JPS60188097A - アルコ−ル検出用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、／８液中のアルコール、特にエタノールの濃
度を酵素法で測定する試験片に関するものであり、さら
に詳細には、ニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオチ
ド（以後ＮＡＤと略す）又は。

ニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオチドフオスフェ
−１−（以後ＮＡＤＰと略す）と、アルコールオキシダ
ーゼと、アルデヒドデヒドロゲナーゼと。

色素と、担体とからなるアルコール検出用試験片に関す
るものである。

溶液中のアルコール濃度の測定は２食品工業や化学工業
において、プロセス管理の目的で頻繁に行われている。

アルコールのうち、特にエタノール濃度の測定は、医学
や臨床検査部門において１當的な測定項目であり、また
、交通法規上では車要な検査項目となっている。

溶液中のアルコール測定に利用されてきた多くの化学的
方法は、アルコールの酸化に要した酸化剤の容量的な変
化や酸化剤の色調変化による方法が採用されている。こ
れらの方法ばずぺて使用才る酸化剤がアルコール以外の
様々な揮発性物質と反応しうるため、特異性を欠くとい
う重大な鄭点がつきまとった。

このため、目的とする物質のみを特異的に測定する物理
化学的な方法として、ガスクロマトグラフィー、　Ｉ＆
体クロマトグラフィーによるアルコールの分析方法が１
９６０年代に開発されたが、それらの方法は正確に定量
ができ、特異的である反面。

分析に長時間を要し、特殊で高価な装置や、それを十分
使いこなしうる人材の育成が必要であり。

汎用性に掛け、即時性、実用性に難点があった。

一方、酵素を用いる生化学的分析方法は、化学的方法や
物理化学的方法に比べると一般的に特異性に優れ、装置
的にも特殊なもの、大型のものを用いる必要がない等の
利点があり、この方法として、アルコールデヒドロゲナ
ーゼを用いた方法（スキヤント・ジェイ・クリニ・ラボ
・アンド　インヘスＩ−，３５Ｆ！頁、　１９５１年、
ポニチェセン等著；５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　
Ｌａｂ、　ａｎｄ　Ｉｎｖｅｓｔ、、　３５Ｆ１．１９
５ＬＲ，Ｂｏｎｎｉｃｌ＋ｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ）やアル
コールオキシダーゼを用いた方法（バイオキミ・バイオ
フィシ・アクタ１５１巻３３０〜３４２頁、　１９６８
年、ジャンセン等著；　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、＾ｃｔａ、　１５１．３３０〜３４２゜１９６８
＋　Ｆｒａｎｋ、　Ｈ，Ｊａｎｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ＞
が報告されている。これらの方法はいずれも、溶液中で
酵素反葛を行わせ、生成したニコチンアミド　アデニン
ジヌクレオチド還元型（以後Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｉ＋と略す）
を３４０ｎｍで測定したり、生成した過酸化水素をパー
オキシダーゼの作用でオルトジアニシジンと反応させ。

その発色を４３６ｎｍで測定したりする方法であり。

またＮ　Ａ　１１　Ｈの測定法として、ジアホラーゼと
色素を組合せた報告（アーチ・バイオキミ・バイオフィ
シ−１３２ｇ、、　１９６９年、カブラン等著；　＾ｒ
ｃｈ　。

Ｒｉｏｃｈｉｍ、旧ｏｃｈＶｓｒ＋　１３２＋　９１＋
　］！１６９．　Ｆ、　Ｋａｐｌａｎｅｔａｌ）もある
が、光学的な方法であるため９分光光度計などの装置は
やはり必要であり１面液や食品などのように混濁したサ
ンプルの場合は測定が不可能であった。また、酵素反応
を行わせるには１種々の試薬を／８解した上で１反応器
中に所定量ずつ分注する操作が必要で、煩雑であり、熔
解した試薬の保存性も悪く、汎用性に欠けている。

特にこれらの方法は、サンプル中に含まれるアスコルビ
ン酸、ビリルビン、Ｓｌ＋化合物などの還元物質によっ
てパーオキシダーゼ作用による呈色反応がさまたげられ
、測定誤差の原因となっている。このような欠点を克服
するために、酵素的方法と電気化学的方法とを組合せて
アルコールを測定する方法が研究されており、酵素電極
法とし°ζ例えば、特公昭５７−５６０１９号公報には
、アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコール脱水素酵素
）を用いた方法が記載されている。この方法は酵素反応
でエタノールから生成した水素を酸化−還元系を用いて
電気的に測定するもので、酵素固定化賄や電気的な測定
装置が必要であり、酵素膜は耐久性に乏しく、液体酵素
膜は４℃で２日間、酵素固定比換でも２週間の安定性し
かなく、実用的でない。

また、　＋、＋＋定に要するサンプルも電極を十分ひた
す量、すなわち比較的多量のサンプルが必要と考えられ
、臨床検査に用いる時などは採血するｌｆ［１液量に限
度があることから、やはりこの方法も汎用性。

一般性、実用性に欠けている。

したがって、当業界では持ち運びが容易で、特別の装置
、技術を要することなく、任意の場所で簡便に、微量の
サンプルでアルコール濃度が測定できる方法が望まれな
がら、それらすべてを満足する方法のないまま今日に至
っているのが現状である。

本発明者らは、かかる現状に鑑み２食品製造管理、急性
アルコール中毒症の診断や交通取締りの現場から持ち運
びが容易で特別の装置、技術をｊ＞Ｐすることなく、任
意の場所で簡便に、微量のサンプルで、アルコール濃度
を検出することができるアルコールの測定について鋭意
ω「究を重ねた結果。

ＮＡＤ又はＮＡＤＰと、アルコールオキシダーゼアホラ
ーゼと．アルデヒドデヒドロゲナーゼと。

色素と，担体とからなる試験片が，測定誤差の原因とな
っていた還元物質の影響を全く受けることなく，シかも
極く微量の被検液でも被検液中のアルコールの含を量に
応じて発色又は脱色し，アルコール濃度が測定でき．上
記の目的が達成されることを見い出し，本発明を完成す
るに至った。

すなわち、本発明ば，　（ａ）ＮＡｒｌ又はＮＡＩ〕Ｐ
と。

（ｂ）アルコールオキシダーゼと．　（Ｃ）ジアホラー
ゼと．　（ｄ）アルデヒドデヒドロノ）ゞナーセと。

（ｅ）色素と，　（ｒ）担体とからなるアルコール検出
用試験片である。

本発明の試験片は．アルコールを含有する溶液を含浸さ
せると，直ちにアルコールと酵素反応を起こし、まずア
ルコールがアルコールオキシダーゼによってアルデヒド
と過酸化水素に変換される段階（反応式−１）、さらに
アルコールオキシダーゼ反応により生成したアルデヒド
が、ＮＡ口又はＮＡＤＰの存在下、アルデヒドデヒドロ
ゲナゼによって酸と還元型Ｎ＾１）（以下Ｎ　Ａ　１１
　Ｈという。）又は還元型ＮＡＤＰ（以下ＮＡＤＰＨと
いう。）に変換される段階（反応式−２）１次に生成し
たＮＡＤＩＩ又はＮＡＤＰＩＩはジアホラーゼによって
色素に水素を移され、その結果色素は退色もしくは発色
する段階とからなっている（反応式−３）。アルコール
量の測定は試験片をアルコールを含む溶液に浸し、その
退色あるいは発色の程度や速さを視認することで行われ
る。

反応式−１ アルコールオキシダーゼ アルコール＋０２″過酸化水素＋アルデヒド反応式−２ アルデヒドデヒドロゲナーゼ アルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）□酸十ＮＡＤ（Ｐ）１１反応
式−３ ジアホラーゼ Ｎ６口（Ｐ）Ｈ十色素（酸化型）□ ＮＡＤ（Ｐ）十色素（還元型） 本発明に用いられる酵素のうち、アルコールオキシダー
ゼは、一般に、＾Ｉｃｏｈｏｌ　：　０ｘｙｆＸｅｎｏ
ｘｉｄｏｒｅ、ｄｕｃｔａｓｅ＋　ＥＣ１＋１＋３＋１
３に分類されるものであって、測定しようとするアルコ
ールを酸化し。

過酸化水素を生成できるものならいずれでもよく。

例えば、エタノールをθす定しようとする場合は。

ヘーリンガー　マン　ハイム山之内社やシグマ社より市
販されている酵母由来のものを使用することができる。

また、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、一般に八１ｄｅ
ｈｙｄｅ：ＮＡＤ　ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｅ
　Ｃ＋１．２．１．３や＾１ｄｅｈｙｄｅ：ＮＡＩ）Ｐ
　ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｌシ　Ｃ，］、２．
１．４　あるいは八Ｉｄｅｈｙｄｅ：ＮＡＤ（Ｐ）　ｏ
ｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ、　ＥＣ１，２゜１．５に
分類されるものであって、測定しようとするアルコール
に対応するアルデヒドを脱水素できるものならいずれで
でもよく２例えばエタノールを測定しようとする場合、
すでに数社（ヘーリンガーマンハイム山之内社、シグマ
社、オリエンタル酵母社）より市販されている　酵母由
来のものを使用することができる。

またジアホラーゼは、一般にＮＡＤＨ：　Ｉｉｐｏａｍ
ｉｄｅｏｘｉｄｏ−ｒｐｄｕｃ、Ｌａ５ｅ　Ｆ、　Ｃ１
，６，４，３や、　ＮＡＤＩＩ　：　ｄｙｅｏｘｉｄｏ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｅ　Ｃ１，６，９９に分類される
ものであって、用いる色素を還元できるものであればい
かなるものでもよく、これもブタ心臓、微生物由来のも
のがずでに市販されている（ヘーリンガーマンハイム山
之内社、東洋紡社）。また好熱性細菌由来のジアホラー
ゼを用いることもでき５例えばバチルス　ステアロサー
モフィラス（Ｂａｃｉ　１１ｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）のジアホラーゼを得るには。

バイオケミカル　ジャーナル　１９１巻、４５７〜４６
５　Ｈ＠、　１９８０年（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　１９
１．４５７〜４６５゜１９８０　）に従えばよい。

さらにＮＡＩＩ、　ＮＡＤＰも試薬として１例えば各社
？（ヘーリンガーマンハイム山之内社、オリエンタル酵
母社、ソグマ社、生化学工業社）から市販されているも
のを用いればよい。色素としては、ジアホラーゼの作用
によって発色もしくは退色するものならいかなるもので
もよく１例えばフェリシアン化合物や一般にホルマザン
色素と呼ばれるものがあり、前者の例としては、フェリ
シアン化カリウム、後者の例としては、ヨードニトロテ
トラゾリウム塩を用いることができる。またその他の色
素として、メチレンブルー、２．６ジクロルフエノール
インドフエノール、インジゴカルミン。

アマランスなどをあげることができ、測定者の安全衛生
トの観点から安全性が確認されている色素。

すなわち食品添加物として許可されているものや。

ＩＫｆｆｉとして用いられているインジゴカルミン、ア
マランス、メチレンブルーを用いるのが好ましい。

このように安全が確認されている色素を用いたアルコー
ル検出用試験片は、唾液中のアルコール濃度の検出に最
適で、交通法規、１−のエタノール測定にメリットが甚
大である。

また５本発明の試験片に用いる担体としては。

常温で水に不溶性もしくはＨ溶性（溶解度１．０％以下
、２５℃）のものならばいかなるものでもよく。

例えばゼラチン、寒天、サイクロデキストリン。

セルロース、紙、キチン、グルカンなどに代表される天
然物の低分子から高分子のものや、レーコン、ビニロン
、ポリエステル、ある種のポリビニルアルコール、ナイ
ロン、アクリルなどの半合成から合成高分子のいずれを
も用いることができる。

大きさや厚さ、形状は任意のものを用いればよい。

本発明の試験片を作るにあたって、それぞれの試薬の濃
度は次のようにすればよい。例えば、１モル／７！の濃
度のアルコール検出用試験片を作る場合２色素は０．０
１〜１０モル／ｌ、好ましくは０．１〜２．０モル／７
！、最も好ましくは０．２〜１．０モル／ｅとすればよ
く、アルコールデヒドロゲナーゼやアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼやジアホラーゼはそれぞれ１０２〜１０１１ユ
ニット／Ｌ好ましくは１０４〜１０９ユニット／Ｉ！、
最も好ましくは１０６〜１０８ユニツト／ｌとすればよ
い。またＮＡＤやＮＡＤＰは、０．００１〜２．０モル
／１．好ましくは０．０１〜１．５モル／ｎ、最も好ま
しくは０．１〜１．０モル／！とすればよい。このＮＡ
ＤやＮＡＤＰは、単独で、あるいは混合して加えてもよ
い。これらを熔解する緩衝液はいかなる種類のものでも
用いることができる。そのｐＨとしては４〜１２．好ま
しくは６〜】１゜最も好ましくは７．０〜９．５であれ
ばよく、その流度としては、　０．０１〜２モル／１．
好ましくは０．１〜１．０モル／ρ、最も好ましくは０
．２〜０．８モル／ｌとすればよい。このような緩衝液
としては。

例えば、トリス−塩酸緩衝液があげられる。検出しよう
とするアルコール濃度が１モル／ｌより低い時には、そ
の低い割合に応じて、各成分を減少させればよいが、実
際には酵素反応に要する時間が長くなるので９色素のみ
を減少させることが普通である。また、用いる酵素の性
質によって、Ｎｉ２）のみ、　ＮＡＩ）Ｐのみ、あるい
は両者を一緒に加えてもよい。添加する酵素の単位ユニ
ットとは１国際単位であり、１分間に基質１マイクロモ
ルを２５〜３０℃の反応条件で変化させる活性をいう。

本発明の試験片を作るには３例えば、水不溶性あるいは
Ｈ溶性の担体の１部あるいは全部を一ト記試薬の溶解液
に含浸せしめればよく、引き上げた後、そのまま使った
り、あるいは乾燥後、使用に供すればよい。また、一層
ずつ積層するような方法で作製してもよい。大きな担体
を用いた場合は。

十記試薬の溶解液にひたしたのち、適当な大きさ。

例えばＩｊｊｆ　５　ｍ　ｍ　＋　長さ４０ｍｍ　（ら
いに細断すればよい。

乾燥を行う際には、酵素が元来熱に対して不安定である
ので、低温乾燥や凍結乾燥などを行う方がよい。乾燥し
たものは、室温保存１力月後にも十分使用に供すること
ができる。

本発明の試験片で実際に溶液中のアルコール濃度を測定
するには５例えば測定に適した濃度の試験片を測定する
溶液にひたし、引き上げて室温にてその色素の退色もし
くは発色に要する時間を測定することで行うことができ
る。また色調変化によってもアルコール濃度を測定する
ことができる。

唾液中のアルコール濃度を測定する場合も、唾液にアル
コール検出用試験片をひたし、退色に要する時間を測定
したり、あるいは色調変化を視認することで唾液中のア
ルコール濃度の測定ができる。

本発明のアルコール検出用試験片は、持ち運びが非常に
容易であることはもちろん、ジアホラーゼと色素とが加
わっているために、酵素反応の結果を視認で判断できる
ため１分光光度計や電気化学的な特殊な装置を全く必要
とせず、測定誤差の原因となっていた還元物質の影響を
全く受けることなく、シかも、任意の場所で簡便に、ｖ
、ｉｗのサンプルで短時間のうちにアルコール濃度を検
出することができる。特）に、乾燥した試験片は１力月
以七の長期保存性に優れており、さらに、好４ハ性細菌
由来の酵素を用いた場合には、−要保存性が優れた試験
片が得られることから、急惺アルコール中毒の診断のよ
うに急を要する場合や、交通法規上の使用に非常に有益
であり９社会生活ト、公衆が得る利益ははかり知れない
ものがある。

次に本発明を実施例により具体的に説明する。

この実施例では下記の試薬を用いた。

１、　ＮＡＤ又はＮ＾ＩＩＰＶオリエンタル酵母社製。

２、アルコールオキシダーゼ；シグマ社製カタログ陶　
＾２４０４゜ ３、ジアホラーゼ；ベーリンガー　マンハイム山之内社
製カタログＩＩｋ１４１１５５１１゜４、アルデヒドデ
ヒドロゲナーゼ；ベーリンガーマンハイム山之内社製カ
タログ１１ｈ１７１８３２なお、各酵素の単位（ユニッ
ト）は国際単位であり、アルコールオキシダーゼ、の１
ユニットハ、２５℃で１分間に１マイクロモルのエタノ
ールを酸化する酵素量であり、アルデヒドデヒドロゲナ
ーゼの１ユニツトは２５℃で１分間に１マイクロモルの
アセトアルデヒドを消費する酵素量であり。

ジアホラーゼの１ユニツトは２５℃でヨードニトロテト
ラゾリウムバイオレット存在下、１分間に１マイクロモ
ルのＮ　Ａ　１１　Ｎを消費する酵素量である。

実施例１ メチレンブルー４ｍＭ／ｊ２．アルコールオキシダーセ
５　Ｘ　１０５ユニツト／　Ｉｔ　、　ＮＡＩＩ　２（
］ｍＭ　／　１．、アルデヒドデヒドロゲナーゼ４　Ｘ
　１０”ユニット／β。

ジアホラーゼＩ　Ｘ　１０５ユニット／Ｉ！、リン酸緩
衝液（ｐＨ８−０）＋Ｎａｚ　ｌｌＰＯ４／　Ｋｔｌｔ
　Ｐ％より調整。〕からなる溶液を濾紙（東洋科学製定
性濾紙陽２゜直径９ｃｍ円型、厚さ０．２６ｍｍ）に含
浸させ、凍結乾燥後幅５ｍｍ＋長さ４０ｎ＋ｍの短冊状
に細断して青色の試験片■を得た。

この試験片Ｉを０．５ｇ／ＩＶのエタノール溶液に浸漬
し、取り出した後、室温に放置し、肉眼で観察したとこ
ろ、浸漬部分の青色が退色し、１分で無色となった。

一方　９％漬するエタノールの濃度を変化させると、試
験片Ｉの青色が完全に退色するのに要する時間、あるい
は退色の程度が変化した。

すなわち、エタノール濃度が追ｉくなるにつれて退色に
要する時間が短くなり、エタノール濃度が非常に薄くな
ると、退色が完全に行われず色調が薄くなるにとどまっ
た。

その結果を第１表に示した。

第　１　表 第１表に示したように、退色に要する時間、その色調変
化を視認することで、溶液中のエタノール濃度を測定す
ることができた。上記組成よりなる試験片Ｉは、簡便で
迅速にエタノールを検出するための試験片として使用可
能であり、室温にて１力月以上保存してもその性能は保
たれていた。

実施例２ 実ｈｉｆ例１で示した組成のうち、メチレンブルーをヨ
〜トニ１〜ロチトラゾリウムバイオレット４ｍＭ／βに
代えて用いた以外は実施例１と同様にして試験片１１を
作成した。

得られた試験片ＩＩは白色であり、０．５Ｒ／　７！の
エタノール溶液に／ｌ−清し、取り出した後、室温に放
置するとｌψ漬細部分徐々に赤く呈色した。

ＥＭ片■は、浸漬するアルコール濃度に応じて呈色の度
合、速さに変化を生じた。

その結果を第２表に示す。

第２表 第２表に示したように、ヨードニトロテトラゾリウムバ
イオレットを用いてもその変色に要する時間や色調変化
から、溶、液中のエタノール濃度が測定できた。しかも
試験片■は迅速で簡単なエタノール検出用試験片として
使用可能であり、暗所で１力月以上その性能が保たれた
。

実施例３ 実施例Ｉで得られた試験片Ｉを用いて、唾液中のアルコ
ール濃度の測定を実施した。

すなわち１体重６５ｋｇの成人男子に日本酒３６０ｍ　
ｌを飲酒させ、飲酒後１時間後の唾液を陣取し、ガスク
ロマトグラフィー（島原製作所ＧＣ−３ＢＴ）を用いて
唾液中のエタノール濃度を測定したところ。

０．６１　ｇ　／　ｊ！であった。

次に、試験片ｌにこの唾液をしましたところ。

５５秒で濃青色が白色に退色し、実施例１の結果から、
約（１，６ｇ／βのエタノールが含まれていることが認
められた。この結果はガスクロマトグラフィーで得られ
た結果とよく一致した。すなわち試験片■を用いること
によって、唾液中のエタノール濃度を簡便に、測定しう
ろことが確認された。

特許出廓人　ユニチカ株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （，１１（ａ）ニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオ
   チド又はニコチンアミド　アデニン　ジヌクレオチドフ
   ォスフエイトと、　（ｂ）アルコールオキシダーゼと、
   　（Ｃ）ジアホラーゼと。 （ｄ）アルデヒドデヒドロゲナーゼと、　（ｅ）色素と
   、　（ｆ）担体とからなるアルコール検出用試験片。