JPS60207596A - 蛋白の産生方法 - Google Patents
蛋白の産生方法Info
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- JPS60207596A JPS60207596A JP59062981A JP6298184A JPS60207596A JP S60207596 A JPS60207596 A JP S60207596A JP 59062981 A JP59062981 A JP 59062981A JP 6298184 A JP6298184 A JP 6298184A JP S60207596 A JPS60207596 A JP S60207596A
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- plasmid
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- gene
- coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/67—Lipotropins, e.g. beta, gamma lipotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
- C07K14/675—Beta-endorphins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、蛋白の産生方法に関する。
大腸菌の外膜を構成する蛋白質のひとつであるＯｍｐ
Ｆ蛋白質は、大腸菌が最も多量に生産する蛋白質のひと
つである。その遺伝子Ｏｍｐ Ｆのプロモーターやリポ
ソーム結合領域はきわめて効率よく機能しているものと
考えられる。ｏｍｐ Ｆ’遺伝子の発現は複雑な制御を
受けるが、そのひとつとしてｏｍｐ Ｆ遺伝子発現の正
の制御遺伝子ｏｍｐ Ｂ遺伝子が知られており、Ｏｍｐ
Ｂ欠損変異株ではｏｍｐ Ｆ遺伝子は発現しない。また
培地の浸透圧によっても制御を受け、高浸透圧培地中で
はｏｍｐ Ｆ遺伝子の発現は抑制される。
Ｆ蛋白質は、大腸菌が最も多量に生産する蛋白質のひと
つである。その遺伝子Ｏｍｐ Ｆのプロモーターやリポ
ソーム結合領域はきわめて効率よく機能しているものと
考えられる。ｏｍｐ Ｆ’遺伝子の発現は複雑な制御を
受けるが、そのひとつとしてｏｍｐ Ｆ遺伝子発現の正
の制御遺伝子ｏｍｐ Ｂ遺伝子が知られており、Ｏｍｐ
Ｂ欠損変異株ではｏｍｐ Ｆ遺伝子は発現しない。また
培地の浸透圧によっても制御を受け、高浸透圧培地中で
はｏｍｐ Ｆ遺伝子の発現は抑制される。
ｏｍｐ Ｆ遺伝子の全塩基配列は本発明者らによって決
定されたが、それによればＯｍｐ Ｆ蛋白質はまずアミ
ン末端にコー個のアミノ酸よりなるシグナル・ペプチド
を有する前駆体として合成される。このシグナル・ペプ
チドはＯｍｐ ？蛋白質の細胞質膜からの分泌に必須の
役割を果たしているものと考えられる。さらにＯｍｐ
Ｆ蛋白質は外膜中で細胞壁を構成するペプチドグリカン
と強い親和性をもった非常に安定な形で多量に存在して
おり、この性質を利用して菌体から容易に精製すること
のできる蛋白質でもある。
定されたが、それによればＯｍｐ Ｆ蛋白質はまずアミ
ン末端にコー個のアミノ酸よりなるシグナル・ペプチド
を有する前駆体として合成される。このシグナル・ペプ
チドはＯｍｐ ？蛋白質の細胞質膜からの分泌に必須の
役割を果たしているものと考えられる。さらにＯｍｐ
Ｆ蛋白質は外膜中で細胞壁を構成するペプチドグリカン
と強い親和性をもった非常に安定な形で多量に存在して
おり、この性質を利用して菌体から容易に精製すること
のできる蛋白質でもある。
本発明者は、上記のような性質を有する大腸菌の外膜蛋
白質をコードする。ｍｐ Ｆ遺伝子に関する研究の一環
として、このＯｍｐ Ｆ遺伝子を含むプラスミドについ
て種々検討を行ない、先に、大腸菌のシグナルペプチド
をコードする遺伝子および所望の蛋白をコードする遺伝
子を含有するプラスミドベクターを見い出した。同ベク
ターは、遺伝子産物たる同蛋白の分泌を可能とする０ 本発明は、このプラスミドベクターを用いて蛋白を産生
させる際に、産生量をさらに向上させる方法に関するも
のである。
白質をコードする。ｍｐ Ｆ遺伝子に関する研究の一環
として、このＯｍｐ Ｆ遺伝子を含むプラスミドについ
て種々検討を行ない、先に、大腸菌のシグナルペプチド
をコードする遺伝子および所望の蛋白をコードする遺伝
子を含有するプラスミドベクターを見い出した。同ベク
ターは、遺伝子産物たる同蛋白の分泌を可能とする０ 本発明は、このプラスミドベクターを用いて蛋白を産生
させる際に、産生量をさらに向上させる方法に関するも
のである。
すなわち、本発明の要旨は、大腸菌のシグナルペプチド
をコードする遺伝子および所望の蛋白をコードする遺伝
子を含有するプラスミドベクターを、グロテアーゼ活性
が欠失または減少゛した宿主大腸菌に導入して同菌を培
養し、産、生ずる蛋白を菌体外に分泌させることを特徴
とする蛋白の産生方法にある。
をコードする遺伝子および所望の蛋白をコードする遺伝
子を含有するプラスミドベクターを、グロテアーゼ活性
が欠失または減少゛した宿主大腸菌に導入して同菌を培
養し、産、生ずる蛋白を菌体外に分泌させることを特徴
とする蛋白の産生方法にある。
以下、本発明の詳細な説明する。
まず、本発明において用いられるベクターは、大腸菌の
シグナルペプチドをコードする遺伝子および所望の蛋白
をコードする遺伝子を含有する。このようなベクターと
しては、たとえば大腸菌由来リラックス型プラスミドに
グラム陰性菌ｏｍｐ Ｆ ／’ ｌ：ｌモーターを含む
Ａｌｕ Ｉフラグメン）、Ａｌｕ ｌ −ｎｇｘ ■フ
ラグメントまたはＡｌｘ ｌ−Ｐｓｔ ｌ （部分消化
）フラグメントを挿入して得られるプラスミドベクター
が挙けられる。
シグナルペプチドをコードする遺伝子および所望の蛋白
をコードする遺伝子を含有する。このようなベクターと
しては、たとえば大腸菌由来リラックス型プラスミドに
グラム陰性菌ｏｍｐ Ｆ ／’ ｌ：ｌモーターを含む
Ａｌｕ Ｉフラグメン）、Ａｌｕ ｌ −ｎｇｘ ■フ
ラグメントまたはＡｌｘ ｌ−Ｐｓｔ ｌ （部分消化
）フラグメントを挿入して得られるプラスミドベクター
が挙けられる。
このベクターの製造法について説明するに、まず、原料
プラスミドとして用いられるのは、大腸菌由来で細胞当
り多数コピーとして存在するプラスミド、すなわちいわ
ゆる大腸菌由来リラックス型プラスミドである。このよ
うなプラスミドとしては、特に制限されないが、たとえ
ばｐＢＲｊ ２コ、ｐＢＲＪＪｊ、ｐＡｃＹｏ／＃１等
が挙げられるが、ｐＢＲＪコλが最も好ましい。
プラスミドとして用いられるのは、大腸菌由来で細胞当
り多数コピーとして存在するプラスミド、すなわちいわ
ゆる大腸菌由来リラックス型プラスミドである。このよ
うなプラスミドとしては、特に制限されないが、たとえ
ばｐＢＲｊ ２コ、ｐＢＲＪＪｊ、ｐＡｃＹｏ／＃１等
が挙げられるが、ｐＢＲＪコλが最も好ましい。
上記のプラスミドベクターは、この原料プラスミドに上
記したＯｍｐ Ｆ’プロモーターを含む特定のＤＮＡフ
ラグメントを導入して造成される。
記したＯｍｐ Ｆ’プロモーターを含む特定のＤＮＡフ
ラグメントを導入して造成される。
このＤＮＡフラグメントは、ｏｍｐＦプロモーターを含
む下記フラグメント（Ｉ）、（Ｉｆ）または（Ｉｌｌ）
である。
む下記フラグメント（Ｉ）、（Ｉｆ）または（Ｉｌｌ）
である。
（１） 止Ｉフラグメント
（…） 立且■−四巨■フ２グメント
（ｌｌＮ）止１− Ｐ＋匹■（部分消化）７ラグメント
このＤＮＡフラグメントはたとえば、次のようにして得
られる。
このＤＮＡフラグメントはたとえば、次のようにして得
られる。
すなわち、大腸菌に一／λのＯｍｐ Ｆ形質導入ファー
ジであるλｏｍｐ Ｆ／ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、／＋ｊ、１０ｆｆ＆−１０り０
（７９ざ０）参照）を、それぞれ制限酵素（１）に匹Ｌ
（＋＋）ｙ丑■と工■または（ｍ ）止ｌ（！：シェ
１（部分消化）を用いて切断して単離することにより上
記（１）、（…）または（ｌｉｔ）で示されるＤＮＡ７
ラグメントが得られる。
ジであるλｏｍｐ Ｆ／ （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、／＋ｊ、１０ｆｆ＆−１０り０
（７９ざ０）参照）を、それぞれ制限酵素（１）に匹Ｌ
（＋＋）ｙ丑■と工■または（ｍ ）止ｌ（！：シェ
１（部分消化）を用いて切断して単離することにより上
記（１）、（…）または（ｌｉｔ）で示されるＤＮＡ７
ラグメントが得られる。
このようにして得られた上記フラグメントを大腸菌由来
リラックス型プラスミドに挿入する方法としては、（１
）同プラスミドを上記７ラグメントを得るに使用したの
と同じ制限酵素で切断して得られるＤＮＡ７ラグメント
と上記フラグメントとをＤＮＡリガーゼで連結して環化
させる方法（ただし、に、ｕ ｌフラグメントは平滑末
端を有するので、同プラスミドを線状化して平滑末端と
したＤＮＡ７ラグメントとＡｌｕ ｌ ７ラグメントと
を連結して環化させることもできん）、（２）いわゆる
ホモポリマー・テーリング法により、大腸菌由来リラッ
クス型プラスミドの適当な制限酵素切断部位（ｐＢＲ，
？、２−の場合、好ましくはＰｅｔ １部位）に上記フ
ラグメントを挿入する方法、および（３）１以上の制限
酵素認識部位を有する合成リンカ−分子を上記フラグメ
ントの両末端に連結させて後、リンカ−分子中に含まれ
る上記制限酵素認識部位を切断する制限酵素で切断し、
得られるＤＮＡ７ラグメントを大腸菌由来リラックス型
プラスミドの同制限酵素切断部位に挿入する方法があげ
られる。
リラックス型プラスミドに挿入する方法としては、（１
）同プラスミドを上記７ラグメントを得るに使用したの
と同じ制限酵素で切断して得られるＤＮＡ７ラグメント
と上記フラグメントとをＤＮＡリガーゼで連結して環化
させる方法（ただし、に、ｕ ｌフラグメントは平滑末
端を有するので、同プラスミドを線状化して平滑末端と
したＤＮＡ７ラグメントとＡｌｕ ｌ ７ラグメントと
を連結して環化させることもできん）、（２）いわゆる
ホモポリマー・テーリング法により、大腸菌由来リラッ
クス型プラスミドの適当な制限酵素切断部位（ｐＢＲ，
？、２−の場合、好ましくはＰｅｔ １部位）に上記フ
ラグメントを挿入する方法、および（３）１以上の制限
酵素認識部位を有する合成リンカ−分子を上記フラグメ
ントの両末端に連結させて後、リンカ−分子中に含まれ
る上記制限酵素認識部位を切断する制限酵素で切断し、
得られるＤＮＡ７ラグメントを大腸菌由来リラックス型
プラスミドの同制限酵素切断部位に挿入する方法があげ
られる。
以下上記した（３）の方法について詳しく述べる。
合成すｙカー分子としては、ＥｉｃｏＲ工、里旦■、１
徂ＨＩ、ｓａｘ ｌ制限酵素認識部位を有するものが好
ましいが、特にＦ、ｃｏＲニリンカーが好適である。
徂ＨＩ、ｓａｘ ｌ制限酵素認識部位を有するものが好
ましいが、特にＦ、ｃｏＲニリンカーが好適である。
１匹−ＲＩ リンカ−を使用して上記した。ｍｐ Ｆプ
ロモーターを含むＤＮＡ７ラグメントに１ｃｏＲＩ末端
を形成させるには、たとえば以下のような方法が採用さ
れる。
ロモーターを含むＤＮＡ７ラグメントに１ｃｏＲＩ末端
を形成させるには、たとえば以下のような方法が採用さ
れる。
１）止ｌフラグメントの場合
止Ｉフラグメント（ｚ ２ｇ ｂｐ ）とＫｃｏ Ｒニ
リンカーを連結させ、ついでＫｃｏＲＩで消化する。
リンカーを連結させ、ついでＫｃｏＲＩで消化する。
ｉｆ） 止ｌ −ｒ＋６注■７ラグメントの場合止１−
ｎ２ｘ ＩＩ ７ラグメント（＆／コｂｐ ）をＤＮ
ＡポリメラーゼＩのに１θｎｏｗ フラグメントによ、
り Ｂｃｎ Ｉｆ末端を平滑末端とし、ついでＥｃｏ’
Ｒニリンカーと混合し、結合させた後、盈工Ｒ工で消化
する。
ｎ２ｘ ＩＩ ７ラグメント（＆／コｂｐ ）をＤＮ
ＡポリメラーゼＩのに１θｎｏｗ フラグメントによ、
り Ｂｃｎ Ｉｆ末端を平滑末端とし、ついでＥｃｏ’
Ｒニリンカーと混合し、結合させた後、盈工Ｒ工で消化
する。
ｆｆＤ Ａｌｘ ｌ −Ｐｓｔ ｌ （部分消化）フラ
グメントの場合 Ａｌｕ ’Ｉ −Ｐｅｔ ｌ （部分消化）フラグメン
ト（ｑ ｔｒ 、２ ｂｐ ）をＳ／ヌクレアーゼ処理
してＰｓｔ ｌ消化で得られた一本鎖部分を切除して平
滑末端とし、ついでＥｃｏ Ｒニリンカーと混合し、連
結した後、Ｅｃｏ Ｒ工で消化する。
グメントの場合 Ａｌｕ ’Ｉ −Ｐｅｔ ｌ （部分消化）フラグメン
ト（ｑ ｔｒ 、２ ｂｐ ）をＳ／ヌクレアーゼ処理
してＰｓｔ ｌ消化で得られた一本鎖部分を切除して平
滑末端とし、ついでＥｃｏ Ｒニリンカーと混合し、連
結した後、Ｅｃｏ Ｒ工で消化する。
このようにしてＥｃｏ Ｒ工等の特定の制限酵素消化に
より粘着末端あるいは平滑末端を形成させ九フ２グメン
トは、ついで大腸菌由来リラックス型プラスミドを上記
したと同じ制限酵素で切断した部位に挿入される。
より粘着末端あるいは平滑末端を形成させ九フ２グメン
トは、ついで大腸菌由来リラックス型プラスミドを上記
したと同じ制限酵素で切断した部位に挿入される。
本発明において用いられるプラスミドベクターは、上記
したように細胞当り多数コピーとして存在するリラック
ス型プラスミドに！Ｆプロモータを含む特定の７２グメ
ントを挿入して得られるものであり、同プロモータ近辺
の下流に存在する適当な制限酵素切断部位に生理活性を
有する有用な、産生ずべき蛋白をコードする遺伝子ＤＮ
Ａフラグメントを挿入して蛋白の産生に使用される。
したように細胞当り多数コピーとして存在するリラック
ス型プラスミドに！Ｆプロモータを含む特定の７２グメ
ントを挿入して得られるものであり、同プロモータ近辺
の下流に存在する適当な制限酵素切断部位に生理活性を
有する有用な、産生ずべき蛋白をコードする遺伝子ＤＮ
Ａフラグメントを挿入して蛋白の産生に使用される。
このようなりＮＡフラグメントとしては、たとえばβ−
エンドルフィンをコードするＤＮＡフラグメントが挙げ
られる。
エンドルフィンをコードするＤＮＡフラグメントが挙げ
られる。
また、上記制限酵素切断部位としては、上記した。ｍｐ
Ｆプロモータを含む特定の、７ラグメントの３′末端
の制限酵素切断部位（ｎｇｘ １１部位等）、合成リン
カ−を使用した場合には、合成リンカ−中の制限酵素切
断部位（ＥｃｏＲＩ部位等）あるいは、上記した特定の
フラグメント近辺の下流に存在するリラックス型プラス
ミド中の適当な制限酵素切断部位が使用される。
Ｆプロモータを含む特定の、７ラグメントの３′末端
の制限酵素切断部位（ｎｇｘ １１部位等）、合成リン
カ−を使用した場合には、合成リンカ−中の制限酵素切
断部位（ＥｃｏＲＩ部位等）あるいは、上記した特定の
フラグメント近辺の下流に存在するリラックス型プラス
ミド中の適当な制限酵素切断部位が使用される。
なお、遺伝子の発現を確実なものとするには、遺伝子の
転写・翻訳がｏｍｐ Ｆプロモータのコントロール下に
あることはもちろん、ホモポリマー・テーリング法を使
用した場合を除き、常法によりコＧ−Ｃ塩基対あるいは
ｐａ−ｃ塩基対をｏｍｐ Ｆプロモータを含むフラグメ
ントに付加する等の方法により遺伝子を正しい解読枠に
置く必要のある場合がある。
転写・翻訳がｏｍｐ Ｆプロモータのコントロール下に
あることはもちろん、ホモポリマー・テーリング法を使
用した場合を除き、常法によりコＧ−Ｃ塩基対あるいは
ｐａ−ｃ塩基対をｏｍｐ Ｆプロモータを含むフラグメ
ントに付加する等の方法により遺伝子を正しい解読枠に
置く必要のある場合がある。
゛また遺伝子を正しい方向性をもって挿入するために遺
伝子のＳ′末端および３′末端の制限酵素認識部位を異
なったものとすることができる。
伝子のＳ′末端および３′末端の制限酵素認識部位を異
なったものとすることができる。
本発明方法においては、このようにして得られるプラス
ミドベクターを、プロテアーゼ活性が欠失又は減少した
宿主大腸菌に導入し、蛋白を菌体外に産生させる。プロ
テアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓθ）活性は、ペプチド結合を
加水分解する酵素活性を意味するが、「欠失」は大腸菌
中で見い出されている数種類のプロテアーゼ活性の少な
くとも一部を欠失したもので６ｊｌ）、「減少」は、通
常の大腸菌株、たとえばＥ、ｃｏｌｌ ＨＢ１０／が有
する活性よシも減少していることを意味する。欠失した
大腸菌としては、たとえば１１ｉ、ｃｏｌｉ Ｋ−／、
２８Ｍ、７コ、 Ｋ、ｃｏｌｉ Ｋ−／−Ｅ３Ｍ３７
、 Ｅ、ｃＯｌｌ Ｋ−／コジャーナル オプ バクテ
リオロジー ｓＭａｏ （Ｊｏｕｒｎａｌｏｔ ＢａＯｔｅｒｉＯ１
０ｇ７ 、／ ！ＬＬ。
ミドベクターを、プロテアーゼ活性が欠失又は減少した
宿主大腸菌に導入し、蛋白を菌体外に産生させる。プロ
テアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓθ）活性は、ペプチド結合を
加水分解する酵素活性を意味するが、「欠失」は大腸菌
中で見い出されている数種類のプロテアーゼ活性の少な
くとも一部を欠失したもので６ｊｌ）、「減少」は、通
常の大腸菌株、たとえばＥ、ｃｏｌｌ ＨＢ１０／が有
する活性よシも減少していることを意味する。欠失した
大腸菌としては、たとえば１１ｉ、ｃｏｌｉ Ｋ−／、
２８Ｍ、７コ、 Ｋ、ｃｏｌｉ Ｋ−／−Ｅ３Ｍ３７
、 Ｅ、ｃＯｌｌ Ｋ−／コジャーナル オプ バクテ
リオロジー ｓＭａｏ （Ｊｏｕｒｎａｌｏｔ ＢａＯｔｅｒｉＯ１
０ｇ７ 、／ ！ＬＬ。
コロＳ−λり３．／９１／）等が挙げられ、他方、減イ
ー、Ｉり 少しだ大腸菌としては、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｎデ９ （ｅｅ
ｌ：Ｌ 。
ー、Ｉり 少しだ大腸菌としては、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｎデ９ （ｅｅ
ｌ：Ｌ 。
ム、弘Ｊ−４Ｌ？、／？ｆ弘）等が挙げられる。
上記の、宿主大腸菌へのプラスミドベクターの導入、培
養は常法によることができる。
養は常法によることができる。
プラスミドベクターとしてシ上記の五Ｆ遺伝子を含むベ
クターを用いる場合、ｏｍｐＦプロモータを含む上記し
たフラグメントはａｍｐ Ｆプロモータの下流ＫＯｍｐ
Ｆ蛋白のシグナルペプチドをコードする遺伝子および
Ｏｍｐ Ｆ蛋白の構造遺伝子の一部を含むので、目的と
す′る蛋白はＮ末端にＯｍｐ ？蛋白の一部を含む安定
な融合蛋白として得られる。
クターを用いる場合、ｏｍｐＦプロモータを含む上記し
たフラグメントはａｍｐ Ｆプロモータの下流ＫＯｍｐ
Ｆ蛋白のシグナルペプチドをコードする遺伝子および
Ｏｍｐ Ｆ蛋白の構造遺伝子の一部を含むので、目的と
す′る蛋白はＮ末端にＯｍｐ ？蛋白の一部を含む安定
な融合蛋白として得られる。
得られた融合蛋白は、必要に応じ目的蛋白として単離さ
れる。
れる。
本発明方法によれば、菌の増殖期に依存することなく、
高産生量を持続して蛋白を菌体外に産生ずることができ
るので、目的蛋白の高産生、分離・精製が容易であり、
実用的価値は大きい。
高産生量を持続して蛋白を菌体外に産生ずることができ
るので、目的蛋白の高産生、分離・精製が容易であり、
実用的価値は大きい。
以下の実施例によシ、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はその要旨を超えない限シ、以下の実施例によ
り限定されるものではない。
、本発明はその要旨を超えない限シ、以下の実施例によ
り限定されるものではない。
実施例／
大腸菌に−７，２のユヮＦ形質導入７アージであるλｏ
ｍｐ Ｆ ／ Ｄ Ｎ Ａ ＣＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ−ムＩＩ！ｒ、１０１！；に
−１０９０（／９８０））を用いてｏｍｐＦ遺伝子を含
むＤＮＡフラグメントを単離した。
ｍｐ Ｆ ／ Ｄ Ｎ Ａ ＣＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ−ムＩＩ！ｒ、１０１！；に
−１０９０（／９８０））を用いてｏｍｐＦ遺伝子を含
むＤＮＡフラグメントを単離した。
λＯｍｐＦ’／の増殖は５ｃｈｒｅｎｋとｗｅｔａｂｅ
ｒｇ の方法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａ
ＩＧθｎｅｔｉｃｅ ＋ ／ ３ ？ 。
ｒｇ の方法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａ
ＩＧθｎｅｔｉｃｅ ＋ ／ ３ ？ 。
１０／−１０’／）に従った（Ｌ培地、Ｊ １７℃）。
λｏｍｐＦ／のＤＮＡを常法に従いフェノール抽出によ
って得た後、エタノール沈澱によって回収した。
って得た後、エタノール沈澱によって回収した。
このλｏｍｐＦ／ＤＮＡを制限酵素上Ｉで完全切断し、
アガロース電気泳動にかけた。ｏｍｐＦプロモータ一部
分を含むｒ丑Ｉフ２グメント（５コｔ ｂｐ ）を切シ
出しく図２）、ＤＮＡ７２グメントの溶出精製を行なっ
た一方、図／に示すようにプラスミドｐＢＲｊココをＨ
１ｎ４ ｍで３７℃、１時間、完全消化し、ついで８１
ヌクレアーゼで処理（コＯ℃、７時間）し、一本鎖部分
を除去した。さらに、ＫＯＯＲニリンカー存在下に、グ
℃、７２時間、ＴダＤＭＡＩＪガーゼで処理した後、Ｅ
ａａ Ｒ１消化（ｊ７℃、７時間）を行なった。ついで
ＴＩＩＤＮＡＩＪガーゼで処理して環化させたプラスミ
ドで大腸＠Ｈｂｔｏ／を形質転換し、形質転換株よＦ）
ｐＫＢＭＯＯ！を得た。
アガロース電気泳動にかけた。ｏｍｐＦプロモータ一部
分を含むｒ丑Ｉフ２グメント（５コｔ ｂｐ ）を切シ
出しく図２）、ＤＮＡ７２グメントの溶出精製を行なっ
た一方、図／に示すようにプラスミドｐＢＲｊココをＨ
１ｎ４ ｍで３７℃、１時間、完全消化し、ついで８１
ヌクレアーゼで処理（コＯ℃、７時間）し、一本鎖部分
を除去した。さらに、ＫＯＯＲニリンカー存在下に、グ
℃、７２時間、ＴダＤＭＡＩＪガーゼで処理した後、Ｅ
ａａ Ｒ１消化（ｊ７℃、７時間）を行なった。ついで
ＴＩＩＤＮＡＩＪガーゼで処理して環化させたプラスミ
ドで大腸＠Ｈｂｔｏ／を形質転換し、形質転換株よＦ）
ｐＫＢＭＯＯ！を得た。
ついで、このｐＫＲｉＮθθｊをＫｃｏＲＩｆｊ７℃、
１時間消化した。一方、上記Ａｌｕ ｌ Ｄ Ｎ Ａフ
ラグメントとＦｊｃＯＲニリンカーを混合（モル比ｌ：
／（７）Ｌ、Ｔ弘Ｄ１１１Ａリガーゼでダ℃、７２時
間処理し、さらにＥｃｏ Ｒ工で消化し、ＢｃｏＲ工粘
着端を有する立１７２グメントを得た。これを上記ｐＹ
、ＥＮＯＯ３のＫｃｏ Ｒ１消化プラスミドに導入し、
ｐＨＦ＋！７７／を得た。
１時間消化した。一方、上記Ａｌｕ ｌ Ｄ Ｎ Ａフ
ラグメントとＦｊｃＯＲニリンカーを混合（モル比ｌ：
／（７）Ｌ、Ｔ弘Ｄ１１１Ａリガーゼでダ℃、７２時
間処理し、さらにＥｃｏ Ｒ工で消化し、ＢｃｏＲ工粘
着端を有する立１７２グメントを得た。これを上記ｐＹ
、ＥＮＯＯ３のＫｃｏ Ｒ１消化プラスミドに導入し、
ｐＨＦ＋！７７／を得た。
また、ｐｌＫＮθθ！を旦とＲ１で消化し、８／ヌクレ
アーゼ処理した後、Ａｌｕ ｌフラグメントと混合し、
Ｔｌ１ＤＩＪＡリガーゼにょシ平滑末端すゲーションさ
せ（＋℃、／Ｊ時間）、形質転換株よりｐＨＦＯｏＪを
得た。
アーゼ処理した後、Ａｌｕ ｌフラグメントと混合し、
Ｔｌ１ＤＩＪＡリガーゼにょシ平滑末端すゲーションさ
せ（＋℃、／Ｊ時間）、形質転換株よりｐＨＦＯｏＪを
得た。
このｐＨＦθθ−を制限酵素ｎｇｘ ｌおよびシλｌで
消化して得られる大きいフラグメントと、ｐＨＦ１７０
／を且り工■およびＳａｌ ｌで消化して得られる小さ
い７ラグメントを混合して、Ｔ４Ｉ’Ｄ Ｎ Ａリガー
ゼで連結しくダ℃、７２時間）、大腸菌ＨＥ／θ／を形
質転換させ、形質転換株よ＃）ｐＨＦＯＯ＆を得た。
消化して得られる大きいフラグメントと、ｐＨＦ１７０
／を且り工■およびＳａｌ ｌで消化して得られる小さ
い７ラグメントを混合して、Ｔ４Ｉ’Ｄ Ｎ Ａリガー
ゼで連結しくダ℃、７２時間）、大腸菌ＨＥ／θ／を形
質転換させ、形質転換株よ＃）ｐＨＦＯＯ＆を得た。
上記のようにして、目的とするプラスミドｐＨＦ００／
、ｐＨＦＯＯ−１およびｐＨＦｏｏ＆を得た０ （β−エンドルフィン様ペプチドの産生）■ ヒトβ−
エンドルフィンをコードする遺伝子を含むＤＮＡ７−）
グメントの調製 （Ａ） 原料プラスミドｐＡ−一の調製ニブラスミドｐ
Ａ、２Ｊは、Ｃ，Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ らが構築したも
のであシ、アンププロモータ・オペレータ領域と開始コ
ドンＡＴＧの直後にＥｃＯＲ工部位を有する環状プラス
ミドである。
、ｐＨＦＯＯ−１およびｐＨＦｏｏ＆を得た０ （β−エンドルフィン様ペプチドの産生）■ ヒトβ−
エンドルフィンをコードする遺伝子を含むＤＮＡ７−）
グメントの調製 （Ａ） 原料プラスミドｐＡ−一の調製ニブラスミドｐ
Ａ、２Ｊは、Ｃ，Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ らが構築したも
のであシ、アンププロモータ・オペレータ領域と開始コ
ドンＡＴＧの直後にＥｃＯＲ工部位を有する環状プラス
ミドである。
ｐＢＲＪ−一を制限酵素ｌ連■で３７℃、７時間、部分
的に消化し、次いで、８／ヌクレアーゼで３７℃、／ｊ
分間処理する。
的に消化し、次いで、８／ヌクレアーゼで３７℃、／ｊ
分間処理する。
次いでＰｓｔ ｌリンカ−で／に℃、１０時間反応させ
、連結させる。Ｐｅｔ ｌで３７℃、１時間消化後、Ｔ
ダＤＮＡリガーゼで／Ｓ℃、／４１４１時間反応て連結
し、環状化する。さらにＥｅＯＲ工で３７℃、１時間消
化し、Ｓ／ヌクレアーゼで処理する。Ｔｅ１ＤＮＡリガ
ーゼで７３℃、ｌダ時間反応後Ｐｓｔ ｌで３７℃、１
時間消化させ、Ｂ／ヌクＬ／アーゼで３７℃、ｉｔ分間
処理する。
、連結させる。Ｐｅｔ ｌで３７℃、１時間消化後、Ｔ
ダＤＮＡリガーゼで／Ｓ℃、／４１４１時間反応て連結
し、環状化する。さらにＥｅＯＲ工で３７℃、１時間消
化し、Ｓ／ヌクレアーゼで処理する。Ｔｅ１ＤＮＡリガ
ーゼで７３℃、ｌダ時間反応後Ｐｓｔ ｌで３７℃、１
時間消化させ、Ｂ／ヌクＬ／アーゼで３７℃、ｉｔ分間
処理する。
１辺Ｒニリンカーで処理後、Ｔ４１ＤＮＡリガーゼで１
３℃、ｌ弘時間反応させ、っｂでＥｃｏＲ工で３７℃１
時間消化する。さらにＴダＤＮＡリガーゼで１５℃、７
７時間処理して環状化し、目的物を得た。
３℃、ｌ弘時間反応させ、っｂでＥｃｏＲ工で３７℃１
時間消化する。さらにＴダＤＮＡリガーゼで１５℃、７
７時間処理して環状化し、目的物を得た。
次に、これを大腸菌ｍｎ１ｏｉに形質転換し、得られた
形質転換株より、ヘレンスキーの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ 、 ２２ 、４１ ’ｉ−２ｇ −’ＩＩ
’ＩＯ，／デフθ）によシブラスミドＤＮＡを調製した
。このＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバートの方法
により、解析し、目的とするＤＮＡであることが確認さ
れた。
形質転換株より、ヘレンスキーの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ 、 ２２ 、４１ ’ｉ−２ｇ −’ＩＩ
’ＩＯ，／デフθ）によシブラスミドＤＮＡを調製した
。このＤＮＡの塩基配列をマキサム−ギルバートの方法
により、解析し、目的とするＤＮＡであることが確認さ
れた。
（Ｂ） ヒトコルテコトロビン−β−リボトロピン（Ａ
ＯＴＨ−β−ＬＰＨ）前駆体遺伝子由来のＤＮＡフラグ
メントの調Ｍ： まず約／ ／、！； Ｋｂｐの前駆体遺伝子が原料とし
て使用される。この前駆体は、コロ７のアミノ酸残基含
有すると考えられ、たとえば、中西らの方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ止■、ダー１３−ダコ７．７９ワタ）によって、一
般゛的に入手しうるヒト胎盤等由来のＤＮＡより得られ
る。
ＯＴＨ−β−ＬＰＨ）前駆体遺伝子由来のＤＮＡフラグ
メントの調Ｍ： まず約／ ／、！； Ｋｂｐの前駆体遺伝子が原料とし
て使用される。この前駆体は、コロ７のアミノ酸残基含
有すると考えられ、たとえば、中西らの方法（Ｎａｔｕ
ｒｅ止■、ダー１３−ダコ７．７９ワタ）によって、一
般゛的に入手しうるヒト胎盤等由来のＤＮＡより得られ
る。
この／ ／、！； ｘｂｐのＡＯＴＨ−β−ＬＰＨ前駆
体フラグメントと、ＥｃｏＲ工で３７℃、１時間消化さ
れたｐＢＲ３−一とをｉｎ Ｖｉｔｒ□で／ｊＣ１／コ
時間、ＴダＤＮＡリガーゼ形質転換し、Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ −Ｈｏｇｎｅｓｓ のコロニー・ハイプリダイゼ
ー７ヨン法（Ｐｒｏｃ。
体フラグメントと、ＥｃｏＲ工で３７℃、１時間消化さ
れたｐＢＲ３−一とをｉｎ Ｖｉｔｒ□で／ｊＣ１／コ
時間、ＴダＤＮＡリガーゼ形質転換し、Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ −Ｈｏｇｎｅｓｓ のコロニー・ハイプリダイゼ
ー７ヨン法（Ｐｒｏｃ。
Ｈａｔ、１Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、 ７．２
、３９１．／−３９４！ｒ。
、３９１．／−３９４！ｒ。
ｌ？り５）により形質転換株を得、これよシブラスミド
ｐＨＬＡ−／を得た。このｐＨＬＡ−／を且追Ｒ工で３
７℃、７時間、祖■で３７℃、７時間消化し、ｓ％ポリ
アクリルアミドゲルより２．ＯＫｂｐのフラグメントを
単離する。次いでこのフラグメントをｐＢＲ３，２−の
旦遠ＲニーＩ旦Ｈ工Ｊ？＆ｂｐフ２グメントの代わシに
導入する。上記と同様にして形質転換株を得、これよシ
ブラスミドｐＹＴ ／を得る。次いで、Ｘｍａ ｌで３
７℃、７時間消化し、３％ポリアクリルアミドゲルより
／、／ Ｋｂｐ ７ラグメントを単離する。
ｐＨＬＡ−／を得た。このｐＨＬＡ−／を且追Ｒ工で３
７℃、７時間、祖■で３７℃、７時間消化し、ｓ％ポリ
アクリルアミドゲルより２．ＯＫｂｐのフラグメントを
単離する。次いでこのフラグメントをｐＢＲ３，２−の
旦遠ＲニーＩ旦Ｈ工Ｊ？＆ｂｐフ２グメントの代わシに
導入する。上記と同様にして形質転換株を得、これよシ
ブラスミドｐＹＴ ／を得る。次いで、Ｘｍａ ｌで３
７℃、７時間消化し、３％ポリアクリルアミドゲルより
／、／ Ｋｂｐ ７ラグメントを単離する。
ＡＣＴ）１−β−ＬＢＨ前駆体遺伝子の大部分を含むこ
のハ／ Ｋｂｐ ７−）グメントをＴダＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端としたのち（３７℃、３０分）、ｌ狙Ｒ
ニリンカーに１３℃、７９時間で連結し、のシしろ付の
ム０ＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体由来のＤＮＡフラグメント
を得た。
のハ／ Ｋｂｐ ７−）グメントをＴダＤＮＡポリメラ
ーゼで平滑末端としたのち（３７℃、３０分）、ｌ狙Ｒ
ニリンカーに１３℃、７９時間で連結し、のシしろ付の
ム０ＴＨ−β−ＬＰＨ前駆体由来のＤＮＡフラグメント
を得た。
（Ｃ） プラスミドｐＹＴ、７の調製：上記プラスミド
ｐＡココおよＵＡＯＴＨ−β−ＬＰＨ由来７ラグメント
をそれぞれ３７℃、１時間Ｋｃｏ Ｒ工で消化した。次
に、この両者をＴダＤＮＡリガーゼで１５℃、／θ時間
反応させ、結合し、プラスミドｐＹＴ ３ を得た。
ｐＡココおよＵＡＯＴＨ−β−ＬＰＨ由来７ラグメント
をそれぞれ３７℃、１時間Ｋｃｏ Ｒ工で消化した。次
に、この両者をＴダＤＮＡリガーゼで１５℃、／θ時間
反応させ、結合し、プラスミドｐＹＴ ３ を得た。
（Ｄ） ヒトβ−エンドルフィンを：１−）”する遺伝
子を含むＤＮＡフラグメントの調製：上記プラスミドを
）ｌａｅ Ｉｌｌを用いて３７℃で消化し目的とするフ
ラグメント（／６０ｂｐ）を得た。
子を含むＤＮＡフラグメントの調製：上記プラスミドを
）ｌａｅ Ｉｌｌを用いて３７℃で消化し目的とするフ
ラグメント（／６０ｂｐ）を得た。
■ プラスミドｐＢＲＪココｔｒｐ ｌの調製プラスミ
ドＲ８Ｆ２／コＱ −ｔ ｒ ｐ （Ｇｏｎｅ 、 ／
（／９７？） 、１ｅｔ−ｔｚ、２） ヲ制ＰＡ’ｅｌ
１ｇ ｎｇｘ １１で３７℃、１時間消化し、７％アガ
ロース電気泳動によ＃）２．３ Ｋｂのｈμ…７ラグメ
ントを得た。一方、ファージＭ ／ ３ ｍｐり（７コ
３１ｂｐ ） （Ｂｅｔｈｅａｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、工ｎｃ。
ドＲ８Ｆ２／コＱ −ｔ ｒ ｐ （Ｇｏｎｅ 、 ／
（／９７？） 、１ｅｔ−ｔｚ、２） ヲ制ＰＡ’ｅｌ
１ｇ ｎｇｘ １１で３７℃、１時間消化し、７％アガ
ロース電気泳動によ＃）２．３ Ｋｂのｈμ…７ラグメ
ントを得た。一方、ファージＭ ／ ３ ｍｐり（７コ
３１ｂｐ ） （Ｂｅｔｈｅａｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、工ｎｃ。
（米国）よ−シ入手）を制限酵素旦＜ｘ １１で３２℃
、７時間消化し、これと上記ｎｇｘ ｌ ７ラグメント
をＴ４’ＤＭＡリガーゼを用いて１５℃、／４’時間処
理して、結合させた。ついでこれを用いて大腸菌ＪＭＩ
Ｏ３（上記ＢｅｔｈｅｅｄａＲｅａｅａｒｃｈ製）を形
質転換し、Ｘｇａｌの色（青から白への変化）を指標と
して、形質転換株を得、これよシＲＦ′をと９、ついで
これを制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１時間消化し、Ｒ
ｃｏ Ｒエフラグメントを得た。すなわち、このフラグ
メントは、プロモーター、オペレーターおよびリーダー
領域とｔｒｐ Ｅの一部とを含有し、末端はＥｃｏ Ｒ
工部位を形成してなる。
、７時間消化し、これと上記ｎｇｘ ｌ ７ラグメント
をＴ４’ＤＭＡリガーゼを用いて１５℃、／４’時間処
理して、結合させた。ついでこれを用いて大腸菌ＪＭＩ
Ｏ３（上記ＢｅｔｈｅｅｄａＲｅａｅａｒｃｈ製）を形
質転換し、Ｘｇａｌの色（青から白への変化）を指標と
して、形質転換株を得、これよシＲＦ′をと９、ついで
これを制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１時間消化し、Ｒ
ｃｏ Ｒエフラグメントを得た。すなわち、このフラグ
メントは、プロモーター、オペレーターおよびリーダー
領域とｔｒｐ Ｅの一部とを含有し、末端はＥｃｏ Ｒ
工部位を形成してなる。
つぎに、プラスミドｐＢＲＪココを制限酵素μ＋ｏＲＩ
で３７℃、１時間消化し、これと上記Ｆｉｃｏ Ｒｌフ
ラグメントをＴ弘ＤＮＡリガーゼを用いて１３℃、／り
時間処理して、結合させた。ついでこれを大腸菌ＨＢ１
０／に形質転換し、形質転換株から、プロモー タの上
流及び下流にμ遠Ｒ工部位を有するプラスミドを得た。
で３７℃、１時間消化し、これと上記Ｆｉｃｏ Ｒｌフ
ラグメントをＴ弘ＤＮＡリガーゼを用いて１３℃、／り
時間処理して、結合させた。ついでこれを大腸菌ＨＢ１
０／に形質転換し、形質転換株から、プロモー タの上
流及び下流にμ遠Ｒ工部位を有するプラスミドを得た。
さらにこのプラスミドをＥｃｏ Ｒ工で３７℃で部分消
化し、Ｔ４ｔＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０分間処
理し、ついでＴ４（ＤＮＡリガーゼで１３℃、７１７時
間処理して結合させた。ついで大腸菌ＨＢ１０／に形質
転換し、形質転換株よシ目的とするプラスミドｐＢＲｊ
ココｔｒｐ ｌを得た（ Ａ、４ ｋｂ ）。
化し、Ｔ４ｔＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０分間処
理し、ついでＴ４（ＤＮＡリガーゼで１３℃、７１７時
間処理して結合させた。ついで大腸菌ＨＢ１０／に形質
転換し、形質転換株よシ目的とするプラスミドｐＢＲｊ
ココｔｒｐ ｌを得た（ Ａ、４ ｋｂ ）。
■ プラスミドｐＢＲ３コ、２ｔｒｐＥβＥの調製７ア
ージＭ／ＪｍｐりをＨｌｎｃ ＩＩで３７℃、７時間消
化して得られる７ラグメントと上記１ （Ｄ）で得られ
たβ−エンドルフィンをコードする遺伝子を含むＨａｅ
ｌフラグメント（／ＡＯｂｐ）とをＴダＤＮＡリガー
ゼで３７℃、７１時間処理して連結し、ついで大腸菌；
ｌＮ１０３を形質転換し、得られたＲＦをさらにＫｃｏ
Ｒ工で３７℃、７時間消化し５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によシ、β−エンドルフィンをコードする
遺伝子を含むＥｃｏ Ｒｌフラグメント（／９（ｌｌｂ
ｐ）を得た。
ージＭ／ＪｍｐりをＨｌｎｃ ＩＩで３７℃、７時間消
化して得られる７ラグメントと上記１ （Ｄ）で得られ
たβ−エンドルフィンをコードする遺伝子を含むＨａｅ
ｌフラグメント（／ＡＯｂｐ）とをＴダＤＮＡリガー
ゼで３７℃、７１時間処理して連結し、ついで大腸菌；
ｌＮ１０３を形質転換し、得られたＲＦをさらにＫｃｏ
Ｒ工で３７℃、７時間消化し５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によシ、β−エンドルフィンをコードする
遺伝子を含むＥｃｏ Ｒｌフラグメント（／９（ｌｌｂ
ｐ）を得た。
次に、上記プラスミドｐＢＲＪＪコｔｒｐ ＢをＥｃｏ
Ｒ工で３７℃、７時間消化し、これと上記Ｂｏｏ Ｒ
ｌフラグメントをＴ４ＣＤＮＡリガーゼで１５℃、ｌｔ
時間処理して結合させ、ついで大腸菌ＨＢ１０／を形質
転換し、ミニスクリーニングによる解析によシ形質転換
株から目的とするプラスミドｐＢＲ３コ２ ｔｒｐ Ｅ
／ｌｌｉ を得た。
Ｒ工で３７℃、７時間消化し、これと上記Ｂｏｏ Ｒ
ｌフラグメントをＴ４ＣＤＮＡリガーゼで１５℃、ｌｔ
時間処理して結合させ、ついで大腸菌ＨＢ１０／を形質
転換し、ミニスクリーニングによる解析によシ形質転換
株から目的とするプラスミドｐＢＲ３コ２ ｔｒｐ Ｅ
／ｌｌｉ を得た。
■ プラスミドｐＢＲ３ココｔｒｐ ｇβＩＡλＰＬの
調製 上記プラスミドｐＢＲ、？ ２２ ｔｒｐ ］！ｔ／ｌ
をＴｌｌＤＮＡポリメラーゼとともに制限酵素Ｈｐａ
ｌで３７℃、１時間消化し、ついで制限酵素ｓａｘ ｌ
で３７℃、７時間消化して７％アガロース電気泳動によ
シ小さい方の７ラグメントを得た。一方、プラスミドｐ
ＢＲ３ココをＫｃｏ ｎ工で３７℃、７時間消化し、さ
らにＴダＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０分間処理し
て、平滑末端を形成させたのち、８ａｌＩで３７℃、１
時間消化して７％アガロース電気泳動により大きい方の
７ラグメントを得る。ついで、この二つの７ラグメント
をＴ４１ＤＮＡリガーゼで１５℃、／り時間処理して連
結させ、ついで大腸菌ＨＢ１０／を形質転換し、得られ
る形質転換株よシ、プ２スミドｐＢＲｊＪコｔｒｐ Ｋ
βＥΔλＰＬを得た。
調製 上記プラスミドｐＢＲ、？ ２２ ｔｒｐ ］！ｔ／ｌ
をＴｌｌＤＮＡポリメラーゼとともに制限酵素Ｈｐａ
ｌで３７℃、１時間消化し、ついで制限酵素ｓａｘ ｌ
で３７℃、７時間消化して７％アガロース電気泳動によ
シ小さい方の７ラグメントを得た。一方、プラスミドｐ
ＢＲ３ココをＫｃｏ ｎ工で３７℃、７時間消化し、さ
らにＴダＤＮＡポリメラーゼで３７℃、３０分間処理し
て、平滑末端を形成させたのち、８ａｌＩで３７℃、１
時間消化して７％アガロース電気泳動により大きい方の
７ラグメントを得る。ついで、この二つの７ラグメント
をＴ４１ＤＮＡリガーゼで１５℃、／り時間処理して連
結させ、ついで大腸菌ＨＢ１０／を形質転換し、得られ
る形質転換株よシ、プ２スミドｐＢＲｊＪコｔｒｐ Ｋ
βＥΔλＰＬを得た。
ついで、このプラスミドを制限酵素Ｂａｍ Ｈ工で消化
（，７７℃、／時間）して、ＢａｍＨエフラグメント（
／？／ｂｐ）を得た。
（，７７℃、／時間）して、ＢａｍＨエフラグメント（
／？／ｂｐ）を得た。
プラスミドｐＵｏ ｔ （Ｇｅｎｅ 、 ／り、２Ｓ？
−一６Ｓ（ｚｖｒ２））をＢａｍ Ｈ工で消化し、得ら
れる大きい方のシ旦Ｈエフラグメントと上記／ ７ ／
ｂｐのＢａｍ ＨｌフラグメントとをＴｅ１ＤＮＡリ
ガーゼで連結（４０１７２時間）した彼、大腸菌ＨＢ１
０／を形質転換し、ｐＵ。
−一６Ｓ（ｚｖｒ２））をＢａｍ Ｈ工で消化し、得ら
れる大きい方のシ旦Ｈエフラグメントと上記／ ７ ／
ｂｐのＢａｍ ＨｌフラグメントとをＴｅ１ＤＮＡリ
ガーゼで連結（４０１７２時間）した彼、大腸菌ＨＢ１
０／を形質転換し、ｐＵ。
ＳβＥ を得た。これを制限酵素罎且ＲＩおよびシ四ｌ
で消化（３７℃、１時間）し、１００ ＲニーシュＩフ
ラグメント（ｚｔ７ｂｐ）を得た。
で消化（３７℃、１時間）し、１００ ＲニーシュＩフ
ラグメント（ｚｔ７ｂｐ）を得た。
一方、上記プラスミドｐＨＩＰＯＯ＆を制限酵素見氏Ｒ
工およびｌμＩで消化（，７？’Ｃ１／時間）して、大
きい方の７ラグメントを得、これと上記Ｈａｏ Ｒニー
Ｓａｌ ｌフラグメントをＴ４’ＤＭＡリガーゼによっ
て連結（ダ℃、７１時間）し、大腸菌ＨＢ１０／を形質
転換し、形質転換株より目的とするプラスミドベクター
ｐＨ７００４βＥを得た。
工およびｌμＩで消化（，７？’Ｃ１／時間）して、大
きい方の７ラグメントを得、これと上記Ｈａｏ Ｒニー
Ｓａｌ ｌフラグメントをＴ４’ＤＭＡリガーゼによっ
て連結（ダ℃、７１時間）し、大腸菌ＨＢ１０／を形質
転換し、形質転換株より目的とするプラスミドベクター
ｐＨ７００４βＥを得た。
（蛋白の産生）
Ｎ９９（ｒｅ”１１．３＆、４４．７−１１９．／９ｇ
亭）に導入し、これをＭ−９培地（Ｂｘｐｅｒｉ’ｍｅ
ｎｔｓ ’ｉＨＭｏｒｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ
、 Ｑ Ｊ ／頁＋ ＯｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （／ ９ ？コ））上で前
培養し、その一部を植菌し本培養した。
亭）に導入し、これをＭ−９培地（Ｂｘｐｅｒｉ’ｍｅ
ｎｔｓ ’ｉＨＭｏｒｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ
、 Ｑ Ｊ ／頁＋ ＯｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ （／ ９ ？コ））上で前
培養し、その一部を植菌し本培養した。
各増殖期において、遠心分離によシ培地を分画し、培地
中のβ−エンドルフィン量を、β−エンドルフィン（”
’Ｉ）を標識としてラジオイムノアセイ（Ｒ工Ａ）して
、測定した０結果を表−ノに示す。
中のβ−エンドルフィン量を、β−エンドルフィン（”
’Ｉ）を標識としてラジオイムノアセイ（Ｒ工Ａ）して
、測定した０結果を表−ノに示す。
なお、後期対数増殖期（６時間後）の培地をＩＯ−重炭
酸アンモニウムで透析し、凍結乾燥によシ濃縮し、つい
で１９％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
を行なった。その結ｌ Ｒ工Ａにおいてβ−エンドルフ
ィン活性を有する蛋白バンドが形成された。
酸アンモニウムで透析し、凍結乾燥によシ濃縮し、つい
で１９％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動
を行なった。その結ｌ Ｒ工Ａにおいてβ−エンドルフ
ィン活性を有する蛋白バンドが形成された。
比較例／
した以外は、実施例／と同様にしてβ−エンドルフィン
様蛋白を産生させ、Ｒ工Ａでその産生量を測定した。そ
の結果を表−７に示す。
様蛋白を産生させ、Ｒ工Ａでその産生量を測定した。そ
の結果を表−７に示す。
表−／
＊本培養後に経過した時間（時間）
第１図は、本発明において用いられるプラスミドベクタ
ーの一例の製造工程例の概略を示し、第一図はｏｍｐ
Ｆプロモーターを含む７ｒｘｕ ｌ ７９グメント（図
１）の制限酵素切断部位を示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ｚ１図 １ 事件の表示 昭和５９年特許願第６２９８１号 ２ 発明の名称 蛋白の産生方法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 （５９６）三菱化成工業株式会社 ４代理人 〒１００ 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 （ほか１名）
ーの一例の製造工程例の概略を示し、第一図はｏｍｐ
Ｆプロモーターを含む７ｒｘｕ ｌ ７９グメント（図
１）の制限酵素切断部位を示す。 図面の浄書（内容に変更なし） ｚ１図 １ 事件の表示 昭和５９年特許願第６２９８１号 ２ 発明の名称 蛋白の産生方法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 （５９６）三菱化成工業株式会社 ４代理人 〒１００ 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 （ほか１名）
Claims (1)
- （１）大腸菌のシグナルペプチドをコードする遺伝子お
よび所望の蛋白をコードする遺伝子を含有するプラスミ
ドベクターを、プロプ・アーゼ活性が欠失または減少し
た宿主大腸菌に導入して同菌を培養し、産生ずる蛋白を
菌体外に分泌させることを特徴とする蛋白の産生方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59062981A JPH0646946B2 (ja) | 1984-03-30 | 1984-03-30 | 蛋白の産生方法 |
| DE8484401709T DE3484950D1 (de) | 1983-08-23 | 1984-08-23 | Plasmidvektoren. |
| EP84401709A EP0138644B1 (en) | 1983-08-23 | 1984-08-23 | Novel plasmid vectors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59062981A JPH0646946B2 (ja) | 1984-03-30 | 1984-03-30 | 蛋白の産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60207596A true JPS60207596A (ja) | 1985-10-19 |
| JPH0646946B2 JPH0646946B2 (ja) | 1994-06-22 |
Family
ID=13216043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59062981A Expired - Lifetime JPH0646946B2 (ja) | 1983-08-23 | 1984-03-30 | 蛋白の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646946B2 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519092A (en) * | 1978-06-08 | 1980-02-09 | Harvard College | Selected protein producing method |
| JPS56154999A (en) * | 1980-04-11 | 1981-11-30 | Harvard College | Synthesis of selective aged protein or polypeptide in bacteria matrix |
-
1984
- 1984-03-30 JP JP59062981A patent/JPH0646946B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5519092A (en) * | 1978-06-08 | 1980-02-09 | Harvard College | Selected protein producing method |
| JPS56154999A (en) * | 1980-04-11 | 1981-11-30 | Harvard College | Synthesis of selective aged protein or polypeptide in bacteria matrix |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0646946B2 (ja) | 1994-06-22 |
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