JPS60196185A - 形質転換酵母の培養方法 - Google Patents
形質転換酵母の培養方法Info
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- JPS60196185A JPS60196185A JP59053069A JP5306984A JPS60196185A JP S60196185 A JPS60196185 A JP S60196185A JP 59053069 A JP59053069 A JP 59053069A JP 5306984 A JP5306984 A JP 5306984A JP S60196185 A JPS60196185 A JP S60196185A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｂ型肝炎ウィルスの遺伝子を組込んだ組換え
プラスミドにより形質転換された酵母の培養方法、およ
びそれによるＢ型肝炎つィルス込面抗原（以下ＨＢｓ抗
原と略称する）の産生量〃に関する。
プラスミドにより形質転換された酵母の培養方法、およ
びそれによるＢ型肝炎つィルス込面抗原（以下ＨＢｓ抗
原と略称する）の産生量〃に関する。
Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス（以下ＨＢＶと略称する
）によって起り、疫学的にも、臨床的にも非常に重大な
る問題を含む、いまだ有効な治療対策が見出されていな
い疾病である。これは世界中に広く分布しているか、特
にアジア、アフリカ地域に多発し問題となっている。
）によって起り、疫学的にも、臨床的にも非常に重大な
る問題を含む、いまだ有効な治療対策が見出されていな
い疾病である。これは世界中に広く分布しているか、特
にアジア、アフリカ地域に多発し問題となっている。
予防する対策としては、ＨＢ ｓ抗原を有効成分とする
ワクチンが最も有効であると考えられ実用化段階に入っ
ている。すなわち、キャリアーと称されるＢ型肝炎ウィ
ルス潜伏持続感染者の血漿より得られるＨＢｓ抗原を高
度に精製し、これを不活化してＢ型肝炎ワクチンがつく
られている。
ワクチンが最も有効であると考えられ実用化段階に入っ
ている。すなわち、キャリアーと称されるＢ型肝炎ウィ
ルス潜伏持続感染者の血漿より得られるＨＢｓ抗原を高
度に精製し、これを不活化してＢ型肝炎ワクチンがつく
られている。
しかしながら、このように血液由来のワクチンは原料を
血液にもとめるため、またＢ型肝炎ウィルスあるいは他
の血液由来のウィルスなどの感染性の因子を否定するた
めに、チンパンジーによる安全性唯認試験が必要である
ことなどの問題点もあり、製造上に多くの制約がある。
血液にもとめるため、またＢ型肝炎ウィルスあるいは他
の血液由来のウィルスなどの感染性の因子を否定するた
めに、チンパンジーによる安全性唯認試験が必要である
ことなどの問題点もあり、製造上に多くの制約がある。
最近ＨＢｓ抗原をヒト血液によらず、組換えＤＮＡ技術
を用いて大腸菌に作らせることが提案されているが（例
えば特開昭５５−１０４８８７号）、大腸菌による場合
には、生じたＨ Ｂ ｓ抗原が大腸菌内で壊れ易いとか
そのＨＢｓ抗原によって大腸菌の増殖が困難であるなど
の欠点を有するためＨＢｓ抗原の産生量が低く、所望の
ＨＢ ｓ抗原の大量生産には、かならずしも適当でない
。
を用いて大腸菌に作らせることが提案されているが（例
えば特開昭５５−１０４８８７号）、大腸菌による場合
には、生じたＨ Ｂ ｓ抗原が大腸菌内で壊れ易いとか
そのＨＢｓ抗原によって大腸菌の増殖が困難であるなど
の欠点を有するためＨＢｓ抗原の産生量が低く、所望の
ＨＢ ｓ抗原の大量生産には、かならずしも適当でない
。
また、ごく最近において、酵母によるＨＢｓ抗原粒子の
産生に成功したことが報告されている〔Ｎａｔｕｒｅ、
２９８，３４７（１９８２））ｏ この文献によれば、
インターフェロンの酵母による産生に使用されているア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）のプロモーター
を利用し、大腸菌−酵母シャトルベクターの該ＡＤＨｌ
プロモーターの下流にＨＢ ｓ蛋白をコードする遺伝子
を接続する方法が採用されている。
産生に成功したことが報告されている〔Ｎａｔｕｒｅ、
２９８，３４７（１９８２））ｏ この文献によれば、
インターフェロンの酵母による産生に使用されているア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）のプロモーター
を利用し、大腸菌−酵母シャトルベクターの該ＡＤＨｌ
プロモーターの下流にＨＢ ｓ蛋白をコードする遺伝子
を接続する方法が採用されている。
また、宮之原らは（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、。
、Ｓｃｉ、。
ＵＳＡ、８０．１（１９８’３）および特願昭５７−１
４２４６０ 号〕、酵母の抑制性酸性ホスファターゼプ
ロモーターを利用し、大腸菌−酵母シャトルベクターの
該抑制性酸性ホスファターゼプロモーターの下流にＨＢ
ｓ抗原蛋白をコードする遺伝子を接続する方法を採用
している。
４２４６０ 号〕、酵母の抑制性酸性ホスファターゼプ
ロモーターを利用し、大腸菌−酵母シャトルベクターの
該抑制性酸性ホスファターゼプロモーターの下流にＨＢ
ｓ抗原蛋白をコードする遺伝子を接続する方法を採用
している。
本発明はこのような事情にもとづき、酵母によるＨＢｓ
抗原の工業的量産をはかるべく、ＨＢ ｓ抗原産生能を
有する形質転換酵母の培養、およびそれによるＨ Ｂ
ｓ抗原の効率の良い産生方法を提供するものである。
抗原の工業的量産をはかるべく、ＨＢ ｓ抗原産生能を
有する形質転換酵母の培養、およびそれによるＨ Ｂ
ｓ抗原の効率の良い産生方法を提供するものである。
発明の目的
本発明は、Ｂ型肝炎ウィルスの遺伝子を組込んだ組換え
プラスミドにより形質転換された酵母の培養方法、およ
びそれによるＨ Ｂ ｓ抗原の産生方法に関する。さら
に詳しくは、大腸菌および酵母の両方で増殖しつる、い
わゆるシャトルベクターを用い、そのベクターに担われ
た抑制性酸性ホスファターゼプロモーターの下流に、Ｈ
Ｂ ｓ抗原の遺伝子を組込んだ組換えプラスミドを得、
これを酵母に与え−Ｃｆ、質転換を起こさせて得られる
形質転換酵母の培養方法に関する。
プラスミドにより形質転換された酵母の培養方法、およ
びそれによるＨ Ｂ ｓ抗原の産生方法に関する。さら
に詳しくは、大腸菌および酵母の両方で増殖しつる、い
わゆるシャトルベクターを用い、そのベクターに担われ
た抑制性酸性ホスファターゼプロモーターの下流に、Ｈ
Ｂ ｓ抗原の遺伝子を組込んだ組換えプラスミドを得、
これを酵母に与え−Ｃｆ、質転換を起こさせて得られる
形質転換酵母の培養方法に関する。
この形質転換酵母を培養し、それによるＨ Ｂ ｓ抗原
を産生させるにあたって、いかにして産生効率を高め、
かつ安定して産生せしめるかについては、実用化のため
未解決の課題が多い。培地の選択および培養条件の選択
等により、ＨＢ ｓ抗原の産生に大きな影響をおよぼす
からである。たとえば培養条件として酵母菌の増殖に最
適な温度やｐＨ１溶存酸素量、ＨＢ ｓ抗原産生に最適
の温度やｐＨ等、多くの要素が考慮される必要がある。
を産生させるにあたって、いかにして産生効率を高め、
かつ安定して産生せしめるかについては、実用化のため
未解決の課題が多い。培地の選択および培養条件の選択
等により、ＨＢ ｓ抗原の産生に大きな影響をおよぼす
からである。たとえば培養条件として酵母菌の増殖に最
適な温度やｐＨ１溶存酸素量、ＨＢ ｓ抗原産生に最適
の温度やｐＨ等、多くの要素が考慮される必要がある。
本発明はこれら条件の解明をはかり究極的にはＨＢｓ抗
原の産生効率を高め、産生の安定化をはかり、組換えＤ
ＮＡ技術を利用した酵母によるＨ Ｂ ｓ抗原の産生を
工業的に応用可能とすることを目的としたものである。
原の産生効率を高め、産生の安定化をはかり、組換えＤ
ＮＡ技術を利用した酵母によるＨ Ｂ ｓ抗原の産生を
工業的に応用可能とすることを目的としたものである。
発明の構成および効果
本発明は、酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモータ
ーを担うプラスミドに当該プロモーターの制御下にＨＢ
Ｖの遺伝子を組込んだ組換えプラスミドにより形質転換
された酵母を培養しＨＢｓ抗原を産生させる方法におい
て、酵母エキス、無機アンモニウム塩、無機マグネシウ
ム塩、およびグルコースまたはサッカロースの一方また
は両方を含有する半合成培地を用いることを特徴とする
。
ーを担うプラスミドに当該プロモーターの制御下にＨＢ
Ｖの遺伝子を組込んだ組換えプラスミドにより形質転換
された酵母を培養しＨＢｓ抗原を産生させる方法におい
て、酵母エキス、無機アンモニウム塩、無機マグネシウ
ム塩、およびグルコースまたはサッカロースの一方また
は両方を含有する半合成培地を用いることを特徴とする
。
本発明における、酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロ
モーターを担うプラスミドをこ当該プロモーターの制御
下にＨＢＶの遺伝子を組込んだ組換えプラスミドにより
形質転換された評母は、特願＋＋７Ｊ ５７−１４２４
６０号に記載の方法にしたがって得られるものである。
モーターを担うプラスミドをこ当該プロモーターの制御
下にＨＢＶの遺伝子を組込んだ組換えプラスミドにより
形質転換された評母は、特願＋＋７Ｊ ５７−１４２４
６０号に記載の方法にしたがって得られるものである。
すなわち、２μプラスミドの増殖起点、酵母染色体の増
殖起点、酵母のロイシン産生遺伝子、大腸菌のアンピシ
リン耐生遺伝子、および酵母の抑制性酸性ホスファター
ゼプロモーター領域からなるシャトルベクターの、抑制
性酸性ホスファターゼプロモーター領域の下流にＨ１３
Ｖの遺伝子を組込んだシャトルベクターを、酵母ＣＡ１
１２２ （ａ 、 Ｉｅｕ２．ｈｉｓ４ 、Ｃａｎ１
、Ｃｉｒ＋）〕または［ＡＨ２２ｐｈｏＢ□（ａ、Ｉｅ
ｕ２．ｈｉｓ４゜Ｃａｎ１．Ｃｉｒ ） ’：）に導入
し形質転換して得られるものである。
殖起点、酵母のロイシン産生遺伝子、大腸菌のアンピシ
リン耐生遺伝子、および酵母の抑制性酸性ホスファター
ゼプロモーター領域からなるシャトルベクターの、抑制
性酸性ホスファターゼプロモーター領域の下流にＨ１３
Ｖの遺伝子を組込んだシャトルベクターを、酵母ＣＡ１
１２２ （ａ 、 Ｉｅｕ２．ｈｉｓ４ 、Ｃａｎ１
、Ｃｉｒ＋）〕または［ＡＨ２２ｐｈｏＢ□（ａ、Ｉｅ
ｕ２．ｈｉｓ４゜Ｃａｎ１．Ｃｉｒ ） ’：）に導入
し形質転換して得られるものである。
本発明における半合成培地による上記形質転換酵母の培
養は、形質転換酵母を、２０μｇ／ｍｌヒスチジンを含
む合成培地（バルクホルダーミニマムメディウム）にて
種培養を行った後、本培養により酵母の増殖、およびＨ
Ｂ ｓ抗原の産生を行わせるものである。この本培養を
上記合成培地で実施するには次のような問題点があり適
当てはない。
養は、形質転換酵母を、２０μｇ／ｍｌヒスチジンを含
む合成培地（バルクホルダーミニマムメディウム）にて
種培養を行った後、本培養により酵母の増殖、およびＨ
Ｂ ｓ抗原の産生を行わせるものである。この本培養を
上記合成培地で実施するには次のような問題点があり適
当てはない。
すなわち、
（１）合成培地中では酵母の増殖かおそく、（定常期に
達するまで約７２時間を要す）菌の増殖量も小さい（定
常期における生菌数２〜３×１０７／′培養液１ｍ１）
。この結果ＨＢ ｓ抗原の産生量が少い（培養液１ ｍ
ｌあたり０２〜０．３μｇ）。
達するまで約７２時間を要す）菌の増殖量も小さい（定
常期における生菌数２〜３×１０７／′培養液１ｍ１）
。この結果ＨＢ ｓ抗原の産生量が少い（培養液１ ｍ
ｌあたり０２〜０．３μｇ）。
（２）菌の増殖速度、増殖量を増加するには培地成分中
のリン含量の増加が効果的であるか、酵母ＡＨ２２の形
質転換体の場合、リン存在下では抑制性酸性ホスファタ
ーゼプロモーターか作動せず、ＨＢｓ抗原か産生されな
い、したかって培養中期以後でリンを含まぬ合成培地に
切り替える必要がある。また、酵母Ａ Ｈ２２ｐｈｏ８
Ｑの形質転換体の場合、リンの存在下でもプロモーター
は作動するが、無リン培地に比して、ＨＢ ｓ抗原の産
生量は少い。（Ｍｉ ｙａｎｏｈａｒａ、ｅｃ ａｌ、
、 Ｐｒｏｃ ５Ｎａｔｌ、 ＡｃａｄＳＳｃｉ 、Ｕ
ＳＡ 。
のリン含量の増加が効果的であるか、酵母ＡＨ２２の形
質転換体の場合、リン存在下では抑制性酸性ホスファタ
ーゼプロモーターか作動せず、ＨＢｓ抗原か産生されな
い、したかって培養中期以後でリンを含まぬ合成培地に
切り替える必要がある。また、酵母Ａ Ｈ２２ｐｈｏ８
Ｑの形質転換体の場合、リンの存在下でもプロモーター
は作動するが、無リン培地に比して、ＨＢ ｓ抗原の産
生量は少い。（Ｍｉ ｙａｎｏｈａｒａ、ｅｃ ａｌ、
、 Ｐｒｏｃ ５Ｎａｔｌ、 ＡｃａｄＳＳｃｉ 、Ｕ
ＳＡ 。
８０．１ 、（１９８３））
などの欠点がある。
本発明方法における半合成培地には、酵母エキス、無機
アンモニウム塩、無機マグネシウム塩、およびグルコー
スまたはサッカロースの一方あるいは両方が含有され、
さらに好ましくはこれに添加剤として、プロリンおよび
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル系界
面活性剤を添加する。これらのうちで、無機アンモニウ
ム塩としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等
が適当てあり、無機マグネシウム塩としては、硫酸マグ
ネシウム、塩化マグネシウム等が適当である。また、ポ
リオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル系界面
活性剤は、プルロニック（旭電化社製）等、種々のもの
が市販されており、これらか利用可能である。
アンモニウム塩、無機マグネシウム塩、およびグルコー
スまたはサッカロースの一方あるいは両方が含有され、
さらに好ましくはこれに添加剤として、プロリンおよび
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル系界
面活性剤を添加する。これらのうちで、無機アンモニウ
ム塩としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等
が適当てあり、無機マグネシウム塩としては、硫酸マグ
ネシウム、塩化マグネシウム等が適当である。また、ポ
リオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル系界面
活性剤は、プルロニック（旭電化社製）等、種々のもの
が市販されており、これらか利用可能である。
半合成培地組成物の好ましい濃度としては、酵母エキス
０．３〜１．０ ’Ｗ／Ｖ％、アンモニウム塩０．５〜
１．０Ｗ／Ｖ％、マグネシウム塩００１〜ＯＩＷ／Ｖ％
、サッカロースおよび／またはグルコース２〜４Ｗ／Ｖ
％、プロリン０．０１〜０．１ ＨＱ ／ ｍｌ、界面
活性剤５〜１０ ｐｐｍである。
０．３〜１．０ ’Ｗ／Ｖ％、アンモニウム塩０．５〜
１．０Ｗ／Ｖ％、マグネシウム塩００１〜ＯＩＷ／Ｖ％
、サッカロースおよび／またはグルコース２〜４Ｗ／Ｖ
％、プロリン０．０１〜０．１ ＨＱ ／ ｍｌ、界面
活性剤５〜１０ ｐｐｍである。
この半合成培地には、酵母エキスが適量含まれるため、
その栄養分、リンの存在により酵母の増殖速度が大で、
約２４時間で定常期に達し、その増殖量は約１ｘｌＯ”
と合成培地に比しきわめて大きい。また酵母エキスの量
か適量に調整されるため、対数増殖期においてリンが消
費され、結果的に無リンに近い状態となる。かくして酵
母Ａ Ｉ（２２ｐｈｏ８０の形質転換体の場合はもちろ
ん、酵母ＡＨ２２の形質転換体の場合も抑制性酸性ホス
ファターゼプロモーターが作動し、ＨＢ ｓ抗原の産生
量が有効に増大する。
その栄養分、リンの存在により酵母の増殖速度が大で、
約２４時間で定常期に達し、その増殖量は約１ｘｌＯ”
と合成培地に比しきわめて大きい。また酵母エキスの量
か適量に調整されるため、対数増殖期においてリンが消
費され、結果的に無リンに近い状態となる。かくして酵
母Ａ Ｉ（２２ｐｈｏ８０の形質転換体の場合はもちろ
ん、酵母ＡＨ２２の形質転換体の場合も抑制性酸性ホス
ファターゼプロモーターが作動し、ＨＢ ｓ抗原の産生
量が有効に増大する。
また、アンモニウム塩、マグネシウム塩、糖類（グルコ
ースおよび／またはサッカロース）は本形質転換酵母の
増殖およびＨＢ ｓ抗原産生形質の発現にとって必須成
分であって、これらのうちどの一つが欠けても菌の増殖
および形質の発現が極端に阻害され、一方これらの添加
量の適切な調整によって、ＨＢｓ抗原の産生がいちじる
しく増大される。また、プロリンおよび界面活性剤は必
須成分ではないが、その添加によりＨＢ ｓ抗原の産生
量がきわめて増大される。
ースおよび／またはサッカロース）は本形質転換酵母の
増殖およびＨＢ ｓ抗原産生形質の発現にとって必須成
分であって、これらのうちどの一つが欠けても菌の増殖
および形質の発現が極端に阻害され、一方これらの添加
量の適切な調整によって、ＨＢｓ抗原の産生がいちじる
しく増大される。また、プロリンおよび界面活性剤は必
須成分ではないが、その添加によりＨＢ ｓ抗原の産生
量がきわめて増大される。
なお本発明における半合成培地に対する酵母エキスの添
加量は、その量か多すぎるとリン過剰となりＨＢ ｓ抗
原の産生が低下するほか、酵母エキス中のロイシンの影
響により、ロイシン産生マーカーをもつ組換えプラスミ
ドが酵母から脱落する。したかつて無制限に酵母エキス
を用い得るものではない。
加量は、その量か多すぎるとリン過剰となりＨＢ ｓ抗
原の産生が低下するほか、酵母エキス中のロイシンの影
響により、ロイシン産生マーカーをもつ組換えプラスミ
ドが酵母から脱落する。したかつて無制限に酵母エキス
を用い得るものではない。
また、本発明の半合成培地に一般的合成培地にみられる
他の栄養分を加えて培養を行うことも可能であるか、Ｈ
Ｂ ｓ量の増大にはつながらず経済的でないはかりか、
場合によっては酵母の遺伝子の他の形質発現が強められ
、結果的にＨＢｓ抗原の産生量が減少することがある。
他の栄養分を加えて培養を行うことも可能であるか、Ｈ
Ｂ ｓ量の増大にはつながらず経済的でないはかりか、
場合によっては酵母の遺伝子の他の形質発現が強められ
、結果的にＨＢｓ抗原の産生量が減少することがある。
本発明において、ＨＢ ｓ抗原産生能を有する形質転換
酵母の培養によるＨ Ｂ ｓ抗原の効率的な産生方法の
さらにもう一つの特徴は、菌の対数増殖期前期において
培養温度を２５〜３０℃、培地のｐＨを４〜５．５、溶
存酸素量２〜５ ＰＰｍに保持し、また対数増殖期中期
以後においては培養温度を２０〜２４℃、培地のｐＨを
６．０〜７．０、溶存酸素量を２〜５ ＰＰｍに保持す
ることである。
酵母の培養によるＨ Ｂ ｓ抗原の効率的な産生方法の
さらにもう一つの特徴は、菌の対数増殖期前期において
培養温度を２５〜３０℃、培地のｐＨを４〜５．５、溶
存酸素量２〜５ ＰＰｍに保持し、また対数増殖期中期
以後においては培養温度を２０〜２４℃、培地のｐＨを
６．０〜７．０、溶存酸素量を２〜５ ＰＰｍに保持す
ることである。
これらの最適範囲は、種々の実験を繰返して確認した結
果であるが、培養温度につぃて述べると、菌の増殖量が
最も大きい値を示す温度は２７〜２８℃付近であり、一
方ＨＢ ｓ抗原の産生量が最も大きいのは、２２〜２４
℃における培養時であり、菌の増殖とＨＢ ｓ抗原産生
の形質発現に適する温度は一致しない。また培養時のｐ
Ｈについても、菌の増殖量が最も大きい値を示すｐＨは
４．５〜５．５付近であるが、ＨＢ ｓ抗原の産生量が
大きいのはｐｉ−１６，０〜６．５付近にあり、ここで
も菌の増殖とＨＢ ｓ抗原産生の形質発現に適するｐＨ
か一致しないことが知られるに至った。
果であるが、培養温度につぃて述べると、菌の増殖量が
最も大きい値を示す温度は２７〜２８℃付近であり、一
方ＨＢ ｓ抗原の産生量が最も大きいのは、２２〜２４
℃における培養時であり、菌の増殖とＨＢ ｓ抗原産生
の形質発現に適する温度は一致しない。また培養時のｐ
Ｈについても、菌の増殖量が最も大きい値を示すｐＨは
４．５〜５．５付近であるが、ＨＢ ｓ抗原の産生量が
大きいのはｐｉ−１６，０〜６．５付近にあり、ここで
も菌の増殖とＨＢ ｓ抗原産生の形質発現に適するｐＨ
か一致しないことが知られるに至った。
そこで、本発明方法に示されたごとく、菌の対数増殖期
前期と、中期以後において培養温度とｐＨ条件を変える
ことか、菌の増殖もすぐれ、さらに増殖された菌がＨＢ
ｓ抗原の産生にすぐれた効果を示すこととなる。これら
は以上の実験結果から得られた知見にもとつくものであ
る。なお溶存酸素量については、菌の増殖とＨＢｓ抗原
の産生のいずれに対しても最適な範囲が２〜５ ＰＰｍ
であることを確認した。
前期と、中期以後において培養温度とｐＨ条件を変える
ことか、菌の増殖もすぐれ、さらに増殖された菌がＨＢ
ｓ抗原の産生にすぐれた効果を示すこととなる。これら
は以上の実験結果から得られた知見にもとつくものであ
る。なお溶存酸素量については、菌の増殖とＨＢｓ抗原
の産生のいずれに対しても最適な範囲が２〜５ ＰＰｍ
であることを確認した。
以上説明したように、本発明によれば、酵母の抑制性酸
性ホスファターゼプロモーターを担うプラスミドに当該
プロモーターの制御下にＨＢＶウィルスの遺伝子を組込
んだ組換えプラスミドにより形質転換された酵母を培養
し、ＨＢｓ抗原を産生させるにあたり、酵母エキス、無
機アンモニウム塩、無機マグネシウム塩および糖類（グ
ルコースおよび／またはサッカロース）を含有する半合
成培地を用いることにより、当該形質転換酵母によるＨ
Ｂ ｓ抗原の産生をきわめて効率的に行なわせること
ができ、さら（ここの合成培地は、安価で調製容易であ
り、かつ加熱滅菌処理等に対しても安定であり、これら
の点からも、本発明方法は、工業的実施において非常に
有利である。また本発明によれば、形質転換酵母の増殖
と、ＨＢ ｓ抗原産生の形質発現とに対応した培養条件
の適切な設定により、上記半合成培地の使用の効果とあ
いまって、ＨＢｓ抗原の産生量が培養液１ｍｌ！あたり
０．５〜０．７μｌというきわめて高い値に達し、酵母
によるＨ Ｂ ｓ抗原の産生、およびこのＨＢｓ抗原に
よるＢ全肝炎ワクチンの製造を工業的に実施可能となら
しめるに、本発明の完成はきわめて大きく寄与するもの
である。
性ホスファターゼプロモーターを担うプラスミドに当該
プロモーターの制御下にＨＢＶウィルスの遺伝子を組込
んだ組換えプラスミドにより形質転換された酵母を培養
し、ＨＢｓ抗原を産生させるにあたり、酵母エキス、無
機アンモニウム塩、無機マグネシウム塩および糖類（グ
ルコースおよび／またはサッカロース）を含有する半合
成培地を用いることにより、当該形質転換酵母によるＨ
Ｂ ｓ抗原の産生をきわめて効率的に行なわせること
ができ、さら（ここの合成培地は、安価で調製容易であ
り、かつ加熱滅菌処理等に対しても安定であり、これら
の点からも、本発明方法は、工業的実施において非常に
有利である。また本発明によれば、形質転換酵母の増殖
と、ＨＢ ｓ抗原産生の形質発現とに対応した培養条件
の適切な設定により、上記半合成培地の使用の効果とあ
いまって、ＨＢｓ抗原の産生量が培養液１ｍｌ！あたり
０．５〜０．７μｌというきわめて高い値に達し、酵母
によるＨ Ｂ ｓ抗原の産生、およびこのＨＢｓ抗原に
よるＢ全肝炎ワクチンの製造を工業的に実施可能となら
しめるに、本発明の完成はきわめて大きく寄与するもの
である。
以下、参煮例および実施例をもって本発明をさらに具体
的に説明する。
的に説明する。
参考例１
宮之原らの方法（特願昭５７−１４２４６０号）に従い
、ＨＢｓ抗原の産生能を有する形質転換酵母を調製する
。
、ＨＢｓ抗原の産生能を有する形質転換酵母を調製する
。
（１）ＨＢＶＤＮＡの調製
（Ｉ）ウィルスＤＮＡの調製
ＨＢ ｓ抗原陽性かつＨＢｅ抗原陽性の供血者（血清型
ａｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７００耐をｓ
、ｏ ｏ ｏ ｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を
除去する。これを４℃にてｉｓ、ｏｏｏ ｒｐｍで８時
間遠心分離し、得られた沈査を緩衝液（１０ｍＭ ト
リ ス −ＨＣｌ 、０．１ ＭＮａＣｊＪ 、 １ｍ
ＭＥＤ” Ａ ； ｐＨ７，５） １０ ｍｌに再溶解
させ、３０％の蔗糖を含有する遠沈管の頂部に重層させ
る。これを４℃にて３９．００Ｏｒｐｍで４時間遠心分
離し、得られた沈査を上記と同じ緩衝液に再溶解させる
。
ａｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７００耐をｓ
、ｏ ｏ ｏ ｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を
除去する。これを４℃にてｉｓ、ｏｏｏ ｒｐｍで８時
間遠心分離し、得られた沈査を緩衝液（１０ｍＭ ト
リ ス −ＨＣｌ 、０．１ ＭＮａＣｊＪ 、 １ｍ
ＭＥＤ” Ａ ； ｐＨ７，５） １０ ｍｌに再溶解
させ、３０％の蔗糖を含有する遠沈管の頂部に重層させ
る。これを４℃にて３９．００Ｏｒｐｍで４時間遠心分
離し、得られた沈査を上記と同じ緩衝液に再溶解させる
。
ついで、ＨＢＶのもつＤＮＡポリメラーゼによる反応を
、６７ｍＭ１−リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、８０ｒｎ
Ｍ ＮＨＣ１，２５ｒｎ Ｍ Ｍｇ Ｃ１２，０，５
Ｍ（Ｗ／Ｖ％、以下同じ）タージトールＮＰ−４９，０
，１％２−メルカプトエタノール、３３０μＭのｄＣＩ
’Ｐ（デオキシシチジントリホスフェート）、ｄＧＴＰ
（デオキシグアノシントリホスフェート）、ｄＡＴＰ（
デオキシアデノシントリホスフェート）、０．５ｔｔ
Ｍａ −〔３２Ｐ） ｄ ＴＴ Ｐ （デオキシチミジ
ントリホスフェート）の混合液５００μｎ 中テ３７℃
にて３０分間行なう。これにさらにｄＴＴＰを最終濃度
３３０μＭになるように加え、３７℃で３時間反応させ
、これに同容量の１００ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ溶液を加え
る。このＤＮＡポリメラーゼ反応により、ＤＮＡ中の一
本鎖部分が修複され、Ｃ３２Ｐ ）ラベル化された材料
を得、これを蔗糖の３０％、２０％および１０％水溶液
を段階的に重層した遠心管の頂部に重層し、４℃にて３
９．００Ｏｒｐｍで４．５時間遠心分離する。
、６７ｍＭ１−リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、８０ｒｎ
Ｍ ＮＨＣ１，２５ｒｎ Ｍ Ｍｇ Ｃ１２，０，５
Ｍ（Ｗ／Ｖ％、以下同じ）タージトールＮＰ−４９，０
，１％２−メルカプトエタノール、３３０μＭのｄＣＩ
’Ｐ（デオキシシチジントリホスフェート）、ｄＧＴＰ
（デオキシグアノシントリホスフェート）、ｄＡＴＰ（
デオキシアデノシントリホスフェート）、０．５ｔｔ
Ｍａ −〔３２Ｐ） ｄ ＴＴ Ｐ （デオキシチミジ
ントリホスフェート）の混合液５００μｎ 中テ３７℃
にて３０分間行なう。これにさらにｄＴＴＰを最終濃度
３３０μＭになるように加え、３７℃で３時間反応させ
、これに同容量の１００ ｍ Ｍ ＥＤＴＡ溶液を加え
る。このＤＮＡポリメラーゼ反応により、ＤＮＡ中の一
本鎖部分が修複され、Ｃ３２Ｐ ）ラベル化された材料
を得、これを蔗糖の３０％、２０％および１０％水溶液
を段階的に重層した遠心管の頂部に重層し、４℃にて３
９．００Ｏｒｐｍで４．５時間遠心分離する。
ついでＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られた沈査を１〜／ ｗｅプロナーゼＥお
よび０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００μ
ｌ中で３７℃にて２時間処理したのち、ＤＮＡをフェノ
ール２００μβで２回抽出し、ついでエーテルで振って
フェノール溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る。
に、上記で得られた沈査を１〜／ ｗｅプロナーゼＥお
よび０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００μ
ｌ中で３７℃にて２時間処理したのち、ＤＮＡをフェノ
ール２００μβで２回抽出し、ついでエーテルで振って
フェノール溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る。
このＤＮＡは２、５Ｘ １０６ｃｐｍ／μｇの比放射活
性を示し、制限酵素消化に充分使用し得る。
性を示し、制限酵素消化に充分使用し得る。
（６）ＨＢＶＤＮＡのクローン化
前記の方法で調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、
下記のようにしてまずλフアージシャロン１５ＡＤＮＡ
をベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラスミ
ドｐＡＣＹＣ１７７をベクターとして再クローン化を行
なう。
下記のようにしてまずλフアージシャロン１５ＡＤＮＡ
をベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラスミ
ドｐＡＣＹＣ１７７をベクターとして再クローン化を行
なう。
（５）λフアージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系によ
るクローン化： ＨＢＶＤＮＡ ２ Ｑｎ ｇ を １０ ｍＭ ト リ
７． −ＨＣｌ（ｐＨ７，４）、７ ｒｎ Ｍ Ｍ
ｇ Ｃ１２，１００ｔｎ Ｍ ＮａＣ１７ｍＭ２−メル
カプトエタノールの混液２０μβ中にて制限エンドヌク
レアーゼＸｈＯ工により３７℃にて２時間処理したのち
、フェノール２０μβにて抽出し、ついでエーテル抽出
後、その水層に２倍容量の冷エタノールを加えてＤＮＡ
を沈殿させる。この混液を一７０８Ｃで１時間保持した
のち１０．００Ｏｒｐｍにて５分間遠心分離して沈殿す
るＤＮＡを回収する。分離した沈査を１０ｍＭトリス−
ＨＣｎ（ＰＨ７，４）および１ｍＭＥＤ−１”Ａの混液
５μｅに溶解させる。ついて、このＨＢＶＤＮＡと等モ
ル量の前記と同様にして制限酵素ＸｈｏＪにより開裂さ
れたλフアージシャロン１６ＡＤＮＡ（Ｘ ｈｏ Ｉ
認識部位を１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ〔５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，４）、Ｉ Ｑ ｒｎ
Ｍ Ｍ ｇ Ｃｊｌｉ ２、ｌＱｍＭジチオスレイト
ール、１００μｇ鷹牛血清アルブミン、０．５ ｍ Ｍ
ＡＴＰおよび０．５μｌ酵素調製物との混液〕１０μｌ
を用いて４℃で１８時間反応させ、この反応混合液を前
記と同様にしてフェノール抽出、エーテル処理およびエ
タノール沈殿に付し、得られた沈査を１０ｍＭ１−リス
ＨＣ，［（ｐＨ７，４） および１ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ混液１０μβ中に溶解させる。
るクローン化： ＨＢＶＤＮＡ ２ Ｑｎ ｇ を １０ ｍＭ ト リ
７． −ＨＣｌ（ｐＨ７，４）、７ ｒｎ Ｍ Ｍ
ｇ Ｃ１２，１００ｔｎ Ｍ ＮａＣ１７ｍＭ２−メル
カプトエタノールの混液２０μβ中にて制限エンドヌク
レアーゼＸｈＯ工により３７℃にて２時間処理したのち
、フェノール２０μβにて抽出し、ついでエーテル抽出
後、その水層に２倍容量の冷エタノールを加えてＤＮＡ
を沈殿させる。この混液を一７０８Ｃで１時間保持した
のち１０．００Ｏｒｐｍにて５分間遠心分離して沈殿す
るＤＮＡを回収する。分離した沈査を１０ｍＭトリス−
ＨＣｎ（ＰＨ７，４）および１ｍＭＥＤ−１”Ａの混液
５μｅに溶解させる。ついて、このＨＢＶＤＮＡと等モ
ル量の前記と同様にして制限酵素ＸｈｏＪにより開裂さ
れたλフアージシャロン１６ＡＤＮＡ（Ｘ ｈｏ Ｉ
認識部位を１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ〔５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７，４）、Ｉ Ｑ ｒｎ
Ｍ Ｍ ｇ Ｃｊｌｉ ２、ｌＱｍＭジチオスレイト
ール、１００μｇ鷹牛血清アルブミン、０．５ ｍ Ｍ
ＡＴＰおよび０．５μｌ酵素調製物との混液〕１０μｌ
を用いて４℃で１８時間反応させ、この反応混合液を前
記と同様にしてフェノール抽出、エーテル処理およびエ
タノール沈殿に付し、得られた沈査を１０ｍＭ１−リス
ＨＣ，［（ｐＨ７，４） および１ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ
Ａ混液１０μβ中に溶解させる。
上記のようにしてアニールさせたＤＮＡより、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、６３巻、２９９〜３０９を参照
）によりλファージを形成させ、さらに大腸菌ＤＰ５
Ｑ Ｓｕｐ Ｆを指示歯としてＬ−寒天平板（２３ａｎ
×２３ＣｒＲ）上に〜１０４個のプラークを形成させる
。これらプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持してい
るファージにより形成されたプラークを選び出すために
、前記で調製した３２ｐ−ラベルされたＨＢＶ ＤＮＡ
をプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行
なイ（５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０頁、１９７７
を参照）、目的とするファージを複数分離する。
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、６３巻、２９９〜３０９を参照
）によりλファージを形成させ、さらに大腸菌ＤＰ５
Ｑ Ｓｕｐ Ｆを指示歯としてＬ−寒天平板（２３ａｎ
×２３ＣｒＲ）上に〜１０４個のプラークを形成させる
。これらプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持してい
るファージにより形成されたプラークを選び出すために
、前記で調製した３２ｐ−ラベルされたＨＢＶ ＤＮＡ
をプローブとしてプラークハイブリダイゼーションを行
なイ（５ｃｉｅｎｃｅ、１９６巻、１８０頁、１９７７
を参照）、目的とするファージを複数分離する。
ｕ３）プラスミドｐＡｃＹｃ１７７をベクターとした再
クローン化： 上記（５）で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージ
について「生化学実験講座、核酸の化学■」５４〜６５
頁に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５Ｑ−８ｕｐＦ
を感染菌としてファージＤＮＡを調整する。得られたＤ
ＮＡを前記の制限酵素Ｘｌｌ０Ｉの反応条件下で２時間
消化したのち、この反応液を０．７５％アカロースゲル
電気泳動にかけ、分離した３、 ２１ｃｂのＨＢＶＤＮ
ＡをＤＥＡＥ紙（東洋戸紙製）に吸着させてベクターＤ
ＮＡと分離し、ついで１ＭＮａＣβ溶液にて溶出し、両
端がＸｈｏ工末端末端ったＨＢＶＤＮＡを得る。
クローン化： 上記（５）で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージ
について「生化学実験講座、核酸の化学■」５４〜６５
頁に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５Ｑ−８ｕｐＦ
を感染菌としてファージＤＮＡを調整する。得られたＤ
ＮＡを前記の制限酵素Ｘｌｌ０Ｉの反応条件下で２時間
消化したのち、この反応液を０．７５％アカロースゲル
電気泳動にかけ、分離した３、 ２１ｃｂのＨＢＶＤＮ
ＡをＤＥＡＥ紙（東洋戸紙製）に吸着させてベクターＤ
ＮＡと分離し、ついで１ＭＮａＣβ溶液にて溶出し、両
端がＸｈｏ工末端末端ったＨＢＶＤＮＡを得る。
つぎにブー）スミドｐＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ。
Ａ 、Ｃ，Ｙ−、Ｃｏｈｅｎ、 ＳＳＮ、、 Ｊ ５Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ 、。
ａｃｔｅｒｉｏｌ 、。
１３４．１１４１〜１１５６（１９７８）〕（このもの
はｘｈｏ ■切断部位を１個所有し、それはカナマイシ
ン耐性遺伝子の中に存在する）を同様にＸ ｈｏ）にて
消化し、その生成物をフェノール抽出、エーテル処理お
よびエタノール沈殿により精製する。
はｘｈｏ ■切断部位を１個所有し、それはカナマイシ
ン耐性遺伝子の中に存在する）を同様にＸ ｈｏ）にて
消化し、その生成物をフェノール抽出、エーテル処理お
よびエタノール沈殿により精製する。
ついで、Ｘｈｏｉ開裂されたｐＡｃＹｃ１７７とＸｈｏ
Ｉ末端−ＨＢＶＤＮＡとを分子比１：５て混合し、前記
Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＋）ガーゼの反応条件下に１８時
間アニールさせる。
Ｉ末端−ＨＢＶＤＮＡとを分子比１：５て混合し、前記
Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＋）ガーゼの反応条件下に１８時
間アニールさせる。
大腸菌Ｘ１７７．６の培養液を高木康敬編著「遺伝子操
作実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０
．１ ｍｌに、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μ
βを加えてよく混合させ、０℃で２５分間放置したのち
、アンピシリン（２０１１ｆ／ ／ ｍｅ ）、氏−ビ
オチン（１μ９７ｍ１）、ジアミノピメリン酸（１００
μ９７ｍ１）、チミン（２０μｆ／ ／ｍｌ ）を含有
するし一寒天プレート上に塗抹して３７℃で一夜培養す
る。出現したコロニーについて、カナマイシン（２０μ
９７ ｍｅ ）を含む寒天プレートとアンピシリン（２
０μＱ ／ ｍｅ ） を含む寒天プレートにそれぞれ
対応させて塗抹し、アンピシリンを含むプレートでのみ
増殖したコロニーを選択する。
作実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０
．１ ｍｌに、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μ
βを加えてよく混合させ、０℃で２５分間放置したのち
、アンピシリン（２０１１ｆ／ ／ ｍｅ ）、氏−ビ
オチン（１μ９７ｍ１）、ジアミノピメリン酸（１００
μ９７ｍ１）、チミン（２０μｆ／ ／ｍｌ ）を含有
するし一寒天プレート上に塗抹して３７℃で一夜培養す
る。出現したコロニーについて、カナマイシン（２０μ
９７ ｍｅ ）を含む寒天プレートとアンピシリン（２
０μＱ ／ ｍｅ ） を含む寒天プレートにそれぞれ
対応させて塗抹し、アンピシリンを含むプレートでのみ
増殖したコロニーを選択する。
得うれたコロニー数個について、「代謝」第１７巻、第
４「リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０）に記載され
る方法に従いプラスミドを調製する。
４「リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０）に記載され
る方法に従いプラスミドを調製する。
得られたプラスミドをｐ ＨＢ Ｖと称す。このｐＨＢ
Ｖを制限酵素Ｘｈｏ、Ｉで処理すると３．２ｘｂの全Ｈ
ＢＶＤＮＡフラグメントか得られ、またＸ ｈｏ Ｉと
ＢａｍＨｉで処理するとＨＢｓＡｇ遺伝子を含む約１，
３Ｋｂのフラグメントが得られる（第１図を参照）。
Ｖを制限酵素Ｘｈｏ、Ｉで処理すると３．２ｘｂの全Ｈ
ＢＶＤＮＡフラグメントか得られ、またＸ ｈｏ Ｉと
ＢａｍＨｉで処理するとＨＢｓＡｇ遺伝子を含む約１，
３Ｋｂのフラグメントが得られる（第１図を参照）。
（２）シャトルベクターｐ Ａ Ｍ ８１．８２．８３
、および８４の調製 酵母５２８８ＣＤＮＡ パンクより得られた抑制性酸性
ホスファターゼを構成する６０，０００ タｋ トンの
ポリペプチド（Ｐ２Ｏ）の遺伝子を含む約８０００ヌク
レオチド対（８Ｋｂ）の制限酵素ＥｃｏＲＩ断片を大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入して
得られるプラスミドを出発材料とし、これを制限酵素Ｓ
ａｌ工で切断し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼにより再ア
ニールさせてｐＢＲ３２２のＳａｌ Ｉ部位から酸性ホ
スファターゼ遺伝子断片の５、２ ｘｂ側を失なったプ
ラスミドｐＡＴ２５（これはｐＢＲ３２２のアンピシリ
ン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲ■部位からＳａｌ ■部位
までの約３．７ Ｋｌ）の断片と酵母菌の酸性ホスファ
ターゼ遺伝子のＥｃｏＲＪ部位からＳａｌ １部位まで
の約２．８ Ｋｂの断片かそれぞれ対応する末端同士で
結合したプラスミドである）を得る。 一 つぎに、このＰＡＴ２５のＥｃｏＲＩ部位に、プラスミ
ドＹＲＰ７をＥ ｃｏ Ｒ工処理することによって得ら
れるａｒｓ ｌおよびＴｒｐｌ遺伝子を含む１，４Ｋｂ
のＥ ｃｏ Ｒ工断片を挿入してプラスミドｐＡＴ２
６を得る（このａｒｓ ｌ −Ｔｒｐ ｌを含む断片は
、そのＴｒｐｌ遺伝子内に制限酵素１−１ｉｎｄ ］Ｉ
［の認識部位を１個有する）。
、および８４の調製 酵母５２８８ＣＤＮＡ パンクより得られた抑制性酸性
ホスファターゼを構成する６０，０００ タｋ トンの
ポリペプチド（Ｐ２Ｏ）の遺伝子を含む約８０００ヌク
レオチド対（８Ｋｂ）の制限酵素ＥｃｏＲＩ断片を大腸
菌プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入して
得られるプラスミドを出発材料とし、これを制限酵素Ｓ
ａｌ工で切断し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼにより再ア
ニールさせてｐＢＲ３２２のＳａｌ Ｉ部位から酸性ホ
スファターゼ遺伝子断片の５、２ ｘｂ側を失なったプ
ラスミドｐＡＴ２５（これはｐＢＲ３２２のアンピシリ
ン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲ■部位からＳａｌ ■部位
までの約３．７ Ｋｌ）の断片と酵母菌の酸性ホスファ
ターゼ遺伝子のＥｃｏＲＪ部位からＳａｌ １部位まで
の約２．８ Ｋｂの断片かそれぞれ対応する末端同士で
結合したプラスミドである）を得る。 一 つぎに、このＰＡＴ２５のＥｃｏＲＩ部位に、プラスミ
ドＹＲＰ７をＥ ｃｏ Ｒ工処理することによって得ら
れるａｒｓ ｌおよびＴｒｐｌ遺伝子を含む１，４Ｋｂ
のＥ ｃｏ Ｒ工断片を挿入してプラスミドｐＡＴ２
６を得る（このａｒｓ ｌ −Ｔｒｐ ｌを含む断片は
、そのＴｒｐｌ遺伝子内に制限酵素１−１ｉｎｄ ］Ｉ
［の認識部位を１個有する）。
上記ＰＡＴ２６のＨｉｎｄｌ［部位に、プラスミドｐＳ
ＬＥ １を出ｎｄ ｌ［で処理して得られる酵母のＬｅ
ｕ ２および２ ｐ ｏｒｉを含むＨｉｎｄ ＩＭ断片
を挿入してシャトルベクター ｐ Ａ Ｔ７７を得る。
ＬＥ １を出ｎｄ ｌ［で処理して得られる酵母のＬｅ
ｕ ２および２ ｐ ｏｒｉを含むＨｉｎｄ ＩＭ断片
を挿入してシャトルベクター ｐ Ａ Ｔ７７を得る。
このｐＡＴ７７をサツカロミセス・セレビシェＡｉ（２
２に組込んだもの（サツカロミセス・セレビシェＡＢ２
２／ｐＡＴ ７７ ）は微工研条寄第３２４号として寄
託している。
２に組込んだもの（サツカロミセス・セレビシェＡＢ２
２／ｐＡＴ ７７ ）は微工研条寄第３２４号として寄
託している。
上記の方法で得られたｐＡＴ７７（１μｇ）をＳａｌ工
テ開裂したのち、２０ｍ〜ｌトリスーＩ（ｃｌｐｉ−Ｉ
８．２ ）、１２ｍＭＣａＣｌ２．１２ｍＭＭｇＣβ
２．０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液５０ｐｌ
中で０、ＩＵのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を３０秒
〜１分間作用させる。ついでフェノール抽出、エタノー
ル沈殿を行なったのち、Ｘｈｏｉリンカー−１ｐｍｏｌ
とＴ４ＤＮＡリカーゼの反応条件下で１２時間結合を
行なう。この反応溶液で大腸菌Ｘ１７７６を形質転換し
、得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラスミ
ドＤＮＡを調製し、各ＤＮＡについてマキサムギルバー
トの方法（Ｍａｘａｍ、 Ａ。
テ開裂したのち、２０ｍ〜ｌトリスーＩ（ｃｌｐｉ−Ｉ
８．２ ）、１２ｍＭＣａＣｌ２．１２ｍＭＭｇＣβ
２．０．２ＭＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液５０ｐｌ
中で０、ＩＵのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を３０秒
〜１分間作用させる。ついでフェノール抽出、エタノー
ル沈殿を行なったのち、Ｘｈｏｉリンカー−１ｐｍｏｌ
とＴ４ＤＮＡリカーゼの反応条件下で１２時間結合を
行なう。この反応溶液で大腸菌Ｘ１７７６を形質転換し
、得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラスミ
ドＤＮＡを調製し、各ＤＮＡについてマキサムギルバー
トの方法（Ｍａｘａｍ、 Ａ。
＆ Ｇ１１ｂｅｒｔ、 Ｗ、 ； Ｐｒｏ、 Ｎ、Ａ、
Ｓ、、 ７４．５６０〜５６４を参照）に従い、塩基
配列を調べ、ＢＡＬ３１処理により除去された酸性ホス
ファターゼ遺伝子領域を決定する。これら中からホスフ
ァターゼ構造遺伝子領域が完全に除去されたプラスミド
ｐＡＭ８１、ＰＡＭ８２、ＰＡＭ８３およびｐＡＭ８４
を得る。
Ｓ、、 ７４．５６０〜５６４を参照）に従い、塩基
配列を調べ、ＢＡＬ３１処理により除去された酸性ホス
ファターゼ遺伝子領域を決定する。これら中からホスフ
ァターゼ構造遺伝子領域が完全に除去されたプラスミド
ｐＡＭ８１、ＰＡＭ８２、ＰＡＭ８３およびｐＡＭ８４
を得る。
ホスファターゼ構造遺伝子の産物Ｐ６０の最初のアミノ
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、ｐＡＭ８１は＋２まで、ＰＡＭ８２は−３３
まで、ｐ Ａ Ｍ ８３は−５０まで、ｐＡＭ３４は−
５１まで、それぞれ除去されたものである。なお、この
ＰＡＭ８２をサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２に組
込んだものは微工研条寄第３１３号として寄託している
。
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、ｐＡＭ８１は＋２まで、ＰＡＭ８２は−３３
まで、ｐ Ａ Ｍ ８３は−５０まで、ｐＡＭ３４は−
５１まで、それぞれ除去されたものである。なお、この
ＰＡＭ８２をサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２に組
込んだものは微工研条寄第３１３号として寄託している
。
（３Ｊ ＨＢ ｓ抗原遺伝子発現プラスミドの調製（１
）ＨＢｓ抗原遺伝子全体が組込まれたプラスミドの調製 プラスミドｐ ＨＢ ＶをＸｈｏＪで処理して得られる
ＨＢＶＤＮＡと、ＸｈｏＩで開裂されたシャトルベクタ
ーｐＡＭ８１、ＰＡＭ８２、ｐＡＭ８３ およびｐＡＭ
８４ のそれぞれを分子比５：１でＴ０ｎ Ｎ Ａ Ｉ
Ｊガーゼによりアニールさせたのち、この反応溶液で大
腸菌Ｘ １７７６を形質転換する。得られたアンピシリ
ン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、こ
れらについて制限酵素Ｘｈ。
）ＨＢｓ抗原遺伝子全体が組込まれたプラスミドの調製 プラスミドｐ ＨＢ ＶをＸｈｏＪで処理して得られる
ＨＢＶＤＮＡと、ＸｈｏＩで開裂されたシャトルベクタ
ーｐＡＭ８１、ＰＡＭ８２、ｐＡＭ８３ およびｐＡＭ
８４ のそれぞれを分子比５：１でＴ０ｎ Ｎ Ａ Ｉ
Ｊガーゼによりアニールさせたのち、この反応溶液で大
腸菌Ｘ １７７６を形質転換する。得られたアンピシリ
ン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、こ
れらについて制限酵素Ｘｈ。
工、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄｌｌＩテ分析することにより、
ベクターへのＨＢＶＤＮＡの組込みおよびその方向を確
認する。
ベクターへのＨＢＶＤＮＡの組込みおよびその方向を確
認する。
選び出されたプラスミドはベクターのホスファターゼプ
ロモーターの下流にＨＢＶ ＤＮＡがＨＢｓ遺伝子、Ｈ
Ｂｃ遺伝子の順に並ぶ向きに挿入されたものであり、こ
れらがＨＢｓ 抗原遺伝子発現プラスミドであって、シ
ャトルベクターｐＡＭ８１、ＰＡＭ８２、ｐＡＭ８３
およびｐＡＭ８４にＨＢＶＤＮＡを組込んだものをそれ
ぞれｐＡＨ２０１、ｐ Ａ Ｈ２Ｑ ３、ｐＡＨ２０５
およびｐＡＨ２０７と称する。
ロモーターの下流にＨＢＶ ＤＮＡがＨＢｓ遺伝子、Ｈ
Ｂｃ遺伝子の順に並ぶ向きに挿入されたものであり、こ
れらがＨＢｓ 抗原遺伝子発現プラスミドであって、シ
ャトルベクターｐＡＭ８１、ＰＡＭ８２、ｐＡＭ８３
およびｐＡＭ８４にＨＢＶＤＮＡを組込んだものをそれ
ぞれｐＡＨ２０１、ｐ Ａ Ｈ２Ｑ ３、ｐＡＨ２０５
およびｐＡＨ２０７と称する。
（３）ＨＢｓ 抗原遺伝子フラグメントが組込まれたプ
ラスミドの調製 プラスミドｐ ＨＢ ＶをＢａｍＨ■で処理して切断し
、その１（Ｂｓ 抗原遺伝子フラグメント３μｍに対し
、２００μＭのαＡＴＬ）１ αｃ −ｒ ｐ 、α−
ｒ −ｒ ｐおよびａ Ｇ Ｔ Ｐを含む６７ ｍＭ
トリス−ＨＣｌ （ｐＨ８，６）、６．７ ｍ Ｍ Ｍ
ｇＣｇ２．１０ ｍＭ２−メルカプトエタノール、５．
７ ｐＭ Ｅ ＤＴＡ、 １６．７ｍＭＡ ｒｎ Ｓ
Ｏ，ｉ溶液１００ ｔｔｌ 中で、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ０．２Ｕを３０分間作用させ、ＢａｍＨ■切断末端
を埋める。ついてフェノール抽出、エタノール沈殿を行
なったのち、これとＸｈｏＩＩＪンカーとを１：１０の
分子比でＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼによる結合反
応を行なう。フェノール抽出、エタノール沈殿ののち、
これをさらにＸｈｏＩで処理すると両端がＸｈＯ■切断
末端となった約１，３ＫｂのＨＢｓ抗原遺伝子フラグメ
ントが得られる。このフラグメントとＸｈｏＩで開裂さ
れたシャトルベクターＰＡＭ８２とを分子比５：１にて
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりアニールさせたのち、前記（
１）′と同様にして大腸菌Ｘ １７７６を形質転換して
プラスミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミドは、
ベクターｐＡＭ８２のホスファターゼプロモーターの下
流にＨＢｓ抗原遺伝子が正しい向きに挿入されたもので
あり、これをＰＡＳ １０１と称する。
ラスミドの調製 プラスミドｐ ＨＢ ＶをＢａｍＨ■で処理して切断し
、その１（Ｂｓ 抗原遺伝子フラグメント３μｍに対し
、２００μＭのαＡＴＬ）１ αｃ −ｒ ｐ 、α−
ｒ −ｒ ｐおよびａ Ｇ Ｔ Ｐを含む６７ ｍＭ
トリス−ＨＣｌ （ｐＨ８，６）、６．７ ｍ Ｍ Ｍ
ｇＣｇ２．１０ ｍＭ２−メルカプトエタノール、５．
７ ｐＭ Ｅ ＤＴＡ、 １６．７ｍＭＡ ｒｎ Ｓ
Ｏ，ｉ溶液１００ ｔｔｌ 中で、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ０．２Ｕを３０分間作用させ、ＢａｍＨ■切断末端
を埋める。ついてフェノール抽出、エタノール沈殿を行
なったのち、これとＸｈｏＩＩＪンカーとを１：１０の
分子比でＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼによる結合反
応を行なう。フェノール抽出、エタノール沈殿ののち、
これをさらにＸｈｏＩで処理すると両端がＸｈＯ■切断
末端となった約１，３ＫｂのＨＢｓ抗原遺伝子フラグメ
ントが得られる。このフラグメントとＸｈｏＩで開裂さ
れたシャトルベクターＰＡＭ８２とを分子比５：１にて
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりアニールさせたのち、前記（
１）′と同様にして大腸菌Ｘ １７７６を形質転換して
プラスミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミドは、
ベクターｐＡＭ８２のホスファターゼプロモーターの下
流にＨＢｓ抗原遺伝子が正しい向きに挿入されたもので
あり、これをＰＡＳ １０１と称する。
（４）形質転換酵母の調製
酵母としてサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２［ａｌ
ｅｕ２、ｈｉｓ ４ Ｃａｎ ｌ （Ｃｉｒ＋） ）
（微工研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（
２％ポリペプトン、１％イーストエキス、２％グルコー
ス）ＩＱＱｍ／に接紬し、３０℃で一晩培養したのち、
遠心して集菌する。滅菌水２０ゴにて菌体を洗浄し、つ
いで１．２Ｍンルビトールおよび１００μ９／ｒｄチモ
リアーゼ６０，０００ （生化学工業製）の溶液５ｍｌ
に懸濁させ、３０℃で約３０分間保ち、スフェロプラス
ト化スる。ついで、スフエロフラス） ヲ１．２ Ｍソ
ルビトール溶液で３回洗浄したのち、２Ｍ７／ｌ、ビ）
−ル、１０ｍＭＣａＣβ２および１０ｍＭトリＸ−ＨＣ
／（ｐＨ７，５）の溶液０．６ ｍｅ ｉこ＠濁させ、
その６０μβずつを小試験管に分注する。これに前記（
３）で調製した組換えプラスミドｐＡＨ２０３溶液３０
μβを加え、充分混合し、さらに０、１ Ｍ ｃａｃｎ
２ （３ｔ４１）加えて最終濃度１０ｍＭＣａＣ１゜と
し、室温に５〜１０分間放置する。ついでこれに、２０
％ポリエチレングリコール４０００．１０ ｍ’Ｍ Ｃ
ａ（Ｊ２および１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）
溶液１麻ずつを加えて混合し、室温に２０分間放置する
。この混合液０．２ ｄずつを４５℃に保温された再生
培地（２２襲ンルビトール、２％グルコース、０．７％
イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％ｙ Ｐ Ｄ、
２０ｓ／ｍｅヒスチジン、３悸寒天）１０＋＋＋／に加
え、軽く混合させ、予め準備された１、２Ｍンルビトー
ル含有最小培地（０，７％イーストニトロゲンベースア
ミノ酸、２％クルコース、２０μｐ／ｍｌヒスチジン、
２％寒天）プレートに重層し、固化させたのち、３０℃
で培養してロイシン非要求性酵母のコロニーを得る。こ
のコロニーを２０μ９７ｍｅヒスチジンを含むバルクホ
ルダーミニマムメディウムＣＴｏｈｅ、ＡＳｅｔ ａｌ
； Ｊ。
ｅｕ２、ｈｉｓ ４ Ｃａｎ ｌ （Ｃｉｒ＋） ）
（微工研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（
２％ポリペプトン、１％イーストエキス、２％グルコー
ス）ＩＱＱｍ／に接紬し、３０℃で一晩培養したのち、
遠心して集菌する。滅菌水２０ゴにて菌体を洗浄し、つ
いで１．２Ｍンルビトールおよび１００μ９／ｒｄチモ
リアーゼ６０，０００ （生化学工業製）の溶液５ｍｌ
に懸濁させ、３０℃で約３０分間保ち、スフェロプラス
ト化スる。ついで、スフエロフラス） ヲ１．２ Ｍソ
ルビトール溶液で３回洗浄したのち、２Ｍ７／ｌ、ビ）
−ル、１０ｍＭＣａＣβ２および１０ｍＭトリＸ−ＨＣ
／（ｐＨ７，５）の溶液０．６ ｍｅ ｉこ＠濁させ、
その６０μβずつを小試験管に分注する。これに前記（
３）で調製した組換えプラスミドｐＡＨ２０３溶液３０
μβを加え、充分混合し、さらに０、１ Ｍ ｃａｃｎ
２ （３ｔ４１）加えて最終濃度１０ｍＭＣａＣ１゜と
し、室温に５〜１０分間放置する。ついでこれに、２０
％ポリエチレングリコール４０００．１０ ｍ’Ｍ Ｃ
ａ（Ｊ２および１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）
溶液１麻ずつを加えて混合し、室温に２０分間放置する
。この混合液０．２ ｄずつを４５℃に保温された再生
培地（２２襲ンルビトール、２％グルコース、０．７％
イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％ｙ Ｐ Ｄ、
２０ｓ／ｍｅヒスチジン、３悸寒天）１０＋＋＋／に加
え、軽く混合させ、予め準備された１、２Ｍンルビトー
ル含有最小培地（０，７％イーストニトロゲンベースア
ミノ酸、２％クルコース、２０μｐ／ｍｌヒスチジン、
２％寒天）プレートに重層し、固化させたのち、３０℃
で培養してロイシン非要求性酵母のコロニーを得る。こ
のコロニーを２０μ９７ｍｅヒスチジンを含むバルクホ
ルダーミニマムメディウムＣＴｏｈｅ、ＡＳｅｔ ａｌ
； Ｊ。
ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、、 １１３．７２７（１ｇ７３）
を参照〕（ごて培養して形質転換酵母サツカロミセス・
セレビシェＡＨ２２／ｐＡＨ２０３を得る。
を参照〕（ごて培養して形質転換酵母サツカロミセス・
セレビシェＡＨ２２／ｐＡＨ２０３を得る。
上記の方法において、組換えプラスミドｐ Ａ Ｈ２Ｏ
３の代りにｐＡＳ １０１、ｐＡＨ２０１およびｐＡＨ
２０５を用い、それぞれ下記の形質転換酵母を得る。
３の代りにｐＡＳ １０１、ｐＡＨ２０１およびｐＡＨ
２０５を用い、それぞれ下記の形質転換酵母を得る。
サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２／ｐＡｓ１０ｆサ
ツカロミセス・セレビシェＡｇ２２／ＰＡＨ２０１サツ
カロミセス・セレビシェＡ行２２／ＰＡＨ２０５上記の
方法において、サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２の
代りにサツカロミセス・セレビシＩＡＨ２２ｐｈｏ８０
Ｃａ １ｅｕ２ｈｉｓ４ Ｃａｎ１ （Ｃｉｒ”））
（微工研条寄第５０９号）を用い、それぞれ下記の形
質転換酵母を得る。
ツカロミセス・セレビシェＡｇ２２／ＰＡＨ２０１サツ
カロミセス・セレビシェＡ行２２／ＰＡＨ２０５上記の
方法において、サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２の
代りにサツカロミセス・セレビシＩＡＨ２２ｐｈｏ８０
Ｃａ １ｅｕ２ｈｉｓ４ Ｃａｎ１ （Ｃｉｒ”））
（微工研条寄第５０９号）を用い、それぞれ下記の形
質転換酵母を得る。
サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２Ｐｈ０８０／ＰＡ
ＳＩＯＩサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２Ｐｈ０８
０／／ｐＡＩｌ（２０エサツ力ロミセス・セレビシェＡ
Ｈ２２Ｐｈ０８０／ＰＡＨ２０３サツカロミセス・セレ
ビシェＡＨ２２ｐｈｏｓｏ／ｐＡＨｚｏｓ実施例１ 前記参考例で得られた形質転換酵母ＡＨ２２／ＰＡ）Ｉ
２０３を、２０μ９／ｍｅヒスチジンを含むバルクホル
タ−ミニマムメディウム１０罰入りのチューブ数本に接
種し、３０℃で４８時間培養する。
ＳＩＯＩサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２Ｐｈ０８
０／／ｐＡＩｌ（２０エサツ力ロミセス・セレビシェＡ
Ｈ２２Ｐｈ０８０／ＰＡＨ２０３サツカロミセス・セレ
ビシェＡＨ２２ｐｈｏｓｏ／ｐＡＨｚｏｓ実施例１ 前記参考例で得られた形質転換酵母ＡＨ２２／ＰＡ）Ｉ
２０３を、２０μ９／ｍｅヒスチジンを含むバルクホル
タ−ミニマムメディウム１０罰入りのチューブ数本に接
種し、３０℃で４８時間培養する。
酵母エキス０．５ Ｗ／Ｖ％、サッカロース４Ｗ／Ｖ％
、硫酸アンモニウム０．５ Ｗ／Ｖ％、硫酸マグネシウ
ム０．０５ Ｗ／Ｖ％を含有する３βの水溶液をオート
クレーフで１２１℃１５分間滅菌を済ました培地に、上
記の１０ｍ１チユーブ中の培養物３本分を混合し、５β
ジャーファーメンタ−中で、温度２２℃、ｐＨ６，２〜
６．５（コントロール）、攪拌回転数３００ ｒＰｍ、
溶存酸素３ｐｐｍ（溶存酸素計により測定し、空気吹込
量調節によりコントロール）の条件下で３６時１間培養
した。
、硫酸アンモニウム０．５ Ｗ／Ｖ％、硫酸マグネシウ
ム０．０５ Ｗ／Ｖ％を含有する３βの水溶液をオート
クレーフで１２１℃１５分間滅菌を済ました培地に、上
記の１０ｍ１チユーブ中の培養物３本分を混合し、５β
ジャーファーメンタ−中で、温度２２℃、ｐＨ６，２〜
６．５（コントロール）、攪拌回転数３００ ｒＰｍ、
溶存酸素３ｐｐｍ（溶存酸素計により測定し、空気吹込
量調節によりコントロール）の条件下で３６時１間培養
した。
培養液１ ｄあたり５．８Ｘ１０ 個まで酵母菌か増殖
していた（コールタ−カウンターにて測定）。また培養
液１０ｍ１を取り、菌体を遠心分離により集菌し、グラ
スビーズ破砕機にて破砕しＨＢ ｓ抗原を抽出した後、
ラジオイムノアッセイ法〔ＡＵＳＲＩＡ−１１（ダイナ
ホット社）〕にて、ヒト由来ＨＢｓ 抗原精製標品を対
照としてＨＢｓ 抗原含有量を測定したところ、培養液
１ ｍｌあたり０．１６μｇのＨＢｓ 抗原が産生され
ていた。
していた（コールタ−カウンターにて測定）。また培養
液１０ｍ１を取り、菌体を遠心分離により集菌し、グラ
スビーズ破砕機にて破砕しＨＢ ｓ抗原を抽出した後、
ラジオイムノアッセイ法〔ＡＵＳＲＩＡ−１１（ダイナ
ホット社）〕にて、ヒト由来ＨＢｓ 抗原精製標品を対
照としてＨＢｓ 抗原含有量を測定したところ、培養液
１ ｍｌあたり０．１６μｇのＨＢｓ 抗原が産生され
ていた。
実施例２
前記参考例で得られた形質転換酵母ＡＨ２２ＰｈＯｓ
ｏ／ｐＡ Ｓ １０１を、２０μｇ／ｍｌヒスチジンを
含むバルクホルダーミニマムメディウム１０＃Ｉｌ入り
のチューブ士数本に接種し、３０℃で４８時間培養する
。
ｏ／ｐＡ Ｓ １０１を、２０μｇ／ｍｌヒスチジンを
含むバルクホルダーミニマムメディウム１０＃Ｉｌ入り
のチューブ士数本に接種し、３０℃で４８時間培養する
。
酵母エキス０，５ＶＶ／Ｖ％、サッカロース４’Ｗ／Ｖ
％硫酸アンモニウム０．５ ’Ｖ％／〆Ｖ％、硫酸マグ
ネシウム０．０５ Ｗ／Ｖ％を含有する滅菌済培地１５
βを各３ｅづつ５基のジャーファーメンタ−に入れ、こ
れに各々３本つつの上記ＩＱｍｌ！チューブ中の培養物
を加える。これらを＄１表１こ記したことく、種々培養
条件を変えて培養を実施した。実施例１と同じく、増殖
菌体数の測定結果および産生ＨＢ ｓ 抗原量の測定結
果を第１表に記す。
％硫酸アンモニウム０．５ ’Ｖ％／〆Ｖ％、硫酸マグ
ネシウム０．０５ Ｗ／Ｖ％を含有する滅菌済培地１５
βを各３ｅづつ５基のジャーファーメンタ−に入れ、こ
れに各々３本つつの上記ＩＱｍｌ！チューブ中の培養物
を加える。これらを＄１表１こ記したことく、種々培養
条件を変えて培養を実施した。実施例１と同じく、増殖
菌体数の測定結果および産生ＨＢ ｓ 抗原量の測定結
果を第１表に記す。
手続補正書（自発ン
昭和５９年５月２９日
特許庁長官 殿
２発明の名称
形質転換酵母の培養方法
３補正をする者
事件との関係 特許出願人
注所 熊本県熊本市清水町大窪６６８番地名称 財団法
人化学及血清療法研究所 ４代理人
人化学及血清療法研究所 ４代理人
Claims (6)
- （１）酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモーターを
担うプラスミドに当該プロモーターの制御下にＢ型肝炎
ウィルスの遺伝子を組込んだ組換えプラスミドにより形
質転換された酵母を培養し、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原
を産生させる方法をこおいて、酵母エキス、無機アンモ
ニウム塩、無機マグネシウム塩およびグルコースまたは
サッカロースの一方または両方を含有する半合成培地を
用いることを特徴とする、形質転換酵母の培養方法。 - （２）無機アンモニウム塩か、硫酸アンモニウムまたは
塩化アンモニウムであり、無機マグネシウム塩が硫酸マ
グネシウムまたは塩化マグネシウムである特許請求の範
囲第（１）項記載の方法。 - （３）半合成培地中に、プロリンおよび非イオン系界面
活性剤を添加する特許請求の範囲第（１）項記載の方法
。 - （４）非イオン系界面活性剤がポリオキシエチレンポリ
オキシプロピレンエーテルである特許請求の範囲第（３
）項記載の方法。 - （５）半合成培地に含有される各成分の濃度が、酵母ｘ
−＋ ス０．３〜１．０ ’Ｗ／Ｖ％、サッカロース
２〜４Ｗ／■係、硫酸アンモニウム０．５〜１．ＯＷ／
Ｖ％、硫酸マグネシウム０．０１〜０．１Ｗ／Ｖ％、プ
ロリン０．０１〜０，１■／ａｔ、ポリオキシエチレン
ポリオキシプロピレンエーテル５〜１０ ＰＰｍである
ｌ’請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （６）酵母を培養するに際して、菌の対数増殖期前期に
おいて培養温度を２５〜３０℃、培地のｐＨを４〜５．
５、溶存酸素量を２〜５ ＰＰｍに保持し、対数増殖期
中期以後においては、培養温度を２０〜２４℃、培地の
ｐＨを６．０〜７．０、溶存酸素量を２〜５ ＰＰｍに
保持する特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59053069A JPS60196185A (ja) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | 形質転換酵母の培養方法 |
| CA000476515A CA1277264C (en) | 1984-03-19 | 1985-03-14 | Method for culturing transformed yeast |
| EP85103132A EP0157275B1 (en) | 1984-03-19 | 1985-03-18 | Method for culturing transformed yeast |
| DE8585103132T DE3575163D1 (de) | 1984-03-19 | 1985-03-18 | Verfahren zur kultivierung transformierter hefe. |
| KR1019850001787A KR920007680B1 (ko) | 1984-03-19 | 1985-03-19 | 형질전환된 효모의 배양방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59053069A JPS60196185A (ja) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | 形質転換酵母の培養方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60196185A true JPS60196185A (ja) | 1985-10-04 |
| JPH0532022B2 JPH0532022B2 (ja) | 1993-05-14 |
Family
ID=12932527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59053069A Granted JPS60196185A (ja) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | 形質転換酵母の培養方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0157275B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60196185A (ja) |
| KR (1) | KR920007680B1 (ja) |
| CA (1) | CA1277264C (ja) |
| DE (1) | DE3575163D1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998044146A1 (en) * | 1997-04-03 | 1998-10-08 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Process for producing foreign proteins |
| JP5883780B2 (ja) * | 2010-03-26 | 2016-03-15 | アサヒグループホールディングス株式会社 | 酵母の培養方法 |
| WO2018159652A1 (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-07 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0233937B1 (en) * | 1985-08-15 | 1993-01-13 | Amgen Inc. | Fermentation methods for hepatitis vaccine production |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| FI932248L (fi) * | 1991-09-18 | 1993-07-02 | Amgen Inc | Hepatit b-vaccinkomposition innehaollande ett gallsyrasalt |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ201705A (en) * | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
-
1984
- 1984-03-19 JP JP59053069A patent/JPS60196185A/ja active Granted
-
1985
- 1985-03-14 CA CA000476515A patent/CA1277264C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-18 DE DE8585103132T patent/DE3575163D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-18 EP EP85103132A patent/EP0157275B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-19 KR KR1019850001787A patent/KR920007680B1/ko not_active Expired
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998044146A1 (en) * | 1997-04-03 | 1998-10-08 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Process for producing foreign proteins |
| JP5883780B2 (ja) * | 2010-03-26 | 2016-03-15 | アサヒグループホールディングス株式会社 | 酵母の培養方法 |
| WO2018159652A1 (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-07 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| JP2018143100A (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-20 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
| CN110337496A (zh) * | 2017-03-01 | 2019-10-15 | 三洋化成工业株式会社 | 有用物质的生产方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1277264C (en) | 1990-12-04 |
| EP0157275A1 (en) | 1985-10-09 |
| KR920007680B1 (ko) | 1992-09-14 |
| DE3575163D1 (de) | 1990-02-08 |
| JPH0532022B2 (ja) | 1993-05-14 |
| KR850006549A (ko) | 1985-10-14 |
| EP0157275B1 (en) | 1990-01-03 |
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