JPS60226822A - 線維状赤血球凝集素の精製方法 - Google Patents
線維状赤血球凝集素の精製方法Info
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- JPS60226822A JPS60226822A JP59084778A JP8477884A JPS60226822A JP S60226822 A JPS60226822 A JP S60226822A JP 59084778 A JP59084778 A JP 59084778A JP 8477884 A JP8477884 A JP 8477884A JP S60226822 A JPS60226822 A JP S60226822A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ボルデテラ属菌が産生する線維状赤血球凝集
素（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｈｅ＋ｎａｇＨＩｕｔｉ
ｎｉｎ；以下Ｆ−ＨＡと略称する）の精製方法、さらに
詳しくは、ボルデテラ属菌培養物を、架橋ポリサッカラ
イド硫酸エステルのゲル誘導体に接触せしめ、Ｆ−ＨＡ
を吸着させた後、ゲルから溶出することにより高純度Ｆ
’−ＨＡを採取する方法に関する。
素（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｈｅ＋ｎａｇＨＩｕｔｉ
ｎｉｎ；以下Ｆ−ＨＡと略称する）の精製方法、さらに
詳しくは、ボルデテラ属菌培養物を、架橋ポリサッカラ
イド硫酸エステルのゲル誘導体に接触せしめ、Ｆ−ＨＡ
を吸着させた後、ゲルから溶出することにより高純度Ｆ
’−ＨＡを採取する方法に関する。
産業上の利用分野
ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳菌、パラ
百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、これらは種々の生
物学的活性物質を産生する。Ｆ−ＨＡはこれらの生物学
的活性物質の中の１つであり、ボルデテラ属に属する菌
は、いずれもＦ−ＨＡを産生する。
百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、これらは種々の生
物学的活性物質を産生する。Ｆ−ＨＡはこれらの生物学
的活性物質の中の１つであり、ボルデテラ属に属する菌
は、いずれもＦ−ＨＡを産生する。
最近になって百日咳菌Ｆ−ＨＡが、百日咳菌の感染およ
び発病の防御において、きわめて重要なる役割を演じて
いることが明らかにされ、百日咳菌感染防御抗原として
注目されるようになった［５ａｔｏ、 Ｙら： Ｉｎｆ
ｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、 ＋ ３１． １２２３−１２３
１（１９８１）、およびＳｅｍ１ｎａｒｓ １ｎＩｎｆ
ｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅ、、３８０−３８５（１９８
２）］。またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ−ＨＡが免
疫学的に同一であることが確認され［Ａｒａｉ、 Ｈら
；Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、 ＋３２＋ （１）＋
２４３−’２５０（１９８１）］、各Ｆ−ＨＡがボルデ
テラ属菌に共通のワクチンコンポーネントとなり得る可
能性も示されている。 このようなことから、医療上有
効な生物学的活性物質であるＦ−ＨＡを簡単にかつ大量
に単離精製する方法の開発が望まれている。
び発病の防御において、きわめて重要なる役割を演じて
いることが明らかにされ、百日咳菌感染防御抗原として
注目されるようになった［５ａｔｏ、 Ｙら： Ｉｎｆ
ｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、 ＋ ３１． １２２３−１２３
１（１９８１）、およびＳｅｍ１ｎａｒｓ １ｎＩｎｆ
ｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ、 Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅ、、３８０−３８５（１９８
２）］。またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ−ＨＡが免
疫学的に同一であることが確認され［Ａｒａｉ、 Ｈら
；Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、 ＋３２＋ （１）＋
２４３−’２５０（１９８１）］、各Ｆ−ＨＡがボルデ
テラ属菌に共通のワクチンコンポーネントとなり得る可
能性も示されている。 このようなことから、医療上有
効な生物学的活性物質であるＦ−ＨＡを簡単にかつ大量
に単離精製する方法の開発が望まれている。
従来技術
従来知られているＦ−ＨＡの採取精製法としては、百日
咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾配遠心にかけ、
さらにゲルろ過を２回くり返し百日咳菌Ｆ−ＨＡを得る
方法がある［５ａｔｏｒＹら；Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｕｕ
ｎｕｎ、＋ ９＋ ８ ０ １（１９７４）１． Ｌｈ
化ながらこの方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ
−ＨＡの収率が低い等の欠点かあり、工業的な精製法と
しては採用し難い。
咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾配遠心にかけ、
さらにゲルろ過を２回くり返し百日咳菌Ｆ−ＨＡを得る
方法がある［５ａｔｏｒＹら；Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｕｕ
ｎｕｎ、＋ ９＋ ８ ０ １（１９７４）１． Ｌｈ
化ながらこの方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ
−ＨＡの収率が低い等の欠点かあり、工業的な精製法と
しては採用し難い。
また同様に百日咳菌Ｆ−ＨＡを精製した例として、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過による方法［Ａｒ
ａｉ、Ｈら； Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋＋ｕｎｕｎ、 ＋
２５．４６０（１９７９）］があるか、この方法によれ
ば、Ｆ−ＨＡの収率か低いうえに、百日咳菌内毒素の除
去が困難であり、実用には供し難い。
ン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過による方法［Ａｒ
ａｉ、Ｈら； Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉ＋＋ｕｎｕｎ、 ＋
２５．４６０（１９７９）］があるか、この方法によれ
ば、Ｆ−ＨＡの収率か低いうえに、百日咳菌内毒素の除
去が困難であり、実用には供し難い。
さら１こ別の例として、ハ（ドロキシアパタイト吸着ク
ロマトグラフィー、ハブトグロビアン・アフィニティク
ロマトグラフイー、硫安分画、ゲルろ過を組合わせる方
法［Ｃｏｕ＋ｅｌｌ、Ｊ、 Ｌ、ら；Ｓｅｍ１ｎａｒｓ
ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｉ
Ｖ＋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ、 、 ３７
＋ １（１９８２）］、およびハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフィー、特異抗体・アフイニティクロ
マトグラフィー。
ロマトグラフィー、ハブトグロビアン・アフィニティク
ロマトグラフイー、硫安分画、ゲルろ過を組合わせる方
法［Ｃｏｕ＋ｅｌｌ、Ｊ、 Ｌ、ら；Ｓｅｍ１ｎａｒｓ
ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｉ
Ｖ＋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ、 、 ３７
＋ １（１９８２）］、およびハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフィー、特異抗体・アフイニティクロ
マトグラフィー。
蔗糖密度勾配超遠心分離を組合わせる方法［流送ら；日
本細菌学雑誌、 、３’８．４２３（１９８３）］があ
るが、これらの方法は工程が非常に長く複雑であるうえ
に、Ｆ −ＨＡの収率が低く、さらにハイドロキシアパ
タイトは高価であり、また上記において用いられている
アフイニティクロマトグラフイゲルは市販されておらず
、これらの調製は非常に手間がかかるうえ１こ、原材料
が非常に高価である。このような種々の欠点のため、上
記方法もＦ−ＨＡの工業的で安価な採取方法とはなり得
ない。
本細菌学雑誌、 、３’８．４２３（１９８３）］があ
るが、これらの方法は工程が非常に長く複雑であるうえ
に、Ｆ −ＨＡの収率が低く、さらにハイドロキシアパ
タイトは高価であり、また上記において用いられている
アフイニティクロマトグラフイゲルは市販されておらず
、これらの調製は非常に手間がかかるうえ１こ、原材料
が非常に高価である。このような種々の欠点のため、上
記方法もＦ−ＨＡの工業的で安価な採取方法とはなり得
ない。
発明の目的
本発明者らは、Ｆ−）−ＩＡの工業的な単離精製法を見
い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデテラ属菌培
養物を、架橋ポリサッカライド硫酸エステルのゲル誘導
体に接触せしめ、Ｆ−ＨＡを吸着させ、夾雑物質と分離
し、ゲルから溶出することにより、高純度のＦ−ＨＡが
きわめて簡単にしかも非常に高い収率で得られることを
発見し、本発明を完成するに至った。
い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデテラ属菌培
養物を、架橋ポリサッカライド硫酸エステルのゲル誘導
体に接触せしめ、Ｆ−ＨＡを吸着させ、夾雑物質と分離
し、ゲルから溶出することにより、高純度のＦ−ＨＡが
きわめて簡単にしかも非常に高い収率で得られることを
発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な生物学的
活性物質であるＦ−ＨＡを、工業的に筒単でかつ大量に
、きわめて高純度にまで精製する方法を提供することに
ある。
活性物質であるＦ−ＨＡを、工業的に筒単でかつ大量に
、きわめて高純度にまで精製する方法を提供することに
ある。
発明の構成および効果。
本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、架橋ポリサッカラ
イド硫酸エステルのゲル誘導体に接触せしめ、Ｆ−ＨＡ
を吸着させた後、ゲルから溶出することを特徴とするＦ
−ＨＡの精製方法である。
イド硫酸エステルのゲル誘導体に接触せしめ、Ｆ−ＨＡ
を吸着させた後、ゲルから溶出することを特徴とするＦ
−ＨＡの精製方法である。
本発明において、出発材料であるボルデテラ属菌培養物
とは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌の培養
物を含む。本発明において好ましい培養物は、百日咳菌
培養物であり、百日咳菌を通常の培地、たとえばツーエ
ン・ウィラー培地や、又テナー・ショルテ培地などの液
状培地にて、常法により静置培養または振盪培養もしく
は通気撹拌培養して得られる培養物である。この培養物
は、遠心分離により菌体を除去した培養上清、あるいは
菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製標品の
形で本発明方法に供される。本発明方法によれば、塩析
、抽出、超遠心分離等の前段部分精製処理をあえて行な
う必要はなく、培養上清等をそのままポリサッカライド
硫酸エステルデル吸着クロマトグラフィーに付すことか
でき、工程がきわめて簡単である。
とは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌の培養
物を含む。本発明において好ましい培養物は、百日咳菌
培養物であり、百日咳菌を通常の培地、たとえばツーエ
ン・ウィラー培地や、又テナー・ショルテ培地などの液
状培地にて、常法により静置培養または振盪培養もしく
は通気撹拌培養して得られる培養物である。この培養物
は、遠心分離により菌体を除去した培養上清、あるいは
菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの部分精製標品の
形で本発明方法に供される。本発明方法によれば、塩析
、抽出、超遠心分離等の前段部分精製処理をあえて行な
う必要はなく、培養上清等をそのままポリサッカライド
硫酸エステルデル吸着クロマトグラフィーに付すことか
でき、工程がきわめて簡単である。
本発明で用いられる架橋ポリサッカライド硫酸エステル
とは、デキストラン、セルロース類、アガロースなどの
ポリサッカライドを、例えばエピクロルヒドリン、ノク
ロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレングリコール
ビスエポキシプロビルエーテル等の加橋剤で加橋して得
られる架橋ポリサッカライドを硫酸エステル化して得ら
れるものである。架橋ポリサッカライドはすでに市販さ
れており例えば、架橋デキストランとしてセファデック
スＧ−１０、Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００（ファル
マシア社製）などがあり、架橋アガロースとしてセフ７
０−ズＣＬ−２８，ＣＬ−４Ｂ、ＣＬ−６Ｂ（７フルマ
シア社製）などがあり、架橋セルロースとしてセルロフ
ァインＧＣＬ−２５、ＧＧＬ−９０（チッソ社製）など
がある。これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒
の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させる
ことにより所望の架橋ポリサッカライド硫酸エステルが
得られる。
とは、デキストラン、セルロース類、アガロースなどの
ポリサッカライドを、例えばエピクロルヒドリン、ノク
ロルヒドリン、ジブロムヒドリン、エチレングリコール
ビスエポキシプロビルエーテル等の加橋剤で加橋して得
られる架橋ポリサッカライドを硫酸エステル化して得ら
れるものである。架橋ポリサッカライドはすでに市販さ
れており例えば、架橋デキストランとしてセファデック
スＧ−１０、Ｇ−２５、Ｇ−５０、Ｇ−１００（ファル
マシア社製）などがあり、架橋アガロースとしてセフ７
０−ズＣＬ−２８，ＣＬ−４Ｂ、ＣＬ−６Ｂ（７フルマ
シア社製）などがあり、架橋セルロースとしてセルロフ
ァインＧＣＬ−２５、ＧＧＬ−９０（チッソ社製）など
がある。これらのゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒
の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させる
ことにより所望の架橋ポリサッカライド硫酸エステルが
得られる。
本発明において、架橋ポリサッカライド硫酸エステルゲ
ルを用いて、ボルデテラ属菌培養物中のＦ−ＨＡを精製
採取するにあたっては、次のような方法で行なわれる。
ルを用いて、ボルデテラ属菌培養物中のＦ−ＨＡを精製
採取するにあたっては、次のような方法で行なわれる。
架橋ポリサッカライド硫酸エステルゲルは、あらかじめ
例えば０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０゜ｆ） ｉ Ｍ
リン酸緩衝液等の、中性付近のｐＨ値（ｐＨ６〜９）で
あり、比電導度５−２５ ｍｓ／Ｃｍ程度の適当な緩衝
液を用いて平衡化を行なった後に、Ｆ−）（Ａの吸着繰
作に供する。
例えば０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０゜ｆ） ｉ Ｍ
リン酸緩衝液等の、中性付近のｐＨ値（ｐＨ６〜９）で
あり、比電導度５−２５ ｍｓ／Ｃｍ程度の適当な緩衝
液を用いて平衡化を行なった後に、Ｆ−）（Ａの吸着繰
作に供する。
架橋ポリサッカライド硫酸エステルゲルへのＦ−ＨＡの
吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−ＨＡの溶出等一連の精製繰作は
、バッチ法お上びカラム法等の工業的に通常よく用いら
れる操作力法で行なう。バッチ法で行なう場合は、ボル
デテラ属菌培養物中に架橋ポリサッカライド硫酸エステ
ルゲルを投入し、ｐＨ６，０〜９．０程度の範囲におい
て０〜３０℃程度の温度にて１０〜６０分程度緩く撹拌
してＦ−ＨＡを吸着させる。この際、ボルデテラ属菌培
養物の比電導度が５．０−２５．０ｍｓ／ａｍ程度とな
るように、適宜濃縮または希釈して吸着操作に利す。
吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−ＨＡの溶出等一連の精製繰作は
、バッチ法お上びカラム法等の工業的に通常よく用いら
れる操作力法で行なう。バッチ法で行なう場合は、ボル
デテラ属菌培養物中に架橋ポリサッカライド硫酸エステ
ルゲルを投入し、ｐＨ６，０〜９．０程度の範囲におい
て０〜３０℃程度の温度にて１０〜６０分程度緩く撹拌
してＦ−ＨＡを吸着させる。この際、ボルデテラ属菌培
養物の比電導度が５．０−２５．０ｍｓ／ａｍ程度とな
るように、適宜濃縮または希釈して吸着操作に利す。
吸着終了後、培養物−ゲル混合液をろ過器」二に充填し
、吸引ろ過してゲルと口液を分離する。分離したゲルを
、比電導度５〜２５ ｍｓ／ｃａｎ程度で、ｐＨが５．
０〜１０．０程度である適当な緩衝液例えば、０．２Ｍ
塩化ナトリウム添加０．０２Ｍマ、。
、吸引ろ過してゲルと口液を分離する。分離したゲルを
、比電導度５〜２５ ｍｓ／ｃａｎ程度で、ｐＨが５．
０〜１０．０程度である適当な緩衝液例えば、０．２Ｍ
塩化ナトリウム添加０．０２Ｍマ、。
キルベン（Ｍｅ Ｉ １ｖａｉｎｅ’ｓ）緩衝液、０．
３Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１Ｍリン酸緩衝液あるい
は０゜３）１４塩化ナトリウム添加０，０１．Ｍトリス
塩酸緩衝液等を注ぎ吸引して洗浄する。
３Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１Ｍリン酸緩衝液あるい
は０゜３）１４塩化ナトリウム添加０，０１．Ｍトリス
塩酸緩衝液等を注ぎ吸引して洗浄する。
この後、ｐＨが５６０〜１０．０程度で、比電導度が２
５〜１３０ｍ５／艶程度である（」二足洗浄用緩衝液の
比電導度より大）適当な緩衝液、例えば１．５Ｍ塩化ナ
トリウム添加マツキルベン緩衝液、１．５Ｍ塩化す）リ
ウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着しているＦ−ＨＡ
を溶出する。
５〜１３０ｍ５／艶程度である（」二足洗浄用緩衝液の
比電導度より大）適当な緩衝液、例えば１．５Ｍ塩化ナ
トリウム添加マツキルベン緩衝液、１．５Ｍ塩化す）リ
ウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着しているＦ−ＨＡ
を溶出する。
カラム法１こで本発明方法を実施する場合は原材料液、
洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と
同様でよく、これらの通液速度は、１０ｍｌ／ｃｍ２／
Ｈｒ−５０−Ｏｉ１／ｃ＋＋＋２／）ｌｒ程度に調整し
て行なうとよい。
洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と
同様でよく、これらの通液速度は、１０ｍｌ／ｃｍ２／
Ｈｒ−５０−Ｏｉ１／ｃ＋＋＋２／）ｌｒ程度に調整し
て行なうとよい。
本発明の精製法によれば、百日咳菌培養物中のＦ−ＨＡ
の特異的吸着能にすぐれ、Ｆ−ＨＡの精製度は数十倍に
達し、しかもＦ−ＨＡの回収率は９０％以上１００％近
くに達する。得られる精製Ｆ−ＨＡの比活性は４〜８Ｘ
１０’ＨＡユニット／ｌ１１ｇ蛋白質ときわめて高く、
ポリアクリルアミドディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分
析において単一のバンドを形成し、百日咳菌内毒素がほ
ぼ完全に除去される。
の特異的吸着能にすぐれ、Ｆ−ＨＡの精製度は数十倍に
達し、しかもＦ−ＨＡの回収率は９０％以上１００％近
くに達する。得られる精製Ｆ−ＨＡの比活性は４〜８Ｘ
１０’ＨＡユニット／ｌ１１ｇ蛋白質ときわめて高く、
ポリアクリルアミドディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分
析において単一のバンドを形成し、百日咳菌内毒素がほ
ぼ完全に除去される。
上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料の百日咳
菌培養物から所望のＦ−ＨＡを高収率、高純度に採取す
ることができ、その繰作もきわめて簡単で、またその精
製用クロマトグラフィー吸着体は、安価に調製でき、し
かもくり返し使用における劣化が全く無く、きわめて経
済的にすぐれている。
菌培養物から所望のＦ−ＨＡを高収率、高純度に採取す
ることができ、その繰作もきわめて簡単で、またその精
製用クロマトグラフィー吸着体は、安価に調製でき、し
かもくり返し使用における劣化が全く無く、きわめて経
済的にすぐれている。
したがって、本発明方法は高純度Ｆ−ＨＡの工業的精製
法としてきわめてすぐれた方法である。
法としてきわめてすぐれた方法である。
また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾配超遠
心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー法等
と組合わせることも可能であり、その際は従来方法で得
られる結果に比して非常にすぐれた結果を得ることがで
きる。
心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー法等
と組合わせることも可能であり、その際は従来方法で得
られる結果に比して非常にすぐれた結果を得ることがで
きる。
本発明の方法で得られるＦ−ＨＡは高純度で他の蛋白質
、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほぼ完全に除去
されているため、その生物学的活性を利用した各種試薬
、医薬品の調製、さらに百日咳菌ワクチンの調製に有用
である。
、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほぼ完全に除去
されているため、その生物学的活性を利用した各種試薬
、医薬品の調製、さらに百日咳菌ワクチンの調製に有用
である。
次１例
以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
調製例１
０℃以下の温度にてピリジン２００Ｊ にクロルスルホ
ン酸１１論１を滴下し、混合する。滴下終了後、混液を
加熱し、６５〜７０℃に昇温する。
ン酸１１論１を滴下し、混合する。滴下終了後、混液を
加熱し、６５〜７０℃に昇温する。
この中にエピクロルヒドリン架橋デキストランであるセ
ファデックスＧ−５０（７フルマシア社製）７．５ｇを
加え、攪拌下６５〜７０℃にて４時間保持する。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和す
る。ゲルを濾過分離し、０、ＯＩＭ＋７ン酸緩衝食塩液
で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エステルを得る
。
ファデックスＧ−５０（７フルマシア社製）７．５ｇを
加え、攪拌下６５〜７０℃にて４時間保持する。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和す
る。ゲルを濾過分離し、０、ＯＩＭ＋７ン酸緩衝食塩液
で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エステルを得る
。
調製例２
前記調製例１と同様にして調製したピリジン−クロルス
ルホン酸混液２１０ＩｌＩｌに架橋セルロースゲルであ
るセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）の乾燥物
７．５ｇを加え、６５〜７０℃にて４時間反応させる。
ルホン酸混液２１０ＩｌＩｌに架橋セルロースゲルであ
るセルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）の乾燥物
７．５ｇを加え、６５〜７０℃にて４時間反応させる。
反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルをｐ過分離し、０．ＯＩＭリン酸緩衝食
塩液で充分に洗浄して架橋セルロース硫酸エステル７．
２ｇを得る。
中和する。ゲルをｐ過分離し、０．ＯＩＭリン酸緩衝食
塩液で充分に洗浄して架橋セルロース硫酸エステル７．
２ｇを得る。
調製例３
前記調製例１と同様にして調整したピリジン−クロルス
ルホン酸混液２１０ＩＩｌｌに、架橋アガロースゲルで
あるセフ７０−スＣＬ−６Ｂ（７フルマシア社製）のピ
リノン包含体３０輸１を加え、６５〜７０℃にて４時間
反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム水
溶液を加えて中和する。
ルホン酸混液２１０ＩＩｌｌに、架橋アガロースゲルで
あるセフ７０−スＣＬ−６Ｂ（７フルマシア社製）のピ
リノン包含体３０輸１を加え、６５〜７０℃にて４時間
反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム水
溶液を加えて中和する。
ゲルを濾過分離し、０．０１Ｍリン酸緩衝食塩液で充分
に洗浄して架橋アガロース硫酸エステル２３鎗Ｐを得る
。
に洗浄して架橋アガロース硫酸エステル２３鎗Ｐを得る
。
実施例１
前記調製例１と同様にして調製したセファデックスＧ−
５０の硫酸エステル化物をカラム（１６關φＸ１００ｍ
ｍ）に充填し、これに０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０，
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８゜０、比電導度約１７ 、
５ ｍｓ／ ｃｍ）を通液して平衡化する。このカラム
に百日咳Ｉ相菌東浜株静置培養上清８００ｍ１を希釈し
て、比電導度約１７．５ｍｓ／ｃｍ 、ｐＨ８，０に合
わせた液を通液する。通液後、上記緩衝液にて洗浄し、
夾雑物質を洗い出す。ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウム
添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，６）で溶出し、Ｆ−ＨＡを
含む両分３０鶴１を得る。
５０の硫酸エステル化物をカラム（１６關φＸ１００ｍ
ｍ）に充填し、これに０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０，
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８゜０、比電導度約１７ 、
５ ｍｓ／ ｃｍ）を通液して平衡化する。このカラム
に百日咳Ｉ相菌東浜株静置培養上清８００ｍ１を希釈し
て、比電導度約１７．５ｍｓ／ｃｍ 、ｐＨ８，０に合
わせた液を通液する。通液後、上記緩衝液にて洗浄し、
夾雑物質を洗い出す。ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウム
添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，６）で溶出し、Ｆ−ＨＡを
含む両分３０鶴１を得る。
培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ両分の分
析結果を第１表に記す。
析結果を第１表に記す。
Ｆ−ＨＡの回収率は９３．８％で、精製度（精製Ｆ−Ｈ
Ａ画分の比活性／培養上清の比活性）は３４倍に達した
。精製Ｆ−ＨＡ画分のＬＰＦ−ＨＡ活性は、ハブＦＥＬ
ＩＳＡ法［佐藤呟第２８回毒素シンポジウム予稿集１４
１（１９８１）］による分析でｌ０ＥＬＩＳ八ユニツ）
／ ｍ ｌ以下であった。
Ａ画分の比活性／培養上清の比活性）は３４倍に達した
。精製Ｆ−ＨＡ画分のＬＰＦ−ＨＡ活性は、ハブＦＥＬ
ＩＳＡ法［佐藤呟第２８回毒素シンポジウム予稿集１４
１（１９８１）］による分析でｌ０ＥＬＩＳ八ユニツ）
／ ｍ ｌ以下であった。
第 １ 表
１）Ｆ−ＨＡ血球凝集試験［５ａｔｏ、 Ｙ、ｅｔ ａ
ｌ、Ｉｎｆｅｃｔ。
ｌ、Ｉｎｆｅｃｔ。
１＋ｎｍｕｎ、＋ ７＋９２９−９９９（１９７３）］
２）キルゾール法蛋白窒素測定値Ｘ６，２５により蛋白
質含量として表示 ３）ＨＡ価／蛋白質含量 ４）５）６．２５μｇ蛋白質／ａ＋ｌの含量に希釈後、
生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じて
実施した。
２）キルゾール法蛋白窒素測定値Ｘ６，２５により蛋白
質含量として表示 ３）ＨＡ価／蛋白質含量 ４）５）６．２５μｇ蛋白質／ａ＋ｌの含量に希釈後、
生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じて
実施した。
実施例２
調製例２と同様にして得られたセルロファインＧＣＬ−
２５の硫酸エステル化物をカラム（１６ｍｍφＸ １０
０ ｍｍ）に充填し、これに０．１４Ｍ塩化ナトリウム
添加０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８゜０）を通液し
て平衡化する。このカラムに、実施例１で用いたものと
同一ロットの百日咳■相菌東浜株ファーメンター培養上
清８００＋＋＋ｌを、比電導度約１０＋ｎｓ／ｃｍに希
釈し、ｐＨ８，０に合わせた液を通液する。通液終了後
、上記緩衝液で洗浄し、ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ム添加リン酸緩衝液（＋））１７．６）で溶出して精製
Ｆ−ＨＡ含有画分３０ｍ１を得る。
２５の硫酸エステル化物をカラム（１６ｍｍφＸ １０
０ ｍｍ）に充填し、これに０．１４Ｍ塩化ナトリウム
添加０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ８゜０）を通液し
て平衡化する。このカラムに、実施例１で用いたものと
同一ロットの百日咳■相菌東浜株ファーメンター培養上
清８００＋＋＋ｌを、比電導度約１０＋ｎｓ／ｃｍに希
釈し、ｐＨ８，０に合わせた液を通液する。通液終了後
、上記緩衝液で洗浄し、ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ム添加リン酸緩衝液（＋））１７．６）で溶出して精製
Ｆ−ＨＡ含有画分３０ｍ１を得る。
培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ画分の分
析結果を第２表に記す。
析結果を第２表に記す。
Ｆ−ＨＡの回収率は７５％で、精製度は２３倍に達した
。
。
第 ２ 表
１）、２）、 ３）、４）、５） 第１表に同じ実施例
３ 調製例３と同様にして得られたセフ７０−スＣＬ−６Ｂ
の硫酸エステル化物をカラム（１６＋ｎｍφＸ １００
ｍｔｏ）に充填し、これに０．２Ｍ塩化ナトリウム添加
０．ＯＩＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）を通液し平衡
化する。このカラムに実施例１で用いたものと同一ロン
ドの百日咳■相菌東浜株ファーメンター培養上清８０（
ｈｌを希釈して比電導度約１７ 、５ ｍｓ／ｃｍ、お
よびｐＨを８．０に調整した液を通液する。通液終了後
、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出す。ついで
１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，６
）で溶出し、Ｆ−ＨＡを含む両分２８ｍ１を得る。
３ 調製例３と同様にして得られたセフ７０−スＣＬ−６Ｂ
の硫酸エステル化物をカラム（１６＋ｎｍφＸ １００
ｍｔｏ）に充填し、これに０．２Ｍ塩化ナトリウム添加
０．ＯＩＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）を通液し平衡
化する。このカラムに実施例１で用いたものと同一ロン
ドの百日咳■相菌東浜株ファーメンター培養上清８０（
ｈｌを希釈して比電導度約１７ 、５ ｍｓ／ｃｍ、お
よびｐＨを８．０に調整した液を通液する。通液終了後
、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出す。ついで
１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，６
）で溶出し、Ｆ−ＨＡを含む両分２８ｍ１を得る。
培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ画分の分
析結果を第３表に記す。
析結果を第３表に記す。
Ｆ −ＨＡの回収率は８７．５％で、精製度は３３倍に
達した。主たＬＰＦ−ＨＡ活性はｌ０ＥＬＩＳＡユニツ
）／＋Ｉｌｌ以下であった。
達した。主たＬＰＦ−ＨＡ活性はｌ０ＥＬＩＳＡユニツ
）／＋Ｉｌｌ以下であった。
本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜきワクチン
」（薬発第２８７号、１９８１を参照）に準じ、マウス
体重減少試験、マウス白血球増加試験、易熱性毒素否定
試験およびマウスヒスタミン増感試験を実施したが、い
ずれも、生理食塩水を接種した対照群と同等であり、副
作用は認められなかった。
」（薬発第２８７号、１９８１を参照）に準じ、マウス
体重減少試験、マウス白血球増加試験、易熱性毒素否定
試験およびマウスヒスタミン増感試験を実施したが、い
ずれも、生理食塩水を接種した対照群と同等であり、副
作用は認められなかった。
第 ３ 表
Claims (10)
- （１）ボルデテラ属菌か産生する線維状赤血球凝集素を
精製取得するに際し、該線維状赤血球凝集素含有液を、
架橋ポリサッカライド硫酸エステルのゲル誘導体に接触
せしめ、線維状赤血球凝集素を吸着させた後、吸着した
線維状赤血球凝集素をゲルから溶出することを特徴とす
る線維状赤血球凝集素の精製方法。 - （２）架橋ポリサッカライド硫酸エステルが架橋デキス
トラン硫酸エステルおよび架橋アガロース硫酸エステル
および架橋セルロース硫酸エステルから選ばれる１種で
ある前記第（１）項記載の方法。 - （３）架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロルヒド
リン架橋デキストラン硫酸エステルである前記第（２）
項記載の方法。 - （４）架橋アガロース硫酸エステルがエピクロルヒドリ
ン架橋アガロース硫酸エステルである前記第（２）項記
載の方法。 - （５） 架１セルロース硫酸エステルがエピクロルヒド
リン架橋セルロース硫酸エステルである前記第（２）項
記載の方法。 - （６）該ポリサッカライド硫酸エステルのゲル誘導体を
、ｐＨ６，９〜９，０、比電導度Ｓ 、 Ｏ〜２Ｓ、Ｏ
ｍｓ／ｃｍの緩衝液であら力比め処理して平衡化したの
ち吸着処理に付す、前記第（１）〜（５）項のいずれか
１つの方法。 - （７）該吸着処理を、ｐＨ６，０〜８．Ｏ１温度θ〜３
０℃、比電導度５．０〜２５．０ｍｓ／ｃｍの条件下に
行なう前記第（１）〜（６）項のいずれか１つの方法。 - （８）線維状赤血球凝集素のゲルからの溶出を１．８
５．０〜１０．０、比電導度２５．０〜１３０ｍ５／ｃ
ｍの緩衝液を用いて行なう前記第（１）〜（７）項のい
ずれが１つの方法。 - （９）該溶出処理に先だって、吸着ゲルを、ｐＨ５，０
−１０，０、比電導度Ｓ、０２５．Ｏｍｓ／ｃｍの緩衝
液で洗浄する前記第（８）項の方法。 - （１０）該線維状赤血球凝集素含有液が百日咳菌培養物
である前記第（１）〜（９）項のいずれか１つの方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59084778A JPS60226822A (ja) | 1984-04-25 | 1984-04-25 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
| CA000479022A CA1237998A (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| AU41223/85A AU571078B2 (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Purification of filamentous hemagglutinin |
| US06/722,381 US4563303A (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| KR1019850002492A KR890001927B1 (ko) | 1984-04-14 | 1985-04-13 | 섬유질 헤마글루티닌의 정제방법 |
| AT85104545T ATE50600T1 (de) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Verfahren zur reinigung von faserartigem haemoglobin. |
| DE8585104545T DE3576173D1 (de) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Verfahren zur reinigung von faserartigem haemoglobin. |
| EP85104545A EP0159003B1 (en) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59084778A JPS60226822A (ja) | 1984-04-25 | 1984-04-25 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60226822A true JPS60226822A (ja) | 1985-11-12 |
| JPS641446B2 JPS641446B2 (ja) | 1989-01-11 |
Family
ID=13840140
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59084778A Granted JPS60226822A (ja) | 1984-04-14 | 1984-04-25 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60226822A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4849358A (en) * | 1987-04-24 | 1989-07-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
-
1984
- 1984-04-25 JP JP59084778A patent/JPS60226822A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4849358A (en) * | 1987-04-24 | 1989-07-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS641446B2 (ja) | 1989-01-11 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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