JPS60209590A - 抗生物質デオキシセフアマイシンｂおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新抗生物質チオキシセファマイシンＢ　（Ｄｅ
ｏｘｙｃｅｐｈａｍｙｃｉｎ　Ｂ）およびその薬理上ｔ
ｏｙしうる塩並びにその製法に関する。

本発明者らは、土壌より分離したストレプトミセス属に
属する５ＡＮＫ　６０３１３４株がダラム陽性、陰性細
ｍに有効な新抗生物質金生産することを見出し、この物
質につき検討し７ｃＭ来、次の構造式を有することか判
明した。

即ち、７−（５−アミノ−５−カルボキシバレルアミド
）−３−（α−メトキシ−シンナモイルオキシメチル）
−７−メドキシー３−セフェム−４−カルボン酸であり
、以下、本物質をデオキシセファマイシンＢと称する。

デオキシセファマイシンＢはダラム陽性および陰性の細
菌類に抗菌性を示した。従って、テオキシセファマイシ
ンＢはこれらに起因するヒト、動物または植物の疾病の
予防または治療に用いられる。

本発明においてはデオキシセファマイシン６薬理上許答
しうる塩も包含される。こ瓦に薬理上許容しうる塩とし
ては例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩
、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩
等をあげることができる。

チオキシセファマイシンＢを土圧する放線菌５ＡＮＫ　
６０３８ｊｔ株の菌学的性状は次の通シである。

１、　形態学的特徴 一般的に基土菌糸は寒天培地上で分枝して、よく伸長し
気菌糸は単純分枝である。胞子鎖の形態は多（のものは
ループ、フック、カギ状であるが、螺旋状を示す場合も
おる。１胞子柄上に形成される胞子数は多くの場合、約
１０〜５０個が観察される。胞子の形は柱状であシ、そ
の大きさは０．１〜１．１μｍ　Ｘ　Ｏ，Ｔ〜１．１μ
ｍであシ、その表向は平滑状を示す。また気菌糸の車軸
分枝、菌核、胞子のうなどの特殊器官は観察されなかっ
た。

２、　各種培養基上の諸性質 各種培養基上で２８℃、１４日間培養後の性状は第１表
に示す通シである。色調の表示は日本色彩研究析板”標
準色票１のカラーチップ・ナンバーを表わす。

第１表 培地の柚類　項目　５ＡＮＫ　６０３Ｂ４株の性状Ｒ明
るい茶味灰　（１−７−１０） ｓｐ　産生ぜず ｓｐ　産生せす ｓｐ　黄味系　（６−６−９） Ｒ黄味系　（４−５−８） ＳＰ　産生せず （Ｉ５Ｐｌ）　Ｒ’す０″ｅｉ　（６−８−９）ｓｐ　
産生せず 栄養外大　Ｇ　良好、平担、黄味法（２−９−１０）（
Ｄｉｆｃｏ）ＡＭ　形成せず Ｒうす黄（３−９−１０） ｓｐ　産生ぜず Ｒ灰味黄茶　（４−５−９） ｓｐ　産生ぜず ＲＰＸｖＦ、ｉす７プ　（３−３−１０）ｓｐ　リｊる
いオリーブ（６−５−１０）水　寒　天　Ｇ　良（ない
、平担、黄味法（１−９−１）店　余シ良くない、ベル
ベット状 明るい茶味灰　（２−７−８） （６） Ｒ明るい茶味灰（２−７−８） ｓｐ　産生ぜず Ｒ茶味灰　（２−５−９） ｓｐ　産生ぜず Ｇ：生育、ＡＭ：気−系、ＲＡＭ面、ｓＰ：可溶性色素 ３、　生理学的性質 ８ＡＮＫ　６０３８４株の生理学的性質は第２表に示す
通シである。

第２表 ゼラチンの液化　陽性（強い） 硝酸塩の還元　陽性 ミルクの凝固（２６°）　陰性 （３１°）　生育せず ミルクのペプトン化（２６°）　陰性 （３７°）　生育せず 生育温度範囲（培地１）＊　５〜３４゜生育適正温度（
／／１）　２２〜２７．５゜食塩耐性　（ｎ　１）　５
％で生育。７％では生育せずカゼインの分解　陽性 チロシン　〃　陽性 キザンチン　〃　陰性 ヒポキサンチン〃　陰性 アデニン　〃　陽性 メラニン様色素生産性（培地２）　陰性（〃３）　陰性 （〃　４）　胸囲 ＊：培地１；イースト・麦芽寒天（ｚｓｐ　２）２；ト
リフトン・イーストエキス・プロス（ＩＭＰ　１）３；
ペプトン・イーストエキス・鉄寒天（ＩＳＰ　６）４；
チロシン寒天Ｃｌ５Ｐ　７） ままた、ブリドハム・ゴドリープ寒天培地を使用して、
２８℃、１４日間培養後に観察した５ＡＮｘ６０３８４
株の炭素源の資化性は第３表に示す通シである。

第　３　表 十二利用する、±：利用性は疑わしい、−ニオＩＪ）月
しない ４、１体成分について ５ＡＮＫ　６０３８４株の細胞壁はビー・ベラカーらの
方法［Ｂ、　Ｅｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、アプライド
・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ）　、　１２巻。

４２１へ一４２３頁、　１９６４年〕　に従い検討した
結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸およびグリシンが検出
されたことから、細胞壁タイプＩであることが確認され
た。また、５ＡＮＫ　６Ｇ３８４株の全細胞中の糖成分
全エム・ビー・レシエバリエの方法［：　Ｍ、Ｐ、Ｌｅ
ｃｈｅｖａｌｉｅｒ　、ジャーナル・オブ・ラボラトリ
イ・アンドＯクリニカル・メテイシン（Ｊｏｕｒｎａｌ
、’ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　＆　Ｃ１１ｎｉｃａ
ｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　。

７１巻、９３４頁、　１９６８年〕に従い検討した結果
、特徴的なパターンは認められなかった。

以上のことから、本菌株は放線鉋の中でもストレプトミ
セス属に属することか判明したのでストレプトミセス・
エスピー・５ＡＮＫ　６０３８４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　８ｐ　、　５ＡＮＫ　６０３８４　）とした。

本菌株はストレプトミセス・エスピー・５ＡＮＫ　６０
３８４として通産省工業技術院微生物工業技術研死り丁
に寄託されておシ、その受託番号は第１４２４号である
。なお、ＢＡＮＫ　６０３８４株の同定はＩＳＰ　Ｃジ
・インターナショナル・ストレプトミセス・プロジェク
ト（Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　Ｐｒｏｊｅｃｔ）〕基準、バージニー
ズ・マニアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌ　ｏｆ　
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）　ｇ　８版、ニス・エイ・ワックスマン（Ｓ　、Ａ
、Ｗａｋ８ｍａｎ）著［ジ・アクチノミセイテス（Ｔｈ
ｅ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ　）　］および放線菌
に関する最近の文献によって行った。

以上チオキシセファマイシンＢの生産菌について説明し
たが、放線菌の諸性）Ｊｋは一定したものでなく自然的
、人工的に容易に変化することは周知の通フであり、本
発明で使用しうる菌株はストレフトミセス属に属する、
デオキシセファマイシンＢ全生産するすべての菌株を包
含するものである。

本発明における培養は一般放線菌における培養方法に準
じて行われ、液体培地中での振盪培養あるいは通気攪拌
培養によるのが好ましい。培地成分としては、放線菌の
栄誉源として公知のものが使用され、たとえば炭素源と
してブドウ糖、シュクロース、クリセリン、マルトース
、テキストリン、澱粉、大豆油、綿実油などが、蟹素源
として大豆粉、落花生粉、綿実粉、ファーマミン、魚粉
、コーン・スチープ・リカー、ペプトン、肉エキス、イ
ースト、イーストエキス、硝酸ソーダ、硝酸アンモ′ニ
ウム、４Ａ酸アンモニウムなどが、また無機塩として食
塩、燐酸塩、炭酸カルシウム、微量金属塩などが必要に
応じて適宜添加される。液体培養に際してはシリコン油
、植物油、界面活性剤などが消泡剤として適宜使用され
る。増泡のｐＨは中性附近、増養温度は２５〜３０℃、
特に２８℃繭後が好ましい。通笥辿気攪拌培養では４０
〜５０時間の培養でチオキシセファマイシンＢの生陀鎗
は最高値に遅する。このようにして培養された培養物中
の主として液体部分ｖｃ８在するデオキシセファマイシ
ンＢは培養終了後、菌体その他の固型部分をけいそう土
等をｆ過助剤とする濾過操作、あるいは遠心分離によっ
て除去し、その１液ある込は上清中から抽出・精製する
ことによって得られる。デオキシセファマイシンＢはそ
の物理化学的性状を利用することによシ、たとえば吸着
剤を用いて採取することができる。吸着剤としてはたと
えは活性炭、あるいは吸着用樹脂であるアンバーライ）
　ＸＡＤ−２、およびＸＡＤ　−４（ローム・アンド・
ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ　１（＋　、　ＨＰ　
２０　、　ＨＰ３０（三菱化成工業■社製）などが使用
される。

チオキシセファマイシンＢ′（Ｉ−含む液をこれらの吸
着剤を通過させて不純物を吸着させて取除（か、または
デオキシセファマイシンＢ會これらの吸着剤に吸沼させ
た後、メタノール水、ｎ−ブタノール水、アセトン水な
どで浴出し精製採取することができる。

また本杭生物質か両性動員であることを利用して精製す
ることも有効な手段の１つである。

たとえはカチオン交換体およびアニオン交換体（イオン
交換樹脂、セファテックスイオン交換体、イオン交換セ
ルロース等）に吸着させた後。

適当な酸、塩基、塩類、あるいはそれらの組合せからな
る緩衝液で溶出される。更に純度の高い抗生物質標品を
得るためには微結晶セルロース、たとえばアビセル（旭
化成工業■社ａ）ｔ−担体とする分配クロマトグラフィ
ー、ノくイオグル（ビオラッド社製）あ°るいはセファ
デックス（ファルマシア社製）などを用いるゲル濾過な
どが有効である。チオキシセファマイシンＢの精製に際
してはその安定性を考慮してｐＨは６．０〜８０の間、
温度も低温、たとえば２０℃以下、よシ好ましくは１０
℃以下で実施することｂ′−必要である。以上の精製手
段を適宜組合せ、反復用いることによってデオキシセフ
ァマイシンＢを精製することができる。このようにして
得られたデオキシセファマイシンＢ（遊離体）は次の理
化学的および生物学的性状を有する。

リ　物質の注状：淡黄色ないし白色粉末。

２）比旋光度：〔α）譬＋９９Ｊ３°（Ｃ、１，０、１
０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，０） ３）元素分析値（鉤：　ｃ、５１．４４　；Ｈ，６，５
６；Ｎ＋７．２８　；　Ｓ　、４．４４ ４）分子量：　５６３　（ＦＡＢ／ＭＳ　）５）分子式
：　Ｃ２５Ｈ２９Ｎ３０１０Ｓ６）紫外線吸収スペクト
ル：λｍａｘ　ｎｍ　（１ｉ４二）１０ｍＭ！Ｊン酸緩
衝液ｐＨ７，０中で測定した紫外線吸収スペクトルは第
１図に示した通υ２８３　ｎｍ　（Ｋ　：！　４１５　
）に極太吸収全話す。

１）赤外線吸収スペクトル、ν１ｎｏｘｃｒｎＫＢｒ錠
で測定した赤外線吸収スペクトルは第２図に示す通シで
ちる。

８）核−気共鳴スベクトル：δ（ｐｐｍ）重ジメチルス
ルホキサイド中、内部基準にＴＭ８　（テトラメチルシ
ラン）を使用して測定した核磁気共鳴スペクトル（４０
０’ＭＨｚ　）は第３図に示す通シである。

９）溶解性：水に易容、メタノール、ジメチルスルホキ
サイドに可溶、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル、
ベンゼンなどの溶媒に不溶である。

１０）呈色反応：ニンヒドリン、ヨード、過マンガン酸
カリ反応で陽性、塩化第二鉄反応で陰性である。

１１）薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ値　０．３吸着剤
；セルロース（イーストマン−クロマグラムシー）　８
０６５　） 展開溶媒；アセトニトリル：　０．７５％酢酸（９：２
） １２）高圧１紙電気泳動： 酢酸：蟻酸：水（７５：　２５　：　９０Ｇ　）の緩衝
液（ｐＨ１８）中で東洋Ｐｉ　Ａ　５１　Ａ　ｆ、用い
た高圧１紙電気泳動（５０ｖｏｘｔ／ｍ、　ｏ、ａ　ｍ
Ａ／ｃｍ）では陰極に向って移動し、標準物質として用
いたアラニンの易動度ヲ１．０とした時、本杭生物質の
それは０．１５を示す。また０、１Ｍトリス・塩酸緩慟
取（ｐＨ７，５）中では陽極に向って移動し、標準物質
として用いたブロム・フェノール・ブルーの易動度２ｉ
、ｏとした時、本杭生物賀のそれｉ、ｌ　Ｏ，４８′ｌ
ｒ：示す。

１３）酸加水分解物： 塩酸：酢酸（１：ｉ）の混合浴液を用いて封管中１０５
℃、１８時間加水分解葡行い、アミ°ノアジピン酸（０
，５４モル）およびグリシン（０，２８モル）をそれぞ
れ検出した。

１４）熱水分解物二８０℃で４時間加水分解を行い結晶
状のα−メトキシ・ケイヒ酸を得た。

１５）抗菌スペクトル：寒天稀釈法によって測定した各
種細菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩりは第４表に示
す通シである。

第４表 スタフィロコッカス−アウレウスＦＤＡ　２０９Ｐ　Ｊ
Ｃ−１２５スタフイロコツカス・エビチルミテイス　５
ＡＮＫ　７１５７５　）　８００ストレプトコツカス・
フェカリス　５ＡＮｘ　７１７７Ｂ　＞８００バチルス
・ズブチリス　ＰＣＩ　２１９　３．１３エツジエリシ
ア・コリー　ＮＩＨＪ　ＪＣ−２＞８００クレブシエラ
・ニュウモニエ　ｐｃ工６０２　１．５６ブロテウス・
ブルガリス　０Ｘ１９　１２．５プロテウス・ミラビリ
ス　５ＡＮＫ　７１８７３　１２．５ブｏ７＋７スー　
レッ）グリ　５ＡＮＫ　７３７７５　＞　８００シユー
ドモナス・エルキノーサ　ＮＣＴＣ１ｏ４９０　）８０
０１６）急性毒性： マウスに対スる急性毒性試歇でデオキシセファマイシン
Ｂｉ静脈内に投与した場合、１００ｍｇ／に９投与にお
いても何んら異常なく耐過した。

上記の如きチオキシセファマイシンＢの％性全既知抗生
物質の諸性状と比較した結果、一致するものはなく新抗
生物賀と判定された。

以上から、デオキシセファマイシンＢは各値細餉感染疾
患を対照とする抗菌剤として使用される。その投与形態
としては皮下注射、静脈内注射、筋肉注射、坐剤などに
よる非経口投与法あるいは錠剤、カプセル剤、散剤、顆
粒剤などによる経口投与法がめけられる。投与量は対象
疾患、投与経路および投与回数などＩｃよって異なるが
、例えは成人に対して辿には１日０．１ｇ乃至２ｇを１
回または数回に分けて投与するのが好ましい。

次に実施例をあけて木兄明全さらに具体的に説明する。

実施例１ ストレプトミセス・エスピー５ＡＮｘ　６０３８４株を
下記の如き培地組成で示されるＡ培地８０　＋＋ｆを含
む５００　ｔｎｌＶ容三角フラスコに一白金耳接檎し、
２１Ｏｒｐｍの回転振盪培養機により２Ｂ℃で９６時間
培養した。

培地組成 Ａ培地　グルコース　３０％ 生イースト　１．０ 大豆粉　３０ 炭酸カルシウム　０．４ ＭｆＳ０４ｊ７１（２００，２ ニツサンテイスフオーム　ＣＢ　４４２　０．０１滅　
菌　ｉｉＪ　ｐＪ（７，２ 得らｔた独培養液を同一培地１５！を含む３０−ｅ谷ジ
ャーファーメンタ−２基に各々７ＳｙａＡずつ接種し通
気量１５１／分、攪拌１００回転／分、内圧１．０に〕
／ｄで２８℃にて４３時間通気攪拌培養した。得られた
培養液３０！に１過助剤としてセライト５４５　（ジョ
ンズ・マンビル・プロタクト・コーポレーションＭ）’
に４％Ｗ／、にナルヨに吸着させ水洗後、２０％アセト
ン水で浴出した。活性分画１２！を集めアセトンを減圧
下で留去し、１．６６ｆｆｌまで濃縮後、凍結乾燥する
ことによりデオキシセファマイシンＢを含む粗粉末４０
９が得られた。このうち２，５ｇの粉末を脱イオン水ｔ
ｏｏｒｎｌＶｃ６解し、流速２−７分でローバーカラム
（ＲＰ−８、Ａサイズ、メルク社製）に吸着させた。次
いで脱イオン水１００ｒｄ、１０チメタノール水１００
ｄで洗＃後、３０％メタノール水で展開ブーると活Ｉ！
＋、物寅が浴出さｎた。この活性分画を減圧下で纏縮し
、凍結乾燥することによシ、チオキシセファマイシンＢ
を含む淡黄色の粗粉末２１０■が得られた。

実施例２ 実施例１と同様にして得た柚培養液２５０−をＡ培地５
０看を含む１００沼答ファーメンタ−に接種し２８℃、
通気量５０２／分、攪拌１７０回転／分で４８時間培養
を行った。

培養終了後、セライト５４５を２５にノ加えて１過する
と１液４３！が得られ１ζ。

ｆ液をダイヤイオンＨＰ　２０のカラム（６彫）に吸着
させ、脱イオン水１８ぶで洗浄後、２０チアセトン水で
浴出し、活性分画３０−ｅが得られた。ｐＨ全７．０に
修正後アセトンを留去し、更に２沼まで減圧下で濃縮し
、凍結乾燥することにより褐色の粗粉末８８ｇが得られ
た。この粉末は丈に分収用高速液体クロマトグラフィー
・システム５００（米国ウォーターズ社製）を用いて精
製した。すなわち粉末８Ｂ＆を脱イオン水２！に再溶解
した後、プレツブパック−５ｕｏ／ｃ”カートリッジカ
ラムに２００ｄ／分の流速で吸着させた。脱イオン水３
石で洗浄後、１０％メタノール水３！、次いで３０チメ
タノール水３！で順次展開した。更に６０チメタノール
水による浴出分画に活性ｖｌＪ質か溶出された。この分
画′ｆ：＃縮し凍結乾燥することによジテオキシセファ
マイシンＢを含む粉末７．９ｇが得られた。

実施例３ 実施例２で得られた粉末３．６．９を少量の脱イオン水
Ｋｍ解し、アビセル５００Ｊ９にアセトニトリルで調製
したカラム（’８Ｘ３０ｎ）　に吸着させ、アセトニト
リルで洗浄後、９０％アセトニトリル、次いで８０％ア
セトニトリルで展開を続けると活性物質が溶出された。

活性分画を集め、減圧下で癖縮し、更に凍結乾燥するこ
とによジデオキシセファマイシンＢ’（５含む粉末２５
０ｔｎｇか得られた。

実施例４ 実施例３で得られた粉末１０８■を脱イオン水１０ｍ７
！に浴解し、１０ｍＭ　リン敵収倫ｅ　（ｐＨ’１０）
で平衡化したＤＥＡＥ−セファテックス人−２５のカラ
ム（１ｘ３ｃＩｎ）ＶｒＣ吸盾させ１０ノ緩偵１液で洗
浄後、同緩倫液１ｃ　０．０５　Ｍ　Ｎａ０ｔを加えて
展開することによシ活性物質が浴出さ扛１こ。

この油性分ｉ［！１１ｔ５ｍｌのダイヤイオンＨＰ　２
０のカラムに吸着させ、十分に水洗後　２０％アセトン
水で浴出した。活性分画′ｆｆ：集め、減圧１で濃縮し
凍結乾燥することによジデオキシセファマイシンＢ　１
　ｍ９が白色粉末として得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はデオキシセファマイシンＢの紫外腺吸収スペク
トルを、第２図は同物質の亦外線吸収スペクトルを、第
３図は同物匁の核−気共鳴吸収スペクトルを示す。 ％軒出願人　三共株式会社 代理人　弁理士樫山庄治 ２ＵＣ）　２５０　３００　３５０　ａ’７０ｙ１ｍ第
１頁の続き ＠発明者榎１）竜三 〇発明者高津　散失 ［相］発明者岩藤　誠吾 庁内整理番号 所内 東京部品用区広町１丁目２番認号　三共株式会社醗酵研
究所内 東京部品用区広町１丁目２番関号　三共株式会社醗酵研
究所内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 で示されるデオキシセファマイシンＢおよびその薬理上
   許容される塩。 ２、　ストレプトミセス属に属するデオキシセファマイ
   シンＢ生産菌を培養して、その培養物よりセファマイシ
   ンＢｉ採取すること全特徴とするデオキシセファマイシ
   ンＢの製法。 ３　ストレプトミセス属に属するデオキシセファマイシ
   ンＢ生産菌がストレプトミセス・エスピー　５ＡＮＫ　
   ６０３８４　（微工研菌寄第７４２４号）である特許請
   求の範囲第２項記載の製法。