JPS60188089A - オリゴ糖の少ない糖液の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ハイトロール又はラフィネートよりオリゴ糖
の少ない糖液を製造する方法に関する。

結晶グルコース製造時に副産物として生産されるハイト
ロールはマルトース、マルトトリオース、イソマルトー
ス、ニゲロース、パノース等のオリゴｉｓ　＜以下本発
明において単にオリゴ糖と称する）を多く含むために、
主成分であるグルコースを多量含有するものの、このハ
イトロールを澱粉糖化液に再混入して、異性化工程を経
て後の異性化糖を製造するための原料として再利用する
ことはこれまでなされておらず、単に水飴用又は特殊な
甘味料（米国特許　第３，９３５，０７０号に記載され
ている。）として利用されているにすぎなかった。

一方、最近異性化糖中のグルコースと果糖を分離する技
術が発達し、果糖含量を従来の４２％（対固型分％、以
下同じ）から８０％へと向上させることが可能となり、
両者を一定比率で混合して果糖含量５５％のものが盛ん
に製造されるようになったが、その分離の際、副生ずる
グルコース画分（ラフィネートと称している）の再利用
が問題となってきた。即ちラフィネート中にもオリゴ糖
が多く含まれており、このラフィネートを澱粉糖化液に
再混合して再び異性化を行おうとしても、生成される異
性化糖液中のオリゴ糖含量が多くなってしまい、再利用
できないのであった。

もっとも、これまでに澱粉糖化液中のグルコース含量を
高め、オリゴ糖を減少せしめる方法として、澱粉糖化の
際にグルコアミラーゼにプルラナーゼ又はイソアミラー
ゼ等のα−１，６グルコシダーゼを併用して糖化を行う
種々の試みがなされていた。例えば特公昭５４−２９５
７０、特開昭５６−２３８９４、特開昭５７−１７０１
９５等がある。しかしながら、これら種々の方法によっ
ても、実際上ＤＥを若干増加させる効果はみられるもの
の、依然として糖化液中にオリゴ糖がかなり含まれ、そ
のために結晶グルコース製造時に副生されるハイトロー
ル又は異性化糖液より高果糖異性化糖液製造時に副生さ
れるラフィネートにオリゴ糖がそのまま移行し結局のと
ころ、これら種々の試みにもかかわらず上記の問題は解
決できないままであった。そこで本発明者らは、ハイト
ロール又はラフィネートを澱粉糖化液に再混入し、異性
化等工程を経た後に得られる異性化糖液の製造に利用す
べく鋭意検討した結果、ハイトロールを希釈した液又は
ラフィネート中のオリゴ糖をよく分解する能力を有する
α−グルコシダーゼを添加し、適当な温度、適当な時間
作用せしめることによって該ハイトロール希釈液又はラ
フィネートをオリゴ糖の少ない糖液とすることに成功し
、かつ又本発明によって得られるオリゴ糖の少ない糖液
はそのまま或いは濃縮して澱粉糖化液に再混入でき、次
いで異性化工程を経た後の異性化糖液製造に再利用でき
ることを知り本発明を完成したものである。

ハイトロールとラフィネートはグルコース、オリゴ糖に
関してほぼ同様の糖組成を有するが、ハイトロールの方
は固型分含有率が約５０〜７０％と多く、（ラフィネー
トは１０〜３０％含量である。）α−グルコシダーゼが
そのままでは作用しにくいのでハイトロールを適当に希
釈して用いる必要がある。ハイトロールの希釈割合とオ
リゴ糖水解率との関係を試験例１にて説明する。

試験例１ ハイトロール原液（固型分合１ｉｆ５０％、固型分中の
オリゴ糖含有率１７．１％）を水で希釈して固型分含量
ｌＯ％（１）、２０％（Ｉ［）及び３０％（ＩＩＩ）と
し、それぞれのハイトロール希釈液■、■、■を基質と
して、これらにペシロミセス・バリオティのα−ンルコ
シダーゼを各基質１ｍｌ当り４単位を添加し、６０℃で
反応せしめ、各時間経過後における各ハイトロール希釈
液中のオリゴ糖残存率、、（％）を調べた。なお対照と
して〆）イドロール原液につぃてもオリゴ糖残存率を調
べた。その結果を表−１に示す。

（以下余白） 表−１より明らかのようにハイトロール中の固型分含量
が少ないほどオリゴ糖残存率が増加しており、少なくと
もハイトロール中に固型分含量として３０％以下になる
ようハイトロールを希釈することが好ましいことがわか
った。本発明においてハイトロール希釈液と称するもの
はハイトロールを希釈してその固型分含量を１０〜３０
％にしたものを意味することとする。本発明の特徴はハ
イトロール希釈液又はラフィネートにα−グルコシダー
ゼを作用させ、該ハイトロール希釈液又はラフィネート
をオリゴ糖含量の少ない糖液とすることにある。そのた
めにはハイトロール希釈液又はラフィネートが酸性であ
り、グルコース含量も多くかつ種々のオリゴ糖を含有し
ているので、本発明において使用できる好適なα−グル
コシダーゼとしては至適ｐｉが酸性側にあり、種々のオ
リゴ糖に幅広い基質特異性を有するとともに、高グルコ
ース濃度中でもよく作用するα−グルコシダーゼが好ま
しい。α−グルコシダーゼ（ＥＣ３，２，１，２０）は
多種類存在するがそのようなα−グルコシダーゼとして
微生物起源の例えばペシロミセス・バリオティ又はアス
ペルギルス・ニガーの産生するα−グルコシダーゼ或い
は植物起源の甜菜種子よりのα−グルコシダーゼ等があ
げられる。

以下にこれらα−グルコシダーゼのｖｔＡ製法ならびに
酵素化学的性質について述べる。

ペシロミセス・バリオティのα−グルコシダーゼの調製
法： ペシロミセス・バリオティ１１７０４８５５の菌株をグ
ルコース１％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３
％及びポリペプトン０．３％からなる培地に接種し、２
８℃で２日間前培養を行っノこ後に馬鈴薯鍛粉３％、Ｎ
Ｈ４ＮＯ３０，０５％、ＫＨ２ｐｏ４０．０２％、Ｍｇ
ＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ０，０５％及びＣａＣＯ３２％から
なる本培地に前培養後の菌体を接種し、３２℃で４０時
間振盪培養を行い、除去し粗酵素液を得、次いで９９％
のエタノールを２倍容加え、生じた沈澱を集め、０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，４）に懸濁し、沈澱を除去
し、透析し、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ　（フ
ァルマシア社製品）、バイオ−ゲルＰ−１５０（バイオ
・ラッド社製品）及び２回目のＤＥＡＲ−セファロース
ＣＬ−６Ｂの各カラムクロマトグラフィーを行い、精製
酵素液を得た。このものを更に鋼製用ディスク電気泳動
処理及び２回目のバイオ−ゲルＰ　−１５０によるゲル
ろ過を行うことによってディスク電気泳動的に単一な標
品を得た。

アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼの調製法
： 市販酵素剤であるトランスグルコシダーゼ「アマノ」　
（天野製薬株式会社製品）を酵素原末とし、このものを
２０ｎ＋Ｍリン＠＠衝液に溶解し、透析し、遠心分離し
て得られる上清を粗酵素液とし、次いで粗酵素液をＤＥ
ＡＥ−セファロース及びトヨパールＨＷ−５５（東洋曹
達工業株式会社製品）カラムクロマトグラフィーで処理
し、ディスク電気泳動的に単一に精製した。

甜菜種子α−グルコシダーゼの調製法：甜菜種子粉末よ
りＡｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、第４２巻２４１〜
２４５頁（１９７８年）の方法により鋼製し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動的に単一の精製α−グルコシダ
ーゼを得た。

本発明において上記の調製法によって得られたペシロミ
セス・バリオティ、アスペルギルス・ニガー及び甜菜種
子よりの各種α−グルコシダーゼは精製酵素のみならず
部分精製したもの及び粗酵素であってもそのまま使用さ
れ得る。更に又これらα−グルコシダーゼは固定化して
使用することもできる。固定化する場合は通常の固定化
方法のいずれの方法でもよいが、本発明において、具体
的には次の方法によって調製される。

固定化α−グルコシダーゼの鋼製法； 精製水で洗浄したセファロース４Ｂ（ファルマシア社製
品）　３００ｇ　（湿重量）を８％エピクロールヒドリ
ンを含有する０、６Ｎカセイソーダ溶液７００艷に懸濁
し４０°Ｃで２時間反応させたのち、精製水で洗浄し、
活性化セファロースを得た。次に該活性化セファロース
３００ｇを０．５Ｍへキサメチレンジアミン溶液７００
−に懸濁し２５°Ｃで１６時間反応させた後、１Ｍ食塩
水及び精製水で順次洗浄しアミノへキシルセファロース
を合成した。

該アミノへキシルセファロース１００ｇを１％グルタル
アルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液２５０戚に懸濁
し、室温にて攪拌しつつ３０分反応させたのち精製水に
て洗浄し、各種起源のα−グルコシダーゼ５，０００単
位を溶解したＯ、　ＩＭリン酸緩衝液２５０ｍｅに懸濁
させた。室温にて攪拌しつつ４時間反応させたのち、各
種α−グルコシダーゼ固定化物をろ過回収し、精製水及
び１Ｍリン酸緩衝液で順次洗浄した。得られた固定化物
の活性はペシロミセス・バリオティのα−グルコシダー
ゼの場合Ｉｇｉｆｉ潤ゲル当り　７．３単位で活性収率
は１４．６％であった。甜菜種子のα−グルコシダーゼ
の場合１ｇ１ｎ潤ゲル当り　９．３単位で活性収率は１
８．５％であった。

次に各種α−グルコシダーゼの酵素化学的性質を比較し
つつ述べる。

ｆｉ＋作用： いずれのα−グルコシダーゼともα−グルコシド結合を
有する少糖類、配糖体又は多糖類に作用し、その非還元
末端からグルコース単位に切断する。

（２）基質特異性： 各種α−グルコシダーゼの種々の基質に対するＶｍａｘ
からめた氷解速度をマルトースを１００とした相対値と
して表＝２に示す。

表−２ （３）至適ｐＨ： ペシロミセス・バリオティ及び甜菜種子のα−グルコシ
ダーゼは４．５付近であり、アスペルギルス・ニガーの
α−グルコシダーゼは４．０〜４．５付近にある。

（４）安定ｐｌＩ： ペシロミセス・バリオティのα−グルコシダ　一ゼはｐ
Ｈ４，５〜９．０の範囲で、アスペルギルス・ニガーの
α−グルコシダーゼはｐｏ　３．５〜８．０の範囲で、
甜菜種子のα−グルコシダーゼはｐＨ３，０〜８．０の
範囲でそれぞれ安定である。

（５）温度安定性： ペシロミセス・バリオティのα−グルコシダーゼは５５
℃、１５分処理で、アスペルギルス・ニガーのα−グル
コシダーゼは５０℃、１５分処理で、甜菜種子α−グル
コシダーゼは６０℃、１５分処理でもそれぞれ安定であ
る。

１６）分子量： ＳＤＳポリアクリルアミドディスク電気泳動法によって
めた各種α−グルコシダーゼの分子量。ペシロミセス・
バリオティのα−グルコシダーゼは１００，０００、ア
スペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼは５８，０
００、甜菜種子のα−グルコシダーゼは９１，０００で
ある。

（７）活性測定法： 基質として０．５％マルトース溶液（ｐｌ＋　４．０の
０．２Ｍ酢酸緩衝液に熔解して調製する。）０．８−を
用い、酵素液０．２−を加え、３７℃においてα−グル
コシダーゼを５分間反応し、グルコースを生成させ、グ
ルコースオキシダーゼ法（Ｇｌｕｃｏｓｅβ−Ｔｅｓｔ
　Ｗａｋｏ　：和光純薬工業株式会社製品）でグルコー
スを測定した。１分間に１μモルのマルトースを分解し
て２μモルのグルコースを生成する酵素活性を１単位（
Ｕ）とする。

次にこれら各種α−グルコシダーゼを用いてハイトロー
ル希釈液又はラフィネート中のオリゴ糖を分解する条件
即ち添加酵素量、作用温度及び作用時間等について検討
した。その結果を試験例２〜３にて説明する。

試験例２ 各種α−グルコシダーゼの添加量をめるためにハイトロ
ール希釈液（固型分２０％、固型分中のオリゴ糖含量率
１７．１％）を基質とし、基質１ｍｌ！当り各種α−グ
ルコシダーゼを１．２．４及び８各車位量添加し６０℃
で１〜６時間作用させ、それぞれのハイトロール希釈液
中のオリゴ糖残存率を調べた。その結果を表−３に示す
。

（以下余白） 表−３より明らかのように各α−グルコシダーゼのいず
れも２単位以上添加した場合にハイトロール希釈液中の
オリゴ糖の氷解が進むことがわかる。そしてより残存率
を減らすだめの添加量としては各α−グルコシダーゼと
も４単位以上必要であることがわかった。

試験例３ ハイトロール希釈液（固型分含量２０％、固型分中のオ
リゴ糖含有率１７．１％）及びラフィネート（固型分合
Ｎ２０％、固型分中のオリゴ糖含有率１３．８％）を基
質としペシロミセス・バリオティのα−グルコシダーゼ
を基質１−当り４単位ずつ添加し、各温度で各時間作用
させたのち、各基質について篠一時的にオリゴ糖残存率
を調べ、作用温度ならびに作用時間を検討した。その結
果を表−４に示す。

（以下余白） 表−４より明らかのように作用温度は高いほどオリゴ糖
残存率が減少することが−わかるが、しかし６０℃以上
になると酵素の失活がみられるので好ましい作用温度と
しては５０〜６０°Ｃである。又作用時間としては１時
間以上であれば、オリゴ糖の残存率が減少するが長時間
経過するといったん生成したグルコースから逆合成によ
ってまたオリゴ糖が再生成されはじめるのでかえってオ
リゴ糖残存率が増加し、したがって２４時間以内にとど
めるのが好ましい。

試験例１〜３で示されるようにハイトロール希釈液又は
ラフィネートにペシロミセス・バリオティ、アスペルギ
ルス・ニガー又は甜菜種子由来のα−グルコシダーゼを
適当な温度で適当な時間、即ち５０〜６０℃、１〜２４
時間作用させることによって、ハイトロール希釈液又は
ラフィネート中のオリゴ糖を分解してグルコースとなさ
しめ、かくしてハイトロール希釈液又はラフィネートよ
りオリゴ糖の少ない糖液を製造することができた。本発
明の方法によって得られたオリゴ糖の少ない糖液は、そ
のままもしくは濃縮後澱粉糖化液に再混入して異性化ｍ
液製造用として大いに利用され得る。

以下に本発明を実施例にてより具体的に説明する。

実施例１ 固型分濃度１５％、糖組成（固型分を１００％として各
糖成分の比率を％で示す。）フラクトース１０．４％、
グルコース７２．７％、オリゴ１１１６．９％であるラ
フィネート１０００−にペシロミセス・バリオティのα
−グルコシダーゼを３０００単位加え、６０°Ｃで４時
間反応したところ、フラクトース１０．３％、グルコー
ス８２．９％、オリゴ［６，８％の糖液が得られた。こ
のものを公知の方法で減圧濃縮して固型分濃度４５％と
し、グルコースイソメラーゼにより異性化反応工程を行
ったところ、フラクトース４２．５％、グルコース５０
．６％、オリゴ糖６．９％という糖組成の異性化糖液を
得た。このものは通常の異性化糖液として使用可能であ
った。

実施例２ 固型分濃度２０％、ｐＨ４，３、糖組成がグルコース８
１．３％、オリゴｆｉ！　１８．７％であるグルコース
ハイトロール希釈液１０００ｍｅにアスペルギルス・ニ
ガーのα−グルコシダーゼを１ｄ当り４単位加え、６０
℃で４時間反応したところグルコース９２．６％、オリ
ゴＩ！７．４％の糖液が得られた。このものを濃縮して
固型分濃度３５％とし、同濃度の液化コーンスターチ（
分解率１５％）に１０％加え、グルコアミラーゼ（グル
クザイムＡＦ−６：天野製薬製）を固型分１ｇ当り４単
位加え、６０℃で４０時間糖化したところ、グルコース
９４．５％、オリゴ糖５．５％の糖組成を持つ糖液を得
た。このものはグルコースイソメラーゼによる異性化糖
の製造に使用することができた。又このものは勿論、精
製ブドウ糖や結晶ブドウ糖の製造にも有効に使用するこ
とができた。

実施例３ 固型分濃度１５％、糖組成フラクトース１０．４％、グ
ルコース７２．７％、オリゴ糖１６．９％であるラフィ
ネート’　３００ｍ１！を甜菜種子α−グルコシダーゼ
をアミノヘキシルセファロースに固定化し、カラムに充
填したもの（７，３単位／ｇ湿潤ゲル、カラム容積１０
０ｍｔ’）に６０℃、５００ｍｅ　／　Ｈｒで通液し４
時間循環反応させたところフラクトース１０．４％、グ
ルコース８３．０％、オリゴ糖６．６％の糖液が得られ
た。

このものを公知の方法で減圧濃縮して固型分濃度４５％
とし、グルコースイソメラーゼにより異性化反応工程を
行ったところ、フラクトース４２．５％、グルコース５
０．８％、オリゴ糖６．７％という糖組成の異性化糖液
を得た。このものは通常の異性化糖液として使用可能で
あった。なおミこの甜菜種子α−グルコシダーゼを固定
化したアミノへキシルセファロースは、上記条件で５回
繰り返し反応させた後も初期の活性の１００％を保持し
ていた。

特許出願人　天野製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　澱粉糖化液からグルコースを結晶分離した後に得ら
   れるハイトロールを希釈した液又は異性化ｍ液をイオン
   交換樹脂処理して高果糖区分を分離した後に得られるラ
   フィネートにα−グルコシダーゼを適当な温度で適当な
   時間作用させることによって該ハイトロール希釈液又は
   ラフィネートをオリゴ糖含量の少ない糖液とすることを
   特徴とするオリゴ糖の少ない糖液の製造法。 ２　α−グルコシダーゼがペシロミセス・バリオティ、
   又はアスペルギルス・ニガーに属する菌株の産生ずるα
   −グルコシダーゼもしくは甜菜種子由来のα−グルコシ
   ダーゼである特許請求の範囲第１項記載のオリゴ糖の少
   ない糖液の製造法。 ３　ハイトロール希釈液又はラフィネートにα−グルコ
   シダーゼを作用させる適当な温度が５０〜６０℃であり
   適当な時間が１〜２４時間である特許請求の範囲第１項
   記載のオリゴ糖の少ない糖液の製造法。 ４　α−グルコシダーゼが固定化α−グルコシダーゼで
   ある特許請求の範囲第１項記載のオリゴ糖の少ない糖液
   の製造法。