JPS60209526A - 高純度ｃｓｆの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＣ８Ｆ　（Ｃｏ１ｏｎｙ’　Ｓｔｉｍｕｌａｔ
ｉｎｇＦａｃｔｏｒ　）の新規な製造法であり、詳しく
は、健康な人の尿から分離された咄乳動物骨髄中の単球
マクロファージ系幹細胞および顆粒球系幹細胞に作用し
てこれらの細胞の単球−マクロファージおよび顆粒球へ
の分化増殖を促進するＣ８Ｆの製造法に関する、〔従来
技術〕 ｃｓｙは呻乳動物の骨髄白血球前駆細胞（以下０ＦＵ−
０とする）に作用して、この細胞の顆粒球又はマクロフ
ァージへの分化増殖を促進する物質であり、骨％ｆｉ細
胞’ａ’　、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養するとき０ＦＵ−
０が分化と同時に増殖してコロニーヲ形成するために必
須な因子である、 （ＩＣｈｉｋａｗａ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ；　Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ。

Ｎａｔｉｏｎａ’ｌ　Ａｃ’ａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃ’
１ｅｎｃｅ　”）　６巻、Ｂ４８８．１９６６年。

Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ、：　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　ｉ巻、Ｂ１８５．１９７６年）
。Ｃ８Ｆは′抗癌剤、放射線椎射によろ白面球減少症或
いは神々のｇ梁症の治療剤として医薬への応用の仙、白
崩球派少症、角生不良性貧鹿等の診断薬としての用途が
期悄される（　ＭｏｔｏｙｏＳｈｉ　Ｋ、ｅｔ　ａｌ、
、Ｊａｐ、’Ｊ、Ｍｅｄ、　２１巻、Ｂ１８７．１９８
２年）。

Ｃ８Ｆはマウス肺培養液、吉田肉扉細胞ｊ０＠養敢、Ｃ
８Ｆ産生腫劫細胞移植マウスの尿（％開昭５８−５９９
２４号公報）などに含有されることが知られているが医
薬品として゛木１用する場合には先膜的副作用の少ない
ヒト由来のＣ８Ｆか好ましい、従来、報告されているヒ
ト由来のＣ８Ｆの起源としては （１）　ヒト尿（５ｔａｎｌｅｙ　Ｅ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ
　ｉ　Ｆｏｄ、Ｐｒｏｃ、。

６４巻Ｐ２２７２．１９７５年） （２）　ヒト胎盤（Ｎ１ｃｏｌａ　Ｎ、Ａ、ｅｔ　ａｌ
　：Ｂ１００ｄ　５４巻Ｐ６１４．１９７９年〕 （３）白血球の培養上清（Ｐｉｋｅ　Ｂ、Ｌ、ｅｔ　ａ
ｌ　ｉ　Ｊ。

０ｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ’、、　７６巻Ｐ７７．１９７
０年）（４）　ヒト楠細胞から樹立した株化ａ胞ＧＯＴ
（ＤｉＰｅｒｓｉｏ　Ｊ、Ｆ、ｅｔ　ａｌ’　ｉ　Ｆｅ
ｄ、、Ｂｌｏｏｄ　５”１巻Ｐ５０７．１９７８年）お
よび’ｒ’、３Ｈ’−５（０ｋａｂｅ　’ｒ、ｅｔ　ａ
ｌ　；　Ｊ、Ｃ！ｅ１１．Ｐｈｙｅｉｏｌ、、１１０巻
Ｐ４１６．１９８２年）の培養上清 などが知られている。（２）については産生源が限られ
ていること、（３）については培養効率が低く、更に培
養土渭ケつる際に、動物の血清７用いるために尚価とな
り、鞘製に細心の注意を要すること、（４）については
（３）の問題廟に加つるに、癌細胞由来という膚で医薬
品として用いる際に不安感が残ること、等の問題小があ
った。

従ってヒト由来のＣ８Ｆを製造する原料としては、健康
なヒトの尿がもつとも工業的な原料である、ヒト尿中に
は非常に多くの種々の蛋白質および糖蛋白質が含まれて
おり、これより０８ＥＦ　’ｌ　部製する方法も棟々提
案されている。

例えはヒト尿ｉ　ＤＥＡＥ−セルロースに吸着（ｐＨ７
，０）させ、吸着物？溶出後、リン酸カルシウムゲルで
砂理（ｐＨ６，５）Ｌ、、次いで再度ＤＦｉＡ］ｌＣ−
セルロースカラムにｐＨ７，４で吸着させ、その吸着物
を濃度勾配をつけた塩化ナトリウム水溶液で溶出させ食
塩濃度０．０７５　Ｍから０．１３　Ｍの溶出画分ンケ
ル濾過（ｐＨ７，４）　Ｌ、次いでコンカナバリン−Ａ
・セファロースカラムに吸着させ溶出液で溶出し最後に
ポリアクリルアミド電気泳動をかげることにより分子量
約４５，０００のマウス骨髄細胞およびヒト骨髄細胞を
分化増殖させるＣ８Ｆ　Ｆ！’えている（　５ｔａｎｌ
ｅｙ、Ｅ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ：　ＦｅｄｅｒｏｔｉｏｎＰ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ３７巻２２７２頁１９７５年）。

又、ヒト尿なケイ素含有吸着剤と接触させ吸着した有効
物質を溶出せしめ、中性塩で漉網沈澱”せしめた分画を
分別しこれを陽イオン交換体と接触させ不純物を交換体
に吸着せしめて除去し、溶出した液ｋｐＨ６−８で陰イ
オン交換体と接触させ有効物質？イオン交換体に吸着せ
しめのち０，１−０．６Ｍの無機塩溶液にて溶出せしめ
、得られた溶出液と高架橋度重合ゲルを充填したカラム
に通液して有効物質を充填剤に吸着させ、のち０．０５
−０．１　Ｍの塩類緩衝液にて溶出せしめ、相対溶出放
置が１．１１−１．６０である分画乞分別しｐＨ６，０
−８．０において物静和性吸着体と接、触させ２０−ｉ
　Ｑ　’Ｑ　ｍＭの糖類を含む１．０−２．０　Ｍ　［
添加１１１＆］液（ｐｔ（６，０−８，０ンで俗出し、
有効成分を集め、次いで溶出液乞ｐ）１７．０−９．０
において調製用電気泳動にかけ、宿所塩溶液により溶出
する分子量７５．０　［１０−９０，０００、等電膚ｐ
ｉ−１４，７±０．２のマウスおよびヒトの骨髄細胞に
作用して顆粒球だけからなるコロニーと形成させろｃｓ
Ｆがえられている（特開昭５４−１４０７０７）、 その他にもヒト尿からのＣ８Ｆの木白製法として、無機
指体への吸着、硫安分画、陽イオン父伽体操作、陰イオ
ン交換体操作、アフィニティークロマトグラフィー操作
、ゲルｄを治操作、電気泳動操作などの慣用的蛋白質お
よび糖蛋白質の精裏方法を組合せて精製する方法か仰ら
れている（　Ｄ　、ＭｅｔｃａＭ。

Ｋ、Ｒ，５ｔａｎｌｅｙ　：Ｂｒ１ｔｉｒｂ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ。

２１巻４８１頁１９７１年。

元吉府ｌ−Ｊ：：、高久更唐；医学のあゆみ、１０６巻
第２号７２頁、１９７８年）。

ヒト尿からのｃｓｙの工業的精製法の目的は高純度のａ
ｓｐ乞効率よく採取″することにあり、以上のような公
知の和製法は部製工程が非常に多く、純度が高くても０
８１回収率が大巾に低下すること、０８１回収率が高い
と＃１１度が低く、ヒトの治療への適用が不可能となる
こと、またコンカナバリンＡ−セフ７ｏ−ス（７）よう
す群特異的アフィニティクロマトグラフィー抄作または
′ｉ電気泳動操作はＣ８Ｆの純度は向上するが分子楢造
なとのＣ８Ｆの物性が変化″′する恐れがあること、な
どの理由により開路があった。

〔発明の目的〕

本発ＥＡ者らはヒト尿からのＣ８Ｆの効率的梢般法に関
し研究した結果、慣用的蛋白質程製振作に加資て新規株
製法を組合セることにょワ哺乳動物の骨髄ＭＢ胞に作用
してマクロファージおまひ穎板球から成るコロニーを形
成させるＣ８Ｆ　ｉ高純度、高収率でｈｆ製する方法ケ
児出し、本発８Ａヶ児放てるに至った。

〔発明の構放〕

本発明は、哺乳動物の骨髄絢胞の分化増殖を促進するｃ
ｓｂ”乞人尿から分晦取倚てる方法にお℃・て（１１人
尿を珪索宮ゼ吸着斧Ｊと接層させ、吸着した傅用物＋ｆ
ｆ１ケアルカリ俗准で浴出する（２１　（１１の、谷出
液？中性久件下で陽イオン交換体と＃触さセ不糾物？該
父俟体に吸着させ除去する（３１　（２１の捻出液をｐ
ｌｉ６．５−６の宋ＦＦ下で陰イオン交換体と接触びせ
有用物ｌＡ？該イオン父碗体に吸着せしめ、のち、０．
１−　［Ｊ、５　Ｍの無機塩浴液にて浴出イる （４）　＋３１の浴用欣ケＰＩ（（５−８の采件］で陰
イオン父慄体と接触さぞ有用物質？該イオン又４体に吸
着さゼ、のちｌＪ、１−　Ｌｌ、３　Ｍの無機塩浴液に
て溶出”ｆる （５１　（４１の浴出液？０．６〜１．５Ｍの無機塩υ
度に調整しｐＨ６−８の条件下で牌水的救独性奴着体と
接触させ、有用物質を該吸着体に吸着させ、のち、［１
，４−Ｌｌ、１５Ｍの無機塩浴液にて浴出するへ（６１
＋５１のＡυ出液ンゲル葭過剤と接触させ相対溶出液層
が１．１−１．７の分画？取得する工程から欣ろことを
４＋体と１−る尚純度ｃｓｒの製造方法であ介。

本発明をさらに詳細に駿明てあ。

ｆｉｌ　４＃康なヒトから狂、めた終部Ｔ（泳ＣｐＨｂ
−８）に含水珪酸（５ｉ０２．（Ｂ２０）ｎ　）のａｉ
子プたＶ工粉末などの吸着剤’ＩＷ・加し唆后抜、御心
分離穿たは勢圧亦・週などにＪｒ）孜看浴を回収し、こ
れｋｐＨ９以上のアルカリ水沼液、・−、えは、仇γ専
なアンモニア水浴液で処理し、吸看吻？浴出さゼる。

（２ン　かくしてえもｔだ溶出液のｐｉ］Ｙ７−ａＫ調
整し脱塩・磯＠後、吻イオン父例俸、グ、１えはアンバ
ーライトＩＲＱ　−ｂ　Ｏ（ｏ−ム・アンド・ハース？
ｉ製）ｆたはカルボキシメチルセルロースなどと接触さ
せ、溶成中の不Ｎ−物ケ吸看屍去てる。

接触はｐｔｌ６−８で行う。このさいＣ８Ｆは吸着され
ずに通溝する。

（３）　こＦＬを爵縮しＰ）１３．５−６、好寸しくは
ｐｉ〕４−５に鳩降したのち、１司じＰＨ″ｐＪ」域の
板伊孜で緩イ匍化した陰イオン：９併体、汐ｌＪえは、
ＤＥＡＥセルロースと接触させ吸着物ンＵ−１−Ｕ、６
　Ｍの無機塩、例えは塩化ナトリウム？含むＭ側＆（ｐ
Ｈ４−５）？用いて浴出させ、分−ケ呆める。

（４）　こオ１ｖ脱地、−縮しｐ）１６−８に調整した
のち、同じｐＨ領域の緩衝液で緩伽化した階イオン又換
体、例えはＤＥＡＥ−セルロースと接触させ、吸着物を
°０から０，５Ｍの塩樋塩、例えは塩化ナトリウム？含
むに漬液ＣｐＨ６−８）を用いて塩濃度？連続１ｆ’ｌ
に高めていく直線的一度勾配溶出法にまり抽出さぞ、０
．１−０．３　Ｍの塩凝度の緩衝液により抽出される分
画？集める。

（５）　この外面１故に無機塩、例えは硫酸アンモニウ
ムｋ　Ｏ，６−１，５Ｍ、好筐しくは０．８−１．２　
Ｍになるように務）力１１Ｌｐｔ（ン６−８に調整して
から、あらかじめ、０．６−１．５　Ｍの無機塩、例え
は、硫酸アンモニウムケ含む緩衝液で酸価化された疎水
クロマトグラフィー用樹脂、例えは７エ二ルセフアロー
ス０Ｌ−４Ｂ、またはオクチルセファロースなどに接触
させ次いで収着物ＹＩＭから０．１Ｍの無機塩、例えば
硫酸アンモニウム？含む４１ｋ慟液（ｐ＃１６−８）を
用いて高い塩濃度から近い塩嬢度へと塩濃度な変化させ
るいわゆる直線的濃度勾配溶出法により浴出させ０，４
Ｍから０．１５Ｍの塩濃度のし心Ｊｌｆ支にまり箔出び
ねる分画？莱める、必要忙より脱塩・−綱でる。

ｔｅ＋更＜上記ｆ；液ケ、分子飾クロマトグラフィーの
目的でゲル港辺仲ｊ１例えはセンアテ゛ソクスＧ−１５
０、バイオゲルｐ　’−１０［Ｊ工たは第・榛糸ゲル帥
過剤など？黄ダ；したカラムに遡液して浴液中のＣＢＦ
を大亭斧ｊに吸漕さぜたのち、ｏ、ｏｉ−０，１５Ｍの
ｆ＃機塩ｆ＃−価１液にて浴出せしめ相対溶出液量が１
．１〜１．７好ましくは１．２〜１．６である分画？保
め肢、塩・敬に、後、保結軒νしてａｓｐを取得ｆる。

なは、相対浴出ｆｆ！Ｌ量とはＶθ／ｖＯで表わされる
数仙である（　Ｖｅはカラムに通液する試料液かカラム
から抽出てる液量ケ示し、Ｖｏはカラ、ム内のゲル粒子
外部の浴次ンケ示ｆ）、上記和製工程で使用する緩体液
は任意のものを選択できるがａｓｐ活性の測定に及ぼｆ
ｋ畳などから、リン酸ナトリウム糸緩衝液が好ましい。

また、Ｃ８Ｆは８！！蛋白質であるためｈ抜操作中ガラ
スやプラスチック製の儀典に付層又はＩ＆看しＣ８Ｆ回
収率が但下する原因となるので全工程中に付着防止１１
す、イタえは小すエナレングリコール（ＭＷ２．ＯＬ）
　０−６，０００　）ンｏ、ｏ　ｏ　ｉ〜０．１％（Ｖ
／／Ｖ　）凸ぐ力ｎ−ｆることか好ましい。

以上の本発明のヒト尿Ｏ６Ｆの鞘表工程ｒ安約すると次
の工程よりｒｉｉろ、 第１ニオｖ：ヒト尿より相蛋白質物質の含水珪酸吸洛１
本によるｌ））層 第２工程：賜イオン交振体忙よる不糾物負の味云打・作 第６王桿：陰イオンダ炉俸による相Ｃ８Ｆ動分の取得操
作（ｐ）ｌ　３．５−６．０　） 第４丁程：直祢的塩凝度久配浴出法での陰イオン交僕体
による壮Ｃ８Ｆ画分の取得操作 （ｐ）１６．０−８．０　） 第５丁程：直椋的塩綴虫勾配浴出法での疎水クロマトグ
ラフィー沖柾加によるｈｃｓｙ画分の増＠挨・作 第６エ程ニゲルσ１溝剤によるｉ％　Ｏ６１’画分の分
子量分別操作（パイロジエン物質及び低分 子物質　の　＞’＋ｉｆ、各日”Ｊ　’ｌｈ；　去　）
上ｈｃ本発明のれ製工程中で特ｂｉＵノな工程は々・、
１工程、１３工梓おＪＵ・沙、５工本ｒであ会、第１工
程のヒト尿中の弧白屓鍮・臂ン回ル、］る方法としては
忙用Ｏ１には翫敞アンモニウムなどの無機塩を添力１１
′ｆる塩析法、イオンシ怜、体によりイオン的に吸着さ
せる方法およＱシリンフｆブフノリンのような吸着剤に
吸廃さゼる方法なとが九らｒでいる。

し力・し、これらの方法ではヒト原子ｖＣｇ　”４７す
る鼾、多な蛋白質ケ回収１−石ことになり矢１丁佳以佐
の朴墓工程で朴製力、率が上からず簡机Ｅ！：、０６Ｆ
　ＣＩ）ｕｙ地か困卯になる。また塩り■法では７蛍の
祈〕αグアンモニウム？使用すること、Ｌ元゛法ては市
１１１１・な扱漸剤？＠！用１−るなと、コスト的にも
呟題かある。

したがって、称単かつ安（＋ｌｉ　ｙｚ方法で、ＣＢＦ
含亘蛋白質分画を第択市にヒト詠より回収て不ことが工
業的に望ずれる。

本発明者らは４Ｍ々の方法を仙九した赴−果、ヒト尿は
電解質物質が多いことに盾目し、含水珪酸（：５１ｏ２
（Ｈ２ｏ）ｎ）からなる吸着剤ケ用いると０８Ｆ含有蛋
白質分画が選択的に回収できることを見出した。

すなわち、本発明の第１工程はヒト尿中に粒状または勅
末状の含水珪酸［５ｉｏ２（ｎ２ｏ）ｎ’］　ｖＯ，０
５−０，５％　（Ｗ／Ｖ）で添加し、吸看後遠心分１ｉ
ｌＩまたは減圧麺沿により吸着剤を回収するきわめて簡
単で安価な方法である′含水珪酸の添加νは上記範囲カ
ー好ましいがこれに限足されるものではない。

次に糾６エ程の陰イオン交排体ｙ用いＯ８′Ｆを鞘ｍ″
ｆる方法は９４戸的方法として公知であるが、本発明で
はＣ８Ｆの等１！膚が低いｐ）１＠域（ｐｌ　３．５−
４．０）にあることに着目し操作条件ｙｐｉ４．０−６
．０、好ましくはｐｌ−１４，５−５，５の範囲ｖｘ択
することにＪｒ１ｍｌ工程でえられたＯ８？含有蛋白賀
分画中の雑多な物置Ｙ＃イオンタ換体に吸着させること
な（Ｏ８Ｆ含套醇分ヲカ先的に吸着させることが判明し
、この操作条件の選択により第４工程以後の精製工程で
の精製効率が大巾に向上することが可能となった。

また本工程の別の特徴はヒト尿中に含穿れてｔ・るＣ８
Ｆの１害物質が本工程で除去されるためＣ８Ｆ活性の１
０１収率ン大巾に向上さゼる匁・果かあることである、 次に第５工程につき説明−する、 Ｃ８Ｆはに蛋白質であり、しかも糖釦の占める害１（合
が非常に大きいことが判明しており、従って糖敦和性樹
脂ケ用いる朴製法か和めて頁匁であることは公知である
、 従来はｃｓｙの外装に１！！紗和性渡脂として詳特異性
アフイニテイクロマトグラフイー甲を１肛が用いられて
いる、 群特異性アフイニテイクロマトグラフイとは生物学的特
異性に中米する蜘和性をもつりガントを固定化した吸着
体を用いそのリガンドに関係した一部の目的ｅｌ質′ｌ
￥枠製する方法でａｓｙ和袈の場合コンカナバリンＡ（
植物性朋豚に象素）？結合した檜物性血琢＆井素ケ結合
したａ脂、例えはＣａｎＡセファロース（ファルマシア
社製）か用いることが知られている、 しかしこの方法でＣ８Ｆ　％’和製′ｆる場合Ｃ８Ｆと
Ｃｏｎ　Ａセファロースとの結合か強＜浴出剤で溶出す
るさい、ｃＳｙの回収率が大巾に借下したり、溶出条件
によってはｃｓｔｒ分子の糖鎖部分が分解″ｆるこ５　
Ｃ！ｏｎ　Ａセファロースの′Ｐ−Ｊ住が困弧で高価な
＆、、脂を褥使用しに（いこと、また溶出剤か高価など
の坤申により１菓的私製法として簑用的ではな％ｚ。

本発明で甲いる提勅和性柾脂は群特異的アフイニテづ−
クロマトとは歩なった疎水性クロマトグラフィー用樹脂
である。

疎水性クロマトグラフィーとは一般式−（ｃＨ２）ｎＸ
で示される疎水性のアルカン訃導体ケリガ°ンドとする
吸着体ン甲いるクロマトグラフィーで、リガンドの生物
学的特異性を第１・用したものではなく、その疎水性を
オＩＩ用するものであり、この一般式でｎ　−１〜８、
ＸとしてはＨ（アルカン）、ＮＨ２（アルキルアミン）
、０ＯＯＨ（脂肪酸、アルカン酸）ＯＨ（アルキルアル
コール）、Ｃ６Ｈ３（フェニール）などがあり、Ｃ８Ｆ
のｈ裂片としてはフェニールセファロース、オクチルセ
ファロースなとか幼果的である、 疎水性クロマトグラフィーによりＣ８Ｆ％ｌｓ表した例
としてはマウスの牌胛禮側か発生する各種Ｏ８Ｆの分１
１１　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｔ　Ｉ　８５　巻３０１頁
、１９８０年）やマウスの麿、に、ＩＩＩ＋か狂生てる
ＣＢＦとインターロイキン２の分ｍｐ（Ｊ、■ｍｎ＋ｕ
ｎｏ１０（ｚ７１２７巻−５１９８３頁１９８１年）ｌ
とにフェニールセファロースの応用が判缶されている、
しかしこｔらはマウス糸のＣ３Ｆ７−あり、当然、ヒト
尿ＣＢＦとは分子種が異なる。聾た夾り物質の検知、鎗
も異なり、従って＠水性クロマトグラフィーの溶出条件
なとの←作峰件か本発明の条件と異なる、 茸だ、ヒト胎盤由米細胆の堀髪喉からフェニルセファロ
ースカラム？用いてＣ！ＳＦ　’ｙ和製′ｆ６方法が報
告されている（、　Ｂｌｏｏｄ　ｓ　４巻ト１１３．６
１４頁）この方法により得られたＣ８Ｆは分子蓋３０．
０　［Ｊ　Ｏでありヒト尿由来のＣ８Ｆとは分子が異な
っている。

さらにそのａｓＦ比活性は１．０００単位／〜蚤白買と
非常に低くフェニルセファロース・カラムのみによるか
シにだル赫辿長・作のよっな偵用的ネ＾製法とフェニル
セファロース−カラムとσ〕組合せによる打・製法では
医薬として逆用できる高＠１度σ）　Ｃ８Ｆケ腔迄でき
ないことが証明されて（・々。

以上よりヒト尿中のＣ８Ｆを筒純度で年ド製増得てる手
段の１つとして疎水性クロマトクゝラフイー法乞組合せ
た例は報告されてな（１、 〔発明の実施例〕 実施例中Ｃ８Ｆの活性は下記の方法により横１ノ定した
。

直径３５３１／ｌのプラスチック培養■［に２０％馬鹿
渭、各１ｍ度のｃｓｙ試料、０．３気の寒天おまひ１×
１０５個のマウス骨髄細胞を含むＭｃＯｏｙ’ｓ　５　
Ａ培地１＋＋ＩＹ＆、ｔ７日間３７°Ｑテ５４００２　
’（ｒ’含も？飽禾Ｕ水蒸気下培養した、培養後、世］
立顕微鋭下で検鋭し、５０個以上の細胞集塊をコロニー
の数とした、またヒト骨髄細胞ケ用（・ろ場合＆；、メ
スチー法（）Ｔ、Ａ、Ｍｅｓｓｎｅｒ、Ｊ、Ｅ、Ｐｉｌ
ｌ　ａｎｄ　Ｅ、Ａ、ＭｃＣ！、ｕ／１ｌｏｃｋ　；Ｂ
ｌｏｏｄ　４２巻Ｐ７０１．１９７６年）によりリド付
漸性骨勧則胞分ｉ［！Ｉｌ？参・め、荷杉卸１施（１×
１０５）ケ片い１４日間培養し５０個以上のａＩ鉋隼塊
ケコロニーの数とした、 またＣ８Ｆの粘性はコロニーケ１　＆ｌ形成させる活性
ケ１単位とし、比活性ン次式により耳高した。

なは蚤白買の足置はブラッドホールド法（＝、ｇ。

Ｂｒａｄｆｏｌｄ　ｉ　Ａｎａｌｙｌｉｃｏｌ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７２　％Ｐ２４Ｂ、１９７６年）
によった。

実施例 成人男子尿２０００ｉ（ｐＨ６，５）に粒状名水珪酸（
曲品名”ホワイトカーボン”偲山１達什卸舶）４Ｋｐを
検力１し１時間投件した。

次いで沈澱物を滌圧砕遇により派別し［ｇ１収した。

この湿潤沈澱物２４％アンモニア水４０ｉに検力１して
３０分間倹押し含水珪酸に成層した蚤白負様物質を溶離
させた。

次いで濃過により不溶管ヲ隙去し溶出＃ｉ？えた。

これケ濃縮装置（ペリコンカセット、ミリポア社汲）に
より２ノにｒ１１３縮し、次いでホロ７ァイ／マ一式透
４７１」７・（クラレ社″Ｆ：）　＋’ｉ：より糾水（
Ｃ対して透俤した、 このか−伯欣のＰＨ？６．５に調部シ２、こねケあらか
じめ００２ＭリンＮゆ玖佃１代（ｐ）１６．ｂ）で平衡
化されたアンバーライトエＲｅ　−５０（ローム・アン
ド・ハースン→抄′Ｖ）カラム（５ｃｍ直径×８０Ｃ八
高さ〕に通液し火苅吻ンこのイオン交勿樹側に吸】ｂさ
せ、さらに上ｂｌ′和価孜を通液し、通壷喉５１ｑだ（
試料尚１工程１〜２）。

このＪ重連・イ（全型ケ０．５　Ｎ−塩酸でｐＨ４，５
に罎繁し、こｔ’＋ｙ、＝あらかじめ０．０２　Ｍ　−
リン酸塩し価液（ｐＨ４，５）で平待■化されたＤＥＡ
Ｅ−セルロース（プテウン社紳）カラム（１０Ｃｌム直
件ｘ　４　Ｑ　ｏｒｔ尚さ）に通赦し、０．０２　Ｍ−
リン酸壌籾偵ｌ吹（ｐＨ４，５）でカラムケ光分洸浄し
たのす、＋、Ｑ、３ｔｉａのＮａＣｌ２を含む［Ｊ、０
２　Ｍ−リン酸塩紗佃＋を俊（ｐＨ４，５）で溶出ケ行
ないＹ仝出液８ｉをえた。この浴用液を濃縮装置で鎖網
し、透析器により純水に対し透析し透析液５ＤＤｒｎノ
ンえた。（試料崩２工程１〜６）。

θ′に、この液全量ケ、あらカＬめＯ，ｌＬ１２Ｍ−リ
ン配塩移ｆＩＩＩＴ液（ｐＨ７，４）で乎伊イヒされた
ＤＥＡＥ−セルロース（ホワソトマン７ユ製ンカラム（
２，５ｃｍ　＋Ｍ径×１０Ｑ　ｃｍ簡さ）に通欲し昧層
佐Ｏから０．５ＭのＮａＣｊｉｐ含む０．０２１，１−
リン銅塩ｋ　ｈ　孜（ＰＨ７，４）を用いて塩（ｐ度？
アＩ÷竹すに尚めていく債紛的濃ｉ欠配浴出法により浴
出さぞ、Ｕ、１　Ｍ　−Ｑ、３Ｍの塩θ度の後価教にＪ
り浴出した分旧６５０Ｍケ徒めた。（試７Ｐ＋Ｎｂ３工
程１〜４）、この分画液に初末状懺酩アンモニウム？１
Ｍは星゛になるように検力［Ｌ　０−５Ｎ　−ＮａＯＨ
でＰＴｉｖ７．４に調水−シ、こ７″１ケあらかじめ０
．１５　Ｍ　−ＮａＣｆｆｌ　ｆ含む０．０１　Ｍ−リ
ン酸塩ｋ　ｋ　？ｉｆ　（ｐｌ（７，４）で平畑丁イピ
されたフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア
社製）カラム（２，５Ｃ八翫径Ｘ　３　Ｑ　６Ｎ尚さ）
に通液し吸着後１ＭからＯＭの４ｒ、−ｒＥ＝アンモニ
ウム？含む０．０１　Ｍリン酸塩緩偵゛ｍ、　（ｐＨ７
，４）　ｋ用いて塩凝度ケ連続的に下けていくＬ区廓的
磁度勾配浴出法により浴出させ０．５Ｍから０．６Ｍの
塩余度の緩＆液により溶出した分−２００阿ｌケ莱めた
。こ（ＦＢＩ−３０００，ファルマシア社製）にょ９測
定した結果、試料鳩５の等＄°点はｐＨ４，３±０．２
であった。

（３１分子：１１ｔ：セファデックスＧ−１５［］’ａ
−’用いたゲルト迦法（カラム；１．６ｃｎＬ直径×９
０ｇＬ高さ、溶出Ｉ俟；　０．０２　Ｍ−リン敵地緩衝
液、ＰＨ７，４＞Ｋまり抑１足した結果、試料鳩５の分
子量は約８０．０００であった。

〔発明の効果〕

本発明は、尚細度のＯ８Ｆを篩収率で工業的に製造″ｆ
′ろ方法を示すものであり又各ＶＡ製工程でＯＳＦ分子
の化学的変化ケうけることな（生体由来そのままのＯ８
Ｆ分子を取得することができろ、さらに、本発明で得ら
れるｃｓＰ′はマウス、サル、ヒトなどの咄乳動物の骨
髄幹細胞に作用してマクロファージおよび顆粒球から成
るコロニー？形成させるものであり、診断剤や医薬への
適用が可能な有用な物質である。

％許出願人　電気化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）哺乳動物の骨髄ａＭｇｔの分化増殖を促進する０’
   ＳＦ　Ｙ人尿から分離取得する方法において（１）　人
   尿を珪素含有吸着剤と接触させ、吸着した有用物質をア
   ルカリ溶液で溶出する （２＋　（１１の溶出液を中性条件下で陽イオン交換体
   と接触させ不純物を該交換体に吸着させ除去する （３１　（２＋の溶出液をｐＨ５，５−６の条件下で陰
   イオン交換体と接触させ、有用物質を該イオン交換体に
   吸着せしめ、のち、０．１−０．３　Ｍの無機塩溶液に
   て溶出する （４’Ｉ　（３１の溶出液ｗＰＨ６−８の条件下で陰イ
   オン交換体と接触させ有用物質を該イオン交換体に吸着
   させ、のち０．１−０．３　Ｍの無機塩溶液にて溶出す
   る （５１　（４１の溶出液を０．６−１．５　Ｍの無機塩
   磯度に調整しｐＨ６−８の条件下で疎水的親和性吸着体
   と接触させ、有用物質を該吸着体に吸着させ、のち肌４
   −０．１５Ｍの無機塩溶液にて溶出する ［６）　ｉ５）の溶出液Ｙデル濾過剤と接触させ相対溶
   出液量が１．１−１．７の分画を取得する工程から成る
   ことを特徴とする高純度Ｏ８Ｆの製造方法。 ２）珪素含有吸着剤が式５ｉＯ１（Ｈ２Ｏ）ｎで示さゎ
   る含水珪酸である特許請求の範囲１）記載の製造方法、 ３）陰イオン交捩体が、第３紗アミノ基？含む弱陰イオ
   ン交換体である特許請求の範囲１）ＷＥ’載の製造方法
   、 ４）　Ｍ水的親和性吸着体が武士〇Ｈ２）ｎＸ　Ｃｎ　
   ＝　１〜８、Ｘ　−Ｈ，−ＮＨ２，−ＣｏｏＨ，−ＯＢ
   、−０６Ｈ５〕”？ｌ”示される疎水性のアルカン誘導
   体をリガンドとする特許請求の範囲１）記載の製造方法
   。 ５）ゲル濾簿剤が三次元の網目構造をもっ有ａ糸または
   無機系のゲル粒子である４＄許請求の範囲１）記載の製
   造方法、