JPS6098988A - Ｌｐｆ−ｈａの精製法 - Google Patents
Ｌｐｆ−ｈａの精製法Info
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- JPS6098988A JPS6098988A JP58206598A JP20659883A JPS6098988A JP S6098988 A JPS6098988 A JP S6098988A JP 58206598 A JP58206598 A JP 58206598A JP 20659883 A JP20659883 A JP 20659883A JP S6098988 A JPS6098988 A JP S6098988A
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｌ Ｐ Ｆ−ＨＡの採取精製法、さらに詳し
くは、百日ぜき菌の培養物からＬＰＦ〜ＨＡ（Ｌｅｕｃ
ｏｃｙｔｏｓｉｓ −ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏ
ｒｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ）を採取するに際し、
変性セルロプラスミンをリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーを用いて、ＬＰＦ−ＨＡを高収率かつ
高純度で得る方法に関する。
くは、百日ぜき菌の培養物からＬＰＦ〜ＨＡ（Ｌｅｕｃ
ｏｃｙｔｏｓｉｓ −ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏ
ｒｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ）を採取するに際し、
変性セルロプラスミンをリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーを用いて、ＬＰＦ−ＨＡを高収率かつ
高純度で得る方法に関する。
産業上の利用分野
ＬＰＦ−ＨＡは、百日ぜき菌工相菌および■相菌が産生
ずる活性物質であって、毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）を
欠（■相菌やパラゴロぜき菌・気管支敗血症菌は産生じ
ない。このＬＰＦ−ＨＡは百日ぜき菌毒素とも称され、
多様な生理活性を有する蛋白質であることが知られてい
る。その主な生理活性としては、白血球増多活性、イン
シュリン分泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血球ａ
集活性等が知られており、なかでも、そのインシュリン
分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤としての応
用が注目されている。
ずる活性物質であって、毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）を
欠（■相菌やパラゴロぜき菌・気管支敗血症菌は産生じ
ない。このＬＰＦ−ＨＡは百日ぜき菌毒素とも称され、
多様な生理活性を有する蛋白質であることが知られてい
る。その主な生理活性としては、白血球増多活性、イン
シュリン分泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤血球ａ
集活性等が知られており、なかでも、そのインシュリン
分泌増強活性にもとづいて、糖尿病の治療剤としての応
用が注目されている。
これらの生理活性とは別に、最近になって百日ぜき閑の
感染および発病の防御にＬＰＦ−ＨＡがきわめて重要な
る役割を演じていることが明らかにされ、百日ぜき菌感
染防御抗原としても注目されるようになった［１’ｉｔ
ｔｍａｎ、Ｍ；Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕ
ｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１ 、４０１〜４０９ （１９
７９）＋および５ａｔｏ、Ｙ；Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ
ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ ｐ／ 、Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ、 ３８０〜３８５
（１９８２）１゜ したがって、Ｌ Ｐ Ｆ−ＨＡの生理活性を研究するう
えに、またその生理活性を利用した医薬品の製造のため
に、さらには副作用のより少ない百日ぜきワクチンを工
業的に製造するために、ＬＰＦ−ＨＡを簡単蚤こかつ大
量に単離精製する方法の開発が望まれている。
感染および発病の防御にＬＰＦ−ＨＡがきわめて重要な
る役割を演じていることが明らかにされ、百日ぜき菌感
染防御抗原としても注目されるようになった［１’ｉｔ
ｔｍａｎ、Ｍ；Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕ
ｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、１ 、４０１〜４０９ （１９
７９）＋および５ａｔｏ、Ｙ；Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ
ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ ｐ／ 、Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ、 ３８０〜３８５
（１９８２）１゜ したがって、Ｌ Ｐ Ｆ−ＨＡの生理活性を研究するう
えに、またその生理活性を利用した医薬品の製造のため
に、さらには副作用のより少ない百日ぜきワクチンを工
業的に製造するために、ＬＰＦ−ＨＡを簡単蚤こかつ大
量に単離精製する方法の開発が望まれている。
従来技術
従来知られているＬＰＦ−ＨＡの採取精製法では、百日
ぜき菌培養物を硫安塩析し、ついて抽出、透析したもの
を出発材料とし、これをイオン交換クロマトグラフィー
、ゲル濾過［Ａｒａｉ 、Ｈ；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、 ４４４，７
６５（１９７６））、あるいはショ糖濃度勾配遠心［５
ａｔｏ。
ぜき菌培養物を硫安塩析し、ついて抽出、透析したもの
を出発材料とし、これをイオン交換クロマトグラフィー
、ゲル濾過［Ａｒａｉ 、Ｈ；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、 ４４４，７
６５（１９７６））、あるいはショ糖濃度勾配遠心［５
ａｔｏ。
Ｙ；Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、６．８９７〜７０４
． （１９７２））などによって精製する方法が採用さ
れている。しかしながら、このような方法では、電気泳
動法１こよる純度分析で１本のバンドのＬＰＦ−１−Ｉ
Ａを１与ることは難しく、またその収量も少ない。
． （１９７２））などによって精製する方法が採用さ
れている。しかしながら、このような方法では、電気泳
動法１こよる純度分析で１本のバンドのＬＰＦ−１−Ｉ
Ａを１与ることは難しく、またその収量も少ない。
高純度のＬＰＦ−ＨＡを比較的大量に得る方法として、
百日ぜき菌培養上清液をノ１イドロキシア／ＮＩＬタイ
トのカラムに通してＬＰＦ−Ｈ’Ａ を吸着させ、洗浄
、ｍ出抜、コンカナバリンＡ−セファロース（ＣｏｎＡ
−３ｅｐｈａｒｏｓｅ、ファル７シア社製）によるアフ
イニテイクロマトグラフィーで精製する方法が提案され
ている（ Ｙａｊｉｍａ、Ｍ；Ｊ、Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍ、
８３゜２９５〜３０３（１９７８）］。しかしながら、
このコンカナバリンＡをリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーは、ＬＰＦ−ＨＡのみと親和性を有す
るのではなく、糖類や糖脂質、さら１こ他の糖蛋白質な
ども吸着するため、百日ぜき菌の他の成分、たとえばＦ
−ＨＡ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−Ｈｅｍａｇｇｌａｔ
ｉｎｉｎ）や菌体膜成分なども吸着し、所望のＬＰＦ−
ＨＡを高純度で単離することが難しく、優れたアフィニ
テイクロマトグラフイーとはいえない。
百日ぜき菌培養上清液をノ１イドロキシア／ＮＩＬタイ
トのカラムに通してＬＰＦ−Ｈ’Ａ を吸着させ、洗浄
、ｍ出抜、コンカナバリンＡ−セファロース（ＣｏｎＡ
−３ｅｐｈａｒｏｓｅ、ファル７シア社製）によるアフ
イニテイクロマトグラフィーで精製する方法が提案され
ている（ Ｙａｊｉｍａ、Ｍ；Ｊ、Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍ、
８３゜２９５〜３０３（１９７８）］。しかしながら、
このコンカナバリンＡをリガンドとするアフイニテイク
ロマトグラフイーは、ＬＰＦ−ＨＡのみと親和性を有す
るのではなく、糖類や糖脂質、さら１こ他の糖蛋白質な
ども吸着するため、百日ぜき菌の他の成分、たとえばＦ
−ＨＡ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ−Ｈｅｍａｇｇｌａｔ
ｉｎｉｎ）や菌体膜成分なども吸着し、所望のＬＰＦ−
ＨＡを高純度で単離することが難しく、優れたアフィニ
テイクロマトグラフイーとはいえない。
最近、ヒトハプトグロビンがＬＰＦ−ＨＡに特異的に結
合することが発見されて以来、上記の方法におけるコン
カナバリンＡの代わりに、このヒトハプトグロビンをリ
ガンドとして用いるアフィニテイクロマトグラフィーで
ＬＰＦ−ＨＡを精製する方法が試みられている（Ｉｒｏ
ｎｓ、Ｌ；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｉｓ
ｉｃａ Ａｃｔａ、５８０，１７５〜１８５（１９７９
）およびＣｏｗｅｌｌ、ｊ； Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ
ＩｎｆｅｃｔｉｏＬｒｓＤｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ、３７１〜３７９（
１９８２）］。このヒトハプトグロビンをリガンドとし
て用いる場合ｆこは、新たに肝炎ウィルス対策のは要な
間頓が生じる。即ち、ヒトハプトグロビンは人面液から
採取されるため、肝炎ウィルス混入の恐れがある。さら
に他の未知の感染性因子混入の懸念もなおざりにできな
いことであり、これは動物血清を用いる場合も同様であ
る。現在のところ肝炎ウィルス等の混入をチェックする
絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウィルス等を不
活化するための手段として、６０°Ｃ９１０〜１５時間
加熱する方法が知られている。本発明者らはそのような
加熱処理を行うと、ハプトグロビンのＬＰＦ−１１Ａ
ｌこ対する親和性はほとんど喪失され、目的とする効果
がなくなってしまうという重大な欠陥があることを見出
した。
合することが発見されて以来、上記の方法におけるコン
カナバリンＡの代わりに、このヒトハプトグロビンをリ
ガンドとして用いるアフィニテイクロマトグラフィーで
ＬＰＦ−ＨＡを精製する方法が試みられている（Ｉｒｏ
ｎｓ、Ｌ；Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ Ｂｉｏｐｈｉｓ
ｉｃａ Ａｃｔａ、５８０，１７５〜１８５（１９７９
）およびＣｏｗｅｌｌ、ｊ； Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ
ＩｎｆｅｃｔｉｏＬｒｓＤｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ、Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ、３７１〜３７９（
１９８２）］。このヒトハプトグロビンをリガンドとし
て用いる場合ｆこは、新たに肝炎ウィルス対策のは要な
間頓が生じる。即ち、ヒトハプトグロビンは人面液から
採取されるため、肝炎ウィルス混入の恐れがある。さら
に他の未知の感染性因子混入の懸念もなおざりにできな
いことであり、これは動物血清を用いる場合も同様であ
る。現在のところ肝炎ウィルス等の混入をチェックする
絶対的な方法はない。一方、かかる肝炎ウィルス等を不
活化するための手段として、６０°Ｃ９１０〜１５時間
加熱する方法が知られている。本発明者らはそのような
加熱処理を行うと、ハプトグロビンのＬＰＦ−１１Ａ
ｌこ対する親和性はほとんど喪失され、目的とする効果
がなくなってしまうという重大な欠陥があることを見出
した。
また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用いる情製
法でも、そのハイドロキシアパタイトのカラム操作に長
時間を要するため、Ｌ Ｐ Ｆ−ＨＡの活性低下の恐れ
があるほかハイドロキシアパタイトが高価であるために
、ＬＰＦ−ＨＡを工業的にかつ安価に採取するには間頓
がある。
法でも、そのハイドロキシアパタイトのカラム操作に長
時間を要するため、Ｌ Ｐ Ｆ−ＨＡの活性低下の恐れ
があるほかハイドロキシアパタイトが高価であるために
、ＬＰＦ−ＨＡを工業的にかつ安価に採取するには間頓
がある。
さらに、最近になって、百日ぜき菌菌体を機械的に破砕
して菌体成分からＬＰＦ−Ｉ−ＩＡを抽出し、硫安分画
したものを出発材料として用い、これをハプトグロビン
またはセルロプラスミンなどのプラズマシアロブロチイ
ンあるいは唾液ムチンなどのシアロブロチイン類をリガ
ンドとするアフィニテイクロマトグラフィーにてＬＰＦ
−ＨＡ を採取する方法が提案されている（英国公開特
許第２．０１５．５３１号）。しかしながらこの英国特
許に具体的に記載されているリガンドはヒトハプトグロ
ビンだけであり、前記と同様の肝炎ウィルス対策の間額
が残る。また、セルロプラスミンについては具体的に開
示がなく、効果があるか否か不明である。本発明者らの
研究によれば、セルロプラスミンをそのまま用いた場合
には、充分な、ＬＰＦ−ＨＡの精製効果が達せられない
。
して菌体成分からＬＰＦ−Ｉ−ＩＡを抽出し、硫安分画
したものを出発材料として用い、これをハプトグロビン
またはセルロプラスミンなどのプラズマシアロブロチイ
ンあるいは唾液ムチンなどのシアロブロチイン類をリガ
ンドとするアフィニテイクロマトグラフィーにてＬＰＦ
−ＨＡ を採取する方法が提案されている（英国公開特
許第２．０１５．５３１号）。しかしながらこの英国特
許に具体的に記載されているリガンドはヒトハプトグロ
ビンだけであり、前記と同様の肝炎ウィルス対策の間額
が残る。また、セルロプラスミンについては具体的に開
示がなく、効果があるか否か不明である。本発明者らの
研究によれば、セルロプラスミンをそのまま用いた場合
には、充分な、ＬＰＦ−ＨＡの精製効果が達せられない
。
発明の目的
上記のような技術的背翳をもとに１本発明者らは、工業
的なＬＰＦ−ＨＡの単離精製法を見出すべく、種々研究
を重ねた結果、アフィニティクロマトグラフイーにおけ
るリガンドとして、変性セルロプラスミンを用いること
により所期の目的を達成することができ、しかも肝炎ウ
ィルス等の対策としての６０℃、１０〜１５時間の熱処
理１こよってもＬ Ｐ Ｆ−ＨＡの吸着活性を低下しな
いばかりか。
的なＬＰＦ−ＨＡの単離精製法を見出すべく、種々研究
を重ねた結果、アフィニティクロマトグラフイーにおけ
るリガンドとして、変性セルロプラスミンを用いること
により所期の目的を達成することができ、しかも肝炎ウ
ィルス等の対策としての６０℃、１０〜１５時間の熱処
理１こよってもＬ Ｐ Ｆ−ＨＡの吸着活性を低下しな
いばかりか。
逆に吸着喰を増大する特徴を有することを知り、本発明
を完成する１こ至った。
を完成する１こ至った。
すなわち１本発明は、百日ぜき閑の培養物からＬＰＦ−
ＨＡを採取する］こ際し、変性セルロプラスミンをリガ
ンドとするアフイニテイクロマトグラフイーを用いるこ
と１こより、百日ぜき菌ＬＰＦ−）ＬＡを１工程１こて
高収率かつ高純度で採取する方法を提供するものである
。本発明の他の目的は、リガンドに起因する肝炎ウィル
スその他の感染性因子の汚染の間頓のない高純度のＬＰ
Ｆ−ＨＡを提供することである。
ＨＡを採取する］こ際し、変性セルロプラスミンをリガ
ンドとするアフイニテイクロマトグラフイーを用いるこ
と１こより、百日ぜき菌ＬＰＦ−）ＬＡを１工程１こて
高収率かつ高純度で採取する方法を提供するものである
。本発明の他の目的は、リガンドに起因する肝炎ウィル
スその他の感染性因子の汚染の間頓のない高純度のＬＰ
Ｆ−ＨＡを提供することである。
発明の構成および効果
本発明の精製法は、百日ぜき菌を常法にしたがって培養
して得られる培養物を出発材料として用い、これを変性
セルロプラスミンをリガンドとするアフイニテイクロマ
トグラフイーに付すことにより行われ、ＬＰＦ−ＨＡの
精製とともに、百日ぜき閑の内毒素が分別され、高純度
のＬＰＦ−ＨＡが高収率で採取される。
して得られる培養物を出発材料として用い、これを変性
セルロプラスミンをリガンドとするアフイニテイクロマ
トグラフイーに付すことにより行われ、ＬＰＦ−ＨＡの
精製とともに、百日ぜき閑の内毒素が分別され、高純度
のＬＰＦ−ＨＡが高収率で採取される。
出発材料として用いられる百日ぜき菌培養物としては、
百日ぜき菌■相菌（およびＩＩ相菌）を通常の培地、た
とえばコーエン・ウイラー培地やステナー・ショルテ培
地等の液状培地にて常法１こより静置培養またはタンク
培養して得られる培養液があり、好ましくは該培養液か
ら遠心または濾過によって菌体を除去したものである。
百日ぜき菌■相菌（およびＩＩ相菌）を通常の培地、た
とえばコーエン・ウイラー培地やステナー・ショルテ培
地等の液状培地にて常法１こより静置培養またはタンク
培養して得られる培養液があり、好ましくは該培養液か
ら遠心または濾過によって菌体を除去したものである。
本発明方法によれば、塩析、抽出、透析、超遠心、濃縮
、平衡化等、公知方法にみられる種々の前段精製処理を
必要とせず、この培養液をそのまま、アフイニテイクロ
マトグラフイ一に供することができる。
、平衡化等、公知方法にみられる種々の前段精製処理を
必要とせず、この培養液をそのまま、アフイニテイクロ
マトグラフイ一に供することができる。
本発明で用いられる変性セルロプラスミンとは、ヒトま
たは動物由来のセルａグラスミンを種々の方法で変性さ
せたものであり、例えばセルロプラスミンを６０〜８５
℃にて１〜２４時間程度加熱処理したもの、または、セ
ルロプラスミンを硫化ナトリウム、硫化アンモニウム等
の硫化物、ｅ−アスコルビン酸、Ｄ−グルコース、Ｄ−
ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、マ
ルトース、ラクトース等の還元糖、アセトアルデヒド、
ギ酸、シュウ酸、メルカプトエタノール、ジエチルジチ
オカルバメート等の還元剤、シアン化ナトリウム、チオ
チアン酸ナトリウム等のシアン化合物、Ｅ ＤＴＡ、ニ
トロトリ酢酸（ＮＴＡ）、 トリエチレンテトラミンヘ
キサ酢酸（Ｔ’ｒＨＡ）等のキレート剤等で処理して、
セルロプラスミンに含まれている銅イオン（Ｃｕ ）を
還元するかまたは銅イオンの１部または全部を遊離、除
去することによって得られるもの等が含まれる。
たは動物由来のセルａグラスミンを種々の方法で変性さ
せたものであり、例えばセルロプラスミンを６０〜８５
℃にて１〜２４時間程度加熱処理したもの、または、セ
ルロプラスミンを硫化ナトリウム、硫化アンモニウム等
の硫化物、ｅ−アスコルビン酸、Ｄ−グルコース、Ｄ−
ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、マ
ルトース、ラクトース等の還元糖、アセトアルデヒド、
ギ酸、シュウ酸、メルカプトエタノール、ジエチルジチ
オカルバメート等の還元剤、シアン化ナトリウム、チオ
チアン酸ナトリウム等のシアン化合物、Ｅ ＤＴＡ、ニ
トロトリ酢酸（ＮＴＡ）、 トリエチレンテトラミンヘ
キサ酢酸（Ｔ’ｒＨＡ）等のキレート剤等で処理して、
セルロプラスミンに含まれている銅イオン（Ｃｕ ）を
還元するかまたは銅イオンの１部または全部を遊離、除
去することによって得られるもの等が含まれる。
上記の変性処理は単独でもまた２種以上の組み合わせて
本よく また変性セルロプラスミンをマトリックスに固
定化した後に行ってもよい。このような変性処理は、通
常、セルロプラスミンを０．１〜０．５ｗ／ｖ 鳴濃度
に生理食塩液で調製したもの１容に対し、以下の緩衝液
１０〜２００容に透析するという極めて簡単な操作によ
って達成できる。すなわち、硫化ナトリウム、硫化アン
モニウム、シアン化ナトリウム等を使う場合では、それ
らを０．０１〜１．０Ｍ程度含むｐ Ｈ６，０〜８．０
＜７）０．０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液を使用し、０
〜６０℃で１〜１０時間程度透析するとよい。
本よく また変性セルロプラスミンをマトリックスに固
定化した後に行ってもよい。このような変性処理は、通
常、セルロプラスミンを０．１〜０．５ｗ／ｖ 鳴濃度
に生理食塩液で調製したもの１容に対し、以下の緩衝液
１０〜２００容に透析するという極めて簡単な操作によ
って達成できる。すなわち、硫化ナトリウム、硫化アン
モニウム、シアン化ナトリウム等を使う場合では、それ
らを０．０１〜１．０Ｍ程度含むｐ Ｈ６，０〜８．０
＜７）０．０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液を使用し、０
〜６０℃で１〜１０時間程度透析するとよい。
Ｉ−アスコルビン酸、還元糖等を用いる場合は、それら
を０．Ｏ１〜１．０Ｍ程度含む０．０１〜０６１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ４，０〜６．０）に０〜１５℃で２４〜３
６時間透析する。アセトアルデヒド、ギ酸、シュウ酸、
メルカグトエタノール、ジエチルジチオカルバメート等
を用いる場合は、それらを０．０１〜０．１ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝液に０〜３０℃で０．５〜３時間透析する。チ
オシアン酸塩を使う場合は、それを０．１〜３．０ Ｍ
含む０．０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８
．０ ）ＩｃＯ〜３０ ’Ｃテ０．５〜５．０時間透析
する。ＥＤＴＡ、ＮＴＡ％ＴＴＨＡを用いる場合は、そ
れを０．０１〜１．０Ｍ程度含む０．０１〜０．１Ｍ（
７）リン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８．０ ） ニＯ〜３
０℃で０，５〜５．０時間透析する。
を０．Ｏ１〜１．０Ｍ程度含む０．０１〜０６１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ４，０〜６．０）に０〜１５℃で２４〜３
６時間透析する。アセトアルデヒド、ギ酸、シュウ酸、
メルカグトエタノール、ジエチルジチオカルバメート等
を用いる場合は、それらを０．０１〜０．１ Ｍ ＩＪ
ン酸緩衝液に０〜３０℃で０．５〜３時間透析する。チ
オシアン酸塩を使う場合は、それを０．１〜３．０ Ｍ
含む０．０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８
．０ ）ＩｃＯ〜３０ ’Ｃテ０．５〜５．０時間透析
する。ＥＤＴＡ、ＮＴＡ％ＴＴＨＡを用いる場合は、そ
れを０．０１〜１．０Ｍ程度含む０．０１〜０．１Ｍ（
７）リン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８．０ ） ニＯ〜３
０℃で０，５〜５．０時間透析する。
原料のセルロプレスミンは市販のものがそのまま用いら
れる。また、人血漿をアルコール分１面したコーンのフ
ラクション■のほか、ヒトもしくは動物の血液から分離
精製してｉ尋ることができる。
れる。また、人血漿をアルコール分１面したコーンのフ
ラクション■のほか、ヒトもしくは動物の血液から分離
精製してｉ尋ることができる。
上記変性セルロプラスミンを用いて１日ぜき菌培養物を
アフィニティクロマトグラフィーに付すには、下記のよ
うにして行われる。
アフィニティクロマトグラフィーに付すには、下記のよ
うにして行われる。
変性セルロプラスミンを臭化シアンで活性化したセファ
ロース、アガロース、セルロース、デキストラン等のマ
トリックスに固定化させるＡＸｅ’ｎらの方法［Ａｘｅ
’ｎ；Ｎａｔｕｒｅ、、２１４，１３（１２〜１３０４
（１９６７）］によりアフィニティゲルを調製し、これ
をカラム法、バッチ法等のクロマトグラフィーにしたが
い、百日ぜき菌培養物と接触させ ′てその中に含まれ
るＬＰＦ−ＨＡを吸着させ、ついで適当な緩衝液で洗浄
して他の物質を除去したのち、溶出液でＬ Ｐ Ｆ−Ｈ
Ａを溶出単離する。
ロース、アガロース、セルロース、デキストラン等のマ
トリックスに固定化させるＡＸｅ’ｎらの方法［Ａｘｅ
’ｎ；Ｎａｔｕｒｅ、、２１４，１３（１２〜１３０４
（１９６７）］によりアフィニティゲルを調製し、これ
をカラム法、バッチ法等のクロマトグラフィーにしたが
い、百日ぜき菌培養物と接触させ ′てその中に含まれ
るＬＰＦ−ＨＡを吸着させ、ついで適当な緩衝液で洗浄
して他の物質を除去したのち、溶出液でＬ Ｐ Ｆ−Ｈ
Ａを溶出単離する。
カラム法では、カラムにアフィニティゲルを充填し、出
発材料の６日ぜき菌培養物を流速１０Ｗｄ！／ｃｔｌｌ
／ ｈ ｒ〜５００ ｍｅ／ａｔ／Ｉ／ｈ ｒで通液
させて吸着させる。
発材料の６日ぜき菌培養物を流速１０Ｗｄ！／ｃｔｌｌ
／ ｈ ｒ〜５００ ｍｅ／ａｔ／Ｉ／ｈ ｒで通液
させて吸着させる。
バッチ法では、容器中に６日ぜき菌培養物を入れ、これ
にアフイニティゲルを直接添加し、３０分〜３時間程度
、好ましくは１時間程度攪拌して吸着させる。
にアフイニティゲルを直接添加し、３０分〜３時間程度
、好ましくは１時間程度攪拌して吸着させる。
アフイニティゲルの用量はとく蟇こ制限されないが、通
常、アフィニティゲル１ ｍｅに対し１，０００〜２，
０００ｆｉｇの蛋白量のＬＰＦ−ｆ（Ａを吸着すること
ができる。
常、アフィニティゲル１ ｍｅに対し１，０００〜２，
０００ｆｉｇの蛋白量のＬＰＦ−ｆ（Ａを吸着すること
ができる。
該ＬＰＦ−ＨＡ吸着アフィニティゲルの洗浄には、ｐＨ
４，０〜９．０（７）緩衝液、比電導度１０ ｍ’ｓ／
ｃｍ〜１５０ ｍｓ／ａｍ の緩衝液等が用いられる。
４，０〜９．０（７）緩衝液、比電導度１０ ｍ’ｓ／
ｃｍ〜１５０ ｍｓ／ａｍ の緩衝液等が用いられる。
例えば、０、１〜１．０ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．
０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８．０）を
用い、カラム法では、カラム体積の数１０倍程度の液量
を流して行う。またバッチ法ではゲル体積の数倍の液量
で洗浄処理が行われる。この洗浄操作により。
０１〜０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８．０）を
用い、カラム法では、カラム体積の数１０倍程度の液量
を流して行う。またバッチ法ではゲル体積の数倍の液量
で洗浄処理が行われる。この洗浄操作により。
出発材料中に多量に含まれる６日ぜき菌内毒素が効果的
に分離除去され、この点においても、本発明方法は従来
公知の方法に比べてきわめてすぐれた特徴を有する。
に分離除去され、この点においても、本発明方法は従来
公知の方法に比べてきわめてすぐれた特徴を有する。
上記洗浄処理後、リガンドに吸着したＬＰＦ−ＨＡを溶
出するには、カオトロピック塩類（例えば、Ｉ、ＣＩ！
０ 、ＣＦ３ＣＯ０、ＳＣＮ 、ＣＣ１３ＣＯＯ−等の
カオトロピックイオンを放出する塩類）、エチレングリ
コール、ジオキサン、尿素、塩酸グアニジン、ＥＤＴＡ
等のアフイニテイクロマトグラフイーにおいて一般的ｔ
ご用いられる溶出液を用いて常法にしたがって行われる
。
出するには、カオトロピック塩類（例えば、Ｉ、ＣＩ！
０ 、ＣＦ３ＣＯ０、ＳＣＮ 、ＣＣ１３ＣＯＯ−等の
カオトロピックイオンを放出する塩類）、エチレングリ
コール、ジオキサン、尿素、塩酸グアニジン、ＥＤＴＡ
等のアフイニテイクロマトグラフイーにおいて一般的ｔ
ご用いられる溶出液を用いて常法にしたがって行われる
。
本発明のアフイニテイクロマトグラフイーによれば、出
発材料のｐＨが４．０〜１００の範囲では安定して９０
幅以上の収率に達する。
発材料のｐＨが４．０〜１００の範囲では安定して９０
幅以上の収率に達する。
本発明の方法によって得られるＬＰＦ−ＨＡの純度は、
表１に例示したように、電気泳動法による分析において
９０％以上、条件により９５幅以上もの高純度に達する
。また比活性値は１３５〜〜１６０ （ＥＬＩＳＡ ｕ
ｎｉｔ／ｍｇ−蛋白質）となり、従来公知の方法では望
み得ない高品質が達成される。
表１に例示したように、電気泳動法による分析において
９０％以上、条件により９５幅以上もの高純度に達する
。また比活性値は１３５〜〜１６０ （ＥＬＩＳＡ ｕ
ｎｉｔ／ｍｇ−蛋白質）となり、従来公知の方法では望
み得ない高品質が達成される。
これに対し、ハプトグロビンをリガンドとスルゲルや、
未変性セルロプラスミンをリガンドとするゲルを用いて
精製した場合、純度は、８５％以下であり、比活性値も
１２０〜１３０ （ＥＬＩＳＡｕｎｉｔ／ｍｇ・蛋白質
）程度までしか達せず、ＬＰＦ−ＨＡに対する特異的吸
着能は、本発明方法にもとづくゲルがはるかにすぐれて
いることが明らかである。このことは、製品ＬＰＦ−Ｈ
Ａのリムルステストおよびウサギ発熱試験等の生物活性
試験にも明確な差となってあられれている。すなわち、
ハプトグロビンをリガンドとするゲルを用いて精製した
ＬＰＦ−ＨＡの場合、百日ぜき菌内毒素の除去が不充分
で約１℃の発熱が認められるが、本発明方法の場合内毒
素の除去はほぼ完全である。
未変性セルロプラスミンをリガンドとするゲルを用いて
精製した場合、純度は、８５％以下であり、比活性値も
１２０〜１３０ （ＥＬＩＳＡｕｎｉｔ／ｍｇ・蛋白質
）程度までしか達せず、ＬＰＦ−ＨＡに対する特異的吸
着能は、本発明方法にもとづくゲルがはるかにすぐれて
いることが明らかである。このことは、製品ＬＰＦ−Ｈ
Ａのリムルステストおよびウサギ発熱試験等の生物活性
試験にも明確な差となってあられれている。すなわち、
ハプトグロビンをリガンドとするゲルを用いて精製した
ＬＰＦ−ＨＡの場合、百日ぜき菌内毒素の除去が不充分
で約１℃の発熱が認められるが、本発明方法の場合内毒
素の除去はほぼ完全である。
さらに肝炎ウィルス、その他の感染性因子対策のため６
０℃、１０時間加熱処理を加えた加熱処理ハプトグロビ
ンをリガンドとするゲルを用いた場合、ＬＰＦ−ＨＡが
全く吸着されず、このものは精製手段として用いること
ができない。
０℃、１０時間加熱処理を加えた加熱処理ハプトグロビ
ンをリガンドとするゲルを用いた場合、ＬＰＦ−ＨＡが
全く吸着されず、このものは精製手段として用いること
ができない。
これに対し、本発明方法においては、加熱処理変性セル
ロプラスミンの場合、当該処理によりＬＰＦ−ＨＡに対
する特異的吸着能、吸着容量を大幅に向上させると同時
１こ、肝炎ウィルス等の対策も併せて実施することがで
きる。またｌ−アスコルビン酸やシアン化ナトリウム等
により変性処理を行った変性セルロプラスミン１こ、６
０℃、１０〜１５時間加熱処理を加えたものをリガンド
として用いた場合でも、加熱処理を加えない場合と同様
の精製能力がある。またあらかじめ６０℃、１０時間の
加熱処理を加えたセルロプラスミン１こ上記１−７スコ
ルビン酸変性処理あるいはシアン化ナトリウム変性処理
等を加えたものを用いた場合も、未加熱処理の場合と同
様またはそれ以上の好成績が得られる。したがって本発
明の方法は、肝炎ウィルス等の汚染の懸念がなく、また
百日ぜき菌内毒素の除去が充分である点でも、公知のハ
プトグロビンをリガンドとするゲルを用いる方法より格
段にすぐれている。
ロプラスミンの場合、当該処理によりＬＰＦ−ＨＡに対
する特異的吸着能、吸着容量を大幅に向上させると同時
１こ、肝炎ウィルス等の対策も併せて実施することがで
きる。またｌ−アスコルビン酸やシアン化ナトリウム等
により変性処理を行った変性セルロプラスミン１こ、６
０℃、１０〜１５時間加熱処理を加えたものをリガンド
として用いた場合でも、加熱処理を加えない場合と同様
の精製能力がある。またあらかじめ６０℃、１０時間の
加熱処理を加えたセルロプラスミン１こ上記１−７スコ
ルビン酸変性処理あるいはシアン化ナトリウム変性処理
等を加えたものを用いた場合も、未加熱処理の場合と同
様またはそれ以上の好成績が得られる。したがって本発
明の方法は、肝炎ウィルス等の汚染の懸念がなく、また
百日ぜき菌内毒素の除去が充分である点でも、公知のハ
プトグロビンをリガンドとするゲルを用いる方法より格
段にすぐれている。
上述のとおり、本発明により提供される変性セルロプラ
スミンをリガンドとするアフイニテイクロマトグラフイ
ーによれば、出発材料の百日ぜき菌培養物から所望のＬ
ＰＦ−ＨＡを高収率、高純度に採取することができ、そ
の操作もきわめて簡単で、またそのアフイニテイゲルは
数１０回繰り返して使用でき、コスト的にもすぐれてお
り、しかも百日ぜき菌内毒素もほとんど分離除去できる
利点を有する。したがって、本発明方法は高純度ＬＰＦ
−ＨＡの工業的製法としてきわめてすぐれた方法である
。
スミンをリガンドとするアフイニテイクロマトグラフイ
ーによれば、出発材料の百日ぜき菌培養物から所望のＬ
ＰＦ−ＨＡを高収率、高純度に採取することができ、そ
の操作もきわめて簡単で、またそのアフイニテイゲルは
数１０回繰り返して使用でき、コスト的にもすぐれてお
り、しかも百日ぜき菌内毒素もほとんど分離除去できる
利点を有する。したがって、本発明方法は高純度ＬＰＦ
−ＨＡの工業的製法としてきわめてすぐれた方法である
。
本発明の方法で得られる［、ＰＦ−ＨＡは高純度で他の
蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほとんど
完全蚤こ除去されているため、その生理活性を利用した
各種試薬、糖尿病治療薬の医薬品の調製、さらに百日ぜ
きワクチンの調製に有用である。
蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほとんど
完全蚤こ除去されているため、その生理活性を利用した
各種試薬、糖尿病治療薬の医薬品の調製、さらに百日ぜ
きワクチンの調製に有用である。
つぎに、調製例、実施例および実験例を挙げて太を明を
さらに置体的に脱明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。
さらに置体的に脱明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。
調製例１
ヒトセルロプラスミンの精製
ヒト血漿をアルコール分画して得られるコーンのフラク
ションＩＶ−１を原料とし、Ｍｏｒｅｌｌらの方法［Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４４．３４９４（１９６
７） ］にしたがって］ヒトセルロプラスミを分ｏｍｉ
する。
ションＩＶ−１を原料とし、Ｍｏｒｅｌｌらの方法［Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４４．３４９４（１９６
７） ］にしたがって］ヒトセルロプラスミを分ｏｍｉ
する。
すなわち、該コーンのフラクションｆｆ−１をＤＥＡＥ
−セファロースＣＬ６Ｂｊこよるイオン交換クロマトグ
ラフィーに付し、ついて混入している可能性のあるハプ
トグロビンをヘモグロビンセファロースゲルによるアフ
イニテイクロマトグラフイーで除去したのち、硫安塩析
し、０．０２５Ｍ酢酸緩衝液（＋））１５．２５）ｌこ
透析して結晶ヒトセルロプラスミ′ンを得る。
−セファロースＣＬ６Ｂｊこよるイオン交換クロマトグ
ラフィーに付し、ついて混入している可能性のあるハプ
トグロビンをヘモグロビンセファロースゲルによるアフ
イニテイクロマトグラフイーで除去したのち、硫安塩析
し、０．０２５Ｍ酢酸緩衝液（＋））１５．２５）ｌこ
透析して結晶ヒトセルロプラスミ′ンを得る。
調製例２
変性セルロプラスミンの調製
調製例１て得られた結晶セルロプラスミンをＭｏｒｅｌ
ｌらの方法（５ｃｉｅｎｃｅ、 １２７．５８８（１９
６３））に準じて処理し、各種変性セルロプラスミンを
調製する。
ｌらの方法（５ｃｉｅｎｃｅ、 １２７．５８８（１９
６３））に準じて処理し、各種変性セルロプラスミンを
調製する。
（１）シアン化ナトリウム変性セルロプラスミン結晶セ
ルロプラスミンの１ｗ／ｖ＜ 水溶液Ｓ。
ルロプラスミンの１ｗ／ｖ＜ 水溶液Ｓ。
ｍｅを、リン酸緩衝液（ｐＨ７，４，イオン強度０．２
）に０．０５Ｍシアン化ナトリウムを含ませた緩衝液５
、ＯＩ！ｌコ４℃で１２時間透析して、オキシダーゼ活
性を９０％喪失したシアン化ナトリウム変性セルロプラ
スミンを得る。
）に０．０５Ｍシアン化ナトリウムを含ませた緩衝液５
、ＯＩ！ｌコ４℃で１２時間透析して、オキシダーゼ活
性を９０％喪失したシアン化ナトリウム変性セルロプラ
スミンを得る。
（２）シアン化ナトリウム変性セルロプラスミンの加熱
処理 （１）と同様の方法でシアン化ナトリウム変性セルロプ
ラスミンの１ｗ／ｖ％水溶液５０ｍｅを調製した後、コ
ノ液を０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）’５．
Ｏｌに透析する。透析路Ｔ後、変性セルログラスミン含
有液を６０℃に加熱・昇温し、１０時間同温度に保持し
て加熱処理を行う。
処理 （１）と同様の方法でシアン化ナトリウム変性セルロプ
ラスミンの１ｗ／ｖ％水溶液５０ｍｅを調製した後、コ
ノ液を０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，４）’５．
Ｏｌに透析する。透析路Ｔ後、変性セルログラスミン含
有液を６０℃に加熱・昇温し、１０時間同温度に保持し
て加熱処理を行う。
＋３１７？−アスコルビン酸変性セルロプラスミン結晶
セルロプラスミンの１ｗ／ｖ％水溶液５０ｍｅを、酢酸
緩衝液（ｐＨ５，２，イオン強度１．２）にｌ−アスコ
ルビン酸５■／ ｍｅを加えた緩衝液５．Ｏｌに４℃で
３６時間透析して、オキシダーゼ活性カ６５．５％とな
ったｌ−アスコルビン酸変性セルロプラスミンを得る。
セルロプラスミンの１ｗ／ｖ％水溶液５０ｍｅを、酢酸
緩衝液（ｐＨ５，２，イオン強度１．２）にｌ−アスコ
ルビン酸５■／ ｍｅを加えた緩衝液５．Ｏｌに４℃で
３６時間透析して、オキシダーゼ活性カ６５．５％とな
ったｌ−アスコルビン酸変性セルロプラスミンを得る。
＋４１ 加熱処理変性セルロプラスミン結晶セルロプラ
スミンを５ ｗ／ｖ％含ｂ ０． Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液（ｐＨ７，５） １００ｍｅを、水溶液中で６０℃
、１５時間加熱処理する。
スミンを５ ｗ／ｖ％含ｂ ０． Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液（ｐＨ７，５） １００ｍｅを、水溶液中で６０℃
、１５時間加熱処理する。
調製例３
加’Ａ 処理セルロプラスミンの！−アスコルビン酸変
性処理 人血漿をアルコール分画してｉ尋られるコーンのフラク
ションＩｌｌを温浴上で６０°Ｃ、１０時間加熱を加え
る。以後調製例１と同様の処理を行い、加熱処理済みの
結晶セルロプラスミンを得る。
性処理 人血漿をアルコール分画してｉ尋られるコーンのフラク
ションＩｌｌを温浴上で６０°Ｃ、１０時間加熱を加え
る。以後調製例１と同様の処理を行い、加熱処理済みの
結晶セルロプラスミンを得る。
この加熱処理済み結晶セルロプラスミンを用い、調製例
２−＋３１と同様の処理を加えて、加熱処理セルロプラ
スミンのｌ−アスコルビン酸変性処理を実施する。
２−＋３１と同様の処理を加えて、加熱処理セルロプラ
スミンのｌ−アスコルビン酸変性処理を実施する。
調製例４
アフイニテイゲルの調製
前記結晶セルロプラスミンおよび各種変性セルロプラス
ミンをリガンドとし、以下のようにしてＣＮＢｒ−活性
化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）Ｉこカップリ
ングさせてアフイニテイゲルを調製する。
ミンをリガンドとし、以下のようにしてＣＮＢｒ−活性
化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）Ｉこカップリ
ングさせてアフイニテイゲルを調製する。
ＣＮＢｒ−活性化セファロ−ス４Ｂ１．５ｇを１．０ｍ
Ｍ塩酸３．Ｏ１！ｌこ１５分間浸漬して膨潤させたのち
、ガラスフィルター（Ｇ３）上で１．０ ｍＭ塩酸を吸
引除去して膨潤セファロースゲル（５，２５ｍｅ）を得
る。
Ｍ塩酸３．Ｏ１！ｌこ１５分間浸漬して膨潤させたのち
、ガラスフィルター（Ｇ３）上で１．０ ｍＭ塩酸を吸
引除去して膨潤セファロースゲル（５，２５ｍｅ）を得
る。
別に、リガンド（蛋白質量１５０ｍｇ）を０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ’
ｒ−Ｉ ８．３ ） ７５ｍ＋！に溶解させ、これに上
記膨潤セファロースゲル５２．５ ｍｅを加え、室温で
穏やかｌこ攪拌しながら２時間カップリングさせる。カ
ップリング終了後、上記と同じ炭酸ナトリウム緩衝液１
５０ｍｆ’で４回洗浄したのち、１．０Ｍエタノールア
ミン水溶液（ｐＨ８，０） １５０ｍｅを加え、再び穏
やかに攪拌しながら２時間反応させる。反応終了後、同
様に炭酸ナトリウム緩衝液１５０ｍｅにて４回洗浄して
エタノールアミンを除去する。
ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ’
ｒ−Ｉ ８．３ ） ７５ｍ＋！に溶解させ、これに上
記膨潤セファロースゲル５２．５ ｍｅを加え、室温で
穏やかｌこ攪拌しながら２時間カップリングさせる。カ
ップリング終了後、上記と同じ炭酸ナトリウム緩衝液１
５０ｍｆ’で４回洗浄したのち、１．０Ｍエタノールア
ミン水溶液（ｐＨ８，０） １５０ｍｅを加え、再び穏
やかに攪拌しながら２時間反応させる。反応終了後、同
様に炭酸ナトリウム緩衝液１５０ｍｅにて４回洗浄して
エタノールアミンを除去する。
得られたゲルを、１．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０，１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）ｆｓ、ｏ ） 、 １５０ｍｅｌこ
て３回洗浄し、さらに１，０Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．１ＭＭリン酸緩衝液 ｐＨ８，０） 、 １５０ｍｅ
ｔこて３回洗浄する。この酢酸緩衝液およびホウ酸緩衝
液による洗浄を交互に３回繰り返して、セルロプラスミ
ンーセファロースおよび変性セルロプラスミンーセファ
ロースアフイニテイゲルを調製する。
Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）ｆｓ、ｏ ） 、 １５０ｍｅｌこ
て３回洗浄し、さらに１，０Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．１ＭＭリン酸緩衝液 ｐＨ８，０） 、 １５０ｍｅ
ｔこて３回洗浄する。この酢酸緩衝液およびホウ酸緩衝
液による洗浄を交互に３回繰り返して、セルロプラスミ
ンーセファロースおよび変性セルロプラスミンーセファ
ロースアフイニテイゲルを調製する。
実施例１
カラム法によるＬＰＦ−ＨＡの精製
前記調製例３で得られたアフイニテイゲル２０ｍｅを充
填したカラム（２８＋ｏ＋φＸ１５（１ｍｍ）ｌこ、Ｌ
ＰＦ−ＨＡを１，４００ＥＬＩＳＡ ｕｎｉｔ／ｍｅ含
有する百日ぜき菌培養上澄液５．Ｏｌを室温にて１５０
ｍｅ／ｄ／ｈｒの流速で流す。つぎに、１．０Ｍ塩化
ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）。
填したカラム（２８＋ｏ＋φＸ１５（１ｍｍ）ｌこ、Ｌ
ＰＦ−ＨＡを１，４００ＥＬＩＳＡ ｕｎｉｔ／ｍｅ含
有する百日ぜき菌培養上澄液５．Ｏｌを室温にて１５０
ｍｅ／ｄ／ｈｒの流速で流す。つぎに、１．０Ｍ塩化
ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）。
１．５００ｍｅを同流速で通液してカラムを洗浄す）る
。
。
上記洗浄処理後、カラムに１．０Ｍ塩化す） ＩＪつム
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に３．０Ｍ
チオシアン酸ナトリウムを加えた溶出液１００ｍｅを３
５．０ ｍｅ ／ ｄ ／ ｈｒ の流速で流しテＬＰ
Ｆ−ＨＡを溶出する。
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に３．０Ｍ
チオシアン酸ナトリウムを加えた溶出液１００ｍｅを３
５．０ ｍｅ ／ ｄ ／ ｈｒ の流速で流しテＬＰ
Ｆ−ＨＡを溶出する。
これらの変性セルロプラスミン、ならびに対照として未
変性セルロプラスミン、ハプトグロビンをリガンドとす
るアフイニテイゲルを用いて得られた各ＬＰＦ−ＨＡ画
分の分析結果、および各実験成績を表−１に示す。
変性セルロプラスミン、ハプトグロビンをリガンドとす
るアフイニテイゲルを用いて得られた各ＬＰＦ−ＨＡ画
分の分析結果、および各実験成績を表−１に示す。
本発明による各変性セルロプラスミンをリガンドとする
場合には、ＬＰＦ−ＨＡの純度も高く、比活性値も高い
。これに対し、未変性セルロプラスミンでは純度、比活
性値ともに低く、また収率も低い。一方公知のハプトグ
ロビンの場合はさらに品質が悪く、収率も悪い。さらに
６０°Ｃ９１０時間加熱処理ハプトグロビンをリガンド
とする場合は、全（ＬＰＦ−ＨＡが吸着されず、目的を
達成す）ることかできなかった。
場合には、ＬＰＦ−ＨＡの純度も高く、比活性値も高い
。これに対し、未変性セルロプラスミンでは純度、比活
性値ともに低く、また収率も低い。一方公知のハプトグ
ロビンの場合はさらに品質が悪く、収率も悪い。さらに
６０°Ｃ９１０時間加熱処理ハプトグロビンをリガンド
とする場合は、全（ＬＰＦ−ＨＡが吸着されず、目的を
達成す）ることかできなかった。
なお、対照として用いたハプトグロビンをリガンドとす
るゲルは、市販のハプトグロビンを用いて、前記調製例
４と同様にしてＣＮＢ ｒ−活性化セファロース４Ｂと
カップリングさせて調製した。
るゲルは、市販のハプトグロビンを用いて、前記調製例
４と同様にしてＣＮＢ ｒ−活性化セファロース４Ｂと
カップリングさせて調製した。
実施例２
バッチ法によるＬＰＦ−ＨＡの精製
５７！広ロフラスコ１こ、ＬＰＦ−ＨＡ（１，４ＱＱ
ＥＬＩＳＡｕｎｉｔ／ｍｅ）を含有する百日ぜき菌培養
上清液４．Ｏ４を加え、これにアフイニテイゲル２０ｍ
ｅを直接添加する。室温１こて１時間、穏やかに攪拌を
続けてＬＰＦ−ｔｌＡをアフイニテイゲルに吸着させた
のち、ガラスフィルター（Ｇ２）を用いて培養上清液を
吸引除去する。このガラスフィルター上のゲルを、１．
０Ｍ塩化ナトリウム−を含む０．１ Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，５） 、 ３００ｍｅで洗浄し、ツイテ１．０
Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐ ）１８．０
）、３００ｍ（！で洗浄する。この洗浄操作を交互に３
回繰り返す。
ＥＬＩＳＡｕｎｉｔ／ｍｅ）を含有する百日ぜき菌培養
上清液４．Ｏ４を加え、これにアフイニテイゲル２０ｍ
ｅを直接添加する。室温１こて１時間、穏やかに攪拌を
続けてＬＰＦ−ｔｌＡをアフイニテイゲルに吸着させた
のち、ガラスフィルター（Ｇ２）を用いて培養上清液を
吸引除去する。このガラスフィルター上のゲルを、１．
０Ｍ塩化ナトリウム−を含む０．１ Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，５） 、 ３００ｍｅで洗浄し、ツイテ１．０
Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐ ）１８．０
）、３００ｍ（！で洗浄する。この洗浄操作を交互に３
回繰り返す。
洗浄後、ゲルよりＬＰＦ−ＨＡを下記のようにして溶出
する。すなわち、該ガラスフィルターのゲルに、１．０
Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７゜
５）に３６０Ｍチオシアン酸ナトリウムを添加した溶出
緩衝液５０ｍｅを注ぎ、５分間保持した後吸引し、溶出
液を回収する。溶出したＬＰＦ−ＨＡを０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）に透析して、チオシアン酸ナト
リウムを除去する。
する。すなわち、該ガラスフィルターのゲルに、１．０
Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７゜
５）に３６０Ｍチオシアン酸ナトリウムを添加した溶出
緩衝液５０ｍｅを注ぎ、５分間保持した後吸引し、溶出
液を回収する。溶出したＬＰＦ−ＨＡを０．０１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，５）に透析して、チオシアン酸ナト
リウムを除去する。
＜’４られたＬＰＦ−ＨＡについて、実施例１と同様に
各分析を実施した。つぎ略こ該Ｌｌ）Ｆ−１（Ａを８０
℃、３０分間加熱処理したのち、リムルステストを行っ
て百日ぜき菌内毒素を測定し、さらにマウス白血球増多
活性その他の生物活性をあわせて測定した。これらの結
果を表２および表３に示す。
各分析を実施した。つぎ略こ該Ｌｌ）Ｆ−１（Ａを８０
℃、３０分間加熱処理したのち、リムルステストを行っ
て百日ぜき菌内毒素を測定し、さらにマウス白血球増多
活性その他の生物活性をあわせて測定した。これらの結
果を表２および表３に示す。
本発明の変性セルロプラスミンをリガンドとするゲルを
用いた場合、高純度のＬＰＦ−ＨＡが高収率で得られ、
リムルステストの結果から百日ぜき菌内毒素が著しく除
去されていることか明らかである。これに対し、対照と
しての７１ブトグロビンをリガンドとするゲルでは、内
毒素の除去が不充分であった。これらのＬＰＦ−ＨＡに
ついてウサギ発熱試験に供したところ、本発明の変性セ
ルロプラスミンをリガンドとするゲルによる精製ＬＰＦ
−ＨＡはいずれも陰性で、内毒素が充分に除去されてい
ることを示した。
用いた場合、高純度のＬＰＦ−ＨＡが高収率で得られ、
リムルステストの結果から百日ぜき菌内毒素が著しく除
去されていることか明らかである。これに対し、対照と
しての７１ブトグロビンをリガンドとするゲルでは、内
毒素の除去が不充分であった。これらのＬＰＦ−ＨＡに
ついてウサギ発熱試験に供したところ、本発明の変性セ
ルロプラスミンをリガンドとするゲルによる精製ＬＰＦ
−ＨＡはいずれも陰性で、内毒素が充分に除去されてい
ることを示した。
手続補正書は式）
■、事件の表示
昭和５８年特許願第 ２０６５９８ 号２発明の名称
Ｌ Ｐ Ｆ −Ｉ−Ｉ Ａの精製法
３補正をする者
事件との関係 特許出願人
住所 熊本県熊本市清水町大窪６６８番地名称 財団法
人化学及血清療法研究所 ４、代理人
人化学及血清療法研究所 ４、代理人
Claims (7)
- （１） 百日ぜき菌培養物からＬＰＦ−ＨＡ（Ｌｅｕｃ
ｏｃｙｔｏｓ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）を取得するに際し、変性セ
ルロプラスミンをリガンドとするアフイニテイクロマト
グラフイーを用いることを特徴とするＬＰＦ−ＨＡの採
取精製法。 - （２）百日ぜき菌培養物が百日ぜき菌を液状培地に培養
して得られるものである前記第（１）項記載の方法。 - （３）百日ぜき菌培養物をｐＨ４，０〜１０．０の範囲
に調整してアフイニテイクロマトグラフイー＄こ付す前
記第（１）項記載の方法。 - （４）該変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由来の
ものである前記第（１）項記載の方法。 - （５）該変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由来の
セルロプラスミンを加熱処理して得られるものである前
記第（１）項記載の方法。 - （６）該変性セルロプラスミンがヒトおよび動物由来の
セルロプラスミンを還元剤処理、シアン化合物処理もし
くはキレート剤処理に付し、セルロプラスミンに結合す
る銅イオンを還元もしくはそＳの銅イオンの一部または
全部を遊離させたものである前記第（１）項記載の方法
。 - （７） リガンドに吸着したＬＰＦ−ＨＡ をカオトロ
ピック塩、エチレングリコール、ジオキサン、尿素、塩
酸グアニジンおよびＥＤＴＡから選ばれる１種もしくは
２種以上を用いて溶出する前記第（１）項記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58206598A JPS6098988A (ja) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
| US06/666,172 US4704274A (en) | 1983-11-01 | 1984-10-26 | Method for the purification of LPF-HA |
| CA000466753A CA1210720A (en) | 1983-11-01 | 1984-10-31 | Method for the purification of leucocytosis-promoting factor hemagglutinin (lpf-ha) |
| DE8484113134T DE3483344D1 (de) | 1983-11-01 | 1984-10-31 | Verfahren zur reinigung von lpf-ha. |
| EP84113134A EP0140386B1 (en) | 1983-11-01 | 1984-10-31 | Method for the purification of lpf-ha |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58206598A JPS6098988A (ja) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6098988A true JPS6098988A (ja) | 1985-06-01 |
| JPS6262153B2 JPS6262153B2 (ja) | 1987-12-24 |
Family
ID=16526042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58206598A Granted JPS6098988A (ja) | 1983-11-01 | 1983-11-01 | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4704274A (ja) |
| EP (1) | EP0140386B1 (ja) |
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| CA (1) | CA1210720A (ja) |
| DE (1) | DE3483344D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US5382657A (en) * | 1992-08-26 | 1995-01-17 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peg-interferon conjugates |
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| JP6061381B2 (ja) | 2011-01-12 | 2017-01-18 | 積水メディカル株式会社 | 一塩基多型の検出方法 |
| US9534029B2 (en) | 2012-10-03 | 2017-01-03 | Csl Behring Ag | Method of purifying proteins |
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| US4551429A (en) * | 1983-09-15 | 1985-11-05 | American Home Products Corporation | Stimulation of antigen production by Bordetella pertussis |
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-
1983
- 1983-11-01 JP JP58206598A patent/JPS6098988A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-26 US US06/666,172 patent/US4704274A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 EP EP84113134A patent/EP0140386B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 DE DE8484113134T patent/DE3483344D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 CA CA000466753A patent/CA1210720A/en not_active Expired
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| JPS62258326A (ja) * | 1986-04-16 | 1987-11-10 | パスツール メリウー セロム エ ヴアクサン | ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の精製方法 |
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|---|---|
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| EP0140386A2 (en) | 1985-05-08 |
| CA1210720A (en) | 1986-09-02 |
| EP0140386B1 (en) | 1990-10-03 |
| EP0140386A3 (en) | 1987-03-04 |
| DE3483344D1 (de) | 1990-11-08 |
| JPS6262153B2 (ja) | 1987-12-24 |
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