JPS6022649A - 物質の特性を螢光により測定する光学的装置およびその使用方法 - Google Patents

物質の特性を螢光により測定する光学的装置およびその使用方法

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JPS6022649A
JPS6022649A JP59070166A JP7016684A JPS6022649A JP S6022649 A JPS6022649 A JP S6022649A JP 59070166 A JP59070166 A JP 59070166A JP 7016684 A JP7016684 A JP 7016684A JP S6022649 A JPS6022649 A JP S6022649A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、物質の特性をその螢光によシ監視する改良さ
れた方法及び装置に関する。
発明の背景 先行技術においては物質の螢光を測定するために様々な
装置を使用している。螢光計は選択された波長の光で物
質を照射し、物質を照射するために使用される波長よシ
長い特定の波長で発せられる螢光を測定する。従来の実
験用分光螢光計は方形の石英サンプルチェンバを使用す
る。励起源はチェンバの一方の側からサンプルを照射し
、発せられる螢光はチェンバの別の側を介して測定され
る。発せられる螢光は、サンプルを照射するために使用
される窓に関して９０’又は１８０°の位置にある窓を
介して測定される。この構成の計器は、一般に個々のサ
ンプルをプロセスに関してオフラインで分析するために
使用される。限られた数のオンライン分析にはフロース
ルーチェンバも利用することができる。
サングルチェンバを有する計器は多くのオンライン測定
には適していない。実際には、大きい容器の内容物を表
わすフローセルにサンプルを供給する上で多くの難点が
ある。吸光度の高いサンプルの場合、照明光が通過する
窓にすぐ隣接するサンプルの層のみが螢光を発する。発
せられる螢光は、検出器が集束される窓に到達すること
ができない。照射光の一部のみがサンプルによシ吸収さ
れる希釈されたサンプルの場合には、サンプルチェンバ
を大きくして、検出器の視野の中によシ多くの螢光体が
存在するようにすれば、高い感度が得られるものと考え
られる。すなわち、サンプルチェンバの大きさを最高の
感度が得られるようにサンプルの特性に従って変化させ
れば良い。あるいは、サンプルを特定の螢光値まで希釈
するとともできる。２つの手順がオンライン測定に実用
できないことは明らかである。しかしながら、多くの場
合、このような計器は吸光度の高いサンプルに対する感
度が低く、大きい反応容器の内容物を表わすフローセル
にサンプルを供給するのが困難であるのでオンライン測
定には適していない。
その他の螢光計は、物質を照射し且つ発せられる螢光を
観察するために単一の透明窓を使用する表面検出器を利
用する。表面検出器の原理は、吸光度の高いサンプルに
対して方形のサングルチェンバを使用する計器よシ高い
感度を有することであると報告されている（　Ｃ，Ａ、
Ｐａｒｋｅｒ著ｒ　Ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃ
ｅ　ｏｆ　５ｏｌｕｔｉｏｎａ、　ＷｔｔｈＡｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　ａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
Ｊ　１９６８年発行、第２２６〜２２９頁参照）。表面
検出器ではオ／ラインプ四セス性能を改善することもで
きる。たとえば、ある螢光計は、ガラス製発酵槽の内部
の培養物質のオンライン螢光測定を実施する喪めに発酵
槽の側面に取付けられる（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈａｒｒｉｓｏ
ｎ及びＢｆｌｔｔｏｎ　Ｃｈａｎｃｅのｒ　Ｆｌｕｏｒ
ｉｍｅｔｒｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒ　Ｍｏｎｉ
ｔｏｒｉｎｇ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌｅｖ
ｅｌ　ｏｆＲｅｄｕｃｅｄ　Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ
　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　１ｎＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｍ４ｃｒｏｏｒｇａｎｌｓ
ｍｓＪ１９７０年発行、第４４６〜４５０頁参照）。こ
の構成はラング光源と、サンプルに隣接する表面上にあ
ってランプ光源に対して６０’を成す共通点に集束され
る検出器とを使用する。この螢光計に対する実用上の制
限は多い。螢光計は透明容器又は窓を有する容器に依存
して利用される。それらの間の角度が一定であるとき、
サンプルの界面と計器との間の距離を最適値に固定しな
ければならない。この距離は１つには容器の窓組立体の
構成によって決まるので、どのような種類の容器にも合
うように計器を設計しなけむばならない。容器の表面は
混合が少ないので、螢光計に最も近い物質は容器の内容
物を表わすとはいいがたい。この螢光計の長時間安定性
は低い（Ｄ、Ｗ、ＺａｂｒＬａｋｉｅ及びＡ　、　Ｅ　
、　Ｈｕｍｐ　ｈ　ｒ’ｅ　ｙのｒＡｐｐｌｉｅｄ　ａ
ｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ−ｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　、　Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆＦｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｍａｓｓ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｉｏｎ　ｂｙＭｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｊｌ　９７８年発行、第
３３７〜３４３頁参照）。また、螢光体の濃度が低いと
きに照射光を使用するのも効率が良くない。この場合、
励起光はタンク内へ数フィー）（１５０〜１８０　ｃｍ
　）程度侵入する。検出器は照射光路から６０°の方向
を見ているので、観察できる螢光の量は少ない。
照射光及び発せられる螢光を集束するだめの複雑なレン
ズ系と、照射光と発せられる螢光とを互いに９０°を成
すように分離するグイクロイックミラーとを使用するゾ
ローブが記載さねている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　ＡｐｐｌｉｅｄΔ４ｊｃｒｏｂｌｏｌｏ
ｇｙａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１９８１
年発行、Ｗ、Ｂｅｙｅｌｅｒ＋Ａ、Ｅｉｎｓｅｌｅ及び
Ａ、Ｆｉｅｃｈｔａｒのｌ”　Ｑｌ−Ｌ４ｎｅＭｅａｓ
ｕｒｅｍｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｃｅ　：Ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ±第１０〜１４頁参照Σこ第１ヌ〜１４ が比較的効率の低い装置であシ、レンズ、フィルタ及び
ダイクロイックミラーに関連する面の数が多いために屈
折による光の損失が大きいので、光を有効に利用できな
い。そのため、検出器の性能が温度に反比例する関係か
ら計器の感度を高めるために、外部冷却水源を使用して
グローブを冷却しなければならない。しかしながら、実
際には温度の下限値は１５℃に設定され、温度がこれよ
り低くなると、グローブ内部の大気からの結露が生じる
。このグローブは工業用としては適していない。照射光
と発せられる螢光とについて光路を分離しなければなら
ないだめに、計器は非対称の大形のものとならざるをえ
ず、測定環境からの密封は困難である。レンズはこわれ
やすく、レンズを適正にアライメントするのは難しい。
レンズは螢光を発しない物質から製造されなければなら
ず、特に紫外線用として石英から製造される場合には高
価である。照射光の波長と発せられる螢光の波長の特定
の組合せに対してダイクロイックミラー及びレンズ系の
性能を最適化しなければならカいので、波長の組合せを
変えたいときにはグローブを変形しなければならない。
さらに、レンズの固有屈折特性は一定であシ、照射光は
発せられる螢光の波長とは異々る波長を有するために、
装置の照射光の照射領域は発せられる各党を測定する検
出器の視野とは異ガる。後述するように、これは重大々
欠点である。
光学検出器について本明細書中で使用される用語「視野
」は、検出器により観察できるサンプル内部の領域を指
す。照明光の「照射領域」はサンプル内部の励起光によ
シ照射される領域として定義される。
別のシステムは、この目的のために分岐オプチカルファ
イバー束を使用する（　Ａｖｒａｈａｍ　Ｍａｙｅｖｓ
ｋｙ及びＢｒ１ｔｔｏｎ　Ｃｈａｎｃｅのｒ　Ｉｎｔｒ
ａｃｅｌｌｕｌａｒＯｘｌｄａｔｉｏｎ−Ｒｅｄｕｃｔ
ｉｏｎ　５ｔａｔｅ　Ｍｅａｓｕｒｅｄ　１ｎＳｉｔｕ
　ｂｙ　ａ　Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ　Ｆｉｂｅｒ−
ＯｐｔｉｃＳｕｒｆａｃｅ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ　
ＪＳｃｉｅｎｃｅ　２　１　７巻。
１９８２年８月６日発行，第５３７〜５４０頁参照）。
この場合も、ファイバーオプティクスの効率が悪いため
に、実用的な大きさのグローブには内蔵できないような
光源と検出器を使用しなければならない。この効率の悪
さは、ファイ・々−を通過することによる紫外線及び可
視光の損失と、照射光を伝送するファイバーにより設定
される照射領域と発せられる螢光を伝送するファイバー
によシ設定される検出器の視野との間の不利なずれとに
関連する。この欠点は、特に、サンプル内への光の入射
が非常に短い距離に制限される吸光度の高いサンプルに
ついては重大である。
本発明は多種多様な物質と共に使用することができるが
、原則的には、直接プロセスにかかわる生きている生物
体の特性をその螢光によりリアルタイムで測定すること
を目的としている。生物系の螢光測定の応用は先行技術
において良く知られている（　５ｉｄｎｅｙ　Ｕｎｄｅ
ｎｆｒｉｅｎｄのｒ　Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃａｎｓｅＡｓ
ｓａｙ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ　Ｊ第１巻。
１９６２年，第■〜刈頁参照）。たとえば、生きている
細胞は、３４０ｎｍの紫外線で照射されたときに４　６
　０　ｎｍの可視螢光線を発する。この螢光の多くは、
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド、リン酸ニ
コチンアミｌ″・アデニン・ジヌクレオチド（　ＮＡＤ
　（ｐ）Ｈ　）などの生体に共通する重要なエネルギー
蓄積分子の還元形態の細胞内蓄積によ多発生される。こ
の原理は、脳，肝臓，腎臓を含む無傷の組織と、精巣組
織における代謝を研究するために採用された（　Ｂｒ１
ｔｔｏｎ　Ｃｈａｎｃｅ及びＶｉｃｔｏｒ　Ａ．Ｌｅｇ
ａｌｌａｉｓの米国特許第３．３　１−　３，２　９　
０号、並びに５ｃｊｅｎｃｅ第２１７巻、１９８２年８
月６日発行、Ａｖｒａｈａｍ　Ｍａｙｅｖｓｋｅｙ及び
Ｂｒ１ｔｔｏｎＣｈａｎｃｅのｒ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌ
ｕｌａｒ　０ｘｊｄａｔｉｏｎ−Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　
５ｔａｔｅ　Ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｉｎ　５ｉｔｕ　ｂｙ
　ａＭｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ　Ｆｉｂｅｒ−Ｏｐｔｉ
ｃ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ　ｊ第５３７〜５４０頁参
照）。酵素，バクテリア及び菌類の懸濁液も螢光を利用
して研究されている（　Ｄ．Ｗ．Ｚａｂｒｉａｋｉｅ及
びＡ．Ｅ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙの「Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎ
ｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ。
Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ　ＢｉｏｍａｓｓＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｂｙ
　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＦｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅ　Ｊ　＋　１９７８年２月発行、第３３７〜
３４３頁参照）。
発明の目的 従って、本発明の目的は、 １、　プロセスに関してオンラインで、すなわちリアル
タイムで測定がなされるように短い測定応答時間が要求
される場合、 ２、低レベルの螢光を定量分析するだめに高い測定感度
が必要とされる場合、 ３、定期的な削器の再校正を不要にするために長時間に
わたる計器の安定性を維持しなければならない場合、 ４、サンプルを得る上での論理計算、プロセスの均質性
、プロセス妨害の危険又は測定前のサンプル安定化など
のサンプリングに関連する問題を避けるために、現場測
定が用いられる場合、５、発酵槽などのプロセス容器に
挿入されるグローブの部分が、容器の滅菌中に、２５０
”Ｆ（１２１℃）の蒸気により規場で滅菌できなければ
ならない場合、 ６、「インボルド（ＩＮＧＯＬＤ　）　Ｊ取付は部品な
どの標準工業用ノズルを使用してプローブをプロセス容
器の壁を通して挿入すべき場合、 ７、撹拌されたプロセス容器内において適切な混合レベ
ルを確保するのに十分な深さまでグローブを挿入しうる
場合 に、物質の特性をその螢光によシ測定する新規なグロー
ブと方法を提供するととにある。被鹸体としては溶液、
固体の表面、気体混合物、固体の懸濁液などがあシ、そ
れらのものの少なくとも１つの成分は螢光を発する（す
なわち螢光体である）。
あるいは、螢光を発しない関連成分を螢光染色と選択的
に結合さゼた上で、本発明を適用することができる。該
関連成分は化学反応物質１反応中間生成物、生成物、副
産物、不純物又は系内の不活性物質々どである。この計
器は、グローブが滅菌環境又は無菌環境の中で動作しな
ければなら々い発酵槽などの生物学反応容器において使
用するのに特に適している。
発明の概要 本発明によれば、物質の特性をその螢光によシ測定する
装置は、励起ビームを集め、再び方向を定めて収束ビー
ムとする円形の凹面鏡に埋設される励起ビーム源を使用
する。所定の照射領域を有スルビームハプロセスザンプ
ルを照射する。ビームは、完全に吸収されるまであらゆ
る方向にサンプルの中に投射されるのが好ましい。この
照射領域において発生されるプロセス物質の螢光は、励
起ビームが通過したのと同じ窓を通って加シ）螢光検出
器によｐ測定される。
本発明の目的を達成するためには、螢光検出器の視野が
励起ビームの照射領域を実質的に包囲し、それによシ、
照射領域において発せられる螢光が検出器の視野に実質
的に含まれるようにすることが重要である。
本発明の好捷しい実施例においては、光源は安定した紫
外線ランプであり、ビームはビーム焦点にある帯域フィ
ルタを通過し、その後は発散して、プローブ端に配置さ
れる石英の窓を介してプロセス物質を照射する。また、
プロセス物質からの螢光は多要素高域フィルタを通過し
、同軸光学系を形成する励起ビームの焦点に隣接し且つ
それを取囲む螢光検出器に入射するのが好オしい。螢光
検出器において発生される電気信号は、プローブの後端
部にある密閉チェンバの内部に配置される低ノイズ増幅
器に結合され、増幅器の螢光信号はケーブルを介して装
置の電源麦示及び制御部へ送られる。
装置の好寸しい実施例の電気表示及び制御部においては
、螢光信号はさらに利得、トリミング及びオフセットに
関して処理される。トリミングされた螢光信号はデジタ
ル電圧計に印加されて表示に利用されると共に、プロセ
スサンプルの螢光を永久的に記録して傾向を指示するだ
めにス）　ＩＪツブチャート式記録計に印加される。自
動ゾロセス制御のために、継電器接点を有するｅ後比較
器も設けられる。
同様に、装置の好ましい実施例においては、紫外線用帯
域フィルタの出力側に紫外線励起ビームに隣接して付加
的な光検出器が配置される。この光検出器は、フィルタ
を通過した励起ビームの軸からずれた部分により照射さ
れる。励起光用光検出器において発生される電気信号は
、プローブの後端部にある密閉チェンバの中に配置され
る低ノイズ前置増幅器に結合される。増幅された励起信
号はケーブルを介して装置の電源、表示及び制御部へ送
られる。装置の電源、表示及び制御部において、増幅さ
れた励起信号は一定の基準電圧と比較される。比較器に
おいて発生される誤ｐ信号はラング調整器の出力を制御
するために使用される。
ランプ調整器の出力は装置のグローブ部へ送られる。装
置のプローブ部において、紫外線ランプ調差器の出力は
信号線を介し−Ｃ１集光ミラーに埋設されるランプへ送
られる。前述の帰還ループは光出力に基づいて紫外線ラ
ンプを安定化する。同様に、ランプ帰還システムはプロ
セス物質を照射する励起ビームを安定化する。さらに詳
細には、ランプ帰還ループは、ランプにおいて発生され
る励起ビームの変化及びドリフトと関連する変化及びド
リフトからプロセス物質において発生される特性螢光を
安定化する。その結果、再現性にすぐれ、線間電圧の変
動、室温の変化又は紫外線ランプのエージングなどの外
部の影響を受けにくい非常に安定した装置が得られる。
ここで使用する用語「螢光検出器」は、広い意味で、電
気的出力が与えられた入射光に従って変化する装置を含
むものと解釈される。これには、フォトダイオード、フ
ォトレジスタ、光学熱電対などが含まれる。同様に、「
ランプ」は光出力が印加される電気的入力と共に変化す
る装置を含む広い意味を有し、水銀アークランプ、蛍光
灯、ネルンストランプ、レーザーなどを含む。同様に、
用語「シール」は漏れを防ぐだめの装置を含む広い意味
を有し、シールにはＯリング、圧縮シール。
線路接触シール、フリットシールなどが含１れる。
同様に、用語「フィルタ」は、広い意味で、所定の波長
の光を屈折することなく、ある波長を選択し、他の波長
は排除する装置を含み、着色フィルタガラス、有機染料
フィルタ、薄膜多重反射干渉フィルタなどを含む。同様
に、用語「ミラー」は、光を集め、収束又は発散させる
装置を含む広い意味ヲ有し、レンズ、プリズム、ブル−
スター角反射鏡、オゾチカルファイ・ぐ−束などを含む
。同様に、用語「窓」は、発散螢光を集めるのを補助す
る平面又は湾曲面を含む広い意味を有する。同様に、用
語「容器」は、広い意味で、キュベツト。
ビーカー、フラスコ、ベトリ皿、タンク、ノぞイゾなど
を含む、サンプルを入れるだめに使用されるあらゆる装
置を含む。
発明の詳細な記載 本発明は、リアルタイムで螢光を測定する改良された光
学装置及び方法を提供することを目的とする。設計に当
たっては、照射光の照射領域が発せられる螢光を測定す
る検出器の視野の中に実質的に含せれるという原理を採
用する。好ましい実施例においては、サンゾルに至る照
射光の経路と、検出器に至る螢光の経路とはあらゆる方
向に本質的に同軸である。この原理によシ励起光を効率
良く使用することができ、検出器の視野がランプの照射
領域の内部で発せられる螢光を完全に包含するだめ、低
濃度の螢光体に対して高感度の測定が可能である。これ
は、ラングの光路と検出器の光路との間にかなシ大きな
角度がある従来の計器のいくつかにおいては不可能であ
った。原理は表面検出器の特殊な場合であるので、吸光
度の高いサンプルに対する測定感度は、照射に使用され
る表面とは異方る表面を介して螢光を測定する手順に比
べて高い。
この原理によれば、多様な標準形ノズルを介してプロセ
ス容器に直接挿入することができるコンパクトな円筒形
のプローブとしてセンサを組立てることができる。グロ
ーブが円筒形であるため、グローブを外部の水（たとえ
ばタンク洗浄水２発泡剤、偶発的な水のあふれなど）か
ら保護するため又はプローブに乾燥ガスを入れるため（
たとえばグローブの内部での結露を避けるため）のグロ
ーブの密封が容易になる。この構成により、サンプルチ
ェンバを使用する従来の計器において安定した代表サン
プルをリアルタイムで提供するととに通常関連する問題
の多くが回避される。ザンプルチェンパがないため、ブ
Ｃ路の長さを全吸収により規定されるサンプル中の吸光
種類の関数として変化させることもできる。その結果、
光路が単一の一定のものである場合に比べてプローブの
測定範囲は広くなυ且つ感度も高くなる。プローブの窓
からの反射による光の損失は、窓によシ設定される測定
平面をあらゆる方向について光路に対して垂直に配置す
ることによシ最少限に抑えられる。
プローブは容器の壁から適切な距離まで容器内へ挿入す
ることができ、撹拌後の容器内で十分な混合レベルが達
成される。照射用う／ゾの出力を安定化させるため、ラ
ンプに供給される電力を調節するだめに使用される励起
波長の強さを測定するセンサは、グローブに内蔵される
。このセンサはランプの故障を検出するためにも使用さ
れる。プローブは、プロセス容器に挿入されるプローブ
の部分がその場で蒸気によシ滅菌可能であシ且つ滅菌後
はプロセスの中で無菌状態で動作するように設計される
。グローブは、プローブに内蔵されるフィルタを選択す
ることにょシ、励起波長と螢光の波長のいかなる組合せ
に対しても動作するように構成される。プローブは監視
又はプロセス制御に適している。プローブは、表面、無
傷の＃１織。
器官又はむき出しの液体の螢光を測定する場合外との容
器を必要としない場合にも使用することができる。
以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する
。
図面において同じ図中符号は同様の構成要素を示す。第
１図は、微生物がノロープ端を励起するグローブ装置は
円形の横断面形状を有する。この実施例では、光学グロ
ーブ装置（１ｏ）は、様々な生物学的成長段階にある多
数の微生物（１４）の懸濁液が入っている発酵槽（］２
）の中へ突出するように取付けられる。励起ビーム（１
６）は、生物学的吸収こう配（１８）に沿って励起ビー
ムが完全に吸収される全吸収面（２ｏ）まで微生物の中
に入射する。この全吸収面までの距離は、所定の時間に
おける微生物懸濁液の濃度によって異なる。グローブは
、発酵槽（１２）に溶接される「インボルド」取付は部
品（２２）に取付けられ、この取付は部品にｏリング（
２４）にょシ密封される。リングナツト（２６）はグロ
ーブを「インボルド」取付は部品（２２）内に堅固に保
持する。
発酵槽（１２）は撹拌機栴（２７）と、空気、栄養及び
声の調節を行なうだめの管（２５）とを具備する。
発酵槽（１２）内部における微生物（１４）の成長は光
学グローブ（オプトロープ）装置（１ｏ）によシ監視さ
れる。このような装置は、以下に詳述するように、円形
の集光ミラー（３ｏ）の中に埋設されるランプ（２８）
を使用する。光は集光ミラーカラ反射されて、フィルタ
（３２）の位置にある焦点で集束される収束ビームを形
成する。
フィルり（３２）はレンズではなく、ビームを目に見え
るほど屈折させたシ、ば−ムの経路を変えたりすること
はない。フィルタは、所定の波長のビームを通過させる
ために設けられる。フィルタを通過した光の発散ビーム
は、石英から形成されるのが好ましいグローブの窓（３
４）を通過し、励起ビーム（１６）の経路に入っている
微生物（１４）を生物学的吸収ζう配（Ｊ８）に沿って
照射する。ビームは、全吸収面（２ｏ）において概略的
に示されるような全吸収が起こるまで、微生物（１４）
の中へ投射されるのが好ましい。全吸収面（２０）は幾
何学的な面ではなく、全吸収が起こる面である。微生物
（１４）の数が増すにつれて、励起ビーム（１６）中に
発生される螢光は多くなる。この螢光はグローブの窓（
３４）及びフィルタ（３６）を介して戻シ、戻り螢光検
出用螢光検出器（３７）によシ検出される。フィルタ（
３６）はレンズではなく、ビームを目に見えるほど屈折
させたシ、ビームの経路を変えたりすることはない。螢
光信号は螢光増幅器（３８）によシ増幅され、信号ケー
ブル（４０）を介して光学グローブ装置の電源（ｐｓ）
、表示及び制御部（４２）へ送られる。螢光信号は７−
′ゾタル電圧計（ＤＶＭ　）　（４４）に表示され、螢
光記録器（４６）に記録される。螢光信号は、さらに設
定値（６７）と比較され、自動プロセス制御に利用され
る。ラング光検出器前置増幅器（４８）はランプ出力制
御帰還ループの一部として使用され、信号ケーブル（４
０）を介して光学プローブ装置のｐｓ、表示及び制御部
（４２）に接続される。このサーボ／ｌ／　−７’につ
いては、特に第５図を参照してさらに詳細に説明する。
ランプ（２８）を動作させるだめの電力はＰＳ１表示及
び制御部（４２）において発生し、ケーブル（５０）を
介して光学プローブ装置（１０）及びランフ’（２８）
に供給される。
第２図は、光学グローブ装置（１０）の光学系と全体的
な構成をさらに詳細に示す横断面図である。ランフ’（
２８）において発生される光は円形の凹面鏡である集光
ミラー（３０）によシ集光され、反射によシ再び経路を
定められて、帯域フィルタ（３２）　（ＮＡＤ　（Ｐ）
Ｈの場合には、たとえば３００〜４００　ｎｍ　）の中
心の位置にある焦点（Ｘ）に向かって収束する。ビーム
は帯域フィルタ（３２）を通過しく第１１図も参照）、
フィルタ（３６）及び螢光検出器（３７）の内部の開口
を介して発散しく第９図及び第１０図も参照）、グロー
ブの窓（３４）とその外側にある微生物（１４）を照明
する。光線（２９）は、（］９）で示されるよう々ある
点で吸収される１で生物学的吸収とり配（１８）の中の
経路に沿って進む。全ての光線は全吸収面（２０）によ
シ規定される距離の中で完全に吸収される。捷た、全反
射面（２０）の位置は測定時における微生物（１４）の
細胞濃度により決定される。細胞濃度が高くなるにつれ
て、第３図に全反射面（２０）ａ’、（２０）ｂ’、（
２０）ｃ及び（２０）ｄにより示すように、全反射面（
２０）は）′Ｃ学ゾローブ装置（１０）及び窓（３４）
に近づく。
細胞又は他の成分の濃度が高くなると全吸収限界はプロ
ーブの窓に近づくが、ランプの照射領域（ＦＩ）と螢光
検出器（３７：ｌ）視野（ＦＶ）（７）限界を決定する
立体角は変化しない。螢光の光子（２１）は窓（３４）
を通って戻シ、集光ミラー（３５）から反射され、反射
により再び経路を定められて、高域フィルタ（３６）　
（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの場合には、たとえば４００〜６００
　ｎｍ　）と螢光検出器（３７）とに入射する。
螢光検出器（３７）は光子を電気信号に変換し、その信
号は信号線を介して螢光増幅器（３８）（第１図）に送
られ、増幅される。明瞭を期するだめ、数本の光線（２
９）、（２ｘ）ｔ、か図示さ７ｔていないカニ、他にも
光路は存在する。第９図から第】１図は、？ｉ”ｉ域フ
ィルタ（３２）、戻シ螢光用高域フィルク（３Ｇ）及び
螢光検出器（３７）を明瞭に図示するために９０°回転
させ、詳細に示す正面図である。図示されるように、帯
域フィルタ（３２）は円形であわ、高域フィルタ（３６
）と螢光検出器（３７）は環状である。第２図に光線（
２９）として示されるような励起ビームは帯域フィルタ
（３２）を通過し、次に、戻り螢光用高域フィルタ（３
６）及び螢光検出器（３７）の開口を通過する。
第２図に詳細に示されるように、光学プローブ装置は、
微生物（１４）の懸濁液がプローブの内部へ侵入するの
を防ぐ窓密制用Ｏリング（３３）をさらに含む。０リン
グ保持部材（３１）はグローブの分解のために設けられ
る。ＯＩＪング（２４）は、微生物（１４）の懸濁液が
この位置を越えて漏れるのを防ぐために「インコ゛ルド
」取付は部品（２２）と共にシールを形成するように設
けられる。ナツト（２６）に１光学７０ローブ装ｆｉ（
１０）を取付は部品（２２）に固着するために使用され
る。
ランプ（２８）の出力を制御するために１史用される付
加的な光検出器（４５）は、螢光検出器（３７）と組合
わされ、それと一体に形成される（第１０図）。この光
検出器はランプ制御用サーボループに含まれるセンサで
あり、第５図に関してさらに詳細に説明する。ランプ制
御用光検出器の出力は信号線を介してランプ光検出器前
置増幅器（４８）に送られ、増幅される。
第４図は光学プローブ装置（１０）の端部を示す。ラン
グの照射領域（１１’、Ｉ）と、螢光検出器（３７）の
視野（ＦＶ）とが示されている。また、螢光検出器（３
７）の直接視野（ＦＶＩ　）と、反射視野（ＦＶ２　）
とが示されている。螢光検出器（３７）の視野はランプ
の照射領域（ＦＩ）より広く、それを完全に包含する。
これは、螢光検出器（３７）と窓（３４）との間の距離
を窓（３４）とランプとの間の距離より短くすることに
よシ達成される。
正確な螢光測定を実施するためには、視野（ＦＶ）が照
射領域（ＦＩ　）をほぼ包含し、好ましくは完全に包含
することが重要である。そうでないと、多くの従来の装
置について見られたように、螢光の一部が螢光検出器に
より検出されず、感度は低くなる。
第５図は、螢光測定用システムエレクトロニクス及びラ
ンプ強度制御用ザーがシステムエレクトロニクスの一実
施例を示すブロック回路図である。
捷ず、１１０？ルトの電力（７２）が印加され、スイッ
チ（７４）はその電力を低圧電源（７０）と、変圧器（
６０）の制御素子であるランプ制御用オツドカプラ（５
８）とに供給する。電力はケーブル（５０）を介してラ
ンニア’（２８）に供給される。ランプ出力制御用の光
検出器（４５）はランプの強さを検出し、検出信号をラ
ンプ出力検出器前置増幅器（４８）及び信号ケーブル（
４０）を介して誤υ増幅器（５４）に送る。誤り増幅器
（５４）は、ケーブル（４０）を介して得られるランプ
強度信号をランプ強度調節用電位差計（５５）で発生さ
れる基準信号と比較する。誤シ増幅器（５４）において
発生される強度変化誤り（ａ　７”ｊ−はランプ制御用
オツドカプラ（５８）を直接制御し、安定したランプ（
２８）の出力を発生する。ランプ故障識別回路／指示器
（５２）は誤り増幅器（５４）からの誤シ信号を監視し
、適正なランプ動作を決定する。パルスモートン−ケン
ス発生器（５６）はスイッチ（５７）を介してランプの
出力を制御し、ランフ°（２８）を点滅動作させる。
連続動作又はパルス動作はスイッチ（６９）を使用して
選択される。
試験すべき微生物懸濁液のある位置（１９）において発
生される螢光の光子（２１）は、戻り螢光用螢光検出器
（３７）で電気信号に変換される。
この信号は、螢光増幅器（３８）及び信号ケーブル（４
０）を介して螢光緩衝増幅器（６２）へ送られる。螢光
緩衝増幅器（６２）は、スフ４ン調節用電位差計（６４
）及びオフセット調節用電位差計（６３）を介して、ス
パン及びオフセットの調節のために螢光信号をトリミン
グする。螢光信号はデジタル電圧計（４４）に表示され
、螢光記録器（４６）に記録される。制御比較器（６６
）は螢光緩衝増幅器（６２）からのトリミングされた螢
光信号をプロセス制御用設定値用ポテンショメータ（６
７）で発生される設定値電圧と比較する。
制御比較器の出力はｇ電器（６８）を動作させる。
継電器（６８）は自動プロセス制御に使用される制御素
子である。
フィルタ（３２）及び（３６）は螢光測定に常に必要と
されるわけではない。照射源によ多発生される固有波長
を励起のだめの波長に制限すべきであれば、フィルタ（
３２）を省略するとともできる。これは、たとえば光源
がレーザーである場合である。検出器の固有感度を発せ
られる螢光の波長に制限すべきであれば、フィルタ（３
６）を省略することができる。
場合によっては、プローブをパルスモードで動作させる
と有利であろう。これは、さらに、装置の電源１表示及
び制御部の変形も含む。この変形により、励起用ランプ
を制御された速度と持続時間をもって点滅させることが
でき、その結果として得られる戻シ生物学的螢光は、ラ
ンプのオフ時間に戻ｐ螢光検出用螢光検出器及び光学系
によシ測定される。この変形においては、螢光を発しな
い物質の後方散乱が減少し、紫外線を感じる生物に対す
る光による損傷が減少し、ランプの有効寿命が長くなる
という利点が得られる。
上述の本発明の装置はパルスモードでの動作が可能であ
る。また、プローブの光学系は、フィルタ（３２）及び
戻シ螢光測定用フィルタ（３６）に隣接して偏光子（図
示せず）を含むことができる。光を偏光することにより
、物質の測定特性が改善される場合がある。
戸外で使用する場合のようにグローブが極端な温度にさ
らされる状況では、グローブの温度を許容限度内に調整
するためにプローブの内部にヒータを設けると有利であ
る。
グローブを特定の分析機能を実行するだめの他の付属品
と組合わぜて使用するとともできる。たとえば、螢光ガ
スの入ったチェノ・ぐをグローブに装着する。この場合
、ガスによシ発せられる螢光の強さは温度によ）左右さ
れることが多いので、螢光の強さによシチェンパの周囲
環境の温度を測定する。場合により付属品として有用で
あるその他のチェンバは、分析すべき化合物は透過する
が、チェンバに供給される他の物質は透過しない半透膜
を含む。チェンバ内の物質は、０２．Ｈ＋などの螢光を
発しない拡散化合物の濃度に応じて弱い発、螢光４本の
螢光を発するまで高める機能を有している場合がある。
さらに、フィルタ（３２）及び（３６）なしでグローブ
を使用することもできるし、あるいは同一のフィルタを
設けることもできる。この場合、装置はサンプル内の粒
子によシ反射される光の量を測定する。このモードにお
いては、装置は反射率計又は比濁計となる。
下記の例は本発明の応用例を示す。これらの例は、添付
の特許請求の範囲に限定される本発明の範囲を限定する
ものではない。
例１ 発酵槽を５０　ｍｍｏ　ｌ　ｅ／ｌのＨ２Ｓｏ　４を含
む水で満たした。溶液を静かに撹拌し７、温度は３０℃
に調整した。この発酵槽に、５０　ｍｍ　ｏ　］　ｅＡ
のＨ２ＳＯ４にキニーネの１１０００ｐｐ溶液のアリコ
ートを加えた。
キニーネは、このような条件下で、３４０ｎｍの最大励
起波長及び４６０ｎｍの最大螢光発光波長を有する螢光
物質である。第６図は、１００のケ゛インにおける螢光
計単位での装置の応答と０〜１０ｐｐｍの範囲のキニー
ネの濃度との関数を示す。
例２ キニーネの濃度がＯ〜３４ｐｐｍとなるように例１の手
順を繰返した。その結果を第７図に示す。
し、−Ｆ余白 例３ 先行技術において一般に知られている手順を採用して、
発酵槽を使用し、コリネノぐクテリウムカルネ（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｌｌｕｎａｅ　）を発
生させた。当初、発酵素には０．１！！／ｌのノぐクチ
リアが入っていた。プロセスの終了時には、発酵素には
６．３ｇ／ｌのバクテリアが入っていたプロセス中にお
ける培養物の螢光を記録した。第８図は、培養物の螢光
とバクテリアの濃度ＣＶｌ＞との関数を示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の一実施例の装置の縦方向部分断面図
、 第２図は、実施例におけるプローブの光学系と全体的な
構成を示す部分横断面図、 第３図は、本発明の実施例による全吸収を示すプローブ
及び被測定媒体の略図、 第４図は、本発明の実施例による照射領域及び視野を示
すグローブの概略図、 第５図は、螢光測定用システムエレクトロニクス及びラ
ンプ強度制御用サーボシステムエレクトロニクスのブロ
ック回路図、 第６図、第７図及び第８図は、例１１例２及び例３にそ
れぞれ記載される実際の手順に従った装置の応答を示す
特性図、及び 第９図、第１０図及び第１１図は、第２図に示される高
域フィルタ３６．螢光検出器３７及び帯域フィルタ３２
の正面図である。 １０・・・光学グローブ装置、１２・・・発酵槽、１６
・・・励起ビーム、１８・・・生物学的吸収こう配、２
０・・・全吸収面、２１・・・光子、２４・・・０リン
グ、２８・・ランプ、２９・・・光線、３０・・・集光
ミラー、３２・・・帯域フィルタ、３３・・・０リング
、３４・・窓、３５・・・集光ミラー、３６・・・高域
フィルタ、３７・・螢光検出器、３８・・・螢光増幅器
、４５・・・光検出器、４８・・・前置増幅器、５２・
・・ランプ故障識別回路／指示器、５４・・・誤シ増幅
器、５６・・・ノソルスモードゾーケンス発生器、５８
・・・ラング制御用オグトカグラ、６２・・・螢光緩衝
増幅器、６６・・・制御比較器、６８・・・継電器、Ｆ
Ｉ・・・照射領域、Ｆｖ・・・視野。 第６図 −２７１− 第　７図 キニーネ　ｒｐｐｍ＋ 第８図 Ｃ１１２３４５６ −ｃ重量（ｇ・ｃｅｌｌＳ／／／Ｌ） 第９図 第１０図 第１１図 ２ アメリカ合衆国ペンシルベニア １９４０６キング・オブ・プラツシ ア・ガルフ・ミルズ・ビレツジ （番地なし）アパートメント・ ニー−１０９ １９３８０ウエスト・チェスター・ エヌ・ニュー・ストリート９０４ 手続補正書（方式） 昭和５９年　８月ｔダ日 特許庁長官　志　賀　学　殿 事件の表示 昭和５９年　特許願　第７０１６ｆｉ号２、発明の名称 物質の特性を該物質の螢光警こより測定する光学的方法
及び装置 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　バイオケム　センサーズ、インコーボレイティ
ド４、代理人 （外　４名） ５゜ ６、補正の対象 図　面 ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 浄書図面　１通 ２７３−

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、照射ビームを照射領域内で経路に沿って試験すべき
    物質の中へ投射する過程と、視野の内部で物質から発せ
    られる螢光を検出する過程を具備し、該照射ビームの照
    射領域は検出視野に実質的に包含されている物質の特性
    を該物質の螢光によシ測定する方法。 ２、該照射ビームは全吸収路に沿って材料の中へ導かれ
    、それにより該物質の内部における該照射ビームの経路
    の長さは該物質以外のものによシ杢質的に制限されない
    特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、励起光の経路と発せられる螢光の経路とは実質的に
    同軸となるように指向され名特許請求の範囲第１項記載
    の方法。 ４、螢光測定は１つの平面に沿って行われ、該励起光及
    び該発せられる螢光の光路は該光路が到達する測定平面
    に対して垂直である特許請求の範囲第４項記載の方法。 ５、励起波長の強さを測定する過程と、該照射ビームの
    出力を安定させるために、その強さに従って該照射ビー
    ムに供給される電力を調整する過程とをさらに含む特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 ６、該発せられる螢光の波長とは異なる波長の該照射ビ
    ームを投射する過程と、該発せられる螢光の波長が該照
    射ビームの波長に関して変化する間に該照射源の該照射
    領域を該光電手段の視野を実質的に包含するように維持
    する過程とをさらに含む特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ７、該照射源の波長と螢光検出器の波長とを該視野又は
    該照射領域を変化させずに互いに無関係に変化させる過
    程を含む特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、該照射光を「オン」期間と「オフ」期間とを繰返し
    て／ｆルス状に照射する過程と、該「オフｊ期間に発せ
    られる螢光を検出する過程とを含む特許請求の範１第１
    項記載の方法。 ９．照射ビームを経路に沿って試験すべき物質の中へ投
    射する手段と、サンプルの内部から発せられる螢光を検
    出する光電手段とを具備し、該照射ビームの照射領域は
    、該発せられる螢光を検出する光電手段の視野に実質的
    に包含されている物質の特性を該物質の螢光によシ測定
    する装置。 １０、該サンプルの内部における照射光の経路の長さは
    該サンプル自体以外のものによシ本質的に制限されない
    特許請求の範囲第９項記載の装置。 １１、励起光の経路と発せられる螢光の経路とは実質的
    に同軸である特許請求の範囲第９項又は第１０項記載の
    装置。 １２、該装置は物質の中へ少なくとも部分的に延びてい
    るグローブの形態を有し、該励起光の経路と該発せられ
    る螢光の経路は該プローブの軸と実質的に同軸である特
    許請求の範囲第１１項記載の装置。 １３、該励起光と該発せられる螢光の光路は、あらゆる
    方向において該光路が横切る測定平面に対して垂直であ
    る特許請求の範囲第１Ｌ項記載の装置。 １４、照射ランプに供給される電力を調整してランプの
    出力を安定させるように励起波長の強さを測定するため
    のセンサが接続されている特許請求の範囲第１１項記載
    の装置。 １５、該グローブの一部はプロセス容器に挿入され、蒸
    気によシその場所で滅菌することができるように密封さ
    れている特許請求の範囲第１１項記載の装置。 １６、該装置は滅菌状態又は無菌状態での動作が必要で
    あるプロセスにおいて使用するために密封されている特
    許請求の範囲第１１項記載の装置。 １７、該照射光を投射する手段は該発せられる螢光の波
    長とは異なる波長を有し、該照射源の照射領域は該発せ
    られる螢光の波長に関係なく該光電手段の視野を実質的
    に包含している特許請求の範囲第９項記載の装置。 １８、該照射源の波長と該螢光検出器の波長とは、視野
    又は照射領域を変化することなく互いに独立して変化さ
    せることができる特許請求の範囲第９項記載の装置。 １９、該グローブ内にランプの故障を指示するランプ故
    障センサが含まれる特許請求の範囲第１１項記載の装置
    。 ２０、自ｉノロセス制御ループ内のセンサとして使用さ
    れる特許請求の範囲第１１項記載の装置。 ２１、該照射光を「オン」期間及び「オフ」期′間を繰
    返えしてパルス状に照射する手段を含み、該光電手段は
    該「オフ」期間に発せられる螢光を検知するように接続
    されている特許請求の範囲第９項記載の装置。 ２２、照射ビームを投射する該手段と該ｉｔ手段とは乾
    燥したｆスが入っている水密チェ／パ内に密閉されてい
    る特許請求の範囲第９項記載の装置。 ２３、該照射ビーム及び該発せられる螢光をろ過させる
    フィルタ手段を含む特許請求の範囲第９項記載の装置。 ２４、該装置の温度を調整するために加熱手段を含む特
    許請求の範囲第９項記載の装置。 ２５、該照射ビーム及び該発せられる螢光を偏光する偏
    光手段を含む特許請求の範囲第９項記載の装置。 ２６、該照射ビームは固有波長を有し、該光電手段は固
    有感度を有し、該固有波長及び固有感度はフィルタ手段
    を使用することなく互いに両立するように制御される特
    許請求の範囲第９項記載の装置。
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