JPS60203183A - 新規なバチルスｓｐ．ＨＡ３−３−２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なる微生物及びそ才りから産生される新規
なるシクロデキストリンφグルカノトランスフェラーゼ
（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ　ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅ　。

以下ＣＧＴａｓｅと略記する）に関する。

ＣＧＴａａｅは、医薬品用の包接化剤等として有用なシ
クロデキストリンを産生ずる作用（シクロデキストリン
生成作用）及びでんぷんを加水分解して液化せしめデキ
ストリンを生成する作用（でんぷん液化作用）を併有す
る酵素であり、その有用性が着目されている。

ＣＧＴａｓｅ及びそれを産生ずる好アルカリ性細菌につ
いては、堀越らによってまとめられた報告がある〔「好
アルカリ性微生物」、株式会社学会出版センター、１９
８２年、１０１〜１１０頁。

（英文）〕。ＣＧＴａｓｅ産生龍が筒く、工業的に利用
可能な菌株の単離は、特に、堀越らによって続ケラれ、
現在捷でにバチルスｓｐ、３８−２およヒｓｐ。

１７−１　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、３８−２．　ｓ
ｐ、１７−１　）等の優良株が見出されている〔堀越、
中村、松沢、山本、　Ｉｓｔ　、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｃｙｃｌｏｄｅ
ｘｔｒｉｎｓ　＋（１，３，）　ｐ、　２５　、１９８
１　、　Ｂｕｄａｐｅｓｔ、”　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｃａ
ｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒ
ｉｎｓ　”　）。

本発明者らは、従来のＣＧＴａｓｅ産生菌に比べて工業
的に利点を有する新規微生物の探索を続けた結果、１９
８２年１１月１１日、中華民国台湾省台北市のある土壌
の中から、従来のＣＧＴａｓｅ産生好アルカリ性細菌に
優るとも劣らない新菌株を単離することに成功し、さら
にこの新菌株から産生さｆるＣＧＴａｓｅが新規なる酵
素であることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明に係る新規微生物は、バチルスｓｐ、ＨＡ３−３
−２　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、ＨＡ３−３−２　）
と名イ＝Ｊけられ、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ
ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　）に寄
託嘔れている（寄託申請書受理番号：第３９６１２号）
。

バチルスｓｐ、ＨＡ　３−３−２の単離（１）第１次ス
クリーニング試験 希釈した土ｊＸ懸濁液１滴を非天平面培地ｎ−ｃ’（ｐ
Ｈｔｏ）上に接種し接地表面に拡げた後、３７℃で２〜
３日間培養した。この培地上に生育しコロニーの周囲に
透明な猿を形成した細菌を釣菌し、寒天斜面培地ｎ　−
Ｃ（ＰＩ−１１０）に分割９して培養した。

（２）　第２次スクリーニング試験 第１スクリーニング試験で選別された菌株全培地ＣＤ−
５（ｐＨ１０）に接１重し、３７℃で３〜４日間振盪培
養した。比較のために、バチルスｓｐ、１７−１を同一
条件で培地ＣＤ−５にて培養した。

Ｍ地ｎ　−Ｃ’：　ｌ−！＞モロコシデンプン２％、ベ
グトン０．５％、牛肉エキス帆５％。

Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、　Ｍｇ５Ｏ，”　７Ｈ２００，
０２％、　Ｎａ２ＣＯ３１％ｌ寒天１．５〜２　％ 培地１ｆ−Ｃ：デンプン２チ、ベグトン０．５チ。

酵母エキス０．５％、　Ｋ２　ＨＰ　０４０−１％。

Ｍｇ５ｏ４−７Ｈ２０ｏ、ｏ　２％、　Ｎａ２ＣＯ３１
チ、寒天１．５〜２％（Ｎａ２ＣＯ３は別途減菌させて
おく必要がある） 培地ＣＤ−５：可溶性デンゾン１％、メ１トノ０５チ、
牛肉エキス１％、　ＮａＣＬ Ｏ，５％　、　Ｎａ、ＣＯ３１％ ＣＧＴａｓｅ％生能の測定 第２次スクリーニング試験で得らｎた振盪培養液を採取
し、本菌株のＣＧＴａｓｅ産生能について測定した。第
１表に示したように、該菌株はバチルスｓｐ、１７−１
に優るとも劣らないＣＧＴａｓｅ産生能を有していた。

なお、該菌株は、主にβ−型のシクロデキストリンを産
生ずる。

第　１　表 バチルスｓｐ、１７−１　２’〜２ａ１４８０バチルス
ｓｐ、ＨＡ３−２−２　２’　ｌ　０６０１）シクロデ
キストリン（ＣＤ）生成活性２）アン１ン液化活性 この試験に分いては、以下の如き方法でＣＤ生成活性を
測定した。

振盪培養液（９６時間、３７℃）を遠心分離し、上清を
２５　ｍＭホウ砂緩衝液（ｐＨ８，５）で連続的に２倍
希釈して、希釈段階が２１　、２２　、２３．・・・。

２ｎ　のイσ釈酵素溶液を調製した。これらの溶液各１
−を、上記緩衝液で調製した２％可可溶性ノン１ン溶液
５ｍｌと混合し、混合物を５５℃に保持してＣＤ−生成
反↓６を行った。４８時間後、叡しく振盪しながら反応
混合物にトリクロロエチレン（ＴＯＥ）２．５　ｍｔを
加え、得ら扛た懸濁液を呈温で一夜保存した。しかる後
、試験管内を観察したところ、ある希釈段階までは多量
のＣＤ−ＴＣＥ複合体が沈積していたが、その−次の希
釈段階ではほとんど沈積が児ら扛なかった。このように
、＠接する２″：）の希釈段階における生成」、の差は
極めて明確に観桜できるので、十分量のＣＤを生成する
ことができるＣＧＴａｓｅの限界ｈ１．を容易に設定す
ることが６１能となる。かかる条件下において、供試酵
素液のＣＤ−生成活性を限界希釈段階　（２ｎ）として
表すことができる。本明細岩・ではこの方法にＣＤ−Ｔ
ＣＥ沃”と呼ぶ〔野本他、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　、旦。

Ｖ　（１９８４））、この方法で得られる値は半定量的
であるが、該方法はＣＧＴｒｓｅ産生細菌のスクリーニ
ングを行う上で簡便容易であり、しかもＣＤ生成活性を
直接測定する方法として有効なものである。

ＣＧＴａｓｅのデングン液化活性はヨード法〔ＮＮａｋ
ａｍｕｒａ、　ｅｔ　ａｌ−、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、　、　４０　、７５３（１９７６）］によ
り測定した。活性単位は、５０℃＋　ｐＨ８，５で１０
分間反応させた場合に、青色の強度（７００ｎｍ）を１
０％減少させたときの活性を一単位として表した。なお
、デンプン液化活性測定法（デキストリン生成活性測定
法）は直接ＣＤ生成活性を７１＜丁ものではないが、一
般のα−アミラーゼ活性測定法として汎用ちれている方
法である。

以下、本菌株の菌学的性質について記載する。

菌学的性質 （イ）形態学的性質 細胞は０．８　Ｘ　３．５〜４μｍのダラム陽性桿状体
である。連鎖状ではなくて単独で生育し、周毛（線毛）
による運動性を示す。１．２　Ｘ　１．５〜２μｍの胞
子を細胞木端に形成し、細胞の胞子形成部位は膨張した
形を示した。

■）　生育状Ｂ（酵母エキスを０．１％含むｐｌ（１１
の栄養寒天培地） 発育状態のコロニーは、白色の半透明で平担な粗−面を
有し、かつ不規則な輪郭を有する。

（ＣＩ　生化学的及び生理学的性負 （１１栄養培地（ｐ）１８．０）　＋ （２）　栄養培地（ｐＨ１０）　＋ （３）嫌気的条件下の栄養培地（ｐＨ８，０）　−（４
〕　嫌気的条件下の栄養培地（ｐＨ１０）　−（５）嫌
気的条件下のグルコース１％　＋徐加栄養培地（ｐＨ１
０） （６）嫌気的条件下のＮａＮＯ３１％添加　−栄養培地
（ｐＨ１０） （７）　アンモニウムの利用（ＰＩ（８、ｐＨ−１０及
びＮａＣ６１５％添加したＰ１１８．０の培地） （８）　クエン酸塩の利用（ｐＨ１０）　−（９）　ク
エン酸塩の利用（ＰＨ１５，Ｑの培　−−地にＮａＣｔ
を５％添加） （ｌＩ　硝＆塩から亜硝酸塩への還元（ｐ）１１０）　
−Ｕ　硝酸塩から亜硝酸塩への還元　＋ （ｐＨ８−０、ＮａＣＬ５　％添加） （２）　インドールの生成（ｐＨＩ　Ｑ）　−Ｑ３　イ
ｙ　トール（Ｄ生理　（ｐｆｌ　８．０　、　−８８０
４５％添加） Ｑ弔　硫化水素の生成（Ｎａ０４５％を　−６ミ加した
−１８．０の培地又は未徐 加のｐｏｌｉｏの培地） Ｕつ　ブルギニンを第１ｊ用したアンモニ　−アの生成
（ｐＨ１０） （２）　タンパク質加水分解活性（ｐＨ１（１）　±０
７ノ　でんふんの分解（ｐＨ１０）　＋１３８）　Ｔ′
ｗｅｃｎ　−８０の分解（ｐＨ１０）　−咋　ナロゾン
の分ＰＳ　（ｐＨ１０）　＋翰　ｖｐ試験　− Ｑυ　Ｍ　Ｒ試！ｊ４　（ｐＨ１０）　−（ＩＡ　ＭＲ
試ＭＡ　（ｐＨ８，０、ＮａＣＬ　５　％添加）　＋（
ハ）　カタラーセ゛　＋ Ｑ少　スキＪ・ミルク中での生育（ｐＨ１０）　脱色←
ν　糖類を利用した咳の生成 アシビノース　＋ グルコース　＋ ラクトース　＋ マルトース　＋ マンニトール　＋ デンソ°ン　＋ イヌリン　− ズルシトール　− α−メチルグルコ７ド　＋ セロビオース　＋ マンノース　十 ンフイノース　− ラムノース　− ガラクトース　＋ フルボーヌ　− フルクトース　士 −リ゛す７ン　− グリセリン　− キンローメ　士 生化￥的及び生理４的デーり （１１−（９）　；　”　十″細胞生育；　ａ　ＩＴ細
胞生育せず萌−翰：”十″活性有；パ−”活性なしくハ
）：＋”酸生成；”−”酸生成せす０　保存方法 好アルカリ性バチルス属細囚の通常の保存方法が適用さ
扛る。

次に１本菌株が産生するＣＧＴａｓｅについて説明する
。

ＣＧＴａａｅ　ｆ産生する好アルカリ性細菌としては、
これまでに堀越らの前記論文に発表されたＢａｃｉｌｌ
ｕｓ趙細菌が知られている。そこで、該論文に掲載され
た方法と同様にして本菌株振盪培養液から粗酵素を得、
該粗酵素のＰＩ−１−活性曲線をめた（第１図参照う。

この曲線を前記該論文中で分類された４つの粗酵素−一
活性曲線と比較したが、該曲線はこ庇ら４つの曲線のい
ずれとも相違した形状を示した（第２図参照）。なお、
堀越らのＣＧＴａｓｅ生産株Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
　３８−２はＴｙｐｅ　ＩＩＩに、またａｐ、１７−１
はＴｙｐｅ　ｎに属する。以上のＲ１果から、本菌株は
堀越らの菌株とは異なる。新規な菌株であることが判明
した。さらに精製酵素の分子量を比較した結果、堀越株
の生産するＣＧＴａｓｅの分子量が８８，０００である
のに対し、本菌株の生産するＣＧＴｒｓｅの分子量は７
９，０００であり、生ｆｆ１ｆるＣＧＴａｓｅも異る酵
素であることが判明した。

以下、本ＣＧＴａｓｅの理化学的性質について記載する
。

囚　作用 シクロデキストリン生成作用、デンプン液化作用０３）
基質特異性 デンプンおよびその分解生成物 （Ｃ）　至適ＰＨ及び安定ＰＨ範囲 至適ＰＨ５，５〜８．５　（第３図）　：　ＣＤ生成活
性争−−−ｅ至適ＰＨ５〜１０（第３図）：デングン液
化活性トーー〕安定ｐＨ６〜１０（ｉ４図）　：　ＣＤ
生成活性＠−−−”ガン１ン液化活性トー→ Ｉ　至適温度及び安矩温度 至適温度６５℃（第５図）　：ＣＤ生成活性・−−一・
デ／ｆン液化活性０−→ 安定温既５０〜５５℃（第６図）：ＣＤ生成活性・−−
−・デンプン液化活性。−〇 ［Ｆ］　阻害及び安定化 阻　害：タンパク質変性剤１重金属ｍｌ　（Ｈｇ　ｉど
）（ＥＤＴＡ、５ＴＰＰの阻＃はうけない）安定化：カ
ルシウムイオン ０　力価の測定法 （１１ＣＤ−ＴＣＥ４（ＣＤ生成活性測定法）（２）　
ヨード法（テン１ン液化活性測矩法）（Ｇ）　精製方法 第２表に記載した方法にょや精製することができる。な
お、ＤＥＡＥ−セルロース画分ｋＤＩｓｃＴｆ気泳動に
（＝Ｊしたが、単一バンドであった。

０　分子景 約７９，０００　（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
により測定）

【図面の簡単な説明】

第１図はバチルスＨＡ３−３−２から得たＣ　Ｇ　Ｔａ
５ｅ粗酵素のデンプン液化活性に及はすＰＨ効果を示し
た図、第２図は好アルカリ性バチルス属細菌におけるア
ルカリ性アミラーゼの…活性曲線の４つのタイプを示し
た図、第３図は該精製ＣＧＴａｓｅの活性に及ぼすＰＨ
効果を示した図、第４図は同精製酵素のＰｌｌ−安定曲
線を示した図、第５図は同精製酵素の活性に及はす温度
効果を示した図、第６図は同精製酵素の温度−安定曲線
を示した図である。 第１図及び第３〜６図において、・−−一・はＣＤ生成
活性を示し、　トーｏはデンプン液化活性を示す。 第１図 ｐＨ 第２Ｂ！ ｐＨｌ）ＨＰＨｐｈ 第３図 ｐＨ 第４図 第５図 １友　（０ｃ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 高温に至適温度を有し、新規シクロデキストリン・グル
   カノトランスフェラーゼ産生能′（［−Ｍするバチルス
   ５ｐＪＩＡ　３−３−２゜