (1) | AU517372B2 (fr) |
| CA (1) | CA1109012A (fr) |
| CH (1) | CH640568A5 (fr) |
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