JPS60201257A - 特定のポリヌクレオチド配列順序の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特定のポリヌクレオチド配列順序を検出する
ための核酸交雑（ハイブリダイゼーション）試験方法及
び試薬系に関する。核酸交雑試験の原理は、関心のもた
れている特定のポリヌクレオチド塩基配列を決定し単離
する手段として、組換えＤＮＡ技術分野の研究者によっ
°ζ開発された。

例えば、その二本鏡型のものを変性することによって得
られるＤＮＡ及びＲＮＡのような一本鎖の核酸は、適切
な条件の下に、相補形の一本鎖の核酸と交雑され、ない
しは組換えられることが見出された。この相補形の核酸
のプローブを、容易に検出可能な化学的な基によって標
識すると、−重鎖型の核酸サンプルを含有した試験媒体
中において、関心のもたれているいかなるポリヌクレオ
チド配列順序の存在をも検出することが可能になる。

分析交雑技術は、ＤＮＡ組換え技術の分野だけでなく、
特に人及び動物用の医薬、農業及び食品科学の分野にお
いて重要なポリヌクレオチドの検出にも適用することが
できる。特にこの技術は、病因学的物質例えばバクテリ
ア及びウィルスを検出もしくは同定し、抗生耐力につい
てバクテリアをスクリーニングするために、又は鎌状赤
血球貧血及びサラセミアのような遺伝異常を診断する助
けとして、又は癌細胞を検出するために使用し得る。こ
の技術の一般的な展望とその将来の装置については、Ｂ
ｉｏＬｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９８３年８月）、ｐｐ
４７１−４７８を参照されたい。

以下の情報は、本発明に関係していると思われる情報を
明らかにする目的で提供される。以下の情報は本発明に
対する公知技術を形成すると解釈すべきではなく、また
そのようなことに対する認容も意図されていない。

従来の核酸交雑試験技術は、一般に、固体の支持体上に
おいて核酸サンプルを不動化することを含む。核酸サン
プル中の関心ある特別の塩基連鎖ないし配列順序、ある
いは遺伝子と核酸プローブの標識されたものとの間の交
雑（ハイブリダイゼーション）は、拘束ないし結合され
ていないプローブ（非結合プローブ）を含有する反応混
合物の残部から固体の支持体を取除いた後、固体の支持
体上の標識を検出することによって定められる。

従来技術による交雑試験を行うために核酸サンプルを不
動化することの必要性は、二つの重要な問題を提起する
。第一に、不動化を実現するうえに必要な手順には、一
般に時間がかかり、臨床実験室における技術の日常的な
使用にとって不所望な工程が付加される。第二に、不均
質なサンプル中のプロティンその他の物質は、特に臨床
サンプルの場合に、核酸の不動化を妨害することがある
。

核酸サンプルを不動化し、標識プローブを加える代わり
に、不動化されたプローブを使用し、核酸のサンプルに
そのまま標識すること、更には、２つのプローブ（一方
のプローブは不動化され、他方のプローブは標識されて
いる）を必要とする二重交雑技術を用いることも可能で
ある（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５
　：　４６８　（１９６Ｂ）　ａｎｄＧｅｎｅ　２１ニ
ア７　８６　（１９８３））、しかし第１の方法は、核
酸サンプルにそのまま標識することに、通常の臨床技術
者の能力をこえる高度の技術を必要とすることと、標識
の歩留りをモニターする簡単で高信頼性の方法がないこ
ととによって、最初に述べた方法よりも更に望ましくな
い。標識の歩留りをモニターする便利な方法がないこと
は、標識媒体に様々な量の標識反応に対する抑制剤（イ
ンヒビツタ−）が含まれている場合に、大きな問題を惹
起することがある。二重交雑技術には、余分の試薬を必
要とすること、培養工程及び交雑反応の動力学が遅延し
非効率的になり易いことなどの欠点があるうえに、サン
プル配列順序との両プローブの相補性が異なる場合、検
定の正確さも同様に変動することが多い。

不動化ＲＮＡプローブの使用と、結果する不動化ＤＮＡ
−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、これらに
対する選択性をもった標識抗体により検出することは、
本出願人に譲渡された米国特許願５Ｎ６１６，１３２号
（出願日、１９８４年６月１日）に記載されている。こ
の方法によれば、核酸サンプルを不動化し標識する必要
は除かれるが、交雑に関与するプローブの鎖が不動化さ
れるため、プローブ及び関心配列順序の再アニーリング
速度が著しく低下することがある。

ポリヌクレオチドのプローブとサンプルと間の交雑生成
物としてのポリヌクレオチドデュプレックスを直接検出
することにより、ポリヌクレオチドのサンプル又はプロ
ーブの不動化及び科学的標識を不要にする技術は、一般
に不満足なものであった。−重鎖のＤＮＡよりも二本鎖
のＤＮＡ　−ＲＮＡと選択的に結合する抗体を生成させ
る試みは成功しなかった（Ｐａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｈａ
ｌｌｏｒａｎ、”　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　ｉｎ　
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　”＋　Ｐｌｅｓｃｉａ　ａｎｄ
　Ｂｒａｕｎ＋Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ
Ｙ　（１９６９）　１８ページ以下〕。ＲＮＡ　−ＤＮ
Ａ混合ハイブリッド又はＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと
結合し一本鎖のポリヌクレオチドに低親和力を示す抗体
を生成させることには多少の成功が得られている〔例え
ばＲｕｄｋｉｎ　ａｎｄ　５ｔｏｌｌａｒ＋　Ｎａｔｕ
ｒｅ　２６５　：　４７２（１９７７）参照〕。しかし
ながら、これらの文献には、前述した標識プローブを用
いる交雑技術の場合と同様に、核酸サンプルの不動化が
必要であることが述べられている。ルドキン（Ｒｕｄｋ
ｉｎ）及びストー９−（Ｓｔｏｌｌａｒ　）は、顕ｌｉ
ｉ！［鏡スライド上に全部の細胞を固定させ、細胞核中
のＤＮＡを曝露した。このものは、ＲＮＡプローブと交
雑され、ハイブリッドは、ＲＮＡ　−ＤＮＡに対するフ
ルオレセイン標識抗体を用いて、螢光顕微鏡によって検
出された。

特異性ＤＮＡ配列順序を検出するための初期の検出手順
は、溶液相法（ｆｏｒｍａｔ）に従っていたが、それに
よれば、交雑には、ＤＮＡサンプル及び同位元素標識Ｒ
ＮＡプローブ両者の可溶型のものが使用された。溶液中
において形成されたハイブリッドは、密度勾配遠心分離
法によって単離する（Ｈａｌｌａｎｄ　Ｓｐｉｅｇｅｌ
ｍａｎｎ　（１９６１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃ
ａｄ。

Ｓｉｃ、４７　：　１３７）。遠心分離は遅すぎるため
多数のサンプルの分析には実用的ではない。この溶液交
雑法は、ニトロセルロースフィルターが他の交雑ＲＮＡ
と共に一本鎖のＤＮＡをつよく吸着することの発見によ
って、一層実用的になった。

（Ｎｙｇａａｒｄ　ａｎｄ　ｌ１ａｌｌ　（１９６４）
　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

９：１２５）。標！１ｉＲＮＡプローブはフィルターに
非常に弱く付着し、この交雑法は、−重鎖のプローブを
加水分解するがＲＮＡ　−ＤＮＡハイブリッドは加水分
解しないリボヌクレアーゼにフィルターを曝露すること
によって改良された。この方法は、ＤＮＡサンプルとＲ
ＮＡプローブとの交雑に限定され、リボヌクレアーゼに
よる消化は注意深く制御する必要がある。そのため、固
相交雑方法が重要になった。

従って、核酸のプローブもそのサンプルも、不動化する
必要はなく、既知の固相交雑技術の欠陥を克服した、核
酸交雑検定方法が強く望まれている。更にこの技術は、
各種の標識特に非同位元素型の標識の使用を可能にする
ものでなければならない。本発明の主な目的は、これら
の利点及び他の利点を備えた核酸交雑検定法及び試薬系
を提供することに存する。

〔発明の概要〕

本発明は、検出しようとする特定のポリヌクレオチド配
列順序と核酸プローブとの間に形成されたハイブリッド
が、これらのハイブリッドに結合選択性を示す抗体試薬
の不動化型又は不動化可能型に結合されることにより不
動化されるようにした、核酸交雑検定法を提供すること
にある。本発明の好ましい実施態様によれば、これによ
って、標識プローブを使用する場合には交雑プローブ又
は非交雑プローブの分離が可能になり、抗ハイブリッド
試薬の標識形を使用した場合には遊離標識第２抗体試薬
からのハイブリッドバウンドの分離が可能になる。この
ように、本発明による検出方法は、核酸のサンプル又は
プローブを不動化する必要を完全に除き、溶液交雑にお
いて交雑速度を高速とし、その効率を高くすることを可
能にする。

一般に、本発明の検出方法によれば、検出しようとする
配列順序と実質的に相補な一本鎖の塩基連鎖を有するプ
ローブと、−重鎖の核酸をじんゆうする試験サンプルと
を接続させる。この交雑工程は、検出しようとする配列
順序とプローブとの間の交雑にとって好都合な条件の下
に行われる。

この場合、生成したハイブリッドは、検出しようとする
配列順序とこれと相補なプローブ配列順序との間の交雑
によって形成されるデュプレックスに結合選択性を示す
抗体試薬の添加によって検出することができる。抗体試
薬は、この試験ステップにおいて、通常は不動化された
状態にあり、例えば固体の支持体に科学的又は物理的に
結合している。別の方法として、抗ハイブリッドは、可
溶型の生成ハイブリッドと接触させた後に不動化するこ
とができる。この不動化は、例えば、この抗ハイブリッ
ドに対する不動化抗体に接触せしめるか、又は、リガン
ドで修正された抗ハイブリッドを使用し、そのリガンド
の結合相手の不動化型を添加することによってなされる
。

不動化抗体試薬に結合された結合デュプレックスは、種
々の方法で測定することができる。通常は、標識プロー
ブか、又は、第２の抗ハイブリッド試薬の標識型のもの
が用いられる。第１の場合には、不動比相と結合され、
ないしは組合わされるに至った交雑標識プローブは、溶
液中に残留する非交雑プローブから分離され、不動比相
と組合わされた標識又は残留非交雑プローブ中の標識が
測定される。標識抗ハイブリッドを使用する場合、生成
ハイブリッドに結合されることにより不動比相と組合わ
されるに至ったものを溶液中に残留したものから分離し
た後、同様にして、不動比相と組合わされるに至った標
識又は非結合標識抗ハイブリッドと共に残留する標識を
測定する。放射性標識及び好ましくは非放射性標識例え
ば酵素、フルオレッサー、リガンド等をはじめとする各
種の標識を使用することができる。

本発明には次のように多くの重要な利点がある。

第１に、反応速度が最も早くなる溶液中において、核酸
サンプルと核酸プローブとの交雑を行わせることができ
る。典型的な固相交雑速度は、固体表面上に不動化され
た核酸サンプルへの標識プローブの拡散によって制限さ
れる。この制限は溶液交雑の場合には生じない。

第２に、核酸サンプルを不動化するために使用した固相
への標識プローブの非特異な結合が、同相法の場合の問
題になる。典型的には核酸サンプルは固相に吸着される
。そのため固体は核酸と高い親和性をもって結合する物
質でなければならないが、この特性は、標識プローブの
非特異な吸着を最小とすべき次の交雑ステフプないしは
工程において問題になる。本発明においては、抗ハイブ
リソド不動化の固相は、核酸を吸着しない物質から選定
しｆｉる。

また、たいていの交雑方法においては、固体表面への吸
着又は固体との共存結合による核酸サンプルの不動化が
必要となる。サンプル中のプロティンその他の物質が不
動化を妨害するので、フェノール抽出のような方法によ
ってサンプルを精製することが必要になる。本発明によ
る溶液交雑方法は、ハイブリッドに対する高い親和性及
び特異性を示してサンプル中のプロティン、炭水化物及
びリビツドによる干渉を受けない抗体によって、ハイブ
リッドを不動化する。

また、吸着又は共有結合により核酸サンプルが不動化さ
れる場合に、再現性の良い収率で核酸を確実に不動化す
る好都合な方法はない。更に、吸着過程は、ポリヌクレ
オチド配列順序の一部を交雑に利用できないものにする
。例えば、ニトロセルロース膜に吸着されたＤＮＡの半
分以下が交雑に利用されるに過ぎない。そのため検定の
検出限界は最適ではなく。ハイブリッドの効率は可変と
なる。本発明によって可能となる溶液交雑によって核酸
サンプルからハイブリッドを最適効率で生成させること
ができる。

〔好ましい実施態様の説明〕 分析の道具としての核酸交雑の使用は、基本的に、ＤＮ
Ａの二本鎖のデュプレックス構造に基ツいている。二本
鎖ＤＮＡの各鎖のプリン塩基とピリミジン塩基との間の
水素結合は、可逆的に破断することができる。この［融
解（ｍｅｌｔｉｎｇ　）　Ｊもしくは「変性（ｄｅｎａ
ｔｕｒｔｉｏｎ　）　Ｊによって生ずるＤＮＡの二本の
相補形の一本鎖は再結合（再アニーリングもしくは交雑
ないしはハイブリダイゼーションとも呼ばれる）してデ
ュプレックス構造を再形成する。当該技術分野において
は周知のように、第２の一本鎖の核酸と十分に相補の（
即ち相同の）塩基連鎖を含む第１の一本鎖の核酸（ＤＮ
Ａ又はＲＮＡ）の、適切な条件下の接触によって、場合
により、ＤＮＡ　−ＤＮＡ、ＲＮＡ　−ＤＮＡ又はＲＮ
Ａ　−ＲＮＡの各ハイブリッドが生成される。

〔プローブ〕

プローブは、検出すべき連鎖と実質的に相補又は相同の
少なくとも１つの一本鎖の塩基連鎖を有する。しかしこ
の塩基連鎖は、単一の連続したポリヌクレオチド区画（
セグメント）である必要はなく、非相同連鎖により中断
された２以上の別々のセグメントから成っていてもよい
。これらの非相同連鎖は直線状でもよいが、自己相補形
で、ヘアピンループを形成していてもよい。更にプロー
ブの相同域の３°　−及び５°　−末端には、相同連鎖
（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　５ｅｑｕｅｃｅ）が増殖のた
めに挿入されたベクターのＤＮＡ又はＲＮＡを含むもの
のような非相同連鎖が結合されていてもよい。いずれの
場合にも、分析試薬として供与されたプローブは、問題
となっている核酸サンプルとの検出可能な交雑を１以上
の点において発現する。臨界な相同区画が一本鎖型であ
り、ＤＮＡ又はＲＮＡサンプルとの交雑に利用され得る
とするならば、直線状又は円形の単一鎖のポリヌクレオ
チドをプローブ要素として利用することができ、その場
合、大部分又は小部分が相補ポリヌクレオチドの１以上
の鎖にデュプレックスされる。実質的に一本鎖型のプロ
ーブを使用することが一般に好ましい。特定の試験のた
めに適したプローブを作製することは当該技術において
普通に行われている。

抗体試薬 本発明の重要な特徴は、溶液中の検出しようとする連鎖
とプローブとの相互作用の好都合な動力学の下に生成さ
れるハイブリッドを選択的に不動化する能力である。本
発明は、従来の検出方法とは対照的に、不動化された状
態で反応媒質に添加されるか又は次の工程において周知
の方法により不動化可能とした抗体試薬に、生成ハイブ
リッドを結合させることによって、この不動化を、独特
の仕方で行わせる。

本発明に使用される抗体試薬は、アンチハイブリッド結
合活性をもつ免疫学的に誘導された結合物質であり、普
通の多くクローン種又は単りローン種の全抗体もしくは
その断片、アグリゲート、又は接合体であってもよい。

好ましいのは、−重鎖の核酸よりも二本鎖の核酸を選択
する抗体試薬、例えばＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドも
しくはＲＮＡ・ＲＮ　Ａ　ハイブリッド又は（１１）挿
入錯体（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｅ
ｓ　）に選択的な抗体試薬である。

単一鎖の核酸よりもＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッド又は
ＲＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドに選択性をもった抗体を
刺激し得ることは周知であるが、ＤＮＡ・ＤＮＡの場合
にはこの選択性は実現できないと現在考えられている。

将来選択性ＤＮＡ　−ＤＮＡ抗体が開発されたら、これ
らは明らかに本発明に適用可能となろう。ＤＮＡ　−Ｒ
ＮＡハイブリッド又はＲＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドに
対する抗体は、プローブがＲＮＡで核酸サンプルがＤＮ
ＡもしくはＲＮＡである場合、又はプローブがＤＮＡで
サンプルがＲＮＡの場合に使用可能である。

また、本明細書において、抗−ＤＮＡ−ＲＮＡ試薬又は
抗−ＤＮＡ　−ＲＮＡ試薬と共に使用されるＲＮＡプロ
ーブという場合、プローブに含有される全部のヌクレオ
チドがリボヌクレオチドであり、即ち２“　−ヒドロキ
シル基を有しているわけではないことを理解すべきであ
る。本発明に使用されるＲＮＡプロ〜ブの基本的な特徴
は、ＲＮＡプローブからなるＤＮＡ　−ＲＮＡ又は　Ｒ
ＮＡ・ＲＮＡハイブリッドにたいする抗体を刺激するこ
とができるように充分な非ＤＮＡ性をもっていることで
ある。これらの抗体は、そのようなハイブリッドを形成
する個々の一本鎖と分析上有意な程度には交叉反応しな
い。そのため、プローブに含まれるヌクレオチドの１以
上の２゛−位置は、本検定の実施に必要な抗体結合特性
が実質的な程度保持されていれば、デオキシ型であって
もよい。

同様に、ＲＮＡプローブは、そうした制限された２゛　
−デオキシ変更に加えて、又はその代りに、他の２°−
変更又は一般に他の変更をそのリポースリン酸骨格に沿
って有するヌクレオチドであってもよいが、この場合、
個別の一本鎖よりも二本鎖を選択する交雑生成物に対す
る抗体の特異性が大きく損なわれないことが条件である
。

これらの変更が抗体プローブ中に存在する場合、抗体試
薬の形成に使用された免疫源は、実質的に対応した変更
ををする一方の鎖と、ＲＮＡサンプルを検出するか又は
ＤＮＡサンプルを検出するかに従って実質的に非変更の
ＲＮＡ又はＤＮＡである他の鎖とを有することが望まし
い。好ましくは、免疫源のうち変更された鎖は、ＲＮＡ
プローブの変更された鎖と同一とする。免疫源の一例は
、ハイブリッド　ポリ　（２’　−０−メチルアゾリニ
ル酸）・ポリ　（２゛−デオキシチミジル酸）、別の例
は、ポリ（２’−〇−エチルイノシン＃ｌ）・ポリ　（
リボシチジル酸）である。ＲＮＡプローブが有し得る修
正ヌクレオチドの別の例は、２″　−〇−メチルリボヌ
クレオチド、２−０−エチルリボヌクレオチド、２°　
−アジドデオキシリボヌクレオチド、２”　−クロロデ
オキシリボヌクレオチド、２’　−０−アセチルリボヌ
クレオチド、並びに、リボヌクレオチドもしくはデオキ
シリボヌクレオチドのメチルホスホネート又はホスホロ
チオレートである。変更ヌクレオチドは、テンプレート
からのプローブの酵素合成中の導入によってＲＮＡプロ
ーブ中に現出させ得る。例えばアデノシン５゛−Ｏ−（
１−チオトリホスフェート）（ＡＴＰαＳ）及びｄＡＴ
Ｐｏｔｓは、それぞれＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ及
びＤＮＡポリメラーゼである。

別の方法として、プローブ作製後に科学的変更を導入す
ることができる。−例としてＲＮＡプローブは、水性溶
液中において緩和な条件下に無水酢酸により２°　−０
−アセチル化されていてもよい。

ＲＮＡ　−ＤＮＡハイブリッドに特異性の抗体を刺激す
る免疫源は、ホモポリマー又はヘテロポリマーのポリヌ
クレオチドデュプレックスを含み得る。可能なホモポリ
マーデュプレックスのうちで特に好ましいのは、ポリ　
（ｒＡ）　・ポリ　（ｄ　Ｔ）（Ｋｉｔａｇａｗａ　ａ
ｎｄ　５ｔｏｌｌａｒ　（１９Ｂ　２　）　Ｍｏ１．　
Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１９：４１３）である。しかし一般に、ヘテロポリマー
デュプレックスが好ましくは使用され、ＲＮＡポリメラ
ーゼによるφ×１７４ブイリオン（ｖｉｒｉｏｎ）　Ｄ
　Ｎ　Ａの転写をはじめとする種々の方法で作製するこ
とができる（Ｎａｋａｚａｔｏ　（１９８０）Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、１９　：　２８３５）−選択されたＲＮＡ・
ＤＮＡデュプレックスは、メチル化蛋白質に吸着される
か、又は、普通の免疫源キャリヤ物質、例えば牛の血清
アルブミンに結合させ、所望の宿主動物に注射すること
ができる（Ｓｔｏｌｌａｒ　（１９８０）Ｍｅｔｈ、　
Ｅｎｚｙｍ、　７０　：　７０も参照）、ＲＮＡ　−Ｒ
ＮＡデュプレックスに対する抗体は、特に砂糖きびに感
染するフィシ−病ウィルス又はレオウィルスのようなウ
ィルスからの二本鎖ＲＮＡに対して形成し得る。また特
にホモポリマーデュプレックス例えばポリ　（ｒｌ）・
ポリ　（ｒＣ）又はポリ　（ｒＡ）・ポリ　（ｒ　Ｕ）
は前記の如く免疫化のために使用し得る。ＲＮＡ　−Ｄ
ＮＡ及びＲＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドに対する抗体に
関する更なる情報は、本出願人に譲渡された米国特許願
５Ｎ６１６１３２号（出願日、１９８４年６月１日）に
記載されている。

挿入錯化合物にたいする抗体を免疫源に対し作製でき、
これは通常はイオンプロティン又はプロティン誘導体（
例えばメチル化された牛血清アルブミン）と陰イオン挿
入体−核酸錯化合物との間のイオン性錯化合物である。

理想的には、挿入体（ｉｎ　ｔｅｒｃａ　ｌａ　ｔｏｒ
　）は、二本鎖の核酸に共有結合される。別法として、
挿入体−核酸複合体を担体蛋白質（ブチイン）に共有結
合させることもできる。

免疫源の核酸部分は、検定ハイブリッドに見出される特
異的対合連鎖であってもよく、またどんな所望の連鎖で
あってもよい（これは抗体の特異性は一般に特別の塩基
連鎖に依存しないためである）。

挿入錯化合物に対する抗体についての別の情報は、本出
願人に譲渡された米国出願第５６０４２９号（出願日、
１９８３年１２月１２日）に記載されている。

抗体試薬は、前述したように、全抗体、抗体断片、多官
能性抗体アグリゲート、また一般に、抗体からの１以上
の特異的結合部位を含む物質から成っていてもよい。抗
体試薬は、全抗体の形態である場合、既知の免疫グロブ
リンのどんなりラス及びサブクラスに所属していてもよ
い（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ等）。普通にＦａｂ　、Ｆ　（
ａｂ’）及びｐ　（ａｂ’＞　２として知られるＩｇＧ
の断片のような、交雑プローブに対する特異性の結合親
和力を備えたどんな前記抗体の断片をも使用し得る。更
に免疫グロブリンのアグリゲート、ポリマー、誘導体及
び接合体又はその断片も、適宜使用してもよい。

抗体試薬の免疫グロブリン源は、普通の抗血清法及び単
クローン法によって容易に取得し得る。

抗血清は、適当な免疫源をもった動物、例えば、マウス
、うさぎ、モルモット又は山羊の免疫化を含む周知の確
立された技術に従って取得される。

免疫グロブリンは、体細胞交雑技術によっても取得され
、これによって、普通車クローン抗体と称される抗体が
生成される。これには適当な免疫源が使用される。

挿入錯化合物に選択性をもった抗体試薬が抗ハイブリッ
ドとして使用される場合、挿入化合物の種類は広汎にな
る。一般には、この挿入化合物は、通常は塩基対の間の
挿入により二本鎖の核酸例えばＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ
−ＲＮＡ又はＲＮＡ・ＲＮＡと結合可能な、低分子量の
扁平な通常は芳香族系の（しかし時として多環式の）分
子であることが好ましいといえるであろう。１次結合機
構は、通常は非共有的であり、共有結合は、挿入体が反
応性又は反応可能な科学的な基（挿入デュプレックス鎖
の一方又は両方の隣接する科学的な基と共に共有結合を
形成する）をもつ第２工程において生ずる。挿入の結果
として、隣接する塩基対が通常の間隔の約２倍に広がり
、デュプレックスの分子の長さが増大する。更に、挿入
体を収容するために、２重弦巻線が約１２〜３６°はど
かれねばならない。一般的な展望及び詳しい情報につい
ては、Ｌｅｒｍａｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、３
　：　１８　（１９６１）　；Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ　
等、”Ｐｔ＋ｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ
　Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　、　Ｃｈａｐｔｅｒ　７
．　ｐｐ４２９−４７６．　Ｈａｒｐｅｒａｎｄ　Ｒｏ
ｗｅ、　ＮＹ　（１９７４）　；　Ｗａｒｉｎｇ＋　Ｎ
ａｔｕｒｅ２１９：１３２０　（１９６Ｂ）；　■ａｒ
ｔｍａｎｎ等。

＾ｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｅｎｇｌ、　Ｅｄ、７　
：　６９３　（１９６Ｂ）　；Ｌｉｐｐａｒｄ、　Ａｃ
ｃｔｓ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｒｅｓ、１１　：　２１１
１　（１９７Ｂ）　：Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｉｎｔｅｒｃａ
ｌａｔｉｏｎ　ＣｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ　（１９Ｂ　２
　）　＋４４５；及びＢｅｒｍａｎ等、＾ｎｎ、　Ｒｅ
ｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｂｉｏｅｎｇ、２０：８７　（１９８１）ｉ並びに前記
米国特許願５Ｎ５６０，４２９号を参照されたい。

挿入体の例としては、アクリジン染料、例えば、アクリ
ジンオレンジ、フエナントリジン類、例えば、エチジウ
ム、フェナジン類、フロクマリン類、フェノチアジン類
及びキノリン類が挙げられる。

挿入錯化合物は、挿入体が科学的に結合されることによ
り挿入錯化合物が交雑により生成するように相補形の単
−鎖酸が変更されたプローブの使用によって、交雑の間
に検定媒体中に形成される。

この結合を得るために、基本的に、どんな便利な方法を
用いてもよい。この結合は、反応性の、好ましくは光反
応性の挿入体を挿入し、た後、結合反応を行うことによ
って形成する。特に有用な方法の１つは、アジド挿入体
である。反応性二トレンば、紫外線又は可視光に曝露す
ることによって容易に生成される。アリールアジドのニ
トレンは、その転位生成物よりも挿入反応を優先して選
択する。代表的なアジド挿入体は、３−アジドアクリジ
ン、９−アジドアクリジン、エチジウムモノアジド、エ
チジウムジアジド、エチジウムディマーアジド（Ｍｉｔ
ｃｈｅｌ　ｅｔ　ａｌ　、ＪＡＣ３１０４：　４２６５
（１９８２））、４−アジド−７−クロロキノリン及び
２−アジドフルオレンである。他の有用な光反応可能な
挿入体は、ピリミジン残渣と共に（２＋　２３シクロア
ダクトを生成するフロクマリンである。ビスクロロエチ
ルアミン及びエポキシド又はアジリジン例えばアフラト
キシン、多環炭化水素エポキシド、マイトマイシン及び
ノルフィリンＡのようなアルキル化剤も使用してよい。

次に挿入体で変更修正されたデュプレックスを変性し、
変更された単一鎖のプローブを生成させる。

本発明の検出方法に使用するための好ましい抗ハイブリ
ッドは、前述したように、二本鎖の核酸と単一鎖の核酸
との間で、結合の判別をするが、この選択性は、すべて
の実施態様について重要ではない。この選択性が臨界で
ある場合には、抗ハイブリッドを得るための種々の余分
なアプローチを利用することができる。これらの例とし
ては、−重鎖でも二本鎖でも、ＤＮＡに対し本質的に非
特異性の抗ＤＮＡ　−ＤＮＡ抗体、シス−ジアミンジク
ロロ白金−ＤＮＡアダクトのような科学的に変更された
核酸に対して育成ないし形成された抗体、抗チミングリ
コールのような０３０４酸化ＤＮＡに対する抗体、抗ジ
スタマイシンＡ−ＤＮＡ錯体又は抗−ネトロプシン−Ｄ
ＮＡ錯体のような抗生物質−ＤＮＡ錯体に対する抗体、
並びに、抗５−ブロモウラシル及び抗６−メチルアデノ
シンのような変更（修正）塩基に対する抗体が挙げられ
る。二本鎖の選択性が重要になるのは、検定のフォーマ
ットが一本鎖核酸の標識を含むことにより、交雑標識核
酸と非交雑標識核酸との間の判別を必要とする時である
。この状態は、核酸プローブと一本鎖の核酸サンプルと
のどちらかが標識されている場合に起きる。他方では、
第２抗ハイプブリソド試薬の標識型が使用される場合、
最終的に不動化される抗ハイブリッドと標識抗ハイブリ
ッドのうちどちらか一方又は他方が一本鎖核酸よりも二
本鎖核酸に選択性を示すことのみが必要である。

抗体試薬の結合によるハイブリッドの不動化を含むもの
として、本発明による検出方法を以上に説明したが、試
験の間に形成される核酸ハイブリッドと選択的に結合す
る能力をもったどんな物質も基本的には同様に使用し得
ることが理解されよう。これは、−重鎖に対する二本鎖
の選択性が重要ではない前記の場合だけではなく、二本
鎖の核酸に対する選択性を必要とする試験フォーマット
（ｆｏｒｍａｔ）の場合にも通用される。本発明の概念
の範囲内において使用可能な本発明の抗体試薬の均等物
は、リガンドーリセプター及び免疫グロブリン結合の場
合のように、高度に特異性の非共有結合性を、通常、示
すであろう。現在又は将来利用可能となる前記特性を備
えた物質は、現在の抗体試薬の均等物として考慮される
。

抗体試薬は、不動化された形態又は不動化可能な形態で
、生成ハイブリッドと接触させることができる。即ち抗
体試薬は、普通の方法によって後に不動化させることが
できる。抗ハイブリッドの不動化型を使用することが一
般に望ましい。固体支持体上にプロティンを不動化（固
定化）する多くの方法が知られており、これらの方法の
大部分は抗体に適用することができる。　（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｔｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、４４　（１
９７６）参照〕。抗体は共有結合又は非共有吸着により
通常不動化される。多用される非共有的方法は、ポリス
チレンのビーズ又は微小粒子及びポリ塩化ビニル面への
非特異的吸着である。多くの共有的方法が用いられてお
り、それらの、例としては、臭化シアン活性化アガロー
ス及びデキストラン、ゲルタールアルデヒド活性化ナイ
ロン及びポリアクリルアミド、アクリル及び他の支持体
上のエポキシドが挙げられる。ＩｇＧクラスの抗体も、
プロティンＡの不動型との結合によって不動化すること
ができる。この不動化のためにプロティンＡが使用され
、標識抗ハイブリッドが試験に使用される場合、プロテ
ィンＡの結合部位を飽和させたり、プロティンＡのりセ
プター部位を含まない標識抗ハイブリッドを利用したり
して、例えばＩｇＧ以外の免疫グロブリンクラスからの
抗ハイブリッド又はＦａｂもしくはＦａｂ’を使用する
ことによって、標識抗ハイブリッドが不動化プロティン
Ａとも結合されてなように注意する必要がある。

不動化の第１の目的は、検定時に生成したハイブリッド
を、標識によって発生する応答又は信号によって測定す
るために、該ハイブリッドを物理的に操作し、単離もし
くは分離し得るようにすることにある。従って不動化は
、試験時に生成させたハイブリッドに抗ハイブリッドを
結合させた後に行ってもよい。このための種々の方法は
自明である。

標識抗ハイブリッドを試験に使用する場合に、不動化抗
体が標識試薬に顕著な親和性をもたないように注意しな
がら、不動化抗−（抗ハイブリッド）抗体を使用するこ
とができる。これは、例えば、異なる免疫グロブリンの
クラスからの抗ハイブリッドを使用するなど、２つの抗
ハイブリッド試薬について抗原的に識別可能な免疫グロ
ブリンを使用することにより達せられる。不動化プロテ
ィンＡも、プロティンＡ及び標識抗ハイブリッドについ
ての前述した同じ注意の下に同様に使用することができ
る。特異性の結合対の一方の員に対する科学的な変更と
、線対の他の員の不動化型の使用とを含む計画は、特に
有用である。有用な結合の対としては、ビオチン／アビ
ジン、ハプテン及び抗原／抗体、炭水化物／レクチン、
酵素／インヒビ・７ター等が挙げられる。抗ハイブリッ
ドをビオチン又はハプテンで修正し、アビジン又は抗ハ
プテン抗体の不動化型をそれぞれ使用することが好まし
い。

検出標識 不動化抗体試薬に最終的に結合され、ないしは組合わさ
れる、当該ハイブリッドは、いろいろの仕方で決定する
ことができる。生成ハイブリッドと結合可能な第２抗体
試薬の標識型又は標識プローブを使用することが一般的
に好ましい。この標識型のものは、核酸プローブも核酸
サンプルも、試験を行うために標識するなど科学的に変
更する必要がないため、特に好ましい。単にハイブリッ
ドを、不動化（又は不動化可能な）第１抗体試薬及び第
２標識抗体試薬と接触させ、不動比相と組合わされ又は
結合されるに至った標識を測定するか、又は、別の方法
として、非結合第２標識抗体試薬として残留する標識を
測定するだけでよい。

第１及び第２の抗体試薬として同一の物質を用いること
も可能である。例えばＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドを
生成させる場合に抗ＤＮＡ　−ＲＮＡを使用し、この抗
ハイブリッドの一方の両分を不動化し、別の画分を標識
することもできる。ハイブリッドは、標識抗ハイブリッ
ドと不動化抗ハイブリッドとの両方を結合可能とするよ
うに、抗ＤＮＡ・ＲＮＡに対する多重のエピトープを有
するであろう。別の方法として、異なった抗ハイブリッ
ドを使用してもよい。例えば、単クローン抗体を使用す
る場合、種々の結合特異性及び（又は）親和性に対して
異なったハイブリドーマを使用することができる。

標識プローブは本発明においていくつかの方法で用いる
ことができる。成る場合には、単一の標識プローブが使
用され、生じた標識ハイブリッドが、不動化抗ハイブリ
ッド又は不動化可能な抗ハイブリッドとの結合により検
出されるように、遊離した標識プローブから分離される
。別の方法として、検出しようとする連鎖上の互に排他
的なセグメントに対し相補形の２つのプローブセグメン
トを含む二重交雑法も使用してよい。一方のプローブ区
画は標識され、他のプローブ区画は、検出しようとする
連鎖と交雑された時に抗ハイプリ・ノドに対しエピトー
プを形成する。

他の多くの標識方法が可能なことは自明である。

例えば、前記の方法よりも好ましくないが、−重鎖の核
酸ザンプルをそのまま標識し、非標識プローブと交雑し
た時に標識ハイブリッドを形成することによって、標識
を導入してもよい。また、後に詳述するように、最終的
に検出可能な信号を供給する物質しこ、例えば共有結合
によって直接に、又は、最終的に検出可能な物質をマイ
クロカプセル又はリポソーム（標識すべき成分に結合さ
れる）に組込むなどによる間接結合によって、それぞれ
結合させることができる。また、理解されるように、特
異的に結合可能なリガンド例えばハプテン又はバイオチ
ンで標識し、リガンドの結合の相手、例えば、検出可能
な種がそれに対し結合される抗体又はアビジン、を添加
することにより、検定中の所望の時に、最終的に検出可
能な種をもち来むことができる。不動化抗ハイブリッド
及び標識抗ハイブリッドを使用する場合、これらは、反
応混合物に同時に添加することができる。しかし、具体
的な系によっては、一方の成分を他の成分よりも所定時
間だけ早く添加することによって、性能を最適化するこ
とも可能であろう。

前述したように、プローブ、第２抗体等を標識するため
に、種々の型式の標識を使用することができる。標識は
、検出可能な物理的、科学的又は電気的性質を備えた物
質である。これらの物質は、免疫試験技術において十分
に開発されており、これらの方法において有用な大部分
の標識は、本発明に適用することができる。特に有用な
のは、酵素活性基、例えば、酵素（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ
、（１９７６）２２：１２３２．米国再発行特許第３１
００６号及び英国特許第２０１９４０８号）、酵素基質
（英国特許第１５４８７４１号参照）、補酵素（米国特
許第４２３０７９７号及び第４２３８５６５号）、酵素
禁止剤（米国特許第４１３４７９２号）、フロレッサー
（Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　（１９７９）２５：３５３
）、クロモフォア、ルミネ・ノサー例えばケミルミネソ
サー及びパイオルミネ・ノサー（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、
（１９７９）２５：５１２及び同書１５３１）、特異的
に結合可能なリガンド、例えば、ビオチン（ヨーロッパ
特許第６３８７９号）又はハプテン（ＰＣＴ公害公報８
３−２２８６号）及び放射性同位元素例えば３Ｈ，３５
Ｓ、３２１）、１２５Ｉ及び１４Ｃである。これらの標
識は、その物理的性質に基づいて検出される（フルオレ
・ノサー、クロモフォア及び放射性同位元素の場合）か
、又は、その反応性又は結合性に基づいて検出される（
酵素、基質、補酵素及び阻害剤）。例えば、コファクタ
ーで標識された種は、標識がコファクターとなる酵素（
循環系が使用される場合は複数の酵素）及び該酵素に対
する基質（１又は複数）を添加することによって検出し
得る。ハプテン又はリガンド（例えばビオチン）標識種
は、（検出可能な分子によりタグを付した）リガンドと
結合しているプロティン（例、アビジン）又はハプテン
に抗体を添加することにより検出し得る。これらの検出
可能な分子は、測定可能な物理的特性（例えば螢光又は
吸光）をもった分子でも、酵素反応の関与物質（前掲の
文献参照）でもよい。−例として、測定可能な物理的性
質を備えた物質を生成させるように基質に作用する酵素
を用いてもよい。この物質の例としては、β−ガラクト
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びペルオキシダ
ーゼが挙げられる。

第１の不動化抗体試薬と組合わされたデュプレックスを
測定するために第２抗体試薬を使用する場合、たの第２
抗体は、それ自身の抗原性のような本来の性質に基づい
て検出することができる。

標識抗−（抗体）抗体は、第２抗体の標識が前記の周知
の標識である場合に、第２抗体試薬と結合する。更に抗
体は、補体結合又は標識プロティンＡの使用、並びに、
抗体検出のために当業界において周知の他の技術を用い
て検出することができる。標識プロティンＡを使用する
場合、不動化抗体試薬は、プロティンＡを結合する部位
のない形をしたものになるであろう（例えば不動化Ｆｅ
ｂ又はＦａｂ’を使用し得る）。

本発明の好ましい実施例において使用される標識成分の
作製方法は、従来から知られている方法を使用すること
ができる。最も好ましいのは、標識プローブ又は第２標
識抗ハイブリツドを含む検定フォーマントである。前述
した標識はこれらの実施態様に用いることができる。プ
ローブ標識に際しては、交雑に関与する標識プローブの
能力に実質的に干渉することなく核酸を変更するうえに
有効な合成法を使用し、標識を後に検出することを可能
にするように交雑のために使用される条件の下に十分に
安定な標識を選定する。

−例として、プローブ標識に次の方法を使用することが
できる。放射性標識ヌクレオチドは、ニックトランスレ
ーション、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素による
末端標識及び生体内標識のような種々の方法によってＤ
ＮＡプローブに組込むことができる。放射線標識ヌクレ
オチドは、米国ウィスコンシン州マジソン、Ｐｒｏｍｅ
ｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｋのリボプローブ（商標）ＤＮＡテ
ンプレート系を用いてバクテリオファージＳＰ６からＤ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼと共に試験管内でＲＮＡプ
ローブに組込むことができる。ランガーほか（（１９８
１）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
＋　７８　：　６６３３　）の方法を用いて、デオキシ
ウリジントリホスフェート及び５−（３−アミノ）アリ
ルウリジンの第１アミンにビオチンを結合することがで
きる。これらのビオチン化ヌクレオチドは、二本鎖ＤＮ
Ａにニックトランスレーションによって組込み、又は末
端デオキシヌクレオチジル転移酵素と共に３°　−ＯＨ
末端に付加させることができる。ビオチンは、ポリアミ
ン（Ｂｒｏｋｅｒ＋　Ｔ、　Ｒ，＋　（１９７８）　Ｎ
ｕｃｌ。

八ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、４　：　３６３）及びシトクロ
ームＣフ゛リッジ（Ｓｏｄｊａ、　Ａ及びＤａｖｉｄｓ
ｏｎ、　Ｎ、（１９７８）Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　
Ｒｅｓ、５　：　３８５）を介してＲＮＡの３°　−Ｏ
Ｈ末端に付着させることもできる。

１２５■−ヒストンをゲルタールアルデヒドにより変性
ＤＮＡに結合させたレンツの方法（（１９８３＞ＥＭＢ
ＯＪｏｕｒｎａｌ、２　：　８１７）によってプロティ
ン標識をプローブに直接結合することができる。

ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼのよう
な酵素は、同様の科学的方法（Ｒｅｎｚ　ａｎｄＫｕｒ
ｚ　（１９８４）　Ｎｕｃｌ、八ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、１
２　：　３４３５）によってＤＮＡプローブに結合させ
得る。ＤＮＡプローブに末端標識するための他の科学的
方法として、Ｅｓｈａｇｈｐｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ　（（
１９７９）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ。

Ｒｅｓ、７　：　１４８５’）に記載された方法がある
。１以上の４−チオウリジン残渣をＤＮＡの３’　−Ｏ
Ｈ端に導入し、種々の親電子低分子量の試薬とチオール
とを反応させる。この科学的方法を用いて種々のハプテ
ンをＤＮＡプローブに付着させることができる。ハプテ
ンＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン
で標識することは、Ｔｃｈｅｎ等（（１９８４）　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８１　
：３４６６）に記載されている。ＤＮＡ及びＲＮＡプロ
ーブをＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオ
レンと反応させて、グアニンの８−炭素値に結合したＮ
−２−アセチルアミノフルオレン残基を有するアダクト
を生成させることができる。この共有結合によって修正
されたＤＮＡは、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチル−
アミノフルオレン残基に対して産生した抗体により検出
し得る。Ｈｕ及びＭｅｓｓｉｎｇ　（（１９８２）　Ｇ
ｅｎｅ、１７　：２７１〕の方法は、−重鎖のＭ１３ベ
クターにクローニングしたプローブに標識を付加するた
めに用いることができる。クローニングが部位に対する
領域５°と相補のユニバーサルプライマーは、プローブ
の塩基配列から下流側のＭ１３鎮と相補のＤＮＡ合成を
開始させる。ＤＮＡポリメラーゼは、放射性ヌクレオチ
ドトリホスフェート及びビオチン５−（３−アミノアリ
ル）デオキシウリジントリホスフェートを新しい鎖に組
込むので、これらの標識を、プローブ連鎖から離れたベ
クターに付着せしめることができる。二本鎖部分を８−
アジドエチジウムと反応させて修正することもできる。

標識抗体の作製については、多（の文献に広く記載され
ている。１′Ｉ−標識は、Ｂａ１ｔｏｎ　ａｎｄ　Ｈｕ
ｎｔｅｒ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１３３：５
２９の方法によって行うことができ、Ｉｓｈｉｋａｗａ
　等（１９８３）Ｊ、　１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　４　
：　２０９には、種々の酵素を抗体に結合させるいくつ
かの方法が解読されている。Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等（１
９７９）　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊。

１０１：３９５は、グルコースオキシダーゼを抗体に結
合するためにマレイミドを用いる方法が記載している。

アルカリ性ホスファクーゼをグルタメルアルデヒドで抗
体に結合させることができる（Ｖｏｌｌｅｒ等（１９７
６）　Ｂｕｌｌ、　Ｗｏｒｌｄ　ＨｅａｌｔｈＯｒｇａ
ｎ、、５３　：　５５　）　ｏ　Ｂｌａｋｅｓｌｅｅ　
ａｎｄ　Ｂａ１ｎｅｓ（１９７６）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　Ｍｅｔｈ、＋　１３　：　３０５の方法によれ
ば、抗体にフルオレセインで標識化することができる。

５ｃｈｒｏｅｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９８１）Ｃｈｅ
ｎ、　Ｃｈｅｍ　、２７　：　１３７　Ｂの方法により
ケミルミネッセント標識を導入することができる。

本発明による試験法の具体的な実施態様を、添付図面及
び下記の実施例によって詳細に説明する。

第１図に示した方法は、問題にしているサンプルの塩基
配列かＲＮＡである場合にＲ’ＮＡ又はＤＮＡであり、
サンプルの塩基配列がＤＮＡである場合にＲＮＡである
非標識ポリヌクレオチドプローブを使用する。場合によ
り、ＲＮＡ　−ＲＮＡハイブリッド又はＲＮＡ　−ＤＮ
Ａハイブリッドに選択性を示す同−又は異なった多クロ
ーン又は単クローン免疫グロブリンを含み得る二つの群
の抗ハイブリッド抗体（Ａｂ）が使用される。第１の抗
ハイブリッド試薬は、不動化（固定化）型になっており
、第２のものは、螢光性物質で標識されている。問題の
塩基配列とプローブとの間にハイブリッドが形成される
と、抗ハイブリッド試薬のための結合部位が形成される
。その結果、ハイブリッドは、不動化抗ハイブリッドと
の結合によって不動化（固定化）され、標識抗ハイブリ
ッドの結合によって螢光標識される。生成した不動化さ
れ標識化されたハイブリッドを、非結合（遊離）の標識
抗ハイブリッドから分離し、不動化種により生じた螢光
量を測定し、サンプル中の問題としている塩基配列の存
在又は量について相関させる。

第２図に示した方法によれば、プローブは、ビオチン標
識（ｂｉｏ　）と科学的に結合された挿入体（Ｉｎｔｅ
ｒｃａｌｔｏｒ　）　（１）とで二重に修正されている
。挿入錯化合物に対する抗体（Ａｂ）は、重要な抗ハイ
ブリッド試薬として用いられ、不動化型で供与される。

ビオチン標識は、検出可能な酵素で標識したアビジン（
Ａｖ）を用いて検出する。交雑工程が終了したら、生成
した不動化ハイブリッドと標識ハイブリッドとを非結合
の標識アビジンから分離し、不動化種の酵素活性を測定
し、問題としている塩基配列の存在に相関させる。

反応混合物 検定しようとするサンプルは、どんな媒体であってもよ
く、通常は、医学、獣医学、環境、栄養又は産業上の意
味をもった液体サンプルである。

尿、血／＆（血ｌ１４を又は血漿）、乳、脳を髄液、喀
痰、糞便、肺アスピレート、のどのタンポン、膣タンポ
ン及び排泄物、直腸クンボン、鼻咽腔アスピレートをは
じめとする人及び動物の試料及び体液を、特に、本発明
の試験方法により試験することができる。患者又は他の
被検源からの試験サンプルが、細胞内に含まれるものの
ような主に二本鎖の核酸を含有する場合、核酸を変性す
るために、そして必要ならば最初に核酸を細胞から遊離
せしめるために、試料を処理する。核酸の変性は、好ま
しくは、アルカリ処理（例、０．ＩＮ水酸化ナトリウム
）又は沸騰水中の加熱によって行い、この処理は、所望
ならば、細胞を溶解させるためにも同時に使用し得る。

核酸の遊離は、例えば、機械的分断（冷凍／融解、摩擦
、高周波による分解）、物理／科学的分断（Ｔｒｉｔｏ
ｎ、　Ｔｗｃｅｎ　％　ドデシル硫酸ナトリウムのよう
な洗剤処理、アルカリ処理浸透衝撃又は熱処理）又は酵
素熔解（リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ペプシン）に
よって行われる。生成した試験媒体は、−重鎖型の核酸
を含有しており、これば本発明の交雑方法により試験す
ることができる。ＲＮＡ　−ＤＮＡハイブリッドを標識
抗体試薬で検出せんとする場合には、アルカリ性の条件
（即ち、サンプル中の核酸を変性するために用いる条件
と同一の条件）による処理のような普通の方法によって
、試料中のｍＲＮＡ及びｒＲＮＡを、交雑反応に関与さ
せないようにすることができる。

当該技術において周知のように、種々の交雑条件を試験
に使用することができる。典型的には、少し温度を高く
して、例えば、約３５゛〜７５℃、通常は、約６５℃の
温度で、ｐＨ約６〜８の適切なイオン強度（例えば５Ｘ
ＳＳＣ−ここにｌＸ５ＳＣ−〇、１５　Ｍ塩化ナトリウ
ム及び０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ　Ｈ７，０
）の緩衝液、所望ならば、プロティン、例えば、牛血清
アルブミン及び変性外来性ＤＮＡ　（例えば子牛胸腺又
は鮭精子から得たもの）を含有する溶液中において、交
雑を行なう。比較的低い交雑温度が望ましい場合には、
水素結合試薬、例えば、ジメチルスルホキシド及びホル
ムアルデヒドを含有させてもよい。交雑を生起させるの
に必要なサンプル鎖とプローブ鎖との間の相補度は、条
件の厳密度に依存する。この厳密度を定めるファクター
は当該技術においては周知である。

通常は、交雑のために選定された温度条件は、生成ハイ
ブリッドと抗ハイブリッド試薬との結合及び標識の応答
の検出に適合しない。そのため、抗ハイブリッド結合工
程及び標識検出工程とは、交雑工程の終了後に進行する
。反応混合物は、通常は、約り℃〜約４０℃の温度範囲
とされ、結合−検出工程はその後に行われる。塩及び／
又はホルムアミドの濃度が抗体結合反応を大きく妨害す
る程度に高い場合には、抗ハイブリッドの添加前に交雑
混合物を希釈することが望ましい。

試薬系 本発明は、所望の試験方法を実施するうえに必要な全て
の要素を含む試薬系即ち試薬の組合わせ或いは手段をも
提供する。試薬系は、試薬の和合性が許容するならば組
成物又は混合物として商業的にパッケージされた形で、
試験装置の形で、又はより普通には、テストキット、即
ち必要な試薬と、通常は試験を遂行するうえの指示書を
含めた１以上の容器、装置その他のパッケージされた組
合わせとして供与される。本発明の試薬系は、本明細書
に記載される種々の交雑フォーマ・ノドを実施するため
の全ての形態及び組成を包含する。

試薬系は、すべての場合において、（ｉ）本明細書中に
説明した核酸プローブと（ｉｉ）抗ノ＼イブリッド試薬
とを有する。試薬系のテストキ・ノドは、補助薬、例え
ば、交雑溶液成分、並びに、試験サンプル中の二本鎖の
核酸を一本鎖の形に変換することのできる変性剤を、更
に有してもよい。好ましくは、−重鎖の核酸をサンプル
からリリースするためにサンプルを処理するための科学
的に溶解−変性する薬剤も含まれる。

次に本発明を次に示す実施例によって更に説明するが、
これらは本発明を限定するものではない。

実施例■ 不動化（固定化）ハイブリッド及び標識抗ノ＼イブリッ
ドを用いる交雑試験 Δ、サイトメガロウィルスのＲＮＡプローブの作サルモ
ネラ・チフイムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈ
ｊｍｕｒｉｕｍ　）　Ｌ　Ｔ　２細胞に感染したバタテ
オファージＳＰ６からのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーターを含むベクターに、シクロメガロウイル
スのゲノムからのＤＮＡ断片をクローニングする。クロ
ーニングされた塩基配列は、ポリメラーゼにより転写さ
れ、ＲＮＡプローブを生成する。

サイトメガロウィルスＤＮＡは、ＥｃｏＲｌ制限エンド
ヌクレアーゼにより消化され、断片は、プラスミドｐＡ
ｃＹｃ１８４にクローニングされる（Ｔａｍａｓｈｉｒ
ｏ　ｅｔ　ａｌ　（１９８２）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ　４２：５４７−５５７）。このプラスミドは、大腸
菌株ＨＢＩＯＩに増殖され、Ｔａｍａｓｈｉｒｏの文献
に定義されるＥｃｏＲＩ　ｅ断片は、プローブの調製の
ために使用される。精製されたプラスミドは、ＥｃｏＲ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼにより消化され、インサート
は、アガロースゲル電気泳動によって単離される（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ等（１９８２）　”　ＭｏＩｅｃｕＩａｒ
　ＣｒｌｏｎｉｎｇＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　、サイトメガロウイ
ルスＥｃｏＲＩ　Ｇ断片は、米国ウィスコンシン州マジ
ソン、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃから入手されたｐ
ｓＰ６５ベクターのＥｃｏＲ１部位にクローニングされ
る。

ＥｃｏＲ１ｅインサートを含むｐｓＰ６５ベクターは、
ＥｃｏｌｉＪＭ　１０３細胞中に３７℃で増殖される。

細胞は溶解され、細胞ＤＮＡはフェノール／クロロホル
ム抽出によって単離される。プラスアミドは、塩化セシ
ウム−臭化エチジウム勾配液中の遠心分離によって、染
色体ＤＮＡから分離される（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　
ａｌの前記文献〕。

塩化セシウム及び臭化エチジウムは、ＮａＣｌ３０ｍＭ
及びＥＤＴＡｌｍＭを含有するトリス−塩酸塩緩衝液（
ｐＨ７，５）中において５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０
（米国ニューシャーシー州ピスカタウエイ、ファーマシ
ア・ファイン・ケミカル社製）上でゲル濾過することに
より、プラスミドから分離される。

ＤＮＡ含有流出液を集め、冷エタノールによってＤＮＡ
を沈澱させる。５０ｍＭ　ＮａＣ１、１０ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２及び１ｍＭ　ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔ
ｈｒｅｉｔｏｌ）を含有する１０ｍＭ）リスー塩酸塩緩
（ｈ液（ｐＨ７，５）中に沈澱物を熔解させ、ＤＮＡ１
μｇ当り１単位の旧ｎｄＩ［［制限エンドヌクレアーゼ
を用いて１時間３７℃で消化させる。混合物をフェノー
ル／クロロホルムで１回抽出し、冷エタノールでＤＮＡ
を沈澱させる。沈澱物を１０１＋１Ｍトリス−塩酸塩緩
（Ｆ液（ｐＨ７，４）中に溶解させ、０．５ｍｇＤ　Ｎ
　Ａ　／ｍ＋を得る。

このｐＳＰ６５ベクターをＥｃｏＲＩ　ｅインサートと
共に、プロモーターに始まって、旧ｎｄｌ［［制限エン
ドヌクレアーゼにより切断された部位に終わるように、
Ｓ　Ｐ　６　ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにより転写
する。転写領域中の大部分のＤＮＡはＥｃｏＲ１インサ
ートである。

転写反応混合物（５００μＬ）組成は、旧ｎｄＩ［［消
化ＤＮＡ５０μｇ、トリス−塩酸塩緩衝液４０ｍＷ　（
ｐＨ７，５）　、ＭｇＣｌ２６ｍＭ、スペルミン２１Ｉ
ＩＭ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰ　Ｏ，５ｍＭ
、ジチオトレイトール１０ｎ＋Ｍ、ＲＮａｓｉｎ　（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ製）５００単位及び５Ｐ６
ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ製
）５０単位である。反応は１時間室温で行わせ、次に余
分にＲＮＡポリメラーゼ５０単位を添加し、１時間反応
させる。

混合物のＤＮＡは、Ｒナーゼを含まないＤナーセ１０μ
ｇにて１０分間３７℃で消化させることにより破壊する
。反応混合物を、フェノール／クロロホルムにより抽出
し、トリス−塩酸塩緩衝液１０　ｍｌ　（ｐＨ７，４）
　、ＮａＣｌ　０．１Ｍ中においてセファデックスＧ−
５０を用いたクロマトグラフィーにより精製する。ＲＮ
Ａを収集し、冷エタノールで６：、緻させる。ＥＤＴＡ
１ｎ＋Ｍを含有する酢酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ　（
ｐＨ６，０）中にこの沈澱物をン容解させる。

Ｂ、単クローン抗体からのＲＮＡ−ＤＮＡ調製１）ＲＮ
Ａ−ＤＮＡハイブリッドの調製−大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１
１．　）からＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼでφ×１７
４ヴイリオンＤＮＡを転写することによってハイブリッ
ドを調製する。この手順は、Ｎａｋａｚａｔｏ　（１９
８０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９　：　２８３５に記載さ
れている。

ｉｉ）メチル化チログロブリンのｆＪＩ製−生のチログ
ロブリン（米国ミズリー州セントルイス、シグマ・ケミ
カル社製）１０（１ｍｇを、無水メタノールｌＱｍｌ及
び２．５Ｍ塩酸のメタノール溶液４００μｌと合わせる
。混合物を回転ミキサーにより室温で５日間反応させる
。沈澱物を遠心分離により収集し、メタノールで２回、
エタノールで２回それぞれ洗浄し、−晩真空下に乾燥す
る。

ｉｉｉ　）マウスの免疫化。２０ｍＭ１−リス−塩酸塩
緩衝液２５０　ｐ　Ｉ　（ｐＨ７，４）及びＥＤＴＡ１
ｍＭ中ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド１５０μｇを、水２
５０μＩ中メチル化千ログロブリン１５０μｇと合わせ
る。生成した沈澱に、トリス緩衝液２．５ｍｌを添加す
る。全混合物を等容量のフロイント・アジュバントで乳
化する。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを懸濁体０．５
ｍｌで免疫化する。３週間後から１週おきにブースター
免疫を与える。最初のブースト後１週間後から２週おき
に血液を採取する。

酵素標識イミュノソルベント（ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｖｅ
ｎｔ　）試験法を用いて、血清中の抗体価を測定する。

米国バージニア州アレキサンドリア、グイナテノク社製
の１　ｍｍｕｌｏｎ　１１マイクロタイターウエルの各
々に５μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを入れることにより、こ
れらのウェルをＲＮＡ　−ＤＮＡによって被覆する。Ｒ
ＮＡ　−ＤＮＡは、ＮａＣ１０，１５Ｍを含有する０、
０１５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８Ｍ）中
にある。溶液を２時間室温に放置した後、牛血清アルブ
ミン５ｍｇ／ｍＬ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０殺菌剤
（Ｖ／Ｖ）を含有する０、０２　Ｍリン酸ナトリウム緩
ｆｆｊ液（ｐＨ７，４）でウェルを洗浄する。適宜希釈
した抗血清（ａｎｔｉ−ｓｅｒｕｍ）をウェルに添加し
て抗体を不動化ＲＮＡ　−ＤＮＡに結合させる。次に周
知の手順により、抗マウスＩｇＧで標識した酵素により
検出する。ＲＮＡ　−ＤＮＡには高血清タイターをもつ
が単一鎖ＤＮＡには低タイターをもつマウスの牌臓細胞
をミエローマ（骨髄腫）細胞と共に融解させ、ハイブリ
ドーマを生成させる（Ｓｔｕａｒｔｅｔ　ａｌ　（１９
８１）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７８　：　３７５１　；　Ｇａｌｆｒｅａｎｄ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）　Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ、７３　：　１）。

クローン化されたハイブリドーマ（Ｃｌｏｎｅｄｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａｓ）をマウスの骨髄内において生長させ、
以後の研究のための適切な量の抗体を生成させる。

トリス−塩酸塩緩衝液１０ｍＭ　（ｐＨ８，０）　（０
，１５Ｍ　ＮａＣｌ含有）により平衡させたＡｆｆｉｇ
ｅｌ−Ｂｌｎｅ（登録商標）樹脂（米国カリフォルニア
州すソチモンド、リオーラソド・ラボラトリーズ製）上
でクロマトグラフィ処理することにより、腹水液からア
ルブミンを除去する。１０ｍＭ）リス−塩酸塩緩衝液か
ら、０．２Ｍ　ＮａＣ１を含有するこの緩衝液に直線勾
配法を用いて、抗体含有基流出液をＤＡＥＴセファロー
ス（米国ニューシャーシー州ビス力タウエイ、ファーマ
シア・ファイン・ケミカルズ）上のクロマトグラフィ処
理により精製する。

溶離プロティンの主要ピークは、トランスフェリン及び
アルブミンを含まない単クローン抗体を含有する。

Ｃ，ＲＮＡ−ＤＮＡに対する単クローン抗体の不動化 ＲＮＡ　−ＤＮＡに対する単クローン抗体は、米国ミド
ルセソクス州ＬＫＢインスツルメンツから入手可能な磁
化可能な微小粒子である＾ｃｔ−ＭａｇｎｏｇｅｌＡｃ
Ａ４４上で不動化される。これらの粒子は、酸化鉄の７
％を含有する多孔室のポリアクリルアミド−アガロース
ビーズであり、この樹脂は、ゲルタールアルデヒドによ
り活性化される。抗体とΔｃｔ−Ｍａｇｎｏｇｅｌ　Ａ
　ｃ　Ａ　４４との結合は、メーカーの指示に従って行
う。

Ｄ、ＲＮＡ−ＤＮＡにたいするフルオレセイン標識抗体 ＲＮＡ　−ＤＮＡに対する精製抗体を、０．１Ｍホウ酸
ナナトリウム緩衝液ｐＨ９，０）中に透析し、抗体５ｍ
ｇを含有する０、５ｍｌを、ホウ酸緩衝液中において、
５−　（４，６−シクロロトリアジンー２−イル）−ア
ミノフルオレセイン（米国オレゴン州、ジャンクション
シティ、モレキュラープロープズＩｎｃ、！り　０．５
ｍｌ混合させる。混合物を１時間２５℃で反応させた後
、０．１Ｍ）リス−塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）を溶離
剤として用いて、Ｉ　Ｘ　２５ｃｍ、＋＜イオゲルＰ−
６ＤＧ　（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ製）塔上で
クロマトグラフィ処理する。０．１ｍｌフラクションご
とに２８０　ｎｍの吸光度をモニターし、最初のピーク
を含むものをプールする。

フルオレセイン／プロティン比をＴｈｅ　ａｎｄ　Ｆｅ
１ｔｋｎｐ（１９７０）　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１８
　：　８６５の方法によって測定する。

Ｅ、尿中のサイトメガロウィルスの交雑試験この試験に
は、遠心分離と、熔解しているＲＮＡプローブとウィル
スＤＮＡとの交雑とが含まれる。

ハイブリッドの生成量は、不動化ＲＮＡ　−ＤＮＡに対
する抗体及びフルオレセイン標識抗体によって免疫科学
的に定められる。

細胞及びその断片は、５ｏｒｖａｌｌ　Ｇ　Ｌ　Ｃ−３
遠心分離機により３０００ｒｐｍで５分間遠心分１ｔｌ
［にかけることによって、尿から除去される。上澄み液
１０ｍ１を、ポリアロマ−超遠心分離筒中に挿入し、ヘ
ソクマンＴｉ５０ローターにより７５分間２５０００ｒ
ｐｍで回転させる。上澄み液を取出し、ペレ・ノドを０
．ＩＭ　Ｎａ０１１０．０５ｎ＋１に溶解させ、３０分
間３７℃で培養する。

０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）　、１
．８Ｍ　ＮａＣ１，０，１％ドデシル硫酸ナトリウム（
Ｗ／Ｖ）及び１ｍＭＥＤＴＡから成る溶液１５０μｌを
添加する。次にＲＮＡプローブ（２０ｎｇ）２０μｌを
添加し、混合物を６５℃で１０時間培養する。

反応液を室温まで冷却し、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び牛血
清アルブミン　５．０ｍｇ　／ｍｌを含有する０、１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）　６５０μＩを
添加する。次に、不動化抗体５０μｌを添加し、固相の
抗体を懸濁状態に保つように、混合物を３０分間攪拌す
る。フルオレセイン標識抗体５０μｌを添加し、１時間
攪拌を続ける。不動化抗体及びフルオレセイン標識抗体
試薬を予備実験において最適化し、被検体中に存在する
ＲＮＡ　−ＤＮＡハイブリッドの全量と結合するうえに
必要な以上の過剰レベルの抗体を形成する。

反応の終了時に反応管の一方の壁部に固体支持体を磁石
で吸引し、液を吸引除去する。２ｍＭのＭｇＣｌ２及び
０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０　（Ｖ／　Ｖ）を含有する０
、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）で固相を
１ａ＋１ずつ２回洗浄する。

固相に結合しているフルオレセインで表示された抗体を
、０．１ＭのＮａＯＨ０，１ｍｌの添加によって解離す
る。懸濁体を５分間攪拌し、固相を磁石により管底部に
吸引する。溶液の螢光を励起について４９５ｎｍの光で
、また放出について５２０ｎｍの光でそれぞれ測定する
。

サイトメガロウィルスを含有しないことがわかっている
尿素試料と並行して、管理検定を行う。

感染した尿素試料により発生させた螢光信号は、管理群
についての値よりも高い値を示すであろう。

実施例２ 不動化抗ハイブリッド及び標識プローブを用いる交雑検
定 Ａ、サイトメガロウィルスＤＮＡの標識プローブの調製 実施例Ｉにおいて得たＥｃｏＲＩ　ｅ断片を、米国メイ
ン州ベバレー、二ニー・イングランド・バイオラブズか
ら入手可能なＭ１３ｍｐ８ヘクターにクローニングする
。組替えウィルスを大腸菌に１２ＪＭＩＯＩ宿主中で増
殖させる。ポリエチレングリコールで沈澱させることに
より、培養流体からウィルスを分離し、−重鎖ヴイリオ
ンＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出によって単
離する。

塩基配列がＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＴの１７
塩基のオリゴデオキシヌクレオチドプライマーは、Ｅｃ
ｏＲ１ｅインサートの３’　−ＯＨ末端に近いＭ１３ｍ
ｌ）８区画と相補である。このプライマーは、大腸菌か
らのＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）
断片によるＤＮＡ合成を開始させ、複製は、ＥｃｏＲＩ
　ｅインサートを経て指向される。新しいＤＮＡプロー
ブは、通常のｄＴＴＰ（Ｌｅａｒｙ　ｅｔ　ａｌ　（１
９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、８０　：　４０４５）の代わりに反応混合物中
に（米国ニューヨーク州ニューヨーク、エンゾ・バイオ
ケミカル・Ｉｎｃ、から入手可能な）Ｂｉｏ−１１−ｄ
ＶＴＰを含めることにより、ビオチンで標識される。

精製されたＭ　１３ｍｐ　８　ＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ　
ｅインサートと共に、１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２（最終濃
度）を含有する２０ｍＭ１−リスー〇ＣＩ緩衝液（ｐＨ
８，０）中の、１モル過剰な１７塩基のプライマーにュ
ー・イングランド・バイオラプズ社製）と結合される（
Ｂａｎｋｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｒｒｅｌ＋　Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ　ｉｎ　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｅ１ｓｅｖｉｅｒ＋　Ｉｒｅｌａｎ
ｄ）　、混合物を５５℃で４５分間培養し、Ｍ１３ｍｐ
８ＤＮＡにプライマーをアニーリングする。反応混合物
を、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びＢｉｏ　−１１
−ｄＵＴＰ中において１５ｍＭとし、最終的に、ＤＮＡ
ポリメラーゼ■のフレノウ断片を添加する。この反応物
は、各組の試薬について定められた期間中２５℃で培養
する。反応時間は、ＥｃｏＲＩ　ｅインサートよりも少
し大きな、新しく合成されたＤＮＡ断片を与えるように
最適化する。最適時間を定めるために、いろいろの時に
反応混合物から試料を取り出し、変性アルカリ性アガロ
ースゲル中で電気泳動にかける（Ｍａｎｉａｔｉｓほか
の前記文献〕。この手順によって、ビオチンで標識され
たＤＮＡに多少の長さの変動が与えられる。しかしＥｃ
ｏＲＩｅインサートをこえてＭ１３塩基塩基中に標識Ｄ
　Ｎ　Ａを延長させることは、本発明の目的のために容
認される。

ＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出によって精製
し、エタノールで沈澱させる。これは、２０ｍＭトリス
−塩酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解させ、エチジウム
残渣は、共有結合の挿入錯体として導入する。この目的
のノこめに、８−アジドエチジウムを、Ｇｒａｖｅｓ　
ｅｔ　ａｌ　（１９７７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　、４７９　：　９８に記
載されたように調製し精製する（本発明者の研究によれ
ば、この手順によって、３−及び８−アジドエチジウム
の異性体混合物が得られる）。

Ｍ１３テンプレートに複合化された、ビオチン標識ＤＮ
Ａの／８液（約５０８ｇ　ＤＮＡ／ｍｌ）を、８−アジ
ドエチジウム中において０．５ｎ＋Ｍとし、１５０ワツ
トの室外スポットライトから１０〜２０ＣＩ１１の距離
で１時間光分解する。ガラス水浴中にあるガラス反応管
内の光分解の間Ｄ　Ｎ　Ａ　／８？＆を攪拌する。ガラ
スは紫外線を吸収し、水浴は、２０°〜３０°Ｃに反応
温度を保つために用いられる。

光分解の終了時点において、水により飽和したｎ−ブタ
ノールで１０回連続して抽出することにより、共有結合
されていないエチジウム光分解生成物を除去する。次に
、エタノールでＤＮＡを沈澱させ、トリス緩衝液に溶解
させる。共有結合しているＤＮＡの量は、光吸収の測定
と、光分解エチジウムアジドの吸光計数Ｅ４９０γ４　
Ｘ　１０３Ｍ　ＣＭ　（ＤＮＡに結合している光分解エ
チジウムのＡ　２６０及びＡ４９０　（Ａ２６６＝　（
Ａ４ｇ□　ｘ　２．３）　−０，０１１３とＤＮＡ塩基
対濃度のＥ２６０ざ１．３　Ｘ　１０’ＭＣｌ１１　と
の間の係数）によって推定する。

エチジウムは、挿入錯体が生成し得る二本鎖の領域でほ
ぼ排他的にＤＮＡに共有結合している。

目標は、１０〜５０個の塩基対に対して１つのエチジウ
ム残渣を導入することにある。光分解反応は、１時間の
反応期間内にほぼ終了させることができ、エチジウムの
合体は、光分解時間を少なくするか又はエチジウム濃度
を少なくすることにより減少させ得る。この合体は、新
しい８−アジドエチジウムを用いて光分解を反復するこ
とにより増大させ得る。

最後の工程は、ビオチン標識され挿入体で修正されたプ
ローブをＭ１３ｍｐ８テンブレ〜）Ｄブレ外ら分離する
ことにある。この分離は、アルカリ性アガロースゲル中
の電気泳動によって行う［Ｍａｎｉａｔｉｓほか、前記
文献］。ＤＮＡ帯は、臭化エチジウムによる螢光染色に
よって、ゲル中において検出される。ビオチン標識され
たＤＮＡは、Ｍ１３ｍｐ８テンプレート鎖よりも小さい
ため、比較的ずみやかに移動する。ビオチン標識された
ＤＮＡを含有するゲルは、切断され、ＤＮＡは電気溶離
により回収される。これは、前掲の文献（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓほか）に記述されている。

Ｂ、エチジウム挿入ＤＮＡに対する単クローン抗体の調
製 １）共有エチジウム−ＤＮＡ錯体の調製鮭精子ＤＮＡ　
（米国ミズリー州セントルイス１、ソグマ・ケミカル社
製）約２５０ｍｇを、５０ｍＭＮａＣ１４０ｍｌに溶解
し、２３ゲージの針に５回通ずことによってせん断する
。せん断ＤＮＡを２５０ｍ　ｌフラスコに入れ、別の１
６０ｍ１緩衝液によって希釈する。Ｓｌ−ヌクレアーゼ
１４５μｍ　１ｍｌ当たり２０’０．０００単位（米国
ニューシャーシー州ピスカタウエイ、ファーマシアｐ−
Ｌハイオケミカルズ製）を添加し、混合物を３７℃で５
０分間培養する。

次に反応混合物を、フェノール：クロロボルムで２回、
クロロホルムで１回各々抽出し、ＤＮＡをエタノールで
２回沈澱させる（Ｍａｎｉａｔｉｓほかの前記文献参照
〕。最終的な沈澱物を２０ｍＭ）’Ｊス塩酸塩緩衝液（
ｐＨ８，０）中に溶解させる。

このＤＮＡを、次の条件下に、８−アジドエチジウムと
反応させる。Ｄ　Ｎ　Ａ　２．７ｍｇ／ｍｌ　４．９５
ｍＭ８−アジドエチジウム１３．５ｍｌ、０．２Ｍ　）
リスー塩酸塩緩１ｈ液１３．５ｍｌ　（ｐＨ８，０）、
０．２Ｍ　ＮａＣ］及び７６ｍ１の水と共に、反応混合
物を調製する。水ジャケットの温度を２２°Ｃに保った
２５０ｍ１ビーカーに混合物を入れる。混合物を攪拌し
、ｌ０ｃｍの距離から１５０ワツトのスポットライトに
よって６０分間照明する。同一の混合物について、この
先分解を反復する。

光分解反応混合物を合併し、２０ｍＭ）リスー塩酸塩緩
１ｈ液（ｐＨ８，０）と０．２ＭのＮａＣ１とで飽和さ
せたｎ−ブタノールの等量ずつで１０回抽出する。抽出
ＤＮＡ溶液は、４．９５ｍＭの８−アジドエチジウム２
３ｍ１及び２０ｍＭのトリス−塩酸塩緩衝液７７ｍｌ　
（ｐＨ８，０）　、０．２　ＭのＮａＣ１と合併する。

この溶液を前記のようにして６０分間光分解する。反応
生成物は、前記のように、緩衝液飽和されたブタノール
で１０回抽出し、ＤＮＡはエタールと共に抽出する。沈
澱物は、ｌｏｍＭのトリス−塩酸塩Ｉ、！衝液（ｐＨ８
，０）　、１ｍＭのＥＤＴＡに溶解させ、２６０μｍ及
び４９０μｍの吸光を記録する。

ｉｉ）共有結合エチジウム−ＤＮＡメチル化チログロフ
′リン錯体の８周部 上記実施例１．Ｂ−（ｉｉ）に述べたように調製したメ
チル化チログロブリン５ｍｇを水１ｍｌに溶解さゼ、２
．２１１１ｇ／ｌｌ１１共有結合エチジウムＤＮＡ溶液
５．６ｍｌを添加する。直ちに沈澱が形成され、懸濁体
は、０．１５　ＭのＮａＣ１で６２．５ｍｌまで希釈さ
れる。

この懸濁体を、同量のフロイント・アジュバントで乳化
し、各々のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスをこの混合物
０．５ｎ＋１を皮下注射して免疫化する。同じ混合物を
用いて２週間の間隔でブースター免疫化を与える。１週
間後に試験採血し、各々の免疫化は、３回目のブースト
の後に開始する。　′ 抗体タイターは、標準酵素標識免疫吸着法によって検定
する。共有結合により挿入されたＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ
及び−重鎮ＤＮＡは、実施例１．Ｂ（ｉｉｉ　）に述べ
られたように、マイクロタイターウェルに塗布される。

希釈した抗血清は、塗布されたウェルにおいて培養し、
不動化抗体に結合している抗体は、前記のように検出す
る。抗血清は、タイターの低いものについては一重鎖及
び二本鎖ＤＮＡに、またタイターの高いものについては
共有結合により挿入されたＤＮＡにそれぞれスクリーニ
ングする。

別の実験で、非共有結合エチジウム−ＤＮＡ挿入錯体に
対する抗体タイターを測定する。この目的のために、二
本鎖のＤＮＡをウェルに塗布し、１００μＭの臭化エチ
ジウムを、希釈された抗血清及びその後の全部の結合溶
液及び洗浄溶液に含有させるが、酵素活性を測定するた
めに用いる基質溶液には含有させない。

抗血清は、典型的には、非共有結合錯体に対してよりも
共有結合により挿入されたＩ）ＮＡに、より高いタイタ
ーを与える。この差異は、二本鎖ＤＮＡのリン酸塩−リ
ボース構造に低収率において共有結合されるエチジウム
残基に対する抗体の存在に起因する。そのため、共有結
合により挿入されたＤＮＡに対して高いタイターの動物
が、ハイプリドーマの調製に用いられる。

選択されたマウスからの肺細胞をミエローマ（骨髄腫）
の細胞と融合させてハイプリドーマを生成させる（Ｓｔ
ｕａｒｔほかの前掲の文献及びＧ１１ｆｒｅａＯｄ　Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎの前掲の文献参照〕。バイプリドーマの
細胞は、選択媒質中にクローニングし、共有結合により
挿入されたＤＮＡに対する抗体を生成するものは、マイ
スの腹腔内に抗体を生成させるように選択される。

抗体は腹水液から、前記実施例１．　Ｂ　−（ｉｉｉ）
に記載したように単離する。

Ｃ０β−ガラクトシダーゼ＝ストレプクビジン複合体（
コンジュゲート）の調製 β−ガラクトシダーゼ上のスルフヒドリル残基は、ジチ
オトレイトールで還元することにより現われる。０．１
ＭのＮ〜２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２
−エタンスルホネート緩衝液（ＨＥＰＥＳ）　、ｐＨ７
，０，０，０９ＭのＮａＣ１２ｍｌに溶解させたβ−ガ
ラクトシダーゼ（３０，０００単位、等級Ｖｎｌ、シグ
マ・ケミカル製）を、３．５μモルのジチオトレイトー
ルと混合し、室温に４時間放置する。ジチオトレイトル
は、セファロース６ＢＣＩ　（ファーマシア・ファイン
・ケミカルズ製）の２．５Ｘ　８０ｃｎ＋カラムを用い
て前記ｋＷ　ｆ！６液中のクロマトグラフィ処理によっ
て除去する。プロティン含有フラクションはプールされ
たものに合併する。

酵素１モル当たりのスルフヒドリル基のモル数は、Ｅｌ
ｌｍａｎ　（１９５９）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

８２：１０の方法によって測定する。

スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＭＣＣ）　（米
国イリノイ州ロックフォード、ピアース・ケミカル社製
）５゜３ｍｇを、無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２
５０μｌに溶解させ、この４０．１７１を０．１Ｍ（７
）ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）　１０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣ１３ｍｌと混合する。この水溶液２５μｌを、ＨＥ
　Ｐ　Ｅ　Ｓ　／ＮａＣ１緩衝液８２５μｍに添加する
。この反応混合物を室温に１５分放置した後、未反応の
グルタチオンを、エルマン法によって測定する。この結
果を用いてＳＭＣＣ濃度を測定する。

米国メリーランド州ゲイターズバーグ、ベスセダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ製ストレプトアビジンを、バイオ
ゲルＰ−６ＤＧ中のゲル排除（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　）
クロマトグラフィ処理によって、０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ
緩ｉｈ液（ｐｉｌ　７．０）　１０．１５ＭＮａＣ１に
交換する。交換後に、３．７ｍｇ／ｍｌストレプトアビ
ジン１．７５＋ａｌを６１ｍＭ　ＳＭＣＣ１７，６ｐ　
１と混合し、１時間３０℃で反応させる。反応混合物を
ＨＥＰＥＳ＠衝液中においてｌＸ２５ｃｍのバイオゲル
Ｐ−６ＤＧカラム上でクロマトグラフィ処理する。２８
０ｎｍの吸収において第１流出ピークに対応するフラク
ションをプールし、前述したようにグルタチオンの逆滴
定によりマレイミド含量について検定する。

マレイミドは加水分解されるので、β−ガラクトシダー
ゼへの結合を可及的速やかに開始させる。

反応容積９．３ｍｌを与えるように、ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ
　緩衝液３．３ｍｌ中に溶解させた活性化ストレプトア
ビジン３．９ｍｇを、還元されたβ−ガラクトシダーゼ
３２ｍｇに添加する。２５℃、４時間後に、１ｍＭグル
タチオン８００μｍを添加することによって反応を終わ
らさせ、更に３０分培養を続ける。次に反応混合物を、
バイオゲルＡ−１，５ｍ（パイオーラード・ラボラトリ
ーズ）の１．５　Ｘ　１１０ｃｍカラムを用いてクロマ
トグラフ処理し、０．ＩＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７
，０）　１０．１５Ｍ　ＮａＣ１により転回する。

２ｍｌフラクションを収集し、２８０ｎｍの吸光度を記
録する。更に研究するために、第１ピークのものをプー
ルする。

Ｄ、エチジウム挿入ＤＮＡに対する抗体の不動化 エチジウム挿入ＤＮＡに対する化クローン抗体を、前記
実施例１．ｃのように、Ａｃｔ−マグノーゲルＡｃＡ４
４上において不動化する。

Ｅ、尿中サイトメガロウィルスの交雑試験ＲＮＡプロー
ブの代わりにビオチン標識ＤＮＡプローブ（前項Ａ）を
用いることを除いては、実施例■、Ｅに記載したように
して、尿試料の処理及び交雑反応を実施する。交雑反応
後に、２ｍＭＭｇＣ１２，５゜Ｏｍｇ牛血清アルブミン
／ｍｌ及びエチジウム挿入ＤＮＡ　（前項り参照）に対
する不動化抗体を含有する０、１　Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液６５０μｌ　（ｐＨ７，４）を添加する。固相の
抗体が懸濁状態に保たれるような仕方で混合物を３０分
間攪拌する。次に、β−ガラクトシダーゼラベルされた
ストレプトアビジン５０μｌを添加し、１時間攪拌を続
ける。

浸漬が終了したら、反応管の一方の壁に固相を磁石で吸
引し、液体を吸気により除去する。２．０ｍ　Ｍ　Ｍｇ
Ｃｌ　２及び０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０　（ｖ／ｖ）を
含有する０、１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
４）１ｍｌずつで固相を２回洗浄する。

固相に関連した酵素活性を、７−β−ガラクトシル−３
−〔６−アミノへキシルカルボキシアミドコクマリン（
Ｗｏｒａｈ　ｅｔ　ａｌ　（１９８１）　Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、２７　：　６７３）８００μＭを含有する０
、１Ｍ　リン酸ナトリウム緩衝液１．０ｍｌ　（ｐＨ７
，４）の添加により測定する。この浸漬終了時に固相粒
子を磁石によりキュベツト底部に吸引し、４００ｎｍの
励起及び４５０ｎｍの発光を用いて溶液の螢光を記録す
る。

サイトメガロウィルスを含有しないことがわかっている
尿試料と並行して管理検定を行う。感染された尿試料に
より発生する螢光信号は管理群のものよりも高くなる。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は本発明の好ましい実施例による試験
方法の説明図である。 ＦＩＧ、１ ＃春： １、−オ］Ｉ睡オ訳添り（テン７”ｌしくＳ） ２、ホ・リヌクレオナト“７°０−７゛（Ｐ） ３、ｙｆ９ｐＡヒオ？熾才ガ、ハイブリグドＦＩＧ、　
２ ２、＃側欠キナ入イネス更フ・ローブ ３、汗伊六イヒ剥しハイフ゛リクド及ゲ１ＦＮ＼希シイ
ｎ１手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年特許願第２６００９９号 ２、発明の名称 特定のポリヌクレオチド配列順序の検出方法３、補正を
する者 事件との関係　特許出願人 氏名　マイルス・ラボラトリーズ・インコーホレーテッ
ド４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　−重鎖の核酸を含む試験サンプル中の成る特定の
   ポリヌクレオチド配列順序の検出方法において、 （ａ）検出しようとする配列順序と実質的に相補の少な
   くとも１つの一本鎖の塩基配列順序を含む核酸プローブ
   を、該核酸プローブと該検出しようとする配列順序との
   間の交雑にとって好都合な条件の下に、該試験サンプル
   と接触させ、（ｂ）相補のプローブ配列順序と検出しよ
   うとする配列順序との間の交雑によって形成されて生じ
   たデュプレックスを、これらのデュプレックスとの結合
   選択性をもった抗体試薬と接触させ、このとき、該抗体
   試薬は不動化されているか又はその後不動化され、 （Ｃ）不動化された該抗体試薬と結合されるに至った該
   デュプレックスを測定する 各工程からなることを特徴とする検出方法。 ２）該抗体試料がＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドに対す
   る結合選択性を示し、ここで該プローブと検出しようと
   する配列順序とのうちどちらか一方はＤＮＡ、他方はＲ
   ＮＡであり、又は、該抗体試料が、ＲＮＡ−１（、ＮＡ
   ハイブリッドに対する結合選択性を示し、ここで該プロ
   ーブと検出しようとする配列順序の両方ともＲＮＡであ
   る特許請求の範囲第１項記載の検出方法。 ３）該抗体試料が、挿入錯体（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉ
   ｏｎｃｏｍｐｌｅｘ　）に対する選択結合性を示し、こ
   こに、検定に際して形成されたデュプレックスは、挿入
   錯体の形でそれに結合された核酸挿入体を含む特許請求
   の範囲第１項記載の検出方法。 ４）不動化抗体試薬に結合されるに至ったデュプレック
   スが、これらのデュプレックスと結合可能な第２抗体試
   薬の標識型のものの添加により測定され、該不動化試薬
   と結合されるに至った標識が測定される特許請求の範囲
   第１項記載の検出方法。 ５）第１と第２の抗体試薬が同一の物質である特許請求
   の範囲第４項記載の検出方法。 ６）該プローブが標識され、不動化抗体試薬と結合され
   るに至ったデュプレックスが、該不動化抗体試薬と結合
   されるに至った標識を測定することにより定められる特
   許請求の範囲第１項記載の検出方法。 ７）該抗体試薬が可溶型で添加され、特異的結合性リガ
   ンドに結合されており、生成したデュプレックスが該リ
   ガンドの結合相手の不動化型に更に接触される特許請求
   の範囲第１〜６項のいずれかに記載の検出方法。 ８）該リガンドがビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）又はハプテ
   ンであり、該結合相手がそれぞれアビジン又は抗ハブテ
   ンである特許請求の範囲第７項記載の検出方法。 ９）−重鎖の核酸を含む試験サンプル中の成る特定のポ
   リヌクレオチド配列順序の検出方法において、 （ａ）検出しようとする配列順序と実質的に相補の少な
   くとも１つの一本鎖の塩基配列順序を含む核酸プローブ
   を、該核酸プローブと該検出しようとする配列順序との
   間の交雑にとって好都合な条件の下に、該試験サンプル
   と接触させ、（ｂ）相補のプローブ配列順序と検出せん
   とする配列順序との間の交雑によって形成されてできた
   デュプレックスを、これらのデュプレックスとの選択的
   結合性をもった不動化抗体試薬と接触させ、（Ｃ）不動
   化抗体試薬と結合するに至った該デュプレックスを測定
   する 各工程からなることを特徴とする検出方法。 １０）該抗体試薬がＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドとの
   選択的結合性を示し、ここに該プローブと検出しようと
   する配列順序とのうちどちらか一方がＤＮＡ、他方がＲ
   ＮＡであるか、又は、該抗体試薬が、ＲＮＡ　−ＤＮＡ
   ハイブリッドとの選択的結合性を示し、ここに該プロー
   ブと検出しようとする配列順序の両方がＲＮＡであり、
   又は、該抗体試薬は、挿入錯体との選択的結合性を示し
   、ここに、検定に際して形成されたデュプレックスは、
   挿入錯体の形でそれに結合された核酸挿入体を含む特許
   請求の範囲第９項記載の検出方法。 １１）不動化抗体試薬に結合されるに至ったデュプレッ
   クスが、これらのデュプレックスと結合選択性をもった
   第２の抗体試薬の標識形式の添加により測定され、該不
   動化試薬と結合されるに至った標識が測定される特許請
   求の範囲第１０項記載の検出方法。 １２）第１と第２の抗体試薬が同一の物質である特許請
   求の範囲第１１項記載の検出方法。 １３）該プローブが標識され、不動化抗体試薬と結合さ
   れるに至ったデュプレックスが該不動化抗体試薬と結合
   されたラベルを測定することにより定められる特許請求
   の範囲第１０項記載の検出方法。 １４）ラベルが酵素活性基、フルオレソサー（螢光原体
   ）、クロモフォア（色原体）、ルミネソザ−（発光原体
   ）、特異的結合性リガンド又は放射性同位元素である特
   許請求の範囲第１１〜１３項のいずれかに記載の検出方
   法。 １５）ラベルが特異的結合性リガンドであり、生じたデ
   ュプレックスが該リガンドの結合相手と更に接触させら
   れ、該結合相手が検出可能な化学的な基によって標識さ
   れている特許請求の範囲第１４項記載の検出方法。 １６）該検出可能な化学的な基が、酵素活性基、フルオ
   レソサー、クロモフォア、ルミネソサー又は放射性同位
   元素である特許請求の範囲第１５項記載の検出方法。 １７）試験サンプルが、その中に存在する核酸を遊離し
   変性する条件にかけられた生物学的サンプルである特許
   請求の範囲第９項記載の検出方法。 １８）試料中の成る特定のポリヌクレオチド配列順序を
   検出するための試薬系であって、（ａ）検出せんとする
   配列順序と実質的に相補的な少なくとも１つの一本鎖の
   塩基配列順序を含む核酸プローブと、 （ｂ）相補的なプローブ配列順序と検出せんとする配列
   順序との間の交雑によって形成されるデュプレックスと
   の選択的結合性を示し、不動化されているか又は特異的
   結合性を示すリガンドに結合されている、抗体試薬と、 （Ｃ）該結合が不動化されていない場合、該リガンドの
   結合相手の不動化型とを含む試薬系。 １９）該抗体試薬がＤＮＡ　−ＲＮＡに対する選択的結
   合性を示し、ここで該プローブと検出せんとする配列順
   序のうちのどちらか一方がＤＮＡであって他方がＲＮＡ
   であるか、又は、該抗体試薬が、ＲＮＡ−ＲＮＡ雑種と
   の選択的結合性を示し、ここで該プローブと検出せんと
   する配列順序の両方がＲＮＡである特許請求の範囲第１
   ８項記載の試薬系。 ２０）該抗体試薬が、挿入錯体に対する選択的結合性を
   示し、ここに、検定に際して形成されたデュプレックス
   が、挿入錯体の形でそれに結合された核酸挿入体を含む
   特許請求の範囲第１８項記載の試薬系。 ２１）該デュプレックスに対する選択的結合性を示す第
   ２抗体試薬の標識型を更に含む特許請求の範囲第１８項
   記載の試薬系。 ２２）第１と第２の抗体試薬が同一の物質である特許請
   求の範囲第２１項記載の試薬系。 ２３）該プローブが標識を含む特許請求の範囲第１８項
   記載の試薬系。 ２４）該ラベルが、酵素活性基、フルオレソサー、クロ
   モフォア、ルミネッサー、特異的結合性リガンド又は放
   射性同位元素である特許請求の範囲第２１〜２３項のい
   ずれかに記載の試薬系。 ２５）ラベルが特異的結合性リガンドであり、試薬系が
   、該リガンドのための結合相手を更に含み、該結合相手
   は、検出可能な化学的な基によって標識されている特許
   請求の範囲第２４項記載の試薬系。 ２６）検出可能な化学的な基が、酵素活性基、フルオレ
   ソサー、クロモフォア、ルミネッサー又は放射性同位元
   素である特許請求の範囲第２５項記載の試薬系。 ２７）リガンドがビオチン又はハプテンであり、該結合
   相手が、それぞれ、アビジン又は抗ハプテン抗体である
   特許請求の範囲第１８項記載の試薬系。