JPS60208998A - ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを非水性溶媒および非水性／水性混合溶媒系に溶解する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはその
誘導体を非水性溶媒または非水性／水性混合溶媒系に溶
解する方法に関するものである。

本発明は特に、前記の溶媒または溶媒系に１核酸、特に
デスオキシリが核酸（ＤＮＡ　）およびその塩の如きポ
リヌクレオチドを溶解する方法に関する。

さらにまた本発明は、りが核酸（ＲＮＡ）および他の蛋
白質からＤＮＡを分離する方法、および種々のＤＮＡ混
合物を分離する方法をも提供するものである。

発明の背景 本発明者は以前に、メタノール、エタノール、有機溶媒
混合物（たとえばメタノール／酢酸エチル混合物、メタ
ノール／クロロホルム混合物、メタノール／トルエン混
合物）の如き非水性溶媒にＤＮＡを溶解する実験を行っ
たが、これらの実験のすべてにおいてＤＮＡの溶解は認
められなかった。

しかしながら、環式レセプター高分子の７種であるクラ
ウンエーテルの如き高分子リガンドを上記溶媒に添加し
た場合には、二重ラセン構造または単純ラセン構造を有
するＤＮＡが骸溶媒に溶解することが今や発見された。

クラウンエーテルは高度の選択性を有する錯化剤であっ
て、これはイオン結合や水素結合Ｋｊっでアルカリ金属
カチオンやアルカリ土類金属カチオンの如き金属イオン
、もしくはアンモニウムカチオンまたはアルキルアンモ
ニウムカチオンと結合して錯体を形成し得るものである
。

酸素、窒素または硫黄をドナー原子として含有する数種
のクラウンエーテルが既に公知である（Ｊ、Ｃｈｅｍ、
Ｓｏｅ、Ｐｅｒｋｌｎ　Ｔｒａｎｓ、　”＊　Ｌ　／９
’ｌＳ’、２１　ｐｐ。

、２３ｊター、２３乙３）。また、酸素、窒素および／
または硫黄をドナー原子として含有する数種の多環式高
分子化合物（たとえば二環式高分子化合物）も公知であ
る（Ｊ、Ｍ、レーン等の論文：　”Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈ
ｅｍ。

Ｓｏｅ、　”　／りＩｌ、　ｐｐ、／２１．２−７．２
１３＞。この論文には、或種のヌクレオチドホスフェー
トポリイオンが水溶液中で、環式ポリアンモニウム構造
を有する高分子化合物と結合して錯体を形成することが
記載されている。これらの多環式高分子化合物は本発明
方法において有利に使用できる。

したがって本発明は、ヌクレオチドおよび／またはポリ
ヌクレオチドおよび／またはその誘導体を非水性溶媒お
よび／または非水性／水性混合溶媒に溶解する方法にお
いて、高分子リガンドまたは高分子リガンド混合物の存
在下に溶解することを特徴とする方法に関するものであ
る。

高分子リガンド：ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
の重量比は、好ましくは／：／ないし３００　：　／で
ある。したがって、高分子リガンド：ポリヌクレオチド
のモル比は好ましくは１０３：／ないし／σ：／であり
、高分子リガンド：ヌクレオチドのモル比は好ましくは
／：／ないし１００：／である。

本発明方法において有利に使用できるクラウンエーテル
および多環式高分子化合物（巨大多環式化合物）は、／
に一クラウン−６、／ｊ−クラウン−ｊ１ジペンゾ−／
♂−クラウンー乙、ジシクロへキシル−／と−クラウン
ー乙１．２／−クラウン−７およびクリプタンド〔，２
２２〕からなる群から選択された化合物である。

ヌクレオチドおよびＤＮＡは本発明方法によってメタノ
ール、エタノール、ジメチルスルホキシドの如き極性−
非水性溶媒に溶解し得る。この非水性溶媒は、酢酸エチ
ル、アセトン、クロロホルム、トルエン、インタンの如
き無極性溶媒でさらに希釈できる°。

本発明方法に従えば、ヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チド（たとえばＤＮＡ　）において、遊離酸および金属
塩（％にナトリウム塩）の両方の形のものが非水性溶媒
系に容易に溶解し得る。したがってこれらの形のものが
好ましい。実質的な量の高分子リガンドが有機または無
機担体物質に結合していることが好ましい。

さらにまた本発明は、７種またはそれ以上のヌクレオチ
ド−高分子り〃ンド錯体および／またはポリヌクレオチ
ド−高分子リガンド錯体を含有する非水性溶液または非
水性／水性混合溶液を提供するものである（この溶液は
、前記の本発明方法によって形成されたものである）。

さらにまた本発明は、７種またはそれ以上のヌクレオチ
ド−高分子リガンド錯体および／またはポリヌクレオチ
ド−高分子りがンド錯体それ自身を含有する非水性溶液
または非水性／水性混合溶液をも提供するものである。

あって、特に、ヌクレオチドおよび／またはポリヌクレ
オチド（特・にＤＮＡ　）を選択的に非水性溶媒または
非水性／水性混合溶媒に溶解することが必須条件である
ような技術分野において有利に利用できる。クラウンエ
ーテルおよび／または多環式高分子化合物を含有する溶
媒に、種々のＤＮＡ製剤（たとえば、容易に入手し得る
ＤＮＡ　４ＩＩＩ剤）はＲＮＡ製剤よりも一層よく溶解
し得ることが見出された。

たとえば、多環式高分子ポリエーテルを含有するアルコ
ールを溶媒として用いる選択的溶解操作によってＤＮＡ
をＲＮＡおよび別の蛋白質から非常に簡単に分離でき、
すなわちＤＮＡが精製でき、しかしてこの場合には、Ｒ
ＮＡおよび別の蛋白質は上記溶媒に比較的難溶な成分で
あって、したがってこれらは器底に沈澱する。したがっ
て本発明は、ヌクレオチドやポリヌクレオチドの分離、
精製のために、特に、ＤＮＡをＲＮＡや別の蛋白質から
分離し精製するために、かつまた、ＤＮＡ混合物の分離
のために非常圧有利に利用できる。

さらにまた本発明方法は、他の種々の好ましい利用態様
において利用できるものである。ヌクレオチドやポリヌ
クレオチド（たとえばＤＮＡ　）の分別結晶のために、
シリカ−アルミナの如き無機担体または有機重合体に結
合したクラウンエーテルおよび／または多環式高分子化
合物を用いる精製方法（たとえばクロマトグラフィ）が
、本発明を利用することによって実施できる。このよう
な精製方法は、従来の技術では容易に実施できなかった
ものである。さらに、ＤＮＡの如きポリヌクレオチドの
合成のときに本発明方法が利用でき、すなわち、化学合
成操作が前記の非水性溶媒または非水性／水性混合溶媒
系の中で実施できる。

さらに、二重ラセン構造のＤＮＡを単純ラセン構造のＤ
ＮＡに変換させるときに本発明方法が利用で　′きる。

種々の溶媒系（たとえばクラウンエーテルを含有する水
／メタノール混合溶媒系、またはクラウンエーテルを含
有するメタノール／ジクロロ′メタン混合溶媒系）中に
ＤＮＡを溶解してなる溶液（／〜／／　０ｔｒｔ）では
、ＵＶ／可視部スペクトルにおける吸光度が約３０−’
１０％上昇し、かつ約２７０ｎｍの位置に、付加的な肩
部（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）が生ずる。

一方、水を溶媒として使用した場合には、この肩部の存
在は認められない。

この吸光度上昇は単純ラセン構造を有する変性ＤＮＡ　
Ｋ固有の現象であり、しかして、メタノール／クラウン
エーテル混合物に溶解した単純ラセン構造を有するＤＮ
Ａのスペクトルは、単純ラセン構造のＤＮＡの水溶液の
スペクトルの場合と同程度の吸光度を有する。このメタ
ノール／クラウンエーテル混合物中の変性ＤＮＡに、水
を用いて透析を行うことによって、変性ＤＮＡを再び非
変性ＤＮＡ　（再−非変性化ＤＮＡ　）に戻すことがで
き、これは２乙Ｏｎｍにおける吸光度の測定によって確
認できる。

さらに、ＤＮＡの化学的変性、たとえばアルキル化剤の
如き水分に敏感な薬剤によってＤＮＡが化学的に変性で
きる。

その結果得られたＤＮＡ分子は、透析やグル濾過技術に
よって水中に入れることができ、元の性状に戻すことが
できる。ＤＮＡを非水性溶媒に入れて上記の如く取扱う
ことからなる操作は、発癌に関する研究の如き種々の研
究において有利に利用できるであろう。

本発明を一層具体的に例示するために、次に実施例を示
す。これらの実施例には、本発明の溶解方法の効果が具
体的に例示されており、さらにまた、この溶解方法は種
々のヌクレオチドやポリヌクレオチドに対し選択性を有
し、したがって種々のヌクレオチドやポリヌクレオチド
の分離、精製のために本発明方法が非常に役立つもので
あることも示されている。

実施例 ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの溶解〔たとえば
、クーララーンエーテル（／ｒ　−Ｃ−乙）を含有する
ＭｅＯＨ中へのＤＮＡの溶解コ 一連の実験を行ったが、その結果を第１表および第２表
に示す。これらの表に使用された略号は次の意味を表わ
す。

＊＝不溶 ＊＊二モル比 ＣＥ　＝クラウンエーテル 第１表および第２表に記載のヌクレオチドおよびポリヌ
クレオチドはシグマ・ケミカル・コンノぐニーから入手
し得る〔同社発行［生物化学用化合物および有機化合物
のカタログ」（／りｒ弘年λ月）参照］。

クラウンエーテル（クリプタンド）を含有するアルコー
ルに溶解して作ったＤＮＡの溶液は、ジクロロメタン、
クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ジエチルエーテ
ル、テトラヒドロフランの如き無極性溶媒を添加したと
きにも、均質状態のまま保たれる（″無極性溶媒りｊ係
、メタノールｊｅＩ）″までの濃度において上記の状態
が保たれる）。

代理人の氏名　川原１）−穂

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド
   および／またはその誘導体を非水性溶媒および／または
   非水性／水性混合溶媒に溶解する方法において、高分子
   りｆンドまたは高分子リガンド混合物の存在下に溶解す
   ることを特徴とする方法〇（２）高分子リガンド：ヌク
   レオチドまたはポリヌクレオチドの重量比が／：ｌない
   し３００　：　／であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 （３）　高分子り〃ンドが／ざ−クラウン−６、／ｊ−
   クラウンーｊ１ジペンゾー／ざ一クラウン−６、ジシク
   ロへキシル−／♂−クラウン−６，２／−クラウン−７
   、およびクリプタンド［，２＃）からなる群から選択さ
   れたものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   または第２項に記載の方法。 （４）　溶媒が、メタノール、エタノール、ジメチルス
   ルホキシド、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチ
   ル、トルエン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン
   、およびこれらの溶媒の混合物からなる群から選択され
   たものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項−
   第３項のいずれか一項に記載の方法。 （５）　ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが、遊離
   酸および／またはその塩好ましくはナトリウム塩の形の
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲ｗ、１項−
   第μ項のいずれか一項に記載の方法。 （６）　実質的量の高分子リガンドが、有機または無機
   担体物質に結合したものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項−第５項のいずれか一項に記載の方法。 （７）　特許請求の範囲第１項−第を項のいずれか一項
   に記載の方法に従って製造された７種またはそれ以上の
   ヌクレオチド−高分子リガンド錯体またはポリヌクレオ
   チド−高分子リガンド錯体を含有する非水性または非水
   性／水性混合溶液。 （８）７種またはそれ以上のヌクレオチド−高分子リガ
   ンド錯体またはポリヌクレオチド−高分子リガンド錯体
   を含有する非水性または非水性／水性混合溶液。 （９）ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの分離およ
   び精製、特にＲＮＡおよび蛋白質からのＤＮＡの分離お
   よび精製、またはＤＮＡの混合物の分離のために下記方
   法を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項−
   第６項のいずれか一項に記載の方法の使用。 ａｌ　非分別結晶および／または分別結晶によってヌク
   レオチドおよび／またはポリヌクレオチドを精製すると
   き罠下記方法を使用することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項−第４項のいずれか一項に記載の方法の使用。 ａυ　非水性溶媒または非水性／水性混合溶媒系の中で
   ＤＮＡの如きポリヌクレオチドの化学的合成を行うとき
   に下記方法を使用することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項−第６項に記載の方法の使用。 θ２　二重ラセン構造を有するＤＮＡを、単純ラセン構
   造を有するＤＮＡに変換させるときに下記方法を使用す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項−第６項のい
   ずれか一項に記載の方法。 ａ３　水分圧敏感々薬剤によってＤＮＡを化学的に変性
   させるときに下記方法を使用することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項−第６項のいずれかに記載の方法の使
   用。 ■　発癌等の研究のために使用することを特徴とする特
   許請求の範囲第７３項に記載の使用。