JPS6022295B2

JPS6022295B2 - 赤血球凝集試験用水性溶媒

Info

Publication number: JPS6022295B2
Application number: JP7937379A
Authority: JP
Inventors: 和美福山; 緑永友; 八尋上村; 哲船越
Original assignee: Green Cross Corp Korea
Current assignee: GC Biopharma Corp
Priority date: 1979-06-22
Filing date: 1979-06-22
Publication date: 1985-06-01
Also published as: JPS562555A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は免疫反応に基づいて抗原又は抗体と検体とを水
性溶媒中で混合し、その凝集反応（凝集の強さ）を追跡
して抗原や抗体を定量的に測定する赤血球凝集試験にお
いて、抗原又は抗体と検体を混合させる際に用いる水性
溶媒に関するものである。

抗原抗体反応やある種の動植物菌体又はウイルス由来の
凝集物質と、生体蛋白質や赤血球との免疫反応に基づく
凝集反応を追跡することにより、それらの一方か又は両
者を定量的に測定する方法は、赤血球凝集反応（ＰＨＡ
法）、逆受身赤血球凝集反応（ＲＰＨＡ法）、細菌の凝
集反応、又はラテックス凝集反応などとして広く臨床検
査の分野で利用されている。

例えばＰＨＡ法について説明すると、精製したＨＢｓ抗
原を凝集試験用坦体としてヒツジ赤血球に感作させてＨ
Ｂｓ抗涼感作ヒツジ赤血球を得、このものと血液検体と
を水性溶媒中で混合した時に凝集反応がみられるか杏か
によって、検体中にＨＢｓ抗体が存在していたか否かを
判定できる。

又凝集がみられた場合は、その検体を段階的に希釈して
凝集反応が観察できなくなるまでの希釈倍数を求めるこ
とにより、その検体に含まれていた日欧抗体を定量的に
測定することができる。次にＲＰＨＡ法では精製したＨ
Ｂｓ抗体を凝集試験用担体として幡乳動物の赤血球に感
作してＨＢｓ抗体感作赤血球を製し、このものと検体と
を水性溶媒中で混合した時に凝集反応がみられるか否か
によって、検体中にＨＢｓ抗原が含まれているか否かを
検知することができる。さらにある種のウイルスと鳥類
の赤血球とはウイルスの有する凝集素の作用により赤血
球を水性溶媒中で凝集させる。この水性溶媒中での凝集
反応の有無を調べ、凝集の強弱によってウイルスの濃度
を定量的に測定することができる。これら多くの水性溶
媒中での凝集反応を利用した赤血球凝集試験は簡便でか
つ測定感度も高いので、各種抗原や抗体の検査に広く利
用されている。

しかしこれら水性溶媒中での赤血球凝集試験に共通した
欠点は、リポプロティンやフィブリノゲン又は部変性を
うけた蛋白質などの擬似反応物質が混在する検体におい
ては、非特異的な凝集反応が起って判定を誤りやすいこ
とである。このような検体を測定する場合には、これら
の擬似反応物の影響が出てこない程度にまで予め希釈し
た後に測定を行うか、もしくは適当な確認試験法を用い
て水性溶媒中での凝集反応の真偽を確かめる必要がある
。そこでこれらの水性溶媒中での非特異的凝集反応を少
くする方法として、測定に用いる水性溶媒の中に少量の
動物蛋白や可溶性赤血球膜成分を加えることによりある
程度改善されることが既に知られている。しかしなお多
くの非特異反応が残るのでさらに良い改善方法の出現が
待望されていた。また非特異反応を消去する別の方法と
して検体中のこれら擬似反応物質を予めカオリンや血球
などに吸着させて除去することも止むを得ず行われてい
るが、多数の検体を同時にかつ短時間に処理するにはあ
まりにも煩雑であった。本発明の目的は赤血球凝集試験
における非特異反応を消去し、極めて検出特異性の優れ
た赤血球凝集試験用水性溶媒を提供することにある。発
明者等は永年免疫反応に基づく赤血球凝集試験において
、その非特異反応を消去するため試験方法の改良研究を
続け、測定系に少量の２価金属イオンを加えること及び
この２価金属イオンとＥＤＴＡのようなキレート剤を併
用することにより、測定特異性が顕著に改善されること
を見出し、この新知見に基づいて本発明を完成した。本
発明は免疫反応に基づく赤血球凝集試験において、その
水性溶媒にＢｅＨ、ＭｇＭ、ｓｒ什、Ｂａ什、Ｆｅ汁、
ｚｎ日、ＣｄＨから選ばれた少なくとも１つの２価金イ
オンを０．００１〜１．のＭの濃度で加えるのである。
又本発明は赤血球凝集試験用水性溶媒に２価金属イオン
を０．００１〜１．ｍＭの濃度に加えると共に、エチレ
ンジアミン４酢酸塩（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤を
０．００５〜１．印けの濃度に加えて２価金属イオンと
キレート剤を少量ずつ併用するのである。こ）に２価金
属イオンを０．００１Ｍ以下又はＥＤＴＡを０．００５
以下の濃度で添加すると、これらの添加物は非特異凝集
を抑制することができないし、２価金属イオンを１．■
Ｍ以上又はＥＤＴＡを１．加Ｍ以上の濃度に添加する
と、赤血球凝集反応の感度が落ちてしまう。水性溶媒と
しては公知のあらゆる赤血球凝集試験用水性溶媒を利用
でき、例えば水、生理食塩水、各種緩衝液（リン酸緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液
）、アルブミン溶液、デキストラン溶液、正常ヒト及び
動物血清溶液、合成高分子物質の溶液、界面活性剤含有
水溶液及びこれらの組み合せからなる溶液等である。

水性溶媒の好適な解は約４．０〜９．０であり、緩衝液
でｐＨを調整することが好ましい。水性溶媒に含まれる
塩の濃度は比較的低濃度が好ましく、より好ましくは生
理的等張な溶液である。なおこの水性溶媒に前記公知の
非侍葵的凝集反応阻止物質（動物蛋白や可溶性赤血球膜
成分）を混合してもよい。本発明に係る水性溶媒を用い
る赤血球凝集試験用担体としてはＯ型の人又はヒツジ、
モルモット、ニワトリなどの動物の赤血球をホルマリン
、グルタルアルデヒドなどで固定したものが好ましい。

担体の大きさは約２０ｒ以下が好ましく、５〜１５山程
度の粒状のものが特に好ましい。このような粒状担体に
抗原又は抗体を感作させる処理は公知の方法に準じて行
う。本発明に係る水性溶媒を使用した赤血球凝集試験の
効果を証明するための実験を行こなった。

まずモルモットに精製ＨＢｓ抗原を免疫して日母抗血清
を得、この抗血清を硫安分固法とイオン交換クロマトグ
ラフィー法とで処理して精製ＨＢｓ抗体を得、この精製
ＨＢｓ抗体をグルタルアルデヒドにより固定されたヒツ
ジ赤血球に感作してＨＢｓ抗体感作ヒツジ赤血球を得る
。他方０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に正常
動物血清及びヒツジ赤血球膜成分とを加えＲＰＨＡ法用
の公知の水性溶媒を調製し、この水性溶媒に第１表に示
す如く２価金属イオン（ＢｅＨ、ＭｇＨ、Ｓｒ日、Ｂａ
什、Ｆｅ什、ｚｎ什、Ｃｄ汁）を単独に加えて本発明に
係る水性溶媒を調製し、コントロールとして無添加のも
のを第１表のＭｇＣ１２の欄に各検体毎に添加量０とし
て示し、又同欄に添加量０．０００１Ｍと１．９Ｍのも
のを示した。

従来方法による確認試験の結果非特異凝集を起こすこと
が知られている、クエン酸塩加人血簸の３検体（表中の
Ｎｏ．１、ＮＯ．２及びＮＯ．３）をＲＰＨＡ法に従い
、この３種類の溶媒を用いてマイクロプレート上でそれ
ぞれ２倍数希釈を行い、この希釈列に上記ＨＢｓ抗体感
作ヒツジ赤血球を混合した。別にＨＢｓ抗原が陽性の検
体（Ｎｏ．４）を同様に処理して試験した。混合液量は
検体希釈液２５ムク、ＨＢｓ抗体感作ヒツジ赤血球２５
仏そであり、室温で２時間後の凝集の強さ（凝集度）を
４、３、２、１で評価し、非凝集を評価０として第１表
の成績を得た。第１表２価金属イオン単独の場合第１表から判るように２価金属イオン無添加の水性溶媒
では１：１６〜１：３２の非特異凝集が、適量の２価金
属イオンを加えた溶媒では１：１〜１．８に抑制されて
おり、ＭｇＣ１２を０．０００１Ｍ添加してもその凝集
度は無添加の場合と同じであって非特異凝集を抑制して
いない。

又ＨＢｓ抗原が陽性の検体Ｎｏ．４では、適量の２価金
属イオンを添加しても腸性であり、この添加が陽性検体
に影響しないことを示しており、ＭｇＣ１２を１．０Ｍ
添加しても感度の低下は認られないが、添加量が１．靴
になると感度が低下しており、添加量が多すぎることを
示している。次にＲＰＨＡ法の公知の水性溶媒に２種の
２価金属イオンを添加した場合及び１種の２価金属ィオ
ンとエチレンジアミン４酢酸３ナトリウム塩（ＥＤＴＡ
−がａ）の両方を添加した場合について、２価金属イオ
ン単独の場合と同じ実験を行い、それぞれ第２表及び第
３表の成績を得た。

第２表２種の２価金属イオンを併用した場合第３表
２価金属イオンとＥＤＴＡを併用した場合第２表から判
るように２種の２価金属イオンを併用することにより非
特異凝集は１：１に抑制されており、検体Ｎｏ．４にお
いて感度の低下は認められなかった。又第３表から判る
ように０．００８Ｍ及び０．０８ＭのＥＯＴＡ−鮒ａを
併用することにより非特異凝集は１：１〜１：２に抑制
されているが、その添加量が０．００１Ｍの場合はＭｇ
Ｃ１２単独の場合と変らない。又検体Ｎｏ．４において
ＥＤＴＡ−がａを１．■Ｍ添加しても感度の底下は認め
られないが、添加量が１．９Ｍ‘こなると感度が低下し
ており、添加量が多すぎることを示している。本発明に
よるときは免疫反応に基づく抗原又は抗体と検体との赤
血球凝集試験において、非特異凝集を箸るしく抑制しう
る水性溶媒を得ることができ、各種抗原や抗体の測定に
利用されている赤血球凝集試験を簡素化すると共に検出
非特異性を顕著に高めうる効果を有す。

以下に本発明の実施例を説明する。

実施例１塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２１細２０）４０のこＰＨ
７．６の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液を加えて赤血球凝集
試験用水性溶媒２０００叫を調製する。

実施例２塩化バリウム（ＢａＣ１２・２日２０）１．２２夕と健
康家兎血清２の‘に生理食塩化を加えて赤血球凝集試験
用水性溶媒２００の‘を調製する。

実施例３酢酸亜鉛｛Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２・が２０｝１．０夕
と健康家兎血清２机上に生理食塩水を加えて赤血球凝集
試験用水性溶媒２００の上を調製する。

実施例４塩化マグネシウム４．０夕とエチレンジアミン４酢酸３
ナトリウム塩５．０９および２０％ウシ血清アルブミン
１０泌に、ｐＨ７．６の０．１Ｍリン酸緩衝液を加えて
赤血球凝集試験用水性溶媒２００叫を調製する。

実施例５塩化バリウム（ＢａＣ１２・２ＬＯ）５．０夕とエチレ
ンジアミン４酢酸３ナトリウム塩５．０夕および２０％
ウシ血清アルブミン１０叫に、ｐＨ７．６の０．１Ｍリ
ン酸緩衝液を加えて赤血球凝集試験用水性溶媒２００私
を調製する。

Claims

【特許請求の範囲】１免疫反応に基づいて抗原又は抗体と検体とを水性溶
媒中で混合し、その凝集反応を追跡して抗原や抗体を測
定する赤血球凝集試験において、Ｂｅ＾＋＾＋、Ｍｇ＾
＋＾＋、Ｓｒ＾＋＾＋、Ｂａ＾＋＾＋、Ｆｅ＾＋＾＋、
Ｚｎ＾＋＾＋、Ｃｄ＾＋＾＋から選ばれた少なくとも１
つの２価金属イオンを０．００１〜１．０Ｍの濃度に含
むことを特徴とする赤血球凝集試験用水性溶媒。２免疫反応に基づいて抗原又は抗体と検体とを水性溶
媒中で混合し、その凝集反応を追跡して抗原や抗体を測
定する赤血球凝集試験において、Ｂｅ＾＋＾＋、Ｍｇ＾
＋＾＋、Ｓｒ＾＋＾＋、Ｂａ＾＋＾＋、Ｆｅ＾＋＾＋、
Ｚｎ＾＋＾＋、Ｃｄ＾＋＾＋から選ばれた少なくとも１
つの２価金属イオンを０．００１〜１．０Ｍの濃度に含
み、さらにエチレンジアミン４酢酸塩を０．００５〜１
．０Ｍの濃度に含むことを特徴とする赤血球凝集試験用
水性溶媒。